JP2015102422A - 感知方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料液中の感知対象物を感知するにあたり、信頼性の高い測定を行うことができる感知方法を提供すること。
【解決手段】一面側の電極４２表面に感知対象物を吸着する吸着層４６が形成された水晶振動子４に対し、前記感知対象物を含有した試料液を前記水晶振動子４の一面側に供給する工程と、前記感知対象物に結合する第１のビーズ群４５を含有した液を前記水晶振動子４の一面側に供給する工程と、しかる後に前記第１のビーズ群４５よりも粒子の直径が小さい第２のビーズ群４７を含有した液を前記水晶振動子４の一面側に供給する工程とを行う。第２のビーズ群４７を供給する工程により、第２のビーズ群４７が第１のビーズ群４５と水晶振動子４表面との間隙に入り込み、第１のビーズ群４５が水晶振動子４上に固定される。従って第１のビーズ群４５により感知対象物の検出感度を増大させることができる。
【選択図】図１０

Description

本発明は、圧電振動子を用いて感知対象物を感知する感知方法に関する。

食品衛生分野においては、食品中のカビ毒や抗生物質などの比較的分子量の低い物質の検出や定量が行われる。また、医薬品開発の分野においても低分子物質の検出や定量を行う場合がある。このような定量を行う手法として、特許文献１に開示されているようなＱＣＭ（Quarts Crystal Microbalance）を利用した感知方法が開発されている。この感知方法は、水晶振動子の表面に形成された吸着層に、試料液中の感知対象物が吸着されると、質量負荷効果により感知対象物の吸着量に応じて水晶振動子の発振周波数が変化することを利用した手法である。

ところで、ＱＣＭによる感知方法においては質量負荷効果を利用していることから、感知対象物の分子量が大きいほど前記吸着量に対する周波数変化量が大きい。即ち、感知対象物が低分子物質である場合には前記吸着量に対する周波数変化量が小さいので、感度が低くなってしまう。従って、試料液に含まれる感知対象物の濃度が低いと信頼度の高い計測を行うことが困難になる。

このような問題に対し、感知対象物である低分子物質に結合する性質を有する低分子物質よりも大きな分子を添加し、低分子物質に結合させることにより周波数変化量を増大させる手法、いわゆる増感と呼ばれる技術が知られている。当該増感に用いられる分子としては、例えば抗原検出を目的とした装置においては抗体が利用されることが多いが、更に大きな増感効果を得ることを目的として、抗体よりも大きな粒子を用いることがある。この場合、用いられる粒子としては粒径はナノメートルもしくはマイクロメートルオーダーであり、材質としては金コロイド、磁気ビーズ、ラテックスなどの質量の大きいものが主に利用されている。

しかし上述した粒子を用いた増感法においては、粒子が一定の大きさより大きくなると、水晶振動子表面に付着した粒子が水晶とは異なる固有の周波数で振動するようになり、非特許文献１及び２にて述べられているように、所望の質量付加による増感効果が得られない現象が知られている。このため、増感を目的として粒子を添加したにもかかわらず、却って感度が減少することがある。

特許文献２には、測定対象に比して粒径の大きな分子、及び架橋性化合物を添加して周波数振幅を増感する方法が開示されている。また特許文献３には、測定対象を吸着する薄膜に対して粒子を付着させ、当該粒子を除去することにより薄膜の表面積を増加させ、周波数振幅の増感を図る方法が開示されている。しかしこれらの方法は、本発明と原理が異なる。

特開２００７−１７８３４８号公報 特開２００６−２７５８６４号公報 特開２００７−１４７５５６号公報

A sensitive new method for the determination of adhesive bonding between a particle and a substrate, J. Appl. Phys. 58(7), 1, October 1985 Positive Frequency Shift Observed Upon Adsorbing Micron-Sized Solid Objects to a Quartz Crystal Microbalance from the Liquid Phase, Anal. Chem. 2010, 82, pp.2237-2242

