JP2002310874A - 水晶振動子を利用した測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 測定対象が低分子物質や、抗体結合部位を一
箇所しか有さない物質であっても高感度で測定を行うこ
とができる測定試薬及び測定方法を提供する。 【解決手段】 被測定物質に対する特異的結合能を有す
る認識素子が不溶性担体に固定化されてなる凝集素子、
前記被測定物質が高分子タンパク質に複数個結合してな
る競合標準物質、及び、水晶振動子から成る測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、水晶振動子を用い
て微量成分を測定する測定試薬及び測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、医療検査・環境測定・食品検査等
の領域において、微量成分を短時間で簡便に測定するこ
とが重要な課題となっており、そのような微量成分の測
定方法として、免疫反応等の生物学的親和性を利用する
方法が提案され、開発が進められている。

【０００３】そのような方法の中で、近年注目されてい
るのが水晶振動子を用いた測定方法である。この測定方
法によれば、水晶振動子表面に物質が吸着することによ
り、その吸着物質の重量に比例して水晶振動子の周波数
が変化することを利用して微量成分の検出、測定をする
ことができる。水晶振動子を用いた微量成分の測定方法
としては、通常、予め水晶振動子表面に認識素子を吸着
・固定化させ、これと被測定物質とを反応させ、反応前
後の周波数変化量を求めることにより、被測定物質の認
識素子との反応性及び被測定物質の質量を測定する方法
が用いられている。

【０００４】抗原又は抗体を担持した不溶性担体粒子と
水晶振動子とを組み合わせた抗原−抗体反応の測定方法
としては、以下の方法が提案されている。特開平３−７
７０６１号公報に記載されている方法は、抗原又は抗体
と、この抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を担持し
た不溶性担体粒子とを液体媒体中で反応させ、同時に、
該反応にかかわる抗原又は抗体を表面に固定化していな
い水晶振動子を該液体媒体中で発振させ、該反応に起因
する凝集体形成による水晶振動子の発振周波数の変化を
測定する方法である。

【０００５】この方法は、まず、水晶振動子を恒温キュ
ベット中の不溶性担体粒子が分散している液体媒体に浸
漬して発振させ発振周波数が安定したところで、該発振
周波数Ｆ１を測定し、次に該恒温キュベット中に分析試
料を一定量添加してそのまま攪拌を行い、再度発振周波
数が安定したところで、発振周波数を測定し、Ｆ２と
し、以上の操作における周波数変化量ΔＦ＝Ｆ１−Ｆ２
から、予め既知濃度の試料を用いて求めておいた検量線
に従い、分析試料中の測定しようとする抗原又は抗体の
存在及び濃度を求めることができるものであり、小型軽
量化できることを特徴とするものである。

【０００６】しかしながら、特開平３−７７０６１号公
報に記載されている方法では、抗原が複数の抗体結合部
位を有する高分子であることが不可欠である。被測定物
質がダイオキシン類をはじめとする環境汚染物質等のよ
うに低分子である場合や抗体結合部位を一箇所しか有さ
ない場合には、抗体又は抗原を固定化した不溶性担体が
凝集体を形成して水晶振動子に結合することはできず、
同方法では測定することが困難であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、測定対象が低分子物質や、抗体結合部位を一箇所し
か有さない物質であっても高感度で測定を行うことがで
きる測定試薬及び測定方法を提供することを目的とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、被測定物質に
対する特異的結合能を有する認識素子が不溶性担体に固
定化されてなる凝集素子、上記被測定物質が高分子タン
パク質に複数個結合してなる競合標準物質、及び、水晶
振動子から成る測定試薬である。

【０００９】本発明の測定試薬を用いる測定方法であっ
て、水晶振動子の周波数変化量を測定し、上記周波数変
化量より測定試料中の被測定物質の量を求める測定方法
もまた、本発明の１つである。以下に本発明を詳述す
る。

