JP4199607B2 - 免疫クロマトグラフィー検査キットおよび免疫クロマトグラフィー検査方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、免疫クロマトグラフィー検査キットおよび免疫クロマトグラフィー検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、抗原抗体反応を簡便に利用する方法として免疫クロマトグラフィーについて数多く報告されている（特許文献１〜３等）。これらに開示されている測定方法は、採取した検体を、目的とする抗体を含む検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる。この方法は、大別して展開型及びフロースルー型が挙げられる。
【０００３】
展開型は、ニトロセルロースなどの多孔質膜の一端に、目的とする被測定物質（例えば抗原）に対するリガンド（例えば特異抗体）を含み、多孔質膜の中程には同様に特定の被測定物質である抗原のみに結合する別の特異抗体を帯状に含む多孔質膜に固定されている。一端に含む特異抗体は、予め着色されており、その特異抗体が存在している多孔質膜の一端上に試料液を染み込ませるとサンプル液中に特異抗体と反応する被測定物質（抗原）があれば、その抗原は特異抗体と結び付いて着色粒子を付けた状態で多孔質膜を毛細管現象によってサンプル液を染み込ませた側と反対の片端へ向かって移動する。移動の途中で帯状に固定されている別の特異抗体の個所を通過する際に、抗原は多孔質膜上の特異抗体に捕捉され、多孔質膜上に帯状の染みが現れる。このことにより目的の抗原が試料中に存在していること及びその量を知ることができる。
【０００４】
一方、フロースルー型は、通常、上部開口部を有するコンテナーに吸収部材を収容するとともに当該吸収部材の上方に被測定物質と特異的に反応するリガンドを固定したクロマト用膜担体を設けた装置が用いられる。かかる装置を用いた被測定物質の測定は、例えば被測定物質が抗原の場合、上部開口部に被測定物質（即ち、抗原）液を加えて、被測定物質と特異的に反応するリガンド（即ち、抗体）を固定したクロマト用膜担体を通過させ、抗原を捕獲させる。次いで、上部開口部に、標識（例えば、酵素）を結合させた抗体液を添加することにより、当該抗体をクロマト用膜担体上に捕獲させた抗原と結合させ、更に標識に基づくシグナルを測定することにより抗原の測定が行われる。なお、クロマト用膜担体を通過した各液は、前記の吸収部材に吸収される。
【０００５】
免疫クロマトグラフィーの手法において、被測定物質を迅速、簡便かつ良好に検出しうるよう種々の検討がなされ、報告されている（特許文献４、５）。しかしながら、これらの報告は免疫クロマトグラフィー検査用テストストリップに関するものであって、検体前処理に関する報告ではない。
【０００６】
【先行文献】
【特許文献１】
特開昭61-145459号公開公報
【特許文献２】
特開平6-160388号公開公報
【特許文献３】
特開平6-50973号公開公報
【特許文献４】
特開2002-328129号公開公報
【特許文献５】
特開2002-328130号公開公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、免疫クロマトグラフィーを行う場合の、試料によるクロマト用膜担体の目詰まりを防ぎ、スムーズに免疫クロマトグラフィーが行われる免疫クロマトグラフィー検査キットまたは免疫クロマトグラフィー検査方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、種々検討し研究を重ねた結果、膜孔径が異なる膜を少なくとも２種類積層したもので検体処理液で処理した試料をろ過すると、スムーズにろ過され、更にろ過して得た試料もクロマト用膜担体の目詰まりを起こすことなくスムーズに免疫クロマトグラフィーが行われることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体処理液で前処理することにより調製された試料を免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査するための免疫クロマトグラフィー検査キットであって、
一端に開口部を有し、検体処理液を収容した状態で開口部がキャップによって封じられた検体処理容器と、キャップが外された検体処理容器の開口部に装着可能であり、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルと、３〜１２μｍの膜孔径を有するクロマト用膜担体を備えた免疫クロマトグラフィー用テストストリップと、を備え、
濾過部材は、膜孔径が免疫クロマトグラフィー用テストストリップのクロマト用膜担体の膜孔径の１／１０〜１／１倍の孔径である濾過膜（Ａ）と、膜孔径が濾過膜（Ａ）の１０〜３０倍である濾過膜（Ｂ）とを備えることを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査キット。
２．鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体処理液で前処理することにより調製された試料を免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査するための免疫クロマトグラフィー検査キットであって、
