CN116413439A - 一种检测抗病毒蛋白a的试纸条、其制备方法及试剂盒 - Google Patents
一种检测抗病毒蛋白a的试纸条、其制备方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116413439A CN116413439A CN202210005931.5A CN202210005931A CN116413439A CN 116413439 A CN116413439 A CN 116413439A CN 202210005931 A CN202210005931 A CN 202210005931A CN 116413439 A CN116413439 A CN 116413439A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- film
- pad
- test strip
- coating
- resolved fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 42
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 42
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 19
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 11
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 11
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 11
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 8
- 238000003475 lamination Methods 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 3
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000007888 film coating Substances 0.000 claims 3
- 238000009501 film coating Methods 0.000 claims 3
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005325 percolation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000013197 protein A assay Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测抗病毒蛋白A的试纸条、制备方法及试剂盒；该试纸条包括PVC底板、NC膜、结合垫、样品垫和吸水纸；PVC底板为长条状构造，样品垫、结合垫、NC膜及吸水纸沿长度方向依次排列在PVC底板上；结合垫上设置有荧光微球标记的抗原/抗体结合层；所述NC膜表面分别设置有间隔排列的检测线和质控线。本发明提供的试剂盒，应用了时间分辨荧光免疫层析法来检测人血清、血浆或全血样本中的MxA的含量，其对操作人员要求低，不需要专业培训后才能操作，具有快速、操作简便、成本低廉等优点，便于基层社区医院推广。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒蛋白A的检测技术领域，尤其涉及一种基于时间分辨荧光免疫层析的检测抗病毒蛋白A的试纸条、其制备方法及试剂盒。
背景技术
抗病毒蛋白A(MxA)是新发现的由1型干扰素－IFN(α/β)诱导产生的分布于细胞质中的78KD的蛋白质，具有广谱的抗病毒作用，是继2’5’－寡腺苷酸合成酶和P86蛋白激酶之后发现的又一种抗病毒蛋白，随着对MxA研究的深入，现已清楚，MxA蛋白对多种RNA病毒和部分DNA病毒均有抑制作用，而且其水平高低可以作为机体IFN诱导状态的适宜标志。体外试验证明，HIV单独感染人单核细胞后，一般在6h可产生MxA蛋白，14天可达高峰，而且这种表达往往不依赖于IFN－α的存在。MxA与病毒的感染密切相关，对病毒的反应也非常敏感，甚至1pfu/ml的病毒量即可使细胞表达可测出的MxA蛋白，因此可用于病毒的早期和急性感染诊断。临床病人又由于不同的感染引起的疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难，大部分依靠于实验室检查方法。然而这种实验室检测方法，操作相对复杂且周期长，检测成本高等不足。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种一种基于时间分辨荧光免疫层析的检测抗病毒蛋白A的试纸条、其制备方法及试剂盒，以实现检测用时短，快速、准确；检测灵敏度高，特异性好的目的。