【００１０】本発明は、水晶振動子表面に物質が吸着す
ることにより、その吸着物質の重量に比例して水晶振動
子の周波数が変化することを利用して被測定物質の質量
を測定する方法を用いるものであるが、従来の方法とは
異なり、被測定物質を高分子タンパク質等に複数個結合
させて、これを競合標準物質とし、検体中の被測定物質
と競合させる競合反応を用いることを特徴とするもので
ある。従って、本発明においては、従来の方法とは異な
り、検体中に存在する被測定物質が多いほど、競合標準
物質と凝集素子との結合が妨げられるために周波数変化
量が減少する。

【００１１】本発明の測定試薬は、被測定物質に対する
特異的結合能を有する認識素子が不溶性担体に固定化さ
れてなる凝集素子、被測定物質が高分子タンパク質に複
数個結合してなる競合標準物質、及び、水晶振動子から
なるものである。

【００１２】本発明の測定試薬の被測定物質としては特
に限定されず、例えば、ヒト血清、尿、体液、河川・湖
沼の水、汚泥、焼却炉の煤塵等に含まれる微量成分等が
挙げられる。上記微量成分としては、例えば、コプラナ
ーＰＣＢ類を含むダイオキシン類、内分泌攪乱物質に指
定されたいわゆる環境ホルモン等を始めとする環境汚染
物質やヒト体内中の微量ホルモン類等が挙げられる。

【００１３】本発明の測定試薬は、被測定物質が分子量
１００〜１０００程度の低分子物質や抗体結合部位を一
箇所しか有さない物質であっても高感度に測定すること
ができる。

【００１４】上記凝集素子は、被測定物質に対する特異
的結合能を有する認識素子が不溶性担体に固定化されて
なるものである。上記不溶性担体としては本発明で用い
られる液体媒体に実質的に不溶性であれば特に限定され
ず、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重
合体、スチレン−スチレンスルホン酸ソーダ共重合体、
スチレン−メタクリル酸エステル共重合体、スチレン−
クロルメチルスチレン共重合体、塩素化ポリスチレン等
の有機高分子物質からなる粒子；シリカ、シリカ−アル
ミナ等の無機酸化物微粒子；有機薄膜を被履したフェラ
イト等の磁性金属微粒子等が挙げられる。上記不溶性担
体の粒径は、０．０１〜１μｍであることが好ましい。
０．０１μｍ未満であると、充分な発振周波数変化が生
じにくくなり、１μｍを超えると、液体媒体中に安定に
分散することが困難となる。

【００１５】上記認識素子としては被測定物質と特異的
に結合するものであれば特に限定されず、例えば、被測
定物質と抗原抗体反応を起こす抗体、被測定物質を特異
的に認識するレセプター分子等が挙げられる。

【００１６】上記抗体としては、例えば、被測定物質及
びハプテン化被測定物質を抗原として、ウサギ、ヤギ、
ヒツジ等の動物を免疫し、その血清からＩｇＧ画分を精
製して得られるポリクローナル抗体；細胞融合法により
得られるモノクローナル抗体等が挙げられる。上記抗体
として、例えば、酵素処理等により得られるＦ（ａｂ
´）_２、Ｆａｂ´やＦａｂを用いてもよく、更に遺伝子
組換え技術により調製したＦａｂ´やｓｃＦｖ等を用い
てもよい。

【００１７】上記レセプター分子としては特に限定され
ないが、例えば、ダイオキシン類はＡｈ（アリルハイド
ロカーボン）レセプターと結合することが知られてお
り、このようなセプターを用いることができる。

【００１８】上記認識素子としては、他に被測定物質と
の結合能を有するペプチドやＤＮＡ等を用いてもよく、
更に、モレキュラーインプリンティング法により作製さ
れる、被測定物質と相補的な結合部位を有した高分子ポ
リマーを用いてもよい。

【００１９】上記不溶性担体に認識素子を固定化する方
法としては特に限定されず、公知の方法を用いることが
でき、例えば、不溶性担体粒子にカップリング剤等を用
いて化学的に吸着させる方法、不溶性担体として反応性
官能基を粒子表面に有する高分子物質のラテックスを用
いて化学的に吸着させる方法、疎水性相互作用等を利用
した物理的に吸着させる方法等が挙げられる。