本発明はこのような事情の下になされたものであり、その目的は、圧電振動子の周波数の変化に基づいて試料液中の感知対象物を感知するにあたり、信頼性の高い測定を行うことができる感知方法を提供することにある。

本発明の感知方法は、
試料液中の感知対象物を圧電振動子の周波数の変化に基づいて感知する方法において、
圧電振動子の一面側の電極表面に形成された、前記感知対象物を吸着する吸着層に対して試料液を供給する工程と、
しかる後に前記感知対象物に対応する部位に吸着する性質を有する第１の粒子の群を含む第１の液を前記圧電振動子の一面側に供給する工程と、
続いて前記第１の粒子よりも粒子径が小さくかつ前記感知対象物に対応する部位に吸着する性質を有する第２の粒子の群を含む第２の液を前記圧電振動子の一面側に供給して、前記第１の粒子と前記吸着層との間に第２の粒子を詰める工程と、
前記圧電振動子を発振回路により発振させ、前記第１の粒子を前記圧電振動子の一面側に供給する前後における各発振周波数を測定する工程と、を含むことを特徴とする。

本発明の感知方法は、感知対象物よりも分子量の大きい第１の粒子を用いて増感を図る感知方法において、第１の粒子よりも小さい第２の粒子の群を用い、第１の粒子と圧電振動子の表面との間の間隙を埋めて、第１の粒子の群を圧電振動子の表面上に固定している。従って、第１の粒子の固有振動が抑えられることにより第１の粒子の群の増感効果を確実に得ることができ、このため感知対象物を高精度に感知することができる。

本発明の感知方法に係る感知装置の構成図である。 前記感知装置を構成する感知センサーの斜視図である。 前記感知センサーの縦断側面図である。 前記感知センサーを構成する水晶振動子の平面図である。 前記感知装置の回路図である。 前記水晶振動子の表面の模式図である。 前記水晶振動子の表面の模式図である。 前記水晶振動子の表面の模式図である。 前記水晶振動子の表面の模式図である。 前記水晶振動子の表面の模式図である。 水晶振動子表面への粒子の結合による共振周波数の変化を表した模式図である。 前記水晶振動子の表面の模式図である。 本発明に係る感知方法の効果を測定したグラフである。 他の感知方法の効果を測定したグラフである。

図１に本発明の感知方法を実施するための感知装置の実施形態の一つを示す。当該感知装置はセンサーユニット２と、このセンサーユニット２に後述のように試料液、第１の液、第２の液、第３の液及び緩衝液を供給するための液供給系１と、センサーユニット２から排出される液体を貯留する液排出系９０と、センサーユニット２に取り付けられた圧電センサーである水晶センサー７と、センサーユニット２に隣接して設けられた発振回路ユニット６と、を備えている。

液供給系１は、流路切替機構１１、試料液供給部１２、後述する第１のビーズの群４５を含有した第１の液を供給する第１の液供給部１３、後述する第２のビーズの群４７を含有した第２の液を供給する第２の液供給部１４、後述する中間物質であるビオチン化抗体４０を含有した第３の液を供給する第３の液供給部１５、緩衝液を供給する緩衝液供給部１７を備えている。流路切替機構１１は試料液供給路１６を介して、試料液、第１の液、第２の液、第３の液、緩衝液のいずれかを選択してセンサーユニット２内に供給するように構成されている。流路切替機構１１としては例えば６つのポートとインジェクションループとを備えたインジェクションバルブが用いられる。この場合インジェクションループ内に、選択された液が一のポートを介して一旦貯留され、次いで他のポートから当該液が送出される。

センサーユニット２は、図２に示すように、支持体２１、配線基板３、水晶振動子４、流路形成部材５及びカバー部２４が下側からこの順番に積層されて構成されている。支持体２１には、水晶センサー７と流路形成部材５とを嵌合し、保持するための支持体凹部２２が形成されている。従って、前記支持体凹部２２に水晶センサー７を嵌合した状態で、流路形成部材５を水晶センサー７に押しつけることにより、流路形成部材５の下面が水晶振動子４を配線基板３に押圧して固着させる。さらに、支持体２１は上方よりカバー体２４にて覆われる。

