CN1147855A - 测定被分析物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及改善的,测定体液样品中被分析物的方法。在该方法中,将样品与能够与被分析物形成特异性结合复合物的特异性结合试剂相接触,其中,将特异性结合试剂固定在多孔固体底物上。然后测定特异性结合复合物的含量。本发明方法附加步骤为在开始测定前,擦拭底物表面以便除掉未吸附的污染物,用着色剂可使未吸附的污染物在底物表面上显色,结果很容易知道什么时候已除掉污染物。
Description
本发明涉及改善的、在固体底物上测定被分析物的方法。尤其,本发明方法适用于体液样品,如唾液、血清、全血和尿样。
通过免疫测定法测定各种体液中的物质的方法是公知的并且经常用于各种不同的目的。实例包括测定血、唾液、尿或其它体液样品中的抗体以此作为病原体存在的指征,并由此诊断各种疾病。其它体液测定包括妊娠试验和为确定血中乙醇量的检验。
尽管可通过测定大量液体来进行这些检验,但通过将样品点在固定有用于被分析物的特异性结合试剂的固体底物上,然后测定特异性结合复合物的含量来进行上述检验通常更容易、更方便。这些检验是很普及的,因为它们相对干净并且操作简单。
然而,在固体底物上进行检验有某些不利之处。首先,在固体底物上进行的很多测定中,有不尽人意数量的假阳性结果,即使样品中没有被分析物,假阳性结果也显示含有被分析物。
第二个问题与使用多孔固体底物有关。理论上,这种底物是特别适用的,因为它能使大量样品从底物表面除掉,同时被分析物由于与固定在底物上的特异性结合分子结合而保留在其表面上。然而实际上有许多困难,因为样品通过底物的流动一般是很慢的,使得有时测定要花费20-30分钟的时间。这对于要求很快知道结果的检验尤其不利,例如,在会诊期间,可由普通医生通过其它方法进行检验的情形中。
上面讨论的不利因素归因于在很多样品中存在不需要的颗粒物质,包括细胞碎片,大的蛋白质,粘多糖和其它大分子。已尝试,通过在试图测定特异性结合复合物之前过滤样品来克服由样品中这些不需要物质产生的问题。
然而,令人意外的是,这样做并非特别有效,并且仍然可得到不尽人意数量的假阳性结果,样品通过底物流动的时间仍然很长,甚至在将样品加入底物之前过滤两次样品也是这样。因此似乎粘蛋白和颗粒物质的存在并非引起假阳性结果和样品流动时间长的全部原因。
然而,为解决假阳性结果和样品流动慢的问题而进行了很多尝试后,本发明人发现,当这种测定涉及在被分析物和固定在多孔固体底物上的特异性结合分子之间的特异性结合复合物的测定时,通过在将样品加到底物上之后擦拭底物表面,可简便而明显地改善检验的可靠性。这是绝对没有料到的,因为曾经认为,通过前面曾尝试过的过滤步骤已除掉了所有的污染物,然而,现在看来似乎并非如此。
因此,本发明提供了一种用于测定体液样品中被分析物的存在的方法,该方法包括使样品与能够与被分析物形成特异性结合复合物的特异性结合试剂相接触,其中,特异性结合试剂被固定在多孔固体底物上;并测定特异结合复合物的含量;其特点是,在测定特异性结合复合物之前,擦拭底物表面以便除掉未吸附的污染物。
在试图测定特异性结合复合物之前擦拭底物这一简单步骤对于测定的成功具有显著的作用。样品从底物上流动所花费的时间,从20-30分钟减小到1-2分钟并且几乎完全消除了假阳性结果,同时仍保留测定对真正阳性结果的灵敏性。
可通过手工的方法进行擦拭,或者,该过程也可以是自动化的。通常,使用能吸收的物质来擦拭底物,适宜物质的实例包括棉花、棉绒和能吸收的纸。
擦拭步骤应充分进行,以便从底物表面除掉未与特异性结合分子结合的任何物质。为了让医生清楚所有不需要的物质都已除掉,可将着色剂加入样品中。如果在将样品转称到底物之前,将缓冲剂或表面活性剂溶液加到样品中,那么可将着色剂包含在缓冲剂或表面活性剂溶液中,但并非必需这样。