本发明从三个方面来给出技术方案。
本发明的技术方案一如下：
一种检测抗病毒蛋白A的试纸条，包括PVC底板、NC膜、结合垫、样品垫和吸水纸；所述PVC底板为长条状构造，所述样品垫、结合垫、NC膜及吸水纸沿长度方向依次排列在所述PVC底板上；所述结合垫上设置有荧光微球标记的抗原/抗体结合层；所述NC膜表面分别设置有间隔排列的检测线和质控线。
一实施例中，所述试纸条，所述样品垫与结合垫的接触部分采用层叠扣压搭接；所述结合垫与NC膜一端的接触部分采用层叠扣压搭接；所述吸水纸与NC膜另一端的接触部分采用层叠扣压搭接。
本发明的技术方案二如下：
上述试纸条的制备方法，包括如下步骤：
样品垫预处理：首先，将玻璃纤维制得玻璃纤维膜材质构造的样品垫；然后，采用处理液对样品垫进行预处理；
结合垫的制备：首先，取100ul时间分辨荧光微球与MES缓冲液混匀，加入EDC和NHS溶液，经活化、离心处理后留存沉淀，并用MES缓冲液冲洗，得到时间分辨荧光溶液；其次，加入抗病毒蛋白A抗体1，混匀后逐渐加入PEG20000溶液和BSA溶液进行封闭混合，经离心处理后，留存沉淀，得到时间分辨荧光－抗体复合物，于4℃保存备用；接着，采用pH为8.5的Tris－HCl缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、吐温－20、叠氮钠及超纯水混合制成时间分辨荧光稀释液；最后，将所述时间分辨荧光－抗体复合物用所述时间分辨荧光稀释液进行复溶后喷涂于玻璃纤维素膜上，37℃恒温干燥箱中固定2h后，制得含荧光微球标记的抗原/抗体结合层的结合垫，备用；
NC膜的包被：将NC膜粘在PVC底板上，用划膜仪依次在其特定位置上划出质控线和检测线；所述质控及所述检测线分别包被后37℃恒温干燥箱中固定4h后取出备用；
试纸条组装：首先，用吸水垫压住NC膜的一端；其次，NC膜的另一端被结合垫压住；接着，样品垫压住结合垫；最后，用切条机裁切，制得试纸条，包装储存，备用。
一实施例，所述制备方法中，所述样品垫预处理步骤中，所述处理液包括磷酸盐缓冲液、1－2％BSA、0.1％Tween－20及2％的海藻糖。
一实施例，所述制备方法中，所述结合垫的制备的制备步骤中，所述PEG20000溶液的质量浓度为20％，所述BSA溶液的质量浓度为20％；所述Tris－HCl缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、吐温－20、叠氮钠的浓度分别为：0.01M、1w/w％、10w/w％、0.1w/w％和0.1w/w％。
一实施例，所述制备方法中，所述NC膜的包被步骤中，还包括配置包被缓冲液步骤：由pH为7.4的0.01－0.02M磷酸盐缓冲液、2％的海藻糖和纯化水混合后配制得到包被缓冲液；以及还包括对检测线和质控线的包被处理步骤：将检测线和质控线用到的原料分别用所述包被缓冲液稀释后再进行包被处理。
一实施例，所述制备方法中，所述NC膜的包被步骤中，所述质控线为羊抗鼠多抗，包被浓度为1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm；检测线为抗病毒蛋白A抗体2，包被浓度为1.0－1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm。
本发明的技术方案三如下：
一种试剂盒，其包括上述试纸条以及用于收纳所述试纸条的试纸条卡壳；在该试纸条卡壳上设有加样孔和检测结果显示区。
本发明提供的抗病毒蛋白A快速诊断试剂盒，应用了时间分辨荧光免疫层析法来检测人血清、血浆或全血样本中的MxA的含量，该方法基于以免疫学为基础，时间分辨荧光为检测技术的侧向层析平台，采用双抗体夹心法，利用了荧光免疫层析的技术原理；测试时，样本与稀释液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，在毛细作用下进行层析，样本中的MxA蛋白与荧光标记的抗MxA抗体结合，扩散至测试区，被检测线包被的另一配对MxA单克隆抗体捕获，并形成“抗体－抗原－荧光抗体”复合物；样本中的MxA浓度与复合物荧光强度成正比，根据设定的标准曲线，荧光免疫检测仪将将荧光信号值转换成样本中MxA浓度。该试剂盒对操作人员要求低，不需要专业培训后才能操作，具有快速、操作简便、成本低廉等优点，便于基层社区医院推广。
附图说明
图1为本发明提供的试纸条结构示意图；
图2为本发明提供的试纸条卡壳结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