一端に開口部を有し、検体処理液を収容した状態で開口部がキャップによって封じられた検体処理容器と、キャップが外された検体処理容器の開口部に装着可能であり、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルと、免疫クロマトグラフィー用テストストリップと、を備え、
濾過部材は、膜孔径が０．３〜１２μｍの濾過膜（Ａ）と、膜孔径が５〜５０μｍの濾過膜（Ｂ）とを備え、濾過膜（Ａ）の膜孔径が濾過膜（Ｂ）の膜孔径よりも小さいことを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査キット。
３．濾過膜（Ａ）の膜孔径が０．５〜５μｍであり、濾過膜（Ｂ）の膜孔径が１０〜５０μｍである前項２記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
４．ノズルが、更にガラスフィルターを有する前項１〜３の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
５．濾過膜（Ａ）および濾過膜（Ｂ）が試料排出孔側から順に設けられている前項１〜３の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
６．濾過膜（Ａ）、濾過膜（Ｂ）およびガラスフィルターが試料排出孔側から順に設けられている前項４に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
７．免疫クロマトグラフィー用テストストリップが展開型免疫クロマトグラフィー用テストストリップである前項１〜６の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
８．検体処理液を収容した検体処理容器の開口部から、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を入れる工程、
検体と検体処理液の混合物を収容した検体処理容器の開口部に、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルを装着する工程、
ノズルの試料排出孔を介して供給された試料を、３〜１２μｍの膜孔径を有するクロマト用膜担体を備えた免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査する工程からなり、
濾過部材は、膜孔径が免疫クロマトグラフィー用テストストリップのクロマト用膜担体の膜孔径の１／１０〜１／１倍の孔径である濾過膜（Ａ）と、膜孔径が濾過膜（Ａ）の１０〜３０倍である濾過膜（Ｂ）とを備えることを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査方法。
９．検体処理液を収容した検体処理容器の開口部から、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を入れる工程、
検体と検体処理液の混和物を収容した検体処理容器の開口部に、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルを装着する工程、
ノズルの試料排出孔を介して供給された試料を、免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査する工程からなり、
濾過部材は、膜孔径が０．３〜１２μｍの濾過膜（Ａ）と、膜孔径が５〜５０μｍの濾過膜（Ｂ）とを備え、濾過膜（Ａ）の膜孔径が濾過膜（Ｂ）の膜孔径よりも小さいことを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（免疫クロマトグラフィー）
免疫クロマトグラフィーの手法は既に公知であるが、大別して、展開型及びフロースルー型等がある。本発明のろ過部材でろ過した試料は何れの型の免疫クロマトグラフィーにも適用することができる。
【００１１】
展開型免疫クロマトグラフィーのテストストリップの一例の概略図を図１に示し、その原理を説明する。ここで、テストストリップとは、免疫クロマトグラフィーが実際に行われる本体を意味し、必要に応じて試料添加部材、標識保持部材、クロマト用膜担体、検出捕獲部位、吸収部材等を備えたものをいう。図１の標識保持部材２に被測定物質である抗原に対するリガンド（即ち抗体）を標識した着色粒子を保持させ、検出部位４に、例えば前記抗原の部位を認識する抗体を固定する。図１の試料添加部材１に上記の処理した検体を試料として滴下し、クロマト用膜担体３を介して吸収部材５の方向に試料を展開させる。検体中に被測定物質である抗原）が存在している場合には、該抗原と検出部位４に固定した抗体とが抗原抗体反応し、標識が反応することで検出部位４の位置にシグナルとしてバンドが現れる。検出部位４に現れたバンドの色調等により、検体中に含まれる被測定物質の量を概略的に把握することができる。なお、標識として酵素、放射性物質、蛍光物質等が利用できることや標識に基づくシグナルの測定法はこの分野で周知である。
【００１２】