図２及び図３において２６は液体供給管、２７は液体排出管であり、液供給系１から液体供給管２６を介して反応用流路５２に供給された試料液が液体排出管２７を通じて液排出系９０へと排出されるように構成されている。液排出系９０は排液貯留部を備えている。

水晶センサー７は、配線基板３上に圧電振動子である水晶振動子４を設けて構成されている。この水晶振動子４は、図４に示すように、圧電片である円盤状の水晶片４１の両面に、励振電極４２、４３を設けて構成されている。この例では図４（ｂ）に示すように裏面側の励振電極４３Ａと第２の励振電極４３Ｂとを互いに離間してＸ方向に並ぶように配置すると共に、図４（ａ）に示すように表面側には前記２つの励振電極４３Ａ、４３Ｂに対する励振電極である共通電極４２を配置している。従って、第１の励振電極４３Ａと共通電極４２とにより第１の振動領域４Ａが、第２の励振電極４３Ｂと共通電極４２とにより第２の振動領域４Ｂが、夫々形成される。

第１の励振電極４３Ａ及び第２の励振電極４３Ｂは、水晶センサー７をセンサーユニット２に接続したときには、図５に示すように配線基板３の導電路３２、３４を介して、２つの発振回路６Ａ、６Ｂに夫々接続される。このとき共通電極４２は配線基板３の導電路３３を介して発振回路６Ａ、６Ｂのアース側に接続されることになる。配線基板３の端部領域には、各導電路３２、３３、３４と夫々接続される接続端子３５、３６、３７が形成されている。

水晶振動子４上の共通電極４２において第１の励振電極４３Ａに対応する第１の領域上には、例えば抗原である感知対象物を吸着するための抗体４９からなる吸着層４６が形成されている。一方共通電極４２において第２の励振電極４３Ｂに対応する第２の領域は、吸着層４６が形成されずに剥き出しの状態となっており、データ処理時に第１の領域の発振周波数の温度変化をキャンセルする役割を果たしている。

また、発振回路ユニット６は、センサーユニット２に差し込まれることにより、図５に示すように前記配線基板３の接続端子部と電気的に接続される。発振回路ユニット６の後段には、測定回路部８１及びデータ処理部８２が設けられている。前記測定回路部８１は、発振周波数を計測する機能を有する。データ処理部８２は、計測された周波数の時系列データを記憶したり当該時系列データを表示したりする部位であり、例えばパーソナルコンピュータからなる。

水晶振動子４の第１の振動領域４Ａ及び第２の振動領域４Ｂの発振周波数は測定回路部８１に取り込まれる。そしてデータ処理部８２にて第１の振動領域４Ａにおける発振周波数と第２の振動領域４Ｂにおける発振周波数との差分の時系列データが求められる。

上述の感知装置を用いて、試料液中の抗原の定量を行う工程について説明する。最初に、緩衝液を緩衝液供給部１７からセンサーユニット２内の反応用流路５２へと供給し、第１の振動領域４Ａ及び第２の振動領域４Ｂの発振周波数Ｆ４ａ及びＦ４ｂを測定する。続いて液供給系１の試料液供給部１２よりセンサーユニット２内に試料液が供給され、当該試料液は液体供給口５３から反応用流路５２へと流入する。反応用流路５２へと流入した試料液は反応用流路５２内部に広がり、水晶振動子４上の共通電極４２が形成された面へと達する。

ここで、試料液中の抗原は、水晶とは直接反応せず、また第２の振動領域４Ｂの共通電極４２は電極が直接剥き出しとなっており、当該領域にも抗原は反応しない。このため、図６のように抗体４９により吸着層４６が形成されている共通電極４２に対して抗原を供給すると、図７に示すように第１の振動領域４Ａの共通電極４２上の吸着層４６を構成する抗体４９に対してのみ抗原が反応し、吸着層４６上に結合される。図７から図１０及び図１２において７１は抗原であり、また抗原７１の吸着層４６への結合密度を実際より高く図示している。