【００２０】上記競合標準物質は、被測定物質が高分子
タンパク質に複数個結合したものである。上記高分子タ
ンパク質としては特に限定されないが、入手の容易さや
経済的な面から、例えば、生化学分野等で汎用されてい
る分子量数万以上のタンパク質である血清アルブミン、
ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素等が
好適に用いられる。

【００２１】上記被測定物質を高分子タンパク質に複数
個結合させる方法としては、例えば、混合酸無水物法、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法、同反応性架橋法、Ｎ
−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド
型架橋法等が挙げられる。

【００２２】本発明で用いられる水晶振動子としては、
例えば、ＡＴカット、ＧＴカット、ＢＴカット等が挙げ
られ、電極の材質としては金や銀等が適している。上記
水晶振動子が液体媒体中に浸漬して用いられる場合は、
片面が封止されていることが好ましい。上記水晶振動子
の発振周波数としては特に限定されず、用途に従い適宜
選択すればよいが、５〜５０ＭＨｚが好ましい。５ＭＨ
ｚ未満であると、感度が充分ではなく、５０ＭＨｚを超
えると、ノイズが生じるために実用的ではない。より好
ましくは、９〜３０ＭＨｚである。

【００２３】本発明の測定試薬を用いた測定方法を図１
に模式的に示す。本発明の測定試薬を用いて測定を行う
と、水晶振動子１表面に、凝集素子２と競合標準物質３
との複合体、又は、凝集素子２と被測定物質４との複合
体が吸着することにより、その吸着物質の重量に比例し
て水晶振動子の周波数が変化することを利用して被測定
物質の質量を測定する方法を用いるものであるが、競合
標準物質３と被測定物質４とが、競合的に凝集素子２に
対して結合するので、検体中に存在する被測定物質が多
いほど、競合標準物質と凝集素子との結合が妨げられる
ために周波数変化量が減少する。このため、本発明の測
定試薬によれば、被測定物質４が分子量１００〜１００
０程度の低分子物質や抗体結合部位を一箇所しか有さな
い物質であっても高感度に測定することができる。

【００２４】以下に、上記認識素子として抗体を用いた
場合を例として掲げ、本発明の測定方法の１態様を説明
する。本発明の測定方法を実施するにあたり、まず、測
定装置を組み立てることが必要であるが、本発明で用い
られる測定装置としては、例えば、特開平３−７７０６
１号公報に記載されているものを用いることができる。
上記測定装置において、水晶振動子チップは、発振回
路、周波数カウンター及びデータ処理用のマイクロコン
ピューターによって構成される測定システムに接続され
る。

【００２５】上記測定装置の組み立てに続いて、不溶性
担体粒子に抗体が固定化されてなる凝集素子を緩衝液溶
液等の液体媒体中に分散させ、測定用の恒温セル中にい
れて攪拌子により一定速度で攪拌しておく。ここで、本
発明で用いられる液体媒体としては、例えば、リン酸緩
衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が好まし
い。

【００２６】上記凝集素子の濃度としては特に限定され
ず、適宜設定することができるが、０．０１〜１．０重
量％であることが好ましい。０．０１重量％未満である
と、抗原抗体反応を充分に行わせることができず、１．
０重量％であると、凝集素子が液体媒体中で安定に分散
することが困難になる。

【００２７】上記攪拌子の回転速度としては、５００〜
１５００ｒｐｍであることが好ましい。５００〜１５０
０ｒｐｍであると、抗原抗体反応を、速やかに行わせる
と同時に発振を安定に行わせることができる。より好ま
しくは、８００〜１０００ｒｐｍである。上記攪拌子は
反応中は一定の回転速度を保つことが好ましい。

【００２８】次いで、水晶振動子を上記恒温セル中の液
体媒体に浸漬して発振させる。発振周波数が安定したと
ころで、周波数（Ｆ１）の測定行う。次いで、抗原を複
数結合した高分子タンパク質及び抗原が含まれている検
体の混合物を添加して、競合的免疫反応を行う。攪拌
は、そのまま続け、周波数が一定に安定した値（Ｆ２）
を求める。最後に、得られたＦ１からＦ２を引くことに
よりΔＦを求める。

