CN109400701B - 冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法，以正常人红细胞为原料直接制备低水平糖化血红蛋白质控品；再以正常人或糖尿病患者红细胞为原料，通过离子亲和层析法制备高浓度、高纯度的HbA1c，取一定量纯化的HbA1c添加到低水平质控品中，得到高水平糖化血红蛋白质控品；最后将低水平和高水平质控品按比例混合，调配得到中水平糖化血红蛋白质控品，然后分别加入一定量防腐剂和冻干保护剂，通过真空冷冻干燥即得到性质稳定的低、中、高冻干态糖化血红蛋白质控品。本发明方法简单，三水平梯度明显，涵盖正常值和医学决定水平处；低水平原料方便易获取，高水平原料采用离子交换层析法制得，纯度高；制备的高、中、低三个水平质控品性质稳定。
Description
技术领域
本发明涉及血红蛋白质控品，尤其是涉及一种冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法。
背景技术
糖化血红蛋白（GHb）是红细胞中的血红蛋白与葡萄糖通过缓慢、持续及不可逆地非酶促蛋白糖化反应的产物。糖化血红蛋白（GHb）由HbA1a、HbA1b、HbA1c组成，其中HbA1c约占70%，且结构稳定，因此被用作糖尿病控制的监测指标。HbAlc水平能够稳定可靠地反映出患者检测前120天内的平均血糖水平，且受抽血时间，是否空腹，是否使用胰岛素等因素干扰小。
目前对第三方糖化血红蛋白质控品（第三方质控品，指既不是仪器厂商的控制品，也不是试剂厂商的控制品，属于独立于任何检测系统产品厂商之外的质控品。该质控品不专为某特定方法或仪器设定或使其最佳化，其性能与试剂或试剂盒批号完全无关，可以对检测系统提供无偏倚的评估）的制备研究主要有国外伯乐、朗道厂家，国内糖化血红蛋白质控品大多需要有配套试剂或配套仪器方可进行糖化血红蛋白项目的质量控制。而糖化血红蛋白质控品常用的制备方法大致可归为以下四种：
1、采集混合新鲜健康人全血，灭活，加入叠氮钠防腐，分装，低温-70℃保存。连续5个月在奥林巴斯 AU5400 生化分析仪上分析质控品的HbA1c的结果及其标准差和CV，并进行稳定性评估。其缺点是该质控物只涉及单一正常水平，且对存贮条件要求苛刻。
2、采集非糖尿病患者的血液样本，进行离心处理、去浆，得到红细胞；向红细胞中加入红细胞保存液，制得红细胞样本。将红细胞样本缓慢加入到分层液，离心得到分层的红细胞，每一密度的细胞分离液中均分散有与其适配的红细胞。将分层的红细胞分装于不同的试管内，向每一试管内加入生理盐水，得到红细胞悬浮液，调节红细胞悬浮液的血红蛋白浓度，筛选出值为一系列的红细胞悬浮液，获得糖化血红蛋白质控品。该方法的缺点是制备的质控品HbA1c测定值在3.5%-5.3%之间，仅可满足正常水平糖化血红蛋白质控品的质量控制。
3、对血液样本进行离心处理，获得红细胞。利用细胞洗涤液对所述红细胞进行洗涤，形成红细胞悬液。在洗涤后的红细胞加入反应液进行糖基化，当糖基化过程中糖化血红蛋白的浓度达到所需的质控物浓度时，利用细胞洗涤液对糖基化处理后的红细胞悬液进行洗涤和去糖基化；在去糖基化的红细胞悬液中加入稳定剂、冻干保护剂，制成液体或冻干的糖化血红蛋白质控物。缺点是该方法制备的冻干态质控品仅涉及糖化血红蛋白HbA1c的测定结果在4%-6%和10%-12%，且操作方法较为复杂，无法对糖化血红蛋白HbA1c在7%-9%的样本进行质量控制。
4、将血红蛋白糖基化，透析除去血红蛋白溶液中葡萄糖，防止血红蛋白进一步糖基化，稀释至所需质控品浓度，冷冻干燥，最后将冻干粉复溶、分装。缺点是该方法制备的冻干态糖化血红蛋白质控品HbA1c测定值在5%-6%之间，仅可满足正常水平糖化血红蛋白质控品的质量控制。
综上，虽然制备糖化血红蛋白质控品的方法各有不同，但多为单水平（如第一、第二种方法）或两水平（低水平和高水平）质控品，且需要有配套试剂或配套仪器才可用于质量控制，不能满足客户的即时需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法，制备出的冻干态糖化血红蛋白质控品具有高、中、低三种水平，可满足不同客户的即时需求。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法，包括低水平冻干态糖化血红蛋白质控品、高水平冻干态糖化血红蛋白质控品和中水平冻干态糖化血红蛋白质控品的制备，其中
低水平冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法如下：
第一步，取正常人全血5ml，先采用2000-4000 rpm/min转速在离心机上离心5-20min，然后弃上清，得下层红细胞；
第二步，按体积比1:10加入磷酸盐缓冲液洗涤，并按照与第一步相同的转速离心，反复洗涤2-5次，弃上清，得下层洗涤后的红细胞；
第三步，下层红细胞按体积比10:1~1:10加入磷酸盐缓冲液进行保存，采用D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为5.3%，峰面积为206万µvolt•秒，得到低水平糖化血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到低水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃；
高水平冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法如下：
以正常人或糖尿病患者红细胞为原料，采用离子亲和层析法制备高浓度HbA1c（一般要求HbA1c纯度不低于70%），然后取一定量纯化的HbA1c添加到上述制备的低水平糖化血红蛋白质控品中，通过D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为14.8%，峰面积为296万µvolt•秒，得到高水平糖化血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到高水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃；
将上述制备的低水平糖化血红蛋白质控品和高水平糖化血红蛋白质控品按一定比例混合，采用D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为9.7%，峰面积为284万µvolt•秒，得到中水平糖化血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到中水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃。