試料液を供給してから所定の時間が経過した後、ビオチン化抗体４０を含んだ第３の液を、第３の液供給部１５からセンサーユニット２内の反応用流路５２へと供給し、図８に示すように抗原７１に対してビオチン化抗体４０を結合させる。ビオチン化抗体４０は、抗原７１に対して選択的に結合する抗体４０ｂと、ビオチン４０ａとが結合して構成された中間物質である。続いて、第１のビーズ（粒子）の群４５を含んだ第１の液を第１の液供給部１３からセンサーユニット２内の反応用流路５２へと供給し、水晶振動子４上の共通電極４２が形成された面に対して、第１のビーズの群４５を供給する。第１のビーズの群４５が分散されている第１の液は例えば緩衝液からなるが、純水であってもよい。

図９に示すように第１のビーズの群４５は表面がビオチン化抗体４０上のビオチン４０ａと結合するようにアビジン粒子４８により処理されている。第１のビーズの群４５の表面に結合されたアビジン粒子４８とビオチン化抗体４０とは、１：１で結合することから、水晶振動子４の表面上に供給された第１のビーズ４５は、ビオチン化抗体４０を介して、前述の吸着層４６に対して結合した抗原７１に重畳して結合する。第１のビーズの群４５を構成するビーズの大きさとしては、直径２００ｎｍ〜３０００ｎｍ、材質としては例えば磁気ビーズ、金コロイド、ラテックスなどが用いられる。

続いて第２のビーズ（粒子）の群４７を含んだ第２の液を第２の液供給部１４からセンサーユニット２内の反応用流路５２に供給する。水晶振動子４の表面上に供給された第２のビーズの群４７は、第１のビーズの群４５と同様に、表面がアビジン粒子４８により処理されている（図１０中には図示せず）。そして図１０に示すように、ビオチン化抗体４０に結合した第１のビーズの群４５の粒子と吸着層４６との間隙に入り込み、当該間隙を埋める。第２のビーズの群４７を構成するビーズの大きさとしては、直径５ｎｍ〜１００ｎｍ、材質としては例えば磁気ビーズ、金コロイド、ラテックスなどが用いられる。そして一定時間経過後、緩衝液を緩衝液供給部１７からセンサーユニット２内の反応用流路５２へと供給し、吸着層４６のブロッキングを行う。

このようにして反応用流路５２内部を通過する試料液は、緩衝液と同様に共通電極４２の表面にも供給され当該共通電極４２上を通過していく。そして振動領域４Ａ、４Ｂの発振周波数の双方が当該水圧により等しく低下する。試料液に感知対象物である抗原７１が含まれている場合には、この作用と同時に、第１の振動領域４Ａ上の吸着膜４６に抗原７１が吸着される。さらに第１のビーズの群４５を共通電極４２の表面に供給することにより、第１のビーズの群４５が抗原７１に重畳して結合されるため、質量負荷効果により吸着量に応じて発振周波数Ｆ１が低下する。一方第２の振動領域４Ｂ上には抗原７１は吸着されないため、第１のビーズの群４５も結合せず、質量負荷効果に起因する発振周波数Ｆ２の低下は発生しない。この結果、振動領域４Ａ、４Ｂの発振周波数はＦ４ａ’、Ｆ４ｂ’となり、（Ｆ４ａ’−Ｆ４ｂ’）と（Ｆ４ａ−Ｆ４ｂ）との間に変化が生じる。この（Ｆ４ａ’−Ｆ４ｂ’）と（Ｆ４ａ−Ｆ４ｂ）との差分をとり、当該差分と試料液中の感知対象物の濃度との関係式を取得しておき、当該関係式と測定により得られた差分とから、試料液中の感知対象物の濃度を求める。