时间分辨荧光免疫层析技术，实际上是蛋白质等高分子偶联到时间分辨荧光颗粒表面的过程。偶联机理是时间分辨荧光微球表面修饰有羧基基团，与蛋白质的氨基基团因共价结合而形成牢固连接。目前医学检验中应用的层析诊断技术主要有两种，时间分辨荧光快速免疫层析法和快速斑点免疫金渗滤法。这两种方法的基本原理都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细吸管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上的包被的抗体或抗原结合，再用时间分辨荧光结合物标记而达到检测目的。免疫时间分辨荧光快速诊断技术具有快速、操作简单、高特异性、高灵敏性、检测成本低、无需复杂技巧和特殊设备，并且特别适用于现场大量样本的实时、快速抽样检测的特点，因此可以简单、快速实现人血清、血浆或全血样本的定量检测。此检测方法克服了如免疫荧光法技术定量检测易出现假阴现象的缺陷、简化了样本处理过程、极大缩短了检测时间、降低了研究成本和技术复杂性。
如图1和2所示，本发明提供一种检测抗病毒蛋白A的试剂盒，包括试纸条和用于适配收纳试纸条的试纸条卡壳8。
如图1所示，试剂盒中的试纸条，为时间分辨荧光免疫层析试纸条，其包括PVC底板7、NC膜4、结合垫2、样品垫1和吸水纸6。其中，PVC底板7为长条状构造，样品垫1、结合垫2、NC膜4及吸水纸6沿长度方向依次排列在PVC底板7上；样品垫1和吸水纸6分别排列在PVC底板7的两端；结合垫2(也称为时间分辨荧光结合垫2)上设置有荧光微球标记的抗原/抗体结合层；NC膜4表面分别设置有间隔排列的检测线3和质控线5。
在上述试纸条上，如图1所示，样品垫1与结合垫2的接触部分采用层叠扣压搭接；结合垫2与NC膜4一端的接触部分采用层叠扣压搭接；吸水纸6与NC膜4另一端的接触部分采用层叠扣压搭接。
如图2所示，试剂盒中的试纸条卡壳8为长条状构造，其规格大小与试纸条相适配。试纸条卡壳8上设有加样孔9和检测结果显示区10；加样孔9位于试纸条的样品垫1端；检测结果显示区10位于NC膜3位置，用于观察检测线3和质控线5的检测变化结果。试纸条卡壳8与一个干燥剂(重量为1g)一同密封于铝箔袋中(图中未示出)，用于保持试剂纸干燥及清洁。使用时，沿铝箔袋撕口处打开，检测样本置于加样孔9，检测结果由检测结果显示区10显示。
本发明还提供上述试纸条的制备方法，其工艺步骤如下：
S1、样品垫预处理：首先，将玻璃纤维通过涂覆、喷丝等工艺，制得玻璃纤维膜材质构造的样品垫；然后，采用处理液对样品垫进行预处理；
S2、结合垫(简称结合垫)的制备：首先，取100ul时间分辨荧光微球与MES缓冲液混匀，加入EDC和NHS溶液，经活化、离心处理后留存沉淀，并用MES缓冲液冲洗，得到时间分辨荧光溶液；其次，加入抗病毒蛋白A抗体1，混匀，逐渐加入PEG20000溶液和BSA溶液进行封闭混合，经离心处理后，留存沉淀，得到时间分辨荧光－抗体复合物，于4℃保存备用；接着，采用pH为8.5的Tris－HCl缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、吐温－20、叠氮钠及超纯水混合制成时间分辨荧光稀释液；最后，将所述时间分辨荧光－抗体复合物用所述时间分辨荧光稀释液进行复溶后喷涂于玻璃纤维素膜上，37℃恒温干燥箱中固定2h后，制得结合垫，备用；
S3、NC膜的包被：将NC膜粘在PVC底板上，用划膜仪依次在其特定位置上划出质控线和检测线；所述质控及所述检测线分别包被后37℃恒温干燥箱中固定4h后取出备用；
S4、试纸条组装：首先，用吸水垫压住NC膜的一端；其次，NC膜的另一端被结合垫压住；接着，样品垫压住结合垫；最后，用切条机裁切，制得试纸条，包装储存，备用。
优选地，上述制备方法的步骤S1中，处理液包括磷酸盐缓冲液、1－2％BSA、0.1％Tween－20及2％的海藻糖。该处理液可增加样品垫的吸收能力，控制微球释放，促进层析作用的发生。
优选地，上述制备方法的步骤S2中，PEG20000溶液的质量浓度为20％，BSA溶液的质量浓度为20％；Tris－HCl缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、吐温－20、叠氮钠的浓度分别为：0.01M、1w/w％、10w/w％、0.1w/w％和0.1w/w％。
优选地，上述制备方法的步骤S3中，还包括配置包被缓冲液步骤：由pH为7.4的0.01－0.02M磷酸盐缓冲液、2％的海藻糖和纯化水混合后配制得到被缓冲液；以及还包括对检测线和质控线的包被处理步骤：将检测线和质控线用到的原料分别用包被缓冲液稀释到一定浓度，再将稀释好的溶液分别包被在NC膜的特定位置；该步骤中，质控线为羊抗鼠多抗，包被浓度为1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm；检测线为抗病毒蛋白A抗体2，包被浓度为1.0－1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm。