着色剂可以是象染料这样的试剂,它对于粘蛋白、细胞碎片组分或保留在底物上、体液测定时引起很多假阳性问题的其它污染物是特异性的。然而,提供一种已染色的颗粒物质如胶乳、琼脂糖、聚苯乙烯或者不与污染物结合并由于颗粒太大不能通过多孔底物而简单地留在底物表面上的其它聚合物作为着色剂,这通常是更简单的。当然,颗粒应大于底物的孔径,但也必须小于可使用的任何预滤器的孔径。已发现,在很多情况下,使用直径大约为3μm的颗粒是适宜的,因为正如下文中要更详细地讨论的那样,在任何最初的纯化步骤中,可选择孔径大于该值的滤器。染色颗粒与粘蛋白、当较小的颗粒通过底物时可能引起假阳性问题的颗粒杂质一起留在底物表面。
因此,当使用着色剂时,对于医生来说,从底物表面擦净着色剂并因此确信所有的表面碎片都已从底物上除掉是件简单的事情。
样品可包含任何体液,例如,唾液、全血、血清或尿,但对于唾液和全血而言,改善最大。因为总的看来,它们可能含有较大量的细胞碎片、高分子量的蛋白质、粘多糖和其它不能通过多孔底物孔隙的高分子量物质。
被分析物可以是任何能够与特异性结合试剂反应、形成特异性结合复合物的特异性结合分子。特异性结合复合物的实例包括抗体-抗原复合物,因此,被分析物可以是抗体或抗原。
如果被分析物是抗体,那么它可以是任何同型抗体并且可以是抗任何病原体的抗体。唾液或全血样品的分析尤其适用于由病原体如幽门螺杆菌(Helicobacter pytori)(以前称Campylobacter pylori)引起的肠感染的诊断。通过唾液或在全血中IgG的存在表明存在幽门螺杆菌感染,因此,如果试验的目的是检测幽门螺杆菌感染,那么,被分析物可以是对幽门螺杆菌抗原具有特异性的IgG。
最广义地使用“抗原”这一术语,它包括病原体细胞或病原体的同种,近种或异种提取物,所有这些都能与体液样品中的特异性抗体结合。
当特异性结合试剂为抗原时,它可以是蛋白质,多糖或脂质或其混合物。优选且为抗原的特异性结合试剂包括蛋白质、脂多糖或通过例如声处理、加压分解、洗涤提取或分级分离制备的病原体细胞提取物。
当使用本发明方法来检测幽门螺杆菌感染时,特异性结合试剂可以是由幽门螺杆菌衍生的抗原。在WO-A-9322682中公开了由幽门螺杆菌衍生的、适于用作本发明方法中的特异性结合试剂的抗原。然而,任何由幽门螺杆菌衍生的抗原都可用作特异性结合试剂。
如上所述,底物是多孔的,以便于大部分样品流过它,同时,被分析样品保留在表面上,被分析物在此处与特异性结合试剂特异性结合。底物可由硝化纤维素或其它物质,例如聚合物象纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯构成,但本发明不限于这些物质。
然而,优选地,底物为硝化纤维素膜并且孔径大约为0.5-8μm,优选大约1-2μm。
尤其优选,用可吸收的芯给物质裱背固体支撑物。通常,由于成本的原因,可吸收的纸往往是选择的物质,但任何可吸收的物质都可用于该目的。
本发明所使用的特异性结合分子可以通过共价键或非共价键(“被动地”)结合到固体表面上。适宜的结合方法是本领域公知的并且通常由交联、共价键结合或通过物理方法将抗原吸附到固体支撑物表面。
按照本发明方法,通过测定在被分析物和特异性结合试剂之间形成的复合物,判断被分析物的存在。因此,某些类型的测定工具是确定特异性结合复合物存在(或者,如果需要,确定存在量)所必需的。
测定工具可以是与报道分子结合并且能够与特异性结合复合物特异性结合的抗体。
如果要测定抗体,那么测定工具可包含对被分析抗体的所有同型抗体具特异性的被标记的第二种抗体。在人类幽门螺杆菌检验中,被分析抗体常常为IgG同型抗体并且此时,第二种抗体可以为抗人IgG。