上述の実施形態によれば、感知対象物である抗原７１よりも分子量の大きい第１のビーズの群４５を用いて増感を図る感知方法において、第１のビーズの群よりも粒子が小さい第２のビーズの群４７を用い、第１のビーズの群４５と水晶振動子４の表面との間の間隙を埋めて、第１のビーズの群４５を水晶振動子４の表面上に固定している。従って、第１のビーズの群４５の粒子の固有振動が抑えられることにより第１のビーズの群４５の増感効果を確実に得ることができ、このため抗原７１を高精度に感知することができる効果がある。

上述してきた実施形態においては、水晶振動子における粒子結合による増感法において、粒子がある程度の大きさを超えると増感効果が低下するという上述してきた問題を解決するために、先ず感知対象物を水晶振動子４上の共通電極４２の表面に形成された吸着層４６に結合させる。その後感知対象物に結合する性質を持つ第１のビーズの群４５を吸着層４６に結合している感知対象物に対して重畳して結合させる。続いて第１のビーズの群４５より粒子が小さい第２のビーズの群４７を水晶振動子４上に供給すると、第２のビーズの群４７を構成するビーズは第１のビーズの群４５を構成するビーズと比して、粒径が１／１０〜１／１００程度であるため、図１０を用いて前述したように、第１のビーズの群４５と吸着層４６との間隙に第２のビーズの群４７が入り込む。そして第２のビーズの群４７が当該間隙を埋めることにより、第１のビーズの群４５の固有振動が抑制される。本発明においては、第１のビーズの群４５を第２のビーズの群４７に先だって水晶振動子４上に供給することにより、抗原７１の量と第１のビーズ群４５がビオチン化抗体４０を介して抗原７１に結合する量との間の対応関係に基づいて、増感効果を得ることができる。また、第２のビーズ４７は第１のビーズ４５に比して体積、重量共に微小であるため、第１のビーズの群４５による増感効果に対して悪影響を与えない。

このように第２のビーズの群４７によって、第１のビーズの群４５を構成するビーズの固有振動を抑制することができる。その結果として、当該第１のビーズの群４５の質量負荷効果が発揮され、後述の（１）式で表される増感効果を効率よく得ることができる。従って、感知対象物の分子量が小さい場合であっても高感度に感知対象物を検出することが可能となる。

ここで、本実施形態における水晶振動子４に対して第１のビーズの群４５及び第２のビーズの群４７を供給する効果について説明する。
圧電振動子の表面に対して質量が負荷される前後における、負荷質量と周波数との関係について、一般的には次式（１）で表される関係式（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙの式）が成立する。背景技術の項にて述べた増感効果は当該関係式を利用している。

ここで、Δｍは負荷質量（ｇ）、Ｓは電極面積（ｃｍ^２）、ρは圧電振動子の密度（ｇ／ｃｍ^３）、μは圧電振動子の剪断応力（ｇ／ｃｍ・ｓｅｃ^２）、Ｎはオーバートーン次数、Ｆは公称周波数（Ｈｚ）、ΔＦは反応前後の圧電振動子における周波数変化（Ｈｚ）である。
しかし、圧電振動子に対して質量を負荷する物質がある程度の大きさを超えると、質量を負荷する物質が圧電振動子とは異なる固有の周波数にて振動するようになり、上述の（１）式の関係、即ち発振周波数の低下が成り立たなくなる現象が知られている。

当該現象について図１１を用いて説明する。
図１１のように、水晶振動子８に単に球体８３を結合させた状態を考える。水晶振動子８の質量をＭ、球体８３の質量をｍとおき、水晶振動子８及び球体８３の単体での振動について、夫々がばね定数Ｋ及びｋであるばねの振動であると仮定する。水晶振動子８と球体８３とは結合しているので、図１１によって示すようにばねを２つ直列に結合させた状態の共振が発生する。

非特許文献１には、当該共振の角周波数は、水晶振動子８の角周波数よりも高くなり、従って上述した（１）の式にて表される関係が成り立たない旨が開示されている。そこで本実施形態においては、球体８３と水晶振動子８との間隙を球体８３よりも小さい粒子にて埋めることにより球体８３の固有振動を抑止し、従って水晶振動子８の単体にての振動のみを得るようにしている。