【００２９】このとき検体中に抗原が含まれていれば、
その抗原が、競合標準物質が凝集素子に結合することを
阻害し、これにより、凝集素子同士の凝集体形成が抑制
される。水晶振動子の周波数は表面上に吸着する物質の
重量により減少するため、検体中に抗原が含まれていれ
ば、周波数減少量も小さくなる。本発明では、数種類の
既知濃度の被測定物質を用いて検量線を作成し、これを
用いて検体中の被測定物質の濃度の算出を行う。

【００３０】上記測定装置において、一度使用した水晶
振動子は、タンパク質等による汚染を洗浄除去して、再
度使用してもよいが、水晶振動子は廉価であることから
一測定毎に取り替えてもよい。本発明の測定方法によれ
ば、未知試料中の種々の物質、とりわけ環境汚染物質の
ような低分子物質の検出及び濃度を高感度に測定するこ
とができる。

【００３１】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００３２】本発明の実施例として、低分子量物質ジニ
トロフェノール（ＤＮＰ）を被測定物質として測定を行
った。１ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ結合牛血清アルブミン（シ
グマ社製）溶液にＤＮＰ（シグマ社製）をそれぞれ０、
０．０１、０．１、１．０、１０、１００ｎｇ／ｍＬと
なるように溶解した液を調製し、これを抗原液とした。

【００３３】不溶性担体粒子として免疫試薬用ラテック
ス（積水化学工業社製）を用い、定法に従い抗ＤＮＰモ
ノクローナル抗体を固定化した。この抗ＤＮＰラテック
スけん濁液（固形分０．０１％）１．２ｍＬを恒温キュ
ベットに入れ、発振機、周波数カウンター、マイクロコ
ンピューターに接続した水晶振動子（９ＭＨｚ）を投入
した。攪拌子で液体媒体を攪拌しながら発振させた。発
振が安定した状態でＱＣＭの発振周波数測定を行い、こ
の値をＦ１とした。

【００３４】次に、抗原液１０μＬを加え、２５℃でイ
ンキュベーションすることにより抗原抗体反応を行っ
た。反応終了後、ＱＣＭの発振周波数測定を行い、この
値をＦ２とした。Ｆ１からＦ２を差し引いた値をΔＦと
した。結果を表１及び図２に示した。

【００３５】

【表１】

【００３６】表１及び図２示した結果より、上記の方法
によれば０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＤＮＰを
測定できることが明らかとなった。

【００３７】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、非
常に簡単な操作で迅速かつ高精度で低分子物質の測定を
行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定試薬を用いた測定方法を模式的に
示した図である。

【図２】本発明におけるＤＮＰ濃度と周波数変化量の関
係を示すグラフである。

【符号の説明】

１ 水晶振動子 ２ 凝集素子 ３ 競合標準物質 ４ 被測定物質

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土居 淳 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質に対する特異的結合能を有す
   る認識素子が不溶性担体に固定化されてなる凝集素子、
   前記被測定物質が高分子タンパク質に複数個結合してな
   る競合標準物質、及び、水晶振動子から成ることを特徴
   とする測定試薬。
2. 【請求項２】 認識素子は、被測定物質を抗原として特
   異的に結合することができる抗体であることを特徴とす
   る請求項１記載の測定試薬。
3. 【請求項３】 認識素子は、被測定物質と特異的に結合
   することができるレセプター分子であることを特徴とす
   る請求項１記載の測定試薬。
4. 【請求項４】 被測定物質は、ダイオキシン類であるこ
   とを特徴とする請求項１、２又は３の測定試薬。
5. 【請求項５】 請求項１、２、３又は４記載の測定試薬
   を用いる測定方法であって、水晶振動子の周波数変化量
   を測定し、前記周波数変化量より測定試料中の被測定物
   質の量を求めることを特徴とする測定方法。