从化学性质来说,“报道分子”是具有分析、鉴定特性或提供能测定抗原-抗体结合的分析鉴定信号的分子或基团。测定可以是定性的或定量的。在该种测定中所使用的报道分子可以是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)。在酶免疫测定中,通常通过戊二醛或高碘酸盐,将酶连接到第二抗体上。然而很容易发现,存在各种不同的连接技术,对于本领域技术人员来说,这些技术都是容易获得的。通常所使用的酶包括辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。通常选择与特殊酶一起使用的发色团,当由相应的酶水解时,产生可测定的颜色变化。根据所选择的用途,发色团可以是可溶的或不溶的。例如,5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑适用于与碱性磷酸酶共轭物一起使用;对于过氧化物酶共轭物来说,通常使用1,2-苯二胺-5-氨基水杨酸、3,3,5,5-四甲基联苯胺,联甲苯胺或邻联茴香胺。使用荧光团也是容易的,它产生荧光产物,而不是上述发色团。荧光团的实例为荧光黄和若丹明。当通过用特定波长的光照射来激发时,由荧光染料标记的抗体吸收光能,使分子处于激发状态,然后以通常可用光学显微镜目测的特定颜色发射光。
然而,本发明尤其适合用作急诊检查,通过该检查,在几分钟内便可获得结果,并且在会诊期间由普通医生即可进行。由于该原因,特别优选的测定方法是尽可能简单并且不需要特殊设备的方法。因此,本发明优选的报道分子为着色剂如胶态金或炭,聚苯乙烯或胶乳颗粒。
当使用该种报道物质时,除去未结合的第二种抗体是重要的,这样可使得结合的第二种抗体与附着的着色剂清晰可见。因此,它尤其适用于由本发明中使用的可吸收垫裱背的多孔膜,因为任何多余的第二种抗体都将通过膜并吸收在垫中,在硝化纤维素膜的表面上只留下结合的第二种抗体和相关的着色剂。
如上所述,尽管尚未完全解决样品流动慢和假阳性结果的问题,但是本发明方法中包括一或多个最初过滤步骤通常是有利的。
典型地,本发明方法中所使用的滤器有效孔径大约为1-15μm,优选3-8μm。使用任何种类的滤器都可以达到这个要求,但优选的种类为由塑料物质制成并且实际孔径大约为5-10μm的釉料(frit)滤器。在该种釉料滤器中,有效孔径小于实际孔径,因为釉料滤器比较深并且孔不成一直线。
在过滤步骤之前可包括的另一步骤是初级分离步骤,在该步骤中,将样品通过粗滤器,如棉花或棉绒垫。该步骤对降低唾液样品的粘度特别有用,可能因为它除掉唾液样品中存在的大部分粘多糖,但该步骤同样也有助于其它种类体液的测定。
有助于消除假阳性结果的进一步改进方法是在底物上提供一种能够与测定试剂反应的对照剂。该对照剂将存在于与特定结合分子不同的位置并且将能够特异性地与测定试剂结合。因此,例如,如果测定试剂为抗人IgG,那么对照剂为人IgG。对照剂的存在是监测本发明方法可行性的手段,因为如果未测定到该对照剂,那么该测定方法显然未能正常运作。
在将样品加到底物中之前,通常优选用含缓冲剂和/或表面活性剂的溶液来处理它。就全血样品而言,可使用赖氨酸缓冲剂。通常,缓冲剂pH大约为6.8-7.8,并且优选大约为7.2。通常缓冲剂中将会有表面活性剂如非离子型聚氧乙烯醚,销售商标为TRITONX-100(UnionCarbide Chemicals and Plastics CO,Inc),其体积含量可以为0.05-1%并且优选大约为0.1%。
联合使用擦拭步骤和缓冲剂可使全血样品的流动时间从20-30分钟减小到120-180秒。
优选地,当体液为唾液时,用含有棕榈酸和/或硬脂酸聚氧乙烯山梨糖醇衍生物并缓冲至pH大约为6.8-7.8、优选大约为7.4的溶液来处理。
可得到适宜的表面活性剂,商标为TWEEN40,TWEEN60,TWEEN61,TWEEN65和TWEEN80。