使用该试剂盒检测抗病毒蛋白A时，其检测步骤如下：
a、沿铝箔袋撕口处打开，将试纸条(又称测试卡)取出平放；
b、向测试卡的加样孔中加入100ul的人血清样本；
c、立即将该测试卡按指示方向插入配套的荧光检测仪的卡槽处，点击标准检测即可，15分钟后会自动进行检测并在屏幕上显示抗病毒蛋白A(MxA)的浓度，打印出该检测结果。
下面通过一些实施例来进一步说明
实施例1样品垫预处理
首先，将玻璃纤维通过涂覆或喷丝方式制得玻璃纤维膜材质构造的样品垫；然后，配置处理液，处理液为磷酸盐缓冲液，其中还包含1－2％BSA，0.1％Tween－20，2％的海藻糖，调整处理液的pH为7.0－8.0后，将整张样品垫全部浸入该处理液中，浸透后控干至无液体滴下，放入37℃恒温干燥箱中烘干2h，取出后加干燥剂密封备用。所述处理液可增加样品垫的吸收能力，控制微球释放，促进层析作用的发生。
实施例2结合垫制备
(1)MxA抗体结合垫制备
按以下步骤制备：
a.时间分辨荧光的制备：取100ul时间分辨荧光微球，加入900ul MES缓冲液混匀，再加入EDC和NHS溶液，使其终浓度分别都为20ug/ml，活化30分钟后离心去上清，用1ml MES缓冲液超声复溶，得到时间分辨荧光溶液。
b.制备MxA荧光微球：取1mL步骤(1)制备好的时间分辨荧光溶液，加入10－15μg抗病毒蛋白A抗体1，混合均匀5min，逐渐加入10μl质量浓度为20％的PEG20000溶液和10μl质量浓度为20％的BSA溶液进行封闭，混合均匀约10分钟后，先以3000－5000r/pm的转速低速离心5－8min，再以10000－12000r/pm的转速高速离心10－15min，弃掉上清，沉淀定容至100μl，沉淀即为MxA荧光微球，得到时间分辨荧光－抗体复合物，于4℃保存备用。
c.时间分辨荧光稀释液的制备方法：每100毫升时间分辨荧光由pH为8.5的0.01MTris－HCl缓冲液、1％的牛血清白蛋白、10％的蔗糖、0.1％的吐温－20和0.1％的叠氮钠、超纯水混合制成时间分辨荧光稀释液。
d.将步骤b制得的时间分辨荧光－抗体复合物用步骤c制得的时间分辨荧光稀释液进行复溶后喷涂于玻璃纤维素膜上，37℃恒温干燥箱中固定2h后，制得含荧光微球标记的抗原/抗体结合层的结合垫，取出备用。
实施例3 NC膜的包被
其工艺步骤如下：
1)包被缓冲液的制备方法：所述包被缓冲液由pH为7.4的0.01－0.02M磷酸盐缓冲液、2％的海藻糖和纯化水制成；
2)将检测线和质控线用到的原料分别用包被缓冲液稀释到一定浓度，制备成相应的质控线溶液和检测线溶液；其中，质控线为羊抗鼠多抗，包被浓度为1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm；检测线为抗病毒蛋白A抗体2，包被浓度为1.0－1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm。
3)将NC膜粘在PVC底板上，用划膜仪将质控线溶液和检测线溶液分别包被在NC膜的特定位置上，37℃恒温干燥箱中固定4h后取出备用。
实例4试纸条组装
首先，用吸水垫压住NC膜的一端约2mm左右；
其次，NC膜的另一端被结合垫压住约1～2mm左右；
接着，样品垫压住结合垫1～2mm左右；
最后，用切条机切成3－4mm宽，制得试纸条，包装储存，备用。
与现有技术相比，本发明的抗病毒蛋白A测定试剂盒(时间分辨荧光免疫层析法)有益效果在于：
1、时间分辨荧光免疫层析技术是一种在免疫渗透技术的基础上建立的一种快速的免疫学检测技术，本发明的试纸条具有制备过程和操作步骤简单，能够方便快捷的在临床诊断和流行病监测一线特异性检测出MxA蛋白，快速判断感染炎症是由细菌还是病毒引起；
2、临床诊断较为便利，无实验室条件限制，适合医疗条件不完善的基层医院和社区诊所的诊疗工作，普通医务人员经过简单的培训就可操作；
3、检测耗时短，10－15min就可得到检测结果；
4、特异性好：只针对抗病毒蛋白A进行检测，无任何干扰因素能影响检测结果；
5、灵敏度高，准确性好；
6、保存和运输方便：在室温下可保存24个月。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种检测抗病毒蛋白A的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括PVC底板、NC膜、结合垫、样品垫和吸水纸；所述PVC底板为长条状构造，所述样品垫、结合垫、NC膜及吸水纸沿长度方向依次排列在所述PVC底板上；所述结合垫上设置有荧光微球标记的抗原/抗体结合层；所述NC膜表面分别设置有间隔排列的检测线和质控线；所述质控线包被羊抗鼠多抗；所述检测线为包被抗病毒蛋白A抗体2。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫与结合垫的接触部分采用层叠扣压搭接；所述结合垫与NC膜一端的接触部分采用层叠扣压搭接；所述吸水纸与NC膜另一端的接触部分采用层叠扣压搭接。