更に、フロースルー型免疫クロマトグラフィーの反応装置の一例の概略図を図２に示し、その原理を説明する。図２に示される反応装置は、プラスチック等からなる円筒状のコンテナー６に、吸収部材５（例えば、ガラス繊維等）が収容されており、当該吸収部材５の上方にはクロマト用膜担体３が設けられており、更にコンテナー６は上部に開口部７を有する構成となっている。かかる構成からなる反応装置を使用して被測定物質を測定する方法の一例として、被測定物質である抗原を測定する例の概略を説明する。まず、被測定物質である抗原を含有する試料液を試料添加部位である開口部７に供給する。試料液は、抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）を保持（感作）させたクロマト用膜担体３を通過し、被測定物質である抗原は当該クロマト用膜担体３に捕獲されると共に通過した試料液は吸収部材５に吸収される。次いで、被測定物質に反応する標識された抗体を供給し、クロマト用膜担体３に捕獲された抗原と該標識抗体を結合させる。その後、開口部７から適当な洗浄液を供給してクロマト用膜担体３を洗浄し、常法に準じて標識に基づくシグナルを測定することにより抗原（被測定物質）を測定（定量又は定性）することができる。なお、標識として酵素、放射性物質、蛍光物質等が利用できることや標識に基づくシグナルの測定法も、展開型免疫クロマトグラフィーと同様にこの分野で周知である。
【００１３】
（検体）
本発明において、被測定検体は特に限定されるものではなく、免疫クロマトグラフィーの手法により測定可能な被測定物質を含む可能性のあるものであれば良い。具体的には、例えば、唾液、血液、血漿、血清、尿、汗、涙、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液等の体液が挙げられる。例えば被測定物質としてインフルエンザウイルスを混入しうるものの例として、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液などが挙げられる。これらの検体を採取する方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いて、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液を採取することができる。
【００１４】
（検体処理）
上記免疫クロマトグラフィーの手法を利用できる試料は、原理上、多孔質膜であるクロマト用膜担体を毛細管現象によって通過できなければならない。しかし、鼻汁や咽頭ぬぐい液は、これらに存在する高粘性物質であるムチンが多孔質膜の膜孔を塞ぎ、またムチンは生体から剥がれ落ちた上皮付着細胞を凝集させるため、これらの物質により多孔質膜の孔が塞がれて検査を行うことができない。そこで、検体を検体処理液を用いて前処理しておくことにより、検査に不要な成分を予め除去しておくことが好ましい。かかる検体処理液は、一般的に使用されるものであれば良く特に限定されないが、反応に至適なpHである5〜9に保持うる緩衝液を構成する成分や、その他の適切な有機酸などを含ませることができ、例えば0.3v/v% NP40, 0.15M NaCl及び10mMジチオスレイトール等を含有する100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)を使用することができる。検体の処理は、検体処理液0.5〜1.0mLに対して検体0.1〜0.2mLを加え、よく振り混ぜで混和することにより行う。同様に鼻汁などの検体を採取した綿棒を検体処理液に浸し、検体処理液と検体をよく混和することにより行うことができる。検体の処理は、例えば検体処理容器に検体処理液を加えて行うことができる。本明細書では検体を処理液で処理したものを、便宜上「試料」という。更に、検体処理液で処理した試料をろ過することで、検査に不要な成分を予め除去することができる。
【００１５】
（ろ過部材）
上記検体処理液で処理した試料のろ過は、ろ過部材を通すことにより行うことができる。本発明のろ過部材は、膜孔径の異なるろ過膜を少なくとも２種類積層したものを含むものである。試料は、上記説明したようにクロマト用膜担体を毛細管現象により移動するものであるから、ろ過された試料の大きさはクロマト用膜担体の膜孔径よりも同等以下となることが必要である。通常、クロマト用膜担体の膜孔径は3〜12μmである。
【００１６】
上記の条件を満たしうるろ過部材を構成するろ過膜のひとつ(A)の膜孔径は、クロマト用膜担体の膜孔径の1/10〜1/1倍とすることができ、好ましくは1/6〜1/2倍とすることができる。また、他のろ過膜(B)の膜孔径は、(A)の膜孔径の10〜30倍、好ましくは15〜25倍とすることができる。
他の態様として、ろ過部材を構成するろ過膜のひとつ(A)の膜孔径は、0.3〜12μmとすることができ、好ましくは0.5〜1.5μmとすることができる。また、他のろ過膜(B)の膜孔径は、5〜50μm、好ましくは15〜30μmとすることができる。
【００１７】
本発明のろ過部材は、(A)及び(B)のろ過膜のほかに、更に(A)及び(B)のろ過膜よりも膜孔径が大きいガラスフィルターを組み合わせることができる。また、ガラスフィルターに加えて他のろ過材を適宜組み合わせることもできるし、ガラスフィルターの他に、他のろ過材を適宜組み合わせることもできる。