尤其优选的是表面活性剂中含40%-65%的硬脂酸,含大约55%硬脂酸衍生物而其余为棕榈酸衍生物的TWEEN60是尤其优选的,它比其它表面活性剂提供明显更可信的结果。
最好选择表面活性剂的含量以使样品以最快的速度流过底物。通常,当表面活性剂的体积含量为0.1%-1%,典型地为0.5%时,流速是最大的。表面活性剂的这一含量对于消除非特异性结合并不特别影响特异性结合提供最佳结果,因此,利用本发明方法可获得最佳测定阈。
为了使检验样品中的粘蛋白以及颗粒物质与检验试剂的非特异性结合达到最小,溶液中可以含有其它试剂。该试剂包括无机盐如氯化钠和蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)。
所含氯化钠的浓度大约为0.1-0.2M。特别优选浓度的上限不超过0.2M,因为超过该值就容易阻碍特异性结合。典型地,溶液中所含氯化钠的浓度大约为0.125M。
如果含有BSA,那么其重量含量通常大约为0.05%-0.5%,优选0.1%。
对处理血样和唾液样品来说,特别优选磷酸盐缓冲剂。而其它用来确保溶液的pH值在优选范围内的缓冲剂的实例是本领域技术人员熟知的。
尽管钠盐通常提供最佳结果,但可使用任何水溶性盐如钠,钾或铵盐来制备缓冲溶液。已发现,用0.001-0.05M,优选大约0.02M的磷酸钠溶液可获得有效的缓冲。
如上面简述过的,用来使要从底物表面擦拭掉的污染物可见的着色剂可包含在缓冲剂或表面活性剂溶液中。当它包含在缓冲剂或表面活性剂溶液中时,颗粒着色剂的重量含量大约为0.005%-0.05%,优选大约为0.01%-0.02%。然而,如果使用染料,其浓度可比该值略高。
包含着色剂的缓冲剂和/或表面活性剂溶液是新的并且其本身构成本发明的一部分。
因此,本发明的第二个目的是提供一种用来处理待测定体液样品并包含表面活性剂和着色剂的缓冲溶液。
如上讨论,对于某些污染物,着色剂可以是特异性的,它需要被除去,但最好含有着色的颗粒物质如胶乳、琼脂糖、聚苯乙烯或其它聚合物。当然,颗粒应大于底物的孔径,但必须小于可使用的任何预滤器的孔径。已发现,在很多情况下,使用直径大约为3μm的颗粒是适宜的。
缓冲溶液可包含在用于实现本发明方法的试剂盒中,该试剂盒本身构成本发明的另一目的。
在本发明这一目的中,提供一试剂盒,它含有:
i.含有表面活性剂和着色剂的缓冲溶液;
ii.固定在多孔底物上并且能与被分析物形成特异性结合复合物的特异性结合试剂;和
iii.用于测定特异性结合复合物含量的测定试剂。
本发明尤其适用于测定抗幽门螺杆菌的抗体,该抗体可存在于幽门螺杆菌感染病人的唾液中。如上讨论,幽门螺杆菌的异乎寻常之处在于,该感染引发唾液中IgG同型抗体。
因此,本发明的第四个目的是提供用于测定对幽门螺杆菌具特异性的IgG的试剂盒,该试剂盒包含:
i.含有表面活性剂和着色剂的溶液;
ii.由固定在多孔底物上的幽门螺杆菌衍生的抗原;和
iii.能够特异性地与人IgG结合的被标记抗体的溶液。
当试剂盒用于全血或唾液样品的测定时,优选的溶液组分为本发明第一目的的方法中所描述的组分。优选的底物和测定试剂也如本发明第一目的中所述。
试剂盒中也可以包含适合于待测体液的采集器械。也可以包含用于样品初级过滤的粗滤器如棉花或棉绒垫并且它们可选择性地构成唾液采集器械的一部分。而且,试剂盒可包含用于除掉样品中颗粒物质的滤器。正如与第一目的的方法有关的论述所讨论的那样,滤器的有效孔径大约为1-15μm,优选3-8μm。使用任何种类的滤器都可达到该要求,但优选由塑料材料制成的釉料滤器并且其典型的实际孔径大约为5-10μm。
现参考下列实施例,详细描述本发明。实施例1制备供唾液样品使用的缓冲的表面活性剂溶液
通过在室温下将下列组分混合来制备缓冲的表面活性剂溶液:
0.02M磷酸钠溶液 100ml
氯化钠 0.73g
牛血清白蛋白 0.1g
TWEEN60TM 0.5g