3.权利要求1或2所述试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
样品垫预处理：首先，将玻璃纤维制得玻璃纤维膜材质构造的样品垫；然后，采用处理液对样品垫进行预处理；
结合垫的制备：首先，取100ul时间分辨荧光微球与MES缓冲液混匀，加入EDC和NHS溶液，经活化、离心处理后留存沉淀，并用MES缓冲液冲洗，得到时间分辨荧光溶液；其次，加入抗病毒蛋白A抗体1，混匀后逐渐加入PEG20000溶液和BSA溶液进行封闭混合，经离心处理后，留存沉淀，得到时间分辨荧光－抗体复合物，于4℃保存备用；接着，采用pH为8.5的Tris－HCl缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、吐温－20、叠氮钠及超纯水混合制成时间分辨荧光稀释液；最后，将所述时间分辨荧光－抗体复合物用所述时间分辨荧光稀释液进行复溶后喷涂于玻璃纤维素膜上，37℃恒温干燥箱中固定2h后，制得含荧光微球标记的抗原/抗体结合层的结合垫，备用；
NC膜的包被：将NC膜粘在PVC底板上，用划膜仪依次在其特定位置上划出质控线和检测线；所述质控及所述检测线分别包被后37℃恒温干燥箱中固定4h后取出备用；
试纸条组装：首先，用吸水垫压住NC膜的一端；其次，NC膜的另一端被结合垫压住；接着，样品垫压住结合垫；最后，用切条机裁切，制得试纸条，包装储存，备用。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述样品垫预处理步骤中，所述处理液包括磷酸盐缓冲液、1－2％BSA、0.1％Tween－20及2％的海藻糖。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述结合垫的制备的制备步骤中，所述PEG20000溶液的质量浓度为20％，所述BSA溶液的质量浓度为20％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述结合垫的制备的制备步骤中，所述Tris－HCl缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、吐温－20、叠氮钠的浓度分别为：0.01M、1w/w％、10w/w％、0.1w/w％和0.1w/w％。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述NC膜的包被步骤中，还包括配置包被缓冲液步骤：由pH为7.4的0.01－0.02M磷酸盐缓冲液、2％的海藻糖和纯化水混合后配制得到包被缓冲液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述NC膜的包被步骤中，还包括对检测线和质控线的包被处理步骤：将检测线和质控线用到的原料分别用所述包被缓冲液稀释后再进行包被处理。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述NC膜的包被步骤中，所述质控线为羊抗鼠多抗，包被浓度为1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm；检测线为抗病毒蛋白A抗体2，包被浓度为1.0－1.5mg/ml，包被量1.0μL/cm。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至2任一所述的试纸条，以及用于收纳所述试纸条的试纸条卡壳；在该试纸条卡壳上设有加样孔和检测结果显示区。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210005931.5A CN116413439A (zh) | 2022-01-05 | 2022-01-05 | 一种检测抗病毒蛋白a的试纸条、其制备方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210005931.5A CN116413439A (zh) | 2022-01-05 | 2022-01-05 | 一种检测抗病毒蛋白a的试纸条、其制备方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116413439A true CN116413439A (zh) | 2023-07-11 |
Family
ID=87052024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210005931.5A Pending CN116413439A (zh) | 2022-01-05 | 2022-01-05 | 一种检测抗病毒蛋白a的试纸条、其制备方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116413439A (zh) |
-
2022
- 2022-01-05 CN CN202210005931.5A patent/CN116413439A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102322094B1 (ko) | 바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치 | |
| CN111426829A (zh) | 一种检测SARS-CoV-2 IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条 | |
| JPS6488155A (en) | Immunological inspection for detecting antibody against antigen | |
| JP6150559B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニアの検出方法 | |
| CN111999492B (zh) | 一种联合检验covid-19n抗原和s蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡 | |
| AU621310B2 (en) | Immunometric assay kit and method applicable to whole cells | |
| CN105259354B (zh) | 结核T细胞释放γ‑干扰素检测试剂盒及其使用方法 | |
| WO1982002211A1 (en) | Device and method for detecting antigens and antibodies | |
| US4590157A (en) | Method for detecting antigens and antibodies | |
| US10921322B2 (en) | Methods for detecting a marker for active tuberculosis | |
| CN112326966A (zh) | 一种新型冠状病毒抗原的快速检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN102135535A (zh) | 一种直接进行半定量分析的免疫胶体金属检测技术及其制备方法和用途 | |
| CN115060888A (zh) | 一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法 | |
| EP2270508A1 (en) | Membrane assay method and kit | |
| CN112379089A (zh) | 一种基于量子点微球免疫层析试纸条的新冠病毒检测方法 | |
| CN111796103A (zh) | 一种检测棘球蚴病的胶体金试纸条及其制备方法 | |
| JP3493544B2 (ja) | 抗体アッセイ装置 | |
| US6461825B1 (en) | Immunometric assay kit and method applicable to whole cells | |
| CN106290880B (zh) | 一种用于犬冠状病毒的免疫层析用试剂组合物及检测方法 | |
| JPS63210772A (ja) | 乾燥試験片及びそれを用いた被検流体中の分析成分の検出方法 | |
| CN116413439A (zh) | 一种检测抗病毒蛋白a的试纸条、其制备方法及试剂盒 | |
| CN1700006A (zh) | 禽流感病毒压电生物传感器检测仪 | |
| CN101762693A (zh) | 一种检测tp抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 | |
| CN219799468U (zh) | 一种侧向层析试纸条、检测试剂卡及检测试剂盒 | |
| CN112553077B (zh) | 一种新型冠状病毒裂解液及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |