CN103645326A - 检测脂蛋白相关磷脂酶a2的化学发光酶联免疫试剂盒及其制备方法 - Google Patents

检测脂蛋白相关磷脂酶a2的化学发光酶联免疫试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒及其制备方法。本发明所提供的检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，包括包被有抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的化学发光板，其特征在于：还包括样品处理液；所述样品处理液主要由A液和B液组成；所述A液含有7.5g/L氯化铵、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸钠；所述B液含有0.5M Tris-Hcl，PH7.6。为最大限度减低Lp-PLA2发光检测噪音，本发明的试剂盒中还包括独特的血液样品处理剂配方，有助于淬灭非特异性光源，大大增强检测光与本底杂光的差别，增加检测特异性。

Description

检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及化学发光酶联免疫技术检测领域，尤其涉及检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒及其制备方法。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）是磷酸脂酶A2超家族中的非钙离子依赖型磷酸脂酶，最初发现其可以降解血小板活化因子，曾被称为血小板活化因子乙酰水解酶。l995年首次被克隆，其编码基因(PLA2G7)，有12个外显子，染色体定位于6p21.2212，由441个氨基酸残基组成的一种丝氨酸脂酶，相对分子质量为50×103(50kDa)。Lp-PLA2以生物膜磷脂为天然底物优先作用于氧化磷脂sn22位上短脂酰链中的酯键，使水溶性强的磷脂产生游离脂肪酸和溶血磷脂参与磷脂的代谢。
循环中Lp-PLA2主要来源于血细胞，如单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞受炎症刺激时少量分泌，并受炎性介质的调节，如γ2干扰素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子促进其分泌。联合应用原位杂交和免疫组织化学技术研究发现，兔和人动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞可表达更高水平的Lp-PLA2mRNA和蛋白。人血浆中的Lp-PLA2与脂蛋白颗粒结合的形式存在，其中2/3与低密度脂蛋白(1ow density lipop rotein,LDL)结合，主要是小而密的LDL结合，其中带负电荷的LDL中的Lp-PLA2含量和活性更高，促进内皮细胞趋化因子释放，促进炎症反应。1/3与高密度脂蛋白(high density lipop rotein,HDL)和极低密度脂蛋白(very low density lipop rotein,VLDL)结合。Lp-PLA2与人类HDL结合少的原因，可能是由于人Lp-PLA2氨基端的高度糖基化阻碍了其与HDL的结合。
目前实验研究及流行病学研究结果揭示了Lp-PLA2生成多种促炎产物，参与从动脉粥样斑块形成到斑块不稳定的各个阶段，具有促进炎症反应作用，可能成为新的心脑事件独立预测因子。血浆Lp-PLA2测量是一个有价值的方法，可用来鉴别或预测具有心脑血管疾病高风险事件的个体。
目前为止，没有见到利用Lp-PLA2与心脑血管疾病之间的相关关系来制备检测人Lp-PLA2的水平的试剂盒的报道。
发明内容
本发明根据上述领域存在的空白和需求，提供了检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒及其制备方法。
本发明的一个目的是提供检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒。
本发明所提供的检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，包括包被有抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的化学发光板，还包括样品处理液；所述样品处理液主要由A液和B液组成；所述A液含有7.5g/L氯化铵、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸钠；所述B液含有0.5M Tris-Hcl，PH7.6。
所述试剂盒还包括样品稀释液；所述样品稀释液由如下方法制备得到：将100ml山羊血清、20ml重量百分比浓度为1%的硫柳汞、10ml0.1M铁氰化钾、0.5ml吐温-20、10ml10mg/ml的庆大霉素、以及余量为PH7.40.01M PBS缓冲液定容至1000ml，即得到所述样品稀释液。
所述试剂盒还包括浓缩洗涤液；所述浓缩洗涤液由如下方法制备得到：将2.96gNaH2PO4·2H2O、29g Na2HPO4·12H2O、234g NaCl和20ml吐温-20，加双蒸水定容至1000ml，即得到浓缩洗涤液。
所述试剂盒还包括化学发光底物液；所述化学发光底物液由化学发光底物液R1和化学发光底物液R2组成；所述化学发光底物液R1为3.0mmol/L鲁米诺与0.3mmol/L对碘苯酚的混合液；化学发光底物液R2为7.5mmol/L的双氧水。
所述试剂盒还包括标准品溶液；所述标准品溶液为6个浓度梯度的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原，所述浓度依次为：0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。
所述试剂盒还包括高值对照液和低值对照液；所述高值对照液或低值对照液由向胎牛血清中添加重组脂蛋白相关磷脂酶A2制备得到；所述高值对照的终浓度为700ng/ml；所述低值对照的终浓度为300ng/ml。
本发明的另一个目的是提供所述检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒的制备方法。
本发明所提供的所述检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备抗体包被液：0.36g NaH2PO4·H2O，3.10g Na2HPO4·2H2O，定容至1L，pH7.6；
（2）包被；
（3）封闭；
其特征在于：还包括制备样品处理液的步骤：将7.5g氯化铵、1.2g酪蛋白和1.2g硬脂酸钠，加入纯化水定容1L，即得到A液；PH7.6、0.5M Tris-HCl溶液为B液；将所述A液和B液分别独立包装，即得到所述样品处理液。
所述包被的条件为2-8℃、18-24小时。
所述封闭的条件为4℃封闭12小时。
所述封闭采用的封闭液由如下方法制备得到：向PH值为7.0-7.5、浓度为10mM的Tris缓冲液中加入质量百分比终浓度2%的苏氨酸、质量百分比终浓度1%的蔗糖、质量百分比终浓度0.5%的β-巯基乙醇。
本发明采用抗Lp-PLA2单克隆抗体包被空白化学发光板，得到检测Lp-PLA2的化学发光酶联免疫试剂盒的核心部件化学发光板。使用时，可按照常规化学发光酶联免疫检测的方法配置其它所需试剂与所述化学发光板配合使用。本发明优选提供试剂盒盒内还放置有其它盛装着化学发光酶链免疫反应所需试剂的部分或全部试剂瓶的试剂盒方案，便于检测反应。该试剂盒可用于鉴别或预测具有心脑血管疾病高风险事件的个体。从实施例可以看出，本发明试剂盒对于Lp-PLA2的最低检测限可低至0.1ng/mL。
为最大限度减低Lp-PLA2发光检测噪音，本发明的试剂盒中还包括独特的血液样品处理剂配方，有助于淬灭非特异性光源，大大增强检测光与本底杂光的差别，增加检测特异性。
具体实施方式
本发明的检测脂蛋白相关磷脂酶A2化学发光酶联免疫试剂盒包括：
化学发光板（包被有抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的96微孔或48微孔的化学发光板）、样品处理液（A液+B液）、其它盛装着化学发光酶链免疫反应所需试剂的试剂瓶——（抗Lp-PLA2酶结合物、标准品6瓶、Lp-PLA2高值对照、Lp-PLA2低值对照、样品稀释液、化学发光底物液R1、化学发光底物液R2、洗涤液(20x浓缩)各1瓶）、说明书一份，不干胶纸片2张。
抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体（Lp-PLA2单克隆抗体）购自天津胜发生物技术有限公司。
实施例1、检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒制备及其检测方法
一、制备检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒
1、样本处理液的配制
样品处理液配方：由A液和B液组成，其中A液为7.5g氯化铵，1.2g酪蛋白，1.2g硬脂酸钠，加入纯化水定容1L，即A液中含有7.5g/L氯化铵、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸钠；B液为0.5M Tris-HCl溶液(PH7.6)。
2、包被抗Lp-PLA2单克隆抗体为化学发光反应板
以下抗体包被液的配方为：
0.36g NaH2PO4·H2O，3.10g Na2HPO4·2H2O，定容至1L，pH7.6。
酶标板选乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板（英国Porvair，96孔板）。
抗体检测板的最佳制备条件为，使用包被单克隆抗体以最佳包被抗体浓度进行包被，用50mM pH值为7.6的磷酸盐缓冲液配制成包被浓度为2μg/ml的Lp-PLA2单抗包被液，并将包被液负载于微孔板（100μl/孔），2-8℃包被18-24小时。
加入封闭液，300μl/孔，4℃封闭12小时，随后弃去封闭液拍干，室温干燥4小时。干燥后的化学发光板，迅速真空封口包装，将封装好的板存于2-8℃。所述封闭采用的封闭液配方为：pH值为7.0-7.5，浓度为10mM的Tris缓冲液中加入质量百分比终浓度2%的苏氨酸、质量百分比终浓度1%的蔗糖、质量百分比终浓度0.5%的β-巯基乙醇。
3、标准品的制备：将重组全长Lp-PLA2抗原(美国abnova公司)用蛋白稳定剂(北京科跃中楷生物技术有限公司)稀释成6个梯度浓度，分别是：0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。
4、样品稀释液、浓缩洗涤液的配制：
A、样品稀释液