深蓝色胶乳颗粒(3.0μm直径) 0.1g深蓝色胶乳颗粒购自Polymer Laboratories,UK.实施例2制备由幽门螺杆菌衍生的抗原
按照WO-A-9322682实施例1中阐述的方法制备由幽门螺杆菌衍生的抗原。简而言之,制备幽门螺杆菌的粗品超声处理物并分级分离。除掉440kDa的蛋白质,剩下含265和340kDa蛋白质的混合物。实施例3制备检验装置
将1-5μl 0.05%(w/w)的实施例2抗原溶液点在底物上构成检验区。该底物为支撑在作为芯给材料的Schleicher&Schuell层析纸NO3469(购自Anderman&Co,KinstonuponThames,UK)裱背层上的1.2μmSARTORIUSTM硝化纤维素膜。
将1-5μl 0.005%(w/w)纯化正常人IgG(Sigma ChemicalCompany Ltd,Poole,Dorset,UK)点到底物上不同于检验区的对照区中。实施例4制备公开试剂
在含有0.05%(体积)商标名为TWEEN20的表面活性剂和0.1%(重量)BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,将与山羊抗人IgG(重链和轻链)结合的胶态金(Biocell ResearchLaboratories,Cardiff,UK)稀释到在520nm处光程长度为1cm时0.5个光密度单位,由此制备公开试剂。实施例5测定唾液样品
用商标名为OMNISAL(Saliva Diagnostic System,Vancouver,Washington,USA)的采集器械来采集唾液(1ml),其中,在也发挥粗滤器作用的垫中采集样品。然后,将含有样品的采集器械转移到含1.0ml实施例1溶液的试管中。用排除大约5m颗粒的Porex Ultrafine血清分离器,将采集到的唾液过滤,然后加到实施例3中制备的检验装置上。
稀释的唾液样品流过硝化纤维素膜而进入层析纸裱背层后,在底物表面形成蓝色胶乳颗粒层。通过用棉绒彻底但轻轻地擦拭直至蓝色消失来除掉该层。
然后,将0.5ml实施例4的公开试剂加到检验装置中。通过硝化纤维素膜将公开试剂排出,然后记录检验结果。
仅在对照区产生一个粉色点表明是可行的但为阴性检验结果,而在检验区和对照区都产生点的检验表明为阳性结果。
该检验可测定象0.8单位(在0-10级)这样低的抗幽门螺杆菌IgG的量并且不产生假阳性结果。实施例6制备供血液样品使用的缓冲的表面活性剂溶液
通过在室温下混合下列组分来制备缓冲的表面活性剂溶液:0.02M磷酸钠溶液 100mlTRITONX-100 0.1ml深蓝色胶乳颗粒(3.0μm直径) 0.1g
深蓝色胶乳颗粒购自Polymer Laboratories,UK。实施例7测定血样
除了用UNISTIK2TM采集器械和VOLAC TM肝素化玻璃试管采集血样外,按照实施例5中的方法进行测定。用实施例6的溶液而不是实施例1的溶液来处理血样。
同样,仅在对照区产生一个粉色点表明是可行的但为阴性的检验结果,而在检验区和对照区都产生一个点的检验表明阳性结果。
该检验可测定象0.8单位(在0-10级)这样低的抗幽门螺杆菌IgG的量。
Claims (30)
1.测定体液样品中被分析物的存在的方法,该方法包括将样品与能够与被分析物形成特异性结合复合物的特异性结合试剂相接触,其中将特异性结合试剂固定在多孔固体底物上;测定特异性结合复合物的含量;其特点是在测定特异性结合复合物之前,擦拭底物表面以除掉未吸附的污染物。
2.权利要求1的方法,其中擦拭步骤手工进行。
3.权利要求1的方法,其中擦拭步骤自动化进行。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中在擦拭步骤前,把将会保留在底物表面上的着色剂加到样品中。