また、本実施形態においては、予め取得した（Ｆ４ａ’−Ｆ４ｂ’）と（Ｆ４ａ−Ｆ４ｂ）との差分と試料液中の感知対象物の濃度との関係式と、測定により得られた差分とに基づいて、試料液中の感知対象物の濃度を求めるものとしてきたが、当該定量の代わりに、（Ｆ４ａ’−Ｆ４ｂ’）と（Ｆ４ａ−Ｆ４ｂ）との間に差分があることを検出することによって、抗原の有無の判定を行ってもよい。

また、上述してきた実施形態においては、試料液供給前に第１の振動領域４Ａ及び第２の振動領域４Ｂ発振の周波数Ｆ４ａ及びＦ４ｂを測定し、（Ｆ４ａ’−Ｆ４ｂ’）と（Ｆ４ａ−Ｆ４ｂ）との差分を比較することにより感知対象物である抗原７１の定量を行うと述べてきたが、発振周波数Ｆ４ａ及びＦ４ｂを測定するタイミングは、第１のビーズの群４５の供給前であれば、前記試料液の供給後、第３の液の供給前であってもよいし、第３の液の供給後であってもよい。

さらに、上述してきた実施形態においては、ビオチン化抗体４０を含んだ第３の液を第３の液供給部１５から供給することに代え、図１２に示すように、予め第１のビーズの群４５及び第２のビーズの群４７の表面を、アビジン粒子４８及び当該アビジン粒子４８に結合するビオチン化抗体４０により処理してもよい。その上で、当該第１のビーズの群４５及び第２のビーズの群４７をこの順番にて水晶振動子４上に供給することにより、同様の結果を得ることができる。即ち、第１のビーズ群４５及び第２のビーズ群４７の各ビオチン化抗体４０が吸着膜４６上の抗原７１に捕捉される。

さらに、上述してきた実施形態においては、水晶振動子４の温度特性による周波数変化をキャンセルするために、振動領域が４Ａ及び４Ｂの二つに分かれた水晶振動子４を用いている。当該水晶振動子４の代わりに、振動領域が一つ、すなわち水晶振動子の両面に夫々一つの対応した電極を設けた水晶振動子を用いてもよい。この場合、水晶振動子の一面側に感知対象物を吸着する吸着層を設け、第１のビーズの群４５の供給前後における当該水晶振動子の発振周波数の差分を測定する。

上述してきた本発明の実施形態に係る感知装置を用い、本発明の効果を測定する試験を行った。感知対象物としてはビオチン結合ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。ビオチン結合ＢＳＡは金電極の表面に微量結合する性質を有する。
（評価試験）
ビオチン結合ＢＳＡを１００μｇ／ｍＬ含有する試料液をセンサーユニットに供給し、一定時間経過後に直径１μｍのアビジン結合磁気ビーズを含有したＢＳＡからなる緩衝液をセンサーユニットに供給し、ビーズ供給前との周波数の変化を取得した。そしてさらに一定時間経過後に直径５０ｎｍのアビジン結合磁気ビーズを含有したＢＳＡからなる緩衝液をセンサーユニット２に供給し、さらなる周波数の変化を取得した。

（参照試験）
評価試験と同じ感知装置を用い、同濃度のビオチン結合ＢＳＡ試料液をセンサーユニットに供給し、一定時間経過後に直径５０ｎｍのアビジン結合磁気ビーズを含有したＢＳＡからなる緩衝液をセンサーユニットに供給し、ビーズ供給前との周波数の変化を取得した。そしてさらに一定時間経過後に直径１μｍのアビジン結合磁気ビーズを含有したＢＳＡからなる緩衝液をセンサーユニットに供給し、さらなる周波数の変化を取得した。