上記のろ過部材を構成するろ過膜は、その膜孔径が試料が最初に通過するほうが大きく、試料が排出される方向に対して順次小さいものを重ね合わせる。そうすることで、検体処理液で処理した試料のろ過をスムーズに行うことができる。
【００１８】
本発明のろ過部材は、試料をろ過することができる態様であれば、特に限定されず使用することができる。例えば、検体処理容器に組み合わせて設けることができる。
【００１９】
（キット）
また、本発明は、上記ろ過部材及び該ろ過部材を含む検体処理容器にも及ぶ。更に、上記ろ過部材又はろ過部材を含む検体処理容器を含む免疫クロマトグラフィーに必要な試薬を含む検出キットにも及ぶものである。具体的には、前処理液、免疫クロマトグラフィー用デバイス、免疫クロマトグラフィー装置、各種抗体を含む試薬等が含まれるもの等が例示される。
【００２０】
【実施例】
本発明の理解のために、以下に図を基にした実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）検体処理
本実施例における検体処理容器及びろ過部材を図３及び４に示した。検体処理容器は、径1cm、高さ5cmのプラスチックボトル８、試料通過口１２及び試料排出口１３を含むノズル９及びキャップ１０とから構成される。使用するまでは、ボトル内に検体処理液を約0.8mL含み、キャップ１０をした状態で保存されている。使用に際し、キャップ１０を開け、採取した検体0.15mLをボトル８内に加え、検体処理液と混和する。その後、キャップ１０の代わりに試料排出口１３を含むを含むノズル９をボトル８に装着し、上記の処理した試料を試料排出口１３から排出する。ノズル９の内側、試料排出口１３と試料通過口１２の間に、本発明のろ過部材１１を装着した（図４）。検体処理液で処理した後の試料は、試料通過口１２からろ過部材１１を経て、試料排出口１３から図１の試料添加部材１に滴下され、免疫クロマトグラフィーが行われる。
【００２２】
（実施例２）ろ過部材
実施例１で示したろ過部材１１を構成する膜は、膜孔径1.5μm厚さ0.4mmのガラス繊維濾紙(ろ過膜ａ)、膜孔径23μm厚さ0.4mmのガラス繊維濾紙（ろ過膜ｂ）、厚さ0.7mmのガラスフィルターである。また、ろ過膜ａからなるろ過部材（▲１▼）、ろ過膜ｂからなるろ過部材（▲２▼）、ガラスフィルターからなるろ過部材（▲３▼）、ろ過膜ａ及びろ過膜ｂを積層してなり試料通過口１２から試料排出口１３に向かってろ過膜ｂ、ろ過膜ａの順に積層されているろ過部材（▲４▼）、ろ過膜ａ、ろ過膜ｂ及びガラスフィルターを積層してなり、試料通過口１２から試料排出口１３に向かってガラスフィルター、ろ過膜ｂ、ろ過膜ａの順に積層されているろ過部材（▲５▼）を調製した。
【００２３】
（実験例１）
実施例２で示した▲１▼〜▲５▼の各種のろ過部材をノズル９に装着した検体処理容器を用いて、検体処理後ろ過した試料についてイムノクロマトグラフィーを行ったときの効果を調べた。
まず、0.3v/v%NP40、0.4MNaCl及び10mMジチオトレイトールを含有する100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)からなる検体処理液0.8mLを含む検体処理容器８に、検体（鼻汁）0.15mLを加えて撹拌したものを試料とし、その後該試料をろ過した。約100検体について試験を行い、ろ過部材（▲１▼）でろ過不能であった試料５検体（Ａ〜Ｅ）について各種ろ過部材の効果を検討した。その結果を表１にした。
【００２４】
【表１】
【００２５】
ろ過不能：試料をろ過する際に、膜の目詰まりにより、試験必要量が得られなかった。
判定不能：試料のろ過はできるが、測定において規定の判定時間になっても移動層が着色しており、判定が困難であった。
【００２６】
膜処理をしていない試料について試験を行った結果、クロマト用膜担体上で目詰まりを起こし、試料液の流れを阻害したため、判定ができなかった。
ろ過膜ａ単独では膜孔径が小さいために、試料をろ過する際に膜の目詰まりを起こし、ろ過することができなかった。
ろ過膜ｂ又はガラスフィルター単独では、膜孔径が大きすぎるため、試料は膜を素通りしてしまい、その結果、試料がクロマト用膜担体上で目詰まりを起こし、試料液の流れを阻害したため、判定ができなかった。
ろ過膜ａに、膜孔径の大きな膜を組み合わせることで、試料中の不溶物が段階的に取り除かれ、膜及びクロマト用膜担体上での目詰まりがなくなり、判定することができた。
【００２７】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、クロマト用膜担体上での目詰まりがなくなり、イムノクロマトグラフィーの検査がスムーズに行われることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】展開型の免疫クロマトグラフィー検査用テストストリップの概略を示す図である。
【図２】フロースルー型の免疫クロマトグラフィー検査用反応装置の一部を示す図である。
【図３】免疫クロマトグラフィー検査用検体処理容器の概略を示す図である。
【図４】図３の検体処理容器のうち、ノズル部分を説明する図である。
【符号の説明】