5.权利要求4的方法,其中着色剂包含直径小于过滤步骤中所使用的任何滤器的孔径但大于底物的孔径的着色颗粒。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中,体液包括唾液,全血,血清或尿。
7.权利要求1-6中任一项的方法,其中,被分析物为抗体。
8.权利要求7的方法,其中,被分析物为对幽门螺杆菌抗原具特异性的抗体。
9.权利要求8的方法,其中,抗体为IgG同型抗体。
10.权利要求1-9中任一项的方法,其中,特异性结合分子为抗原。
11.权利要求10的方法,其中,抗原是由幽门螺杆菌衍生的。
12.权利要求1-11中任一项的方法,其中,底物是由硝化纤维素,纤维素,聚丙烯酰胺,尼龙,聚苯乙烯,聚氯乙烯或聚丙烯形成的。
13.权利要求1-12中任一项的方法,其中,底物孔径大约为0.5-8μm,优选大约为1-2μm。
14.权利要求1-13中任一项的方法,其中,由可吸收的芯给材料来裱背固体支撑物。
15.权利要求1-14中任一项的方法,其中,用与报道分子结合并且能够与特异性结合复合物特异性结合的抗体来测定特异性结合复合物。
16.权利要求15的方法,其中,被分析物为幽门螺杆菌特异性IgG同型抗体并且用能够与人IgG特异性结合的抗体来测定特异性结合复合物。
17.权利要求15或16的方法,其中,报道分子为酶,如辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶;荧光团如荧光黄或罗丹明;含放射性核素的分子;或者着色剂,如胶态金或聚苯乙烯颗粒。
18.权利要求1-17中任一项的方法,它进一步包括在试图测定特异性结合复合物含量之前将样品过滤的步骤。
19.权利要求18的方法,其中,滤器的有效孔径大约为3-8μm。
20.权利要求1-19中任一项的方法,它进一步包括最初的粗滤步骤。
21.权利要求1-20任一项中用于测定全血样品的方法,该方法包括用缓冲的表面活性剂溶液来处理样品的步骤,所述缓冲的表面活性剂溶液包含表面活性剂例如以TRITONX-100为商标出售的非离子型聚氧乙烯醚,其体积含量为0.05%-1%,并且在将样品加到底物上之前,缓冲至pH大约为6.8-7.8。
22.权利要求1-21中任一项的用于测定唾液样品的方法,该方法包括用缓冲的表面活性剂溶液来处理样品的步骤,所述缓冲的表面活性剂溶液包含棕榈酸和/或硬脂酸的聚氧乙烯山梨糖醇酐衍生物并且在将样品加到底物上之前缓冲至pH大约为6.8-7.8。
23.权利要求1-22中任一项的方法,其中,在底物上固定有一种能按照与特异性结合复合物相同方法测定的对照剂。
24.权利要求23的方法,其中对照剂为人IgG。
25.用于处理待测体液样品的缓冲溶液,它包含一种表面活性剂和一种在测定期间将留在底物表面上的着色剂。
26.权利要求25中的缓冲溶液,其中,着色剂包含直径小于过滤步骤中所使用的任何滤器的孔径但大于底物孔径的着色颗粒。
27.权利要求25或26中的溶液,其中,颗粒包含胶乳,琼脂糖,聚苯乙烯或其它聚合物。
28.一种试剂盒,它包含
i权利要求25-27中任一项的缓冲溶液;
ii.固定在多孔底物上并且能够与被分析物形成特异性结合复合物的特异性结合试剂;和
iii.测定特异性结合复合物的存在的测定试剂。
29.一种试剂盒,它包含
i.权利要求25-27中任一项的缓冲溶液;
ii.固定在多孔底物上的由幽门螺杆菌衍生的抗原;和
iii.能够与人IgG特异性结合的被标记抗体的溶液。
30.权利要求28或29中的试剂盒,它进一步包含下列中的一种或多种:
体液采集器械;
粗滤器如棉花或棉绒垫,它可构成采集器械的一部分;和用于除掉样品中颗粒物质的滤器。
Applications Claiming Priority (2)
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