山羊血清100ml（Biotopped，100ml/瓶）
1%(重量比)硫柳汞20ml（EYSIN，1kg）
0.1M铁氰化钾10ml（acros,100g/瓶）
吐温-200.5ml（amres,500ml/瓶）
10mg/ml庆大霉素10ml（sigma,500mg/瓶）
加0.01M PBS(PH7.4)定容至1000ml，过滤除菌，4℃保存。
B、洗涤液(20倍浓缩)
NaH2PO4·2H2O2.96g（北京化学试剂公司，500g/瓶）
Na2HPO4·12H2O29g（北京化学试剂公司，500g/瓶）
NaCl234g（北京化学试剂公司，500g/瓶）
吐温-2020ml（amres，500ml/瓶）
加双蒸水定容至1000ml，过滤除菌，4℃保存。
5、化学发光底物的制备
化学发光体系由发光剂(鲁米诺，sigma)、增强剂(对碘苯酚，duly)及双氧水（上海实验试剂有限公司）构成。化学发光底物液由化学发光底物液R1和化学发光底物液R2组成。
化学发光底物液R1为3.0mmol/L鲁米诺与0.3mmol/L对碘苯酚的混合液，化学发光底物液R2为7.5mmol/L的双氧水。
6、高值对照和低值对照的制备
胎牛血清（gibco，500ml/瓶）中添加一定量的重组Lp-PLA2抗原蛋白(美国abnova公司)，高值对照的终浓度为700ng/ml，低值对照的终浓度为300ng/ml，过滤除菌。
二、试剂盒的应用及测操作程序
(1)平衡：从冷藏环境中取出试剂及样品，置于室温(18-25℃)平衡约30分钟。
(2)样品处理：将样品处理液中的A液和B液混合，然后取充分混匀的待检全血样本25μl加入200μl样品处理液中，震荡混匀。
(3)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水作20倍稀释成工作浓度洗涤液，如产生结晶，应待其于室温溶解后再稀释。
(4)加样：取96孔化学发光酶标板，预设置空白、低值对照、高值对照各3孔。每孔中先加入50μl样品稀释液(空白对照每孔加入100μl样品稀释液)；然后低、高值对照孔加入50μl低、高值对照，其余孔按设定各加入50μl待测样品；加样完毕后用不干胶封片封盖反应板，37℃振荡孵育60分钟。
(5)洗板：甩去板孔中的液体，在吸水纸上拍干；用工作浓度洗涤液洗板6次，最后拍干。
(6)加酶结合物：每孔加入100μl酶结合物(辣根过氧化酶标记的羊抗人Lp-PLA2抗体)，用不干胶封片封盖反应板，37℃孵育30分钟。
(7)洗板：同(5)。
(8)加底物：每孔先后加入化学发光底物液R1、化学发光底物液R2各50μl，避光显色至少2分钟。
(9)测定：加发光底物液后2～30分钟在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)。用所获得的每个浓度的标准品溶液的发光强度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的发光强度值(B0)再乘以100%，即百分发光值。计算公式为：百分发光值(%)=(B/B0)×100%。
(10)以Lp-PLA2标准品溶液的浓度(ng/mL)的半对数值为x轴，百分发光值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分发光值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中Lp-PLA2的含量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析。
实施例2、含有样品处理液的试剂盒与不含有样品处理液的试剂盒比较
实验组：样品经本发明样品处理液处理
对照组：样品未经处理。
以上述实验组和对照组进行对比试验。对正常对照样本100例，患心脑血管疾病样本100例采用实验组和对照组进行平行检测，检测方法参见上述实施例1，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。检测结果如表1、表2和表3所示：
表1对照组试剂盒测定结果
组别 例数 + - 阳性率（%）
正常对照组 358 23 335 6.42%
患病样本组 254 64 190 25.20%
表2实验组试剂盒测定结果
组别 例数 + - 阳性率（%）
正常对照组 358 25 333 6.98%
患病样本组 254 69 185 27.17%
表3实验组和对照组试剂盒测定结果比较
表1-3所述数据表明，本发明试剂盒与对照组试剂盒的阳性符合率为90.4%，阴性符合率为99.6%，两种检验方法的符合率为98.2%。经验证，对照试剂盒检出2份假阳性、9份假阴性，而本发明试剂盒检测结果与临床结果完全相符。
实施例3、试剂盒灵敏度和准确度试验
一、试剂盒灵敏度实验
1、对零标准溶液进行20次检测，测定结果的平均值加上3倍标准差作为试剂盒的最低检测限。
表4零标准测定结果统计表ng/mL
样品号 1 2 3 4 5 6 7 8
测定值 0.06 0.07 0.08 0.06 0.07 0.05 0.06 0.05
样品号 9 10 11 12 13 14 15 16
测定值 0.04 0.05 0.08 0.08 0.06 0.06 0.06 0.07
样品号 17 18 19 20 平均值 标准差 最低检测限
测定值 0.06 0.07 0.04 0.06 0.06 0.01 0.1
由表4可知，试剂盒的最低检测限为0.1ng/mL。
二、标准品精密度试验：
制作三批试剂盒，每批抽取10个试剂盒，测定250ng/mL标准品溶液的发光强度值，计算变异系数。
实验设3次重复，结果如表5所示，表明变异系数范围在5.2%-15.1%之间，符合精密度小于或等于20%的要求。
表5标准可重复性试验(CV%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
01批 11.6 13.2 8.9 5.2 12.7 14.8 10.8 9..5 6.6 7.8
02批 6.9 10.4 11.7 5.8 7.7 11.3 12.5 15.1 5.9 10.3
03批 12.2 10.3 9.6 8.7 11.5 7.9 10.7 11.2 6.4 9.6
三、样本精密度和准确度试验
1、样品精密度试验
从三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取3个试剂盒，用低值对照进行实验，每个实验重复5次，分别计算变异系数，结果表明变异系数均小于20%。
2、样本准确度试验
用实施例1中所述的试剂盒检测高、低值对照，每个做4个平行，分别计算准确度(准确度=实测值/添加值)。回收率均在90%-110%之间。

Claims (10)

1.一种检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，包括包被有抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的化学发光板，其特征在于：还包括样品处理液；所述样品处理液主要由A液和B液组成；所述A液含有7.5g/L氯化铵、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸钠；所述B液含有0.5M Tris-Hcl，PH7.6。
2.根据权利要求1所述的检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液；所述样品稀释液由如下方法制备得到：将100ml山羊血清、20ml重量百分比浓度为1%的硫柳汞、10ml0.1M铁氰化钾、0.5ml吐温-20、10ml10mg/ml的庆大霉素、以及余量为PH7.40.01M PBS缓冲液定容至1000ml，即得到所述样品稀释液。
3.根据权利要求2所述的检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括浓缩洗涤液；所述浓缩洗涤液由如下方法制备得到：将2.96gNaH2PO4·2H2O、29g Na2HPO4·12H2O、234g NaCl和20ml吐温-20，加双蒸水定容至1000ml，即得到浓缩洗涤液。
4.根据权利要求3所述的检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括化学发光底物液；所述化学发光底物液由化学发光底物液R1和化学发光底物液R2组成；所述化学发光底物液R1为3.0mmol/L鲁米诺与0.3mmol/L对碘苯酚的混合液；化学发光底物液R2为7.5mmol/L的双氧水。
5.根据权利要求4所述的检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品溶液；所述标准品溶液为6个浓度梯度的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原，所述浓度依次为：0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。
6.根据权利要求5所述的检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括高值对照液和低值对照液；所述高值对照液或低值对照液由向胎牛血清中添加重组脂蛋白相关磷脂酶A2制备得到；所述高值对照的终浓度为700ng/ml；所述低值对照的终浓度为300ng/ml。
7.权利要求1-6中任一所述检测脂蛋白相关磷脂酶A2的化学发光酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备抗体包被液：0.36g NaH2PO4·H2O，3.10g Na2HPO4·2H2O，定容至1L，pH7.6；
（2）包被；
（3）封闭；
其特征在于：还包括制备样品处理液的步骤：将7.5g氯化铵、1.2g酪蛋白和1.2g硬脂酸钠，加入纯化水定容1L，即得到A液；PH7.6、0.5M Tris-HCl溶液为B液；将所述A液和B液分别独立包装，即得到所述样品处理液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述包被的条件为2-8℃、18-24小时。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述封闭的条件为4℃封闭12小时。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述封闭采用的封闭液由如下方法制备得到：向PH值为7.0-7.5、浓度为10mM的Tris缓冲液中加入质量百分比终浓度2%的苏氨酸、质量百分比终浓度1%的蔗糖、质量百分比终浓度0.5%的β-巯基乙醇。
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