本发明的优点在于以正常人红细胞为原料直接制备低水平糖化血红蛋白质控品；同时，以红细胞为原料采用离子亲和层析法制备高纯度、高浓度的HbA1c（一般要求HbA1c纯度不低于70%），然后取一定量纯化的HbA1c添加到低水平糖化血红蛋白质控品中，得到高水平糖化血红蛋白质控品；最后通过低水平和高水平按不同比例混合，调配得到中水平糖化血红蛋白质控品；方法简单，三水平梯度明显，可涵盖正常值和医学决定水平处；低水平原料方便易获取，高水平原料采用离子交换层析法制得，纯度高。制备的高、中、低三个水平质控品性质稳定，2-8℃存放可稳定保存2年，在4℃开瓶可稳定28天；37℃加速14天测定HbA1c相对偏差均在6%以内；反复冻融5次测定HbA1c相对偏差均在5%以内。
本发明制备的冻干态糖化血红蛋白质控品适用于各临床实验室、第三方体检中心、各省市临检中心等开展有糖化血红蛋白项目进行样本检测时的室内质量控制和室间质量评价。
附图说明
图1为本发明制备的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品高效液相色谱图。
图2为本发明制备的高水平冻干态糖化血红蛋白质控品高效液相色谱图。
图3为本发明制备的中水平冻干态糖化血红蛋白质控品高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以方便本领域技术人员的理解。
实施例1 制备低水平冻干态糖化血红蛋白质控品
具体包括下述步骤：
第一步，取正常人全血5ml，先采用2000-4000 rpm/min转速在离心机上离心20min，然后弃上清，得下层红细胞；
第二步，按体积比1:10（v/v）加入磷酸盐缓冲液洗涤，并采用相同的转速（2000-4000 rpm/min）离心10~15min，反复洗涤5次，弃上清，得下层洗涤后的红细胞；
第三步，下层红细胞按体积比10:1~1:10加入磷酸盐缓冲液进行保存，采用D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为5.3%，峰面积为206万µvolt•秒，得到低水平糖化血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到低水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃。低水平冻干态糖化血红蛋白质控品高效液相色谱图如图1所示。
实施例2 制备高水平冻干态糖化血红蛋白质控品
其制备方法为：以正常人红细胞为原料（红细胞处理可采用实施例1中第1步的方法），采用离子亲和层析法，制备高纯度、高浓度的HbA1c（一般要求HbA1c纯度不低于70%）；然后取一定量纯化的HbA1c添加到实施例1制备的低水平糖化血红蛋白质控品中，采用D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为14.8%，峰面积为296万µvolt•秒，即得到高水平糖化血红蛋白质控品；然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到高水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃。高水平冻干态糖化血红蛋白质控品的高效液相色谱图如图2所示。
实施例3 制备中水平冻干态糖化血红蛋白质控品
其制备方法为：取实施例1的低水平糖化血红蛋白质控品和实施例2的高水平糖化血红蛋白质控品，按低水平:高水平=1:2~1:3之比例进行混合，采用D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为9.7%，峰面积为284万µvolt•秒，即得到中水平血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到中水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃。中水平冻干态糖化血红蛋白质控品的高效液相色谱图如图3所示。
实施例4 本发明制备的质控品的性能测定
将实施例1~3制备的高、中、低水平的冻干态糖化血红蛋白质控品依次进行4℃开瓶稳定性、37℃加速稳定性及反复冻融考察，具体测定数据见下表：
结论：制备的高、中、低三个水平质控品性质稳定，2-8℃存放可稳定保存2年，在4℃开瓶可稳定28天；37℃加速14天测定HbA1c相对偏差均在6%以内；反复冻融5次测定HbA1c相对偏差均在5%以内。
Claims (1)
1.一种冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法，其特征在于：包括低水平冻干态糖化血红蛋白质控品、高水平冻干态糖化血红蛋白质控品和中水平冻干态糖化血红蛋白质控品的制备，其中
低水平冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法如下：
第一步，取正常人全血5ml，先采用2000-4000 rpm/min转速在离心机上离心5-20min，然后弃上清，得下层红细胞；
第二步，按体积比1:10加入磷酸盐缓冲液洗涤，并按照与第一步相同的转速离心，反复洗涤2-5次，弃上清，得下层洗涤后的红细胞；
第三步，下层红细胞按体积比10:1~1:10加入磷酸盐缓冲液进行保存，采用D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为5.3%，峰面积为206万µvolt•秒，得到低水平糖化血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到低水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃；
高水平冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法如下：
以正常人或糖尿病患者红细胞为原料，采用离子亲和层析法制备纯度大于70%的高浓度HbA1c，然后取一定量纯化的HbA1c添加到上述制备的低水平糖化血红蛋白质控品中，通过D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为14.8%，峰面积为296万µvolt•秒，得到高水平糖化血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到高水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃；
将上述制备的低水平糖化血红蛋白质控品和高水平糖化血红蛋白质控品按低水平:高水平=1:2~1:3之比例混合，采用D-10血红蛋白测试系统测定HbA1c结果为9.7%，峰面积为284万µvolt•秒，得到中水平糖化血红蛋白质控品，然后加入1‰庆大霉素和5%海藻糖，分装后采用真空冷冻干燥技术进行冻干，得到中水平冻干态糖化血红蛋白质控品，贮存于2-8℃。
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