１ 試料添加部材
２ 標識保持部材（被測定物質に対する抗体標識着色粒子保持部）
３ クロマト用膜担体
４ 検出部位（被測定物質に対する抗体固定部）
５ 吸収部材
６ コンテナー
７ 開口部（試料添加口）
８ 検体処理用容器
９ ノズル
１０ キャップ
１１ ろ過部材
１２ 試料通過口
１３ 試料排出口
【発明が属する技術分野】
本発明は、免疫クロマトグラフィー検査キットおよび免疫クロマトグラフィー検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、抗原抗体反応を簡便に利用する方法として免疫クロマトグラフィーについて数多く報告されている（特許文献１〜３等）。これらに開示されている測定方法は、採取した検体を、目的とする抗体を含む検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる。この方法は、大別して展開型及びフロースルー型が挙げられる。
【０００３】
展開型は、ニトロセルロースなどの多孔質膜の一端に、目的とする被測定物質（例えば抗原）に対するリガンド（例えば特異抗体）を含み、多孔質膜の中程には同様に特定の被測定物質である抗原のみに結合する別の特異抗体を帯状に含む多孔質膜に固定されている。一端に含む特異抗体は、予め着色されており、その特異抗体が存在している多孔質膜の一端上に試料液を染み込ませるとサンプル液中に特異抗体と反応する被測定物質（抗原）があれば、その抗原は特異抗体と結び付いて着色粒子を付けた状態で多孔質膜を毛細管現象によってサンプル液を染み込ませた側と反対の片端へ向かって移動する。移動の途中で帯状に固定されている別の特異抗体の個所を通過する際に、抗原は多孔質膜上の特異抗体に捕捉され、多孔質膜上に帯状の染みが現れる。このことにより目的の抗原が試料中に存在していること及びその量を知ることができる。
【０００４】
一方、フロースルー型は、通常、上部開口部を有するコンテナーに吸収部材を収容するとともに当該吸収部材の上方に被測定物質と特異的に反応するリガンドを固定したクロマト用膜担体を設けた装置が用いられる。かかる装置を用いた被測定物質の測定は、例えば被測定物質が抗原の場合、上部開口部に被測定物質（即ち、抗原）液を加えて、被測定物質と特異的に反応するリガンド（即ち、抗体）を固定したクロマト用膜担体を通過させ、抗原を捕獲させる。次いで、上部開口部に、標識（例えば、酵素）を結合させた抗体液を添加することにより、当該抗体をクロマト用膜担体上に捕獲させた抗原と結合させ、更に標識に基づくシグナルを測定することにより抗原の測定が行われる。なお、クロマト用膜担体を通過した各液は、前記の吸収部材に吸収される。
【０００５】
免疫クロマトグラフィーの手法において、被測定物質を迅速、簡便かつ良好に検出しうるよう種々の検討がなされ、報告されている（特許文献４、５）。しかしながら、これらの報告は免疫クロマトグラフィー検査用テストストリップに関するものであって、検体前処理に関する報告ではない。
【０００６】
【先行文献】
【特許文献１】
特開昭61-145459号公開公報
【特許文献２】
特開平6-160388号公開公報
【特許文献３】
特開平6-50973号公開公報
【特許文献４】
特開2002-328129号公開公報
【特許文献５】
特開2002-328130号公開公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、免疫クロマトグラフィーを行う場合の、試料によるクロマト用膜担体の目詰まりを防ぎ、スムーズに免疫クロマトグラフィーが行われる免疫クロマトグラフィー検査キットまたは免疫クロマトグラフィー検査方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、種々検討し研究を重ねた結果、膜孔径が異なる膜を少なくとも２種類積層したもので検体処理液で処理した試料をろ過すると、スムーズにろ過され、更にろ過して得た試料もクロマト用膜担体の目詰まりを起こすことなくスムーズに免疫クロマトグラフィーが行われることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体処理液で前処理することにより調製された試料を免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査するための免疫クロマトグラフィー検査キットであって、
一端に開口部を有し、検体処理液を収容した状態で開口部がキャップによって封じられた検体処理容器と、キャップが外された検体処理容器の開口部に装着可能であり、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルと、３〜１２μｍの膜孔径を有するクロマト用膜担体を備えた免疫クロマトグラフィー用テストストリップと、を備え、
濾過部材は、膜孔径が免疫クロマトグラフィー用テストストリップのクロマト用膜担体の膜孔径の１／１０〜１／１倍の孔径である濾過膜（Ａ）と、膜孔径が濾過膜（Ａ）の１０〜３０倍である濾過膜（Ｂ）とを備えることを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査キット。
２．鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体処理液で前処理することにより調製された試料を免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査するための免疫クロマトグラフィー検査キットであって、
一端に開口部を有し、検体処理液を収容した状態で開口部がキャップによって封じられた検体処理容器と、キャップが外された検体処理容器の開口部に装着可能であり、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルと、免疫クロマトグラフィー用テストストリップと、を備え、
濾過部材は、膜孔径が０．３〜１２μｍの濾過膜（Ａ）と、膜孔径が５〜５０μｍの濾過膜（Ｂ）とを備え、濾過膜（Ａ）の膜孔径が濾過膜（Ｂ）の膜孔径よりも小さいことを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査キット。
３．濾過膜（Ａ）の膜孔径が０．５〜５μｍであり、濾過膜（Ｂ）の膜孔径が１０〜５０μｍである前項２記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
４．ノズルが、更にガラスフィルターを有する前項１〜３の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
５．濾過膜（Ａ）および濾過膜（Ｂ）が試料排出孔側から順に設けられている前項１〜３の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
６．濾過膜（Ａ）、濾過膜（Ｂ）およびガラスフィルターが試料排出孔側から順に設けられている前項４に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
７．免疫クロマトグラフィー用テストストリップが展開型免疫クロマトグラフィー用テストストリップである前項１〜６の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
８．検体処理液を収容した検体処理容器の開口部から、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を入れる工程、
検体と検体処理液の混合物を収容した検体処理容器の開口部に、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルを装着する工程、
ノズルの試料排出孔を介して供給された試料を、３〜１２μｍの膜孔径を有するクロマト用膜担体を備えた免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査する工程からなり、
濾過部材は、膜孔径が免疫クロマトグラフィー用テストストリップのクロマト用膜担体の膜孔径の１／１０〜１／１倍の孔径である濾過膜（Ａ）と、膜孔径が濾過膜（Ａ）の１０〜３０倍である濾過膜（Ｂ）とを備えることを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査方法。
９．検体処理液を収容した検体処理容器の開口部から、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を入れる工程、
検体と検体処理液の混和物を収容した検体処理容器の開口部に、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルを装着する工程、
ノズルの試料排出孔を介して供給された試料を、免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査する工程からなり、
濾過部材は、膜孔径が０．３〜１２μｍの濾過膜（Ａ）と、膜孔径が５〜５０μｍの濾過膜（Ｂ）とを備え、濾過膜（Ａ）の膜孔径が濾過膜（Ｂ）の膜孔径よりも小さいことを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（免疫クロマトグラフィー）
免疫クロマトグラフィーの手法は既に公知であるが、大別して、展開型及びフロースルー型等がある。本発明のろ過部材でろ過した試料は何れの型の免疫クロマトグラフィーにも適用することができる。
【００１１】
展開型免疫クロマトグラフィーのテストストリップの一例の概略図を図１に示し、その原理を説明する。ここで、テストストリップとは、免疫クロマトグラフィーが実際に行われる本体を意味し、必要に応じて試料添加部材、標識保持部材、クロマト用膜担体、検出捕獲部位、吸収部材等を備えたものをいう。図１の標識保持部材２に被測定物質である抗原に対するリガンド（即ち抗体）を標識した着色粒子を保持させ、検出部位４に、例えば前記抗原の部位を認識する抗体を固定する。図１の試料添加部材１に上記の処理した検体を試料として滴下し、クロマト用膜担体３を介して吸収部材５の方向に試料を展開させる。検体中に被測定物質である抗原）が存在している場合には、該抗原と検出部位４に固定した抗体とが抗原抗体反応し、標識が反応することで検出部位４の位置にシグナルとしてバンドが現れる。検出部位４に現れたバンドの色調等により、検体中に含まれる被測定物質の量を概略的に把握することができる。なお、標識として酵素、放射性物質、蛍光物質等が利用できることや標識に基づくシグナルの測定法はこの分野で周知である。
【００１２】
更に、フロースルー型免疫クロマトグラフィーの反応装置の一例の概略図を図２に示し、その原理を説明する。図２に示される反応装置は、プラスチック等からなる円筒状のコンテナー６に、吸収部材５（例えば、ガラス繊維等）が収容されており、当該吸収部材５の上方にはクロマト用膜担体３が設けられており、更にコンテナー６は上部に開口部７を有する構成となっている。かかる構成からなる反応装置を使用して被測定物質を測定する方法の一例として、被測定物質である抗原を測定する例の概略を説明する。まず、被測定物質である抗原を含有する試料液を試料添加部位である開口部７に供給する。試料液は、抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）を保持（感作）させたクロマト用膜担体３を通過し、被測定物質である抗原は当該クロマト用膜担体３に捕獲されると共に通過した試料液は吸収部材５に吸収される。次いで、被測定物質に反応する標識された抗体を供給し、クロマト用膜担体３に捕獲された抗原と該標識抗体を結合させる。その後、開口部７から適当な洗浄液を供給してクロマト用膜担体３を洗浄し、常法に準じて標識に基づくシグナルを測定することにより抗原（被測定物質）を測定（定量又は定性）することができる。なお、標識として酵素、放射性物質、蛍光物質等が利用できることや標識に基づくシグナルの測定法も、展開型免疫クロマトグラフィーと同様にこの分野で周知である。
【００１３】
（検体）
本発明において、被測定検体は特に限定されるものではなく、免疫クロマトグラフィーの手法により測定可能な被測定物質を含む可能性のあるものであれば良い。具体的には、例えば、唾液、血液、血漿、血清、尿、汗、涙、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液等の体液が挙げられる。例えば被測定物質としてインフルエンザウイルスを混入しうるものの例として、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液などが挙げられる。これらの検体を採取する方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いて、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液を採取することができる。
【００１４】
（検体処理）
上記免疫クロマトグラフィーの手法を利用できる試料は、原理上、多孔質膜であるクロマト用膜担体を毛細管現象によって通過できなければならない。しかし、鼻汁や咽頭ぬぐい液は、これらに存在する高粘性物質であるムチンが多孔質膜の膜孔を塞ぎ、またムチンは生体から剥がれ落ちた上皮付着細胞を凝集させるため、これらの物質により多孔質膜の孔が塞がれて検査を行うことができない。そこで、検体を検体処理液を用いて前処理しておくことにより、検査に不要な成分を予め除去しておくことが好ましい。かかる検体処理液は、一般的に使用されるものであれば良く特に限定されないが、反応に至適なpHである5〜9に保持うる緩衝液を構成する成分や、その他の適切な有機酸などを含ませることができ、例えば0.3v/v% NP40, 0.15M NaCl及び10mMジチオスレイトール等を含有する100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)を使用することができる。検体の処理は、検体処理液0.5〜1.0mLに対して検体0.1〜0.2mLを加え、よく振り混ぜで混和することにより行う。同様に鼻汁などの検体を採取した綿棒を検体処理液に浸し、検体処理液と検体をよく混和することにより行うことができる。検体の処理は、例えば検体処理容器に検体処理液を加えて行うことができる。本明細書では検体を処理液で処理したものを、便宜上「試料」という。更に、検体処理液で処理した試料をろ過することで、検査に不要な成分を予め除去することができる。
【００１５】
（ろ過部材）
上記検体処理液で処理した試料のろ過は、ろ過部材を通すことにより行うことができる。本発明のろ過部材は、膜孔径の異なるろ過膜を少なくとも２種類積層したものを含むものである。試料は、上記説明したようにクロマト用膜担体を毛細管現象により移動するものであるから、ろ過された試料の大きさはクロマト用膜担体の膜孔径よりも同等以下となることが必要である。通常、クロマト用膜担体の膜孔径は3〜12μmである。
【００１６】
上記の条件を満たしうるろ過部材を構成するろ過膜のひとつ(A)の膜孔径は、クロマト用膜担体の膜孔径の1/10〜1/1倍とすることができ、好ましくは1/6〜1/2倍とすることができる。また、他のろ過膜(B)の膜孔径は、(A)の膜孔径の10〜30倍、好ましくは15〜25倍とすることができる。
他の態様として、ろ過部材を構成するろ過膜のひとつ(A)の膜孔径は、0.3〜12μmとすることができ、好ましくは0.5〜1.5μmとすることができる。また、他のろ過膜(B)の膜孔径は、5〜50μm、好ましくは15〜30μmとすることができる。
【００１７】
本発明のろ過部材は、(A)及び(B)のろ過膜のほかに、更に(A)及び(B)のろ過膜よりも膜孔径が大きいガラスフィルターを組み合わせることができる。また、ガラスフィルターに加えて他のろ過材を適宜組み合わせることもできるし、ガラスフィルターの他に、他のろ過材を適宜組み合わせることもできる。
上記のろ過部材を構成するろ過膜は、その膜孔径が試料が最初に通過するほうが大きく、試料が排出される方向に対して順次小さいものを重ね合わせる。そうすることで、検体処理液で処理した試料のろ過をスムーズに行うことができる。
【００１８】
本発明のろ過部材は、試料をろ過することができる態様であれば、特に限定されず使用することができる。例えば、検体処理容器に組み合わせて設けることができる。
【００１９】
（キット）
また、本発明は、上記ろ過部材及び該ろ過部材を含む検体処理容器にも及ぶ。更に、上記ろ過部材又はろ過部材を含む検体処理容器を含む免疫クロマトグラフィーに必要な試薬を含む検出キットにも及ぶものである。具体的には、前処理液、免疫クロマトグラフィー用デバイス、免疫クロマトグラフィー装置、各種抗体を含む試薬等が含まれるもの等が例示される。
【００２０】
【実施例】
本発明の理解のために、以下に図を基にした実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）検体処理
本実施例における検体処理容器及びろ過部材を図３及び４に示した。検体処理容器は、径1cm、高さ5cmのプラスチックボトル８、試料通過口１２及び試料排出口１３を含むノズル９及びキャップ１０とから構成される。使用するまでは、ボトル内に検体処理液を約0.8mL含み、キャップ１０をした状態で保存されている。使用に際し、キャップ１０を開け、採取した検体0.15mLをボトル８内に加え、検体処理液と混和する。その後、キャップ１０の代わりに試料排出口１３を含むを含むノズル９をボトル８に装着し、上記の処理した試料を試料排出口１３から排出する。ノズル９の内側、試料排出口１３と試料通過口１２の間に、本発明のろ過部材１１を装着した（図４）。検体処理液で処理した後の試料は、試料通過口１２からろ過部材１１を経て、試料排出口１３から図１の試料添加部材１に滴下され、免疫クロマトグラフィーが行われる。
【００２２】
（実施例２）ろ過部材
実施例１で示したろ過部材１１を構成する膜は、膜孔径1.5μm厚さ0.4mmのガラス繊維濾紙(ろ過膜ａ)、膜孔径23μm厚さ0.4mmのガラス繊維濾紙（ろ過膜ｂ）、厚さ0.7mmのガラスフィルターである。また、ろ過膜ａからなるろ過部材（▲１▼）、ろ過膜ｂからなるろ過部材（▲２▼）、ガラスフィルターからなるろ過部材（▲３▼）、ろ過膜ａ及びろ過膜ｂを積層してなり試料通過口１２から試料排出口１３に向かってろ過膜ｂ、ろ過膜ａの順に積層されているろ過部材（▲４▼）、ろ過膜ａ、ろ過膜ｂ及びガラスフィルターを積層してなり、試料通過口１２から試料排出口１３に向かってガラスフィルター、ろ過膜ｂ、ろ過膜ａの順に積層されているろ過部材（▲５▼）を調製した。
【００２３】
（実験例１）
実施例２で示した▲１▼〜▲５▼の各種のろ過部材をノズル９に装着した検体処理容器を用いて、検体処理後ろ過した試料についてイムノクロマトグラフィーを行ったときの効果を調べた。
まず、0.3v/v%NP40、0.4MNaCl及び10mMジチオトレイトールを含有する100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)からなる検体処理液0.8mLを含む検体処理容器８に、検体（鼻汁）0.15mLを加えて撹拌したものを試料とし、その後該試料をろ過した。約100検体について試験を行い、ろ過部材（▲１▼）でろ過不能であった試料５検体（Ａ〜Ｅ）について各種ろ過部材の効果を検討した。その結果を表１にした。
【００２４】
【表１】
ろ過不能：試料をろ過する際に、膜の目詰まりにより、試験必要量が得られなかった。
判定不能：試料のろ過はできるが、測定において規定の判定時間になっても移動層が着色しており、判定が困難であった。
【００２６】
膜処理をしていない試料について試験を行った結果、クロマト用膜担体上で目詰まりを起こし、試料液の流れを阻害したため、判定ができなかった。
ろ過膜ａ単独では膜孔径が小さいために、試料をろ過する際に膜の目詰まりを起こし、ろ過することができなかった。
ろ過膜ｂ又はガラスフィルター単独では、膜孔径が大きすぎるため、試料は膜を素通りしてしまい、その結果、試料がクロマト用膜担体上で目詰まりを起こし、試料液の流れを阻害したため、判定ができなかった。
ろ過膜ａに、膜孔径の大きな膜を組み合わせることで、試料中の不溶物が段階的に取り除かれ、膜及びクロマト用膜担体上での目詰まりがなくなり、判定することができた。
【００２７】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、クロマト用膜担体上での目詰まりがなくなり、イムノクロマトグラフィーの検査がスムーズに行われることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】展開型の免疫クロマトグラフィー検査用テストストリップの概略を示す図である。
【図２】フロースルー型の免疫クロマトグラフィー検査用反応装置の一部を示す図である。
【図３】免疫クロマトグラフィー検