評価試験の結果を図１３に、参照試験の結果を図１４に、夫々グラフにて示す。
評価試験においては１μｍのビーズを供給した後周波数が減少し（ａ_１）、その後５０ｎｍのビーズを供給することにより、周波数が大きく減少し（ａ_２）、上述した（１）式の効果が得られることが示された。一方、参照試験においては５０ｎｍのビーズを供給したところ周波数が減少したものの（ｂ_１）、その後１μｍのビーズを供給したところ、周波数が増加した（ｂ_２）。このことは大きな（１μｍ）ビーズを供給する前に小さな（５０ｎｍ）ビーズを供給しても、増感効果を得ることはできず、却って上述した水晶振動子と大きなビーズ（粒子）との結合共振が起きたものと推測される。従って本発明のビーズによる増感方法は水晶振動子とビーズの結合共振を有意に抑止し、所望の質量負荷効果による増感を実現することができるといえる。

１ 液供給系
２ センサーユニット
３ 配線基板
４ 水晶振動子
４０ ビオチン化抗体
４２ 共通電極
４５ 第１のビーズの群
４６ 吸着層
４７ 第２のビーズの群
４８ アビジン粒子
４９ 抗体
５ 流路形成部材
７１ 抗原

Claims (9)

1. 試料液中の感知対象物を圧電振動子の周波数の変化に基づいて感知する方法において、
   圧電振動子の一面側の電極表面に形成された、前記感知対象物を吸着する吸着層に対して試料液を供給する工程と、
   しかる後に前記感知対象物に対応する部位に吸着する性質を有する第１の粒子の群を含む第１の液を前記圧電振動子の一面側に供給する工程と、
   続いて前記第１の粒子よりも粒子径が小さくかつ前記感知対象物に対応する部位に吸着する性質を有する第２の粒子の群を含む第２の液を前記圧電振動子の一面側に供給して、前記第１の粒子と前記吸着層との間に第２の粒子を詰める工程と、
   前記圧電振動子を発振回路により発振させ、前記第１の粒子を前記圧電振動子の一面側に供給する前後における各発振周波数を測定する工程と、を含むことを特徴とする感知方法。
2. 前記試料液を供給する工程を行った後、第１の液を前記圧電振動子の一面側に供給する工程の前に、前記感知対象物に吸着される中間物質を含む第３の液を前記圧電振動子の一面側に供給する工程を行い、
   前記第１の粒子及び第２の粒子は、前記中間物質に吸着される性質を有することを特徴とする請求項１記載の感知方法。
3. 前記第１の粒子は、粒子本体を構成する基体と、基体の外周面に付着し、感知対象物に対応する部位に吸着する性質を有すると共に前記基体よりも粒径が小さい吸着用粒子の群と、を備えたことを特徴とする請求項１または２記載の感知方法。
4. 前記第１の粒子に備えられた吸着用粒子は、アビジン粒子であることを特徴とする請求項３記載の感知方法。
5. 前記第２の粒子は、粒子本体を構成する基体と、基体の外周面に付着し、感知対象物に対応する部位に吸着する性質を有すると共に前記基体よりも粒径が小さい吸着用粒子の群と、を備えたことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の感知方法。
6. 前記第２の粒子に備えられた吸着用粒子は、アビジン粒子であることを特徴とする請求項５記載の感知方法。
7. 前記試料液を供給する工程を行った後、第１の液を前記圧電振動子の一面側に供給する工程の前に、前記感知対象物に吸着される中間物質である、ビオチンが結合されたウシ血清アルブミンを含む第３の液を前記圧電振動子の一面側に供給する工程を行うことを特徴とする請求項４または６記載の感知方法。
8. 前記第１の粒子及び第２の粒子は、粒子本体を構成する基体と、基体の外周面に付着すると共に前記基体よりも粒径が小さい吸着用粒子と、当該吸着用粒子に付着した中間物質と、を備え、
   前記中間物質は、前記感知対象物に吸着される性質を有することを特徴とする請求項１記載の感知方法。
9. 前記第１の粒子及び第２の粒子に備えられた吸着用粒子は、アビジン粒子であり、かつ前記中間物質は、ビオチン化抗体であることを特徴とする請求項８記載の感知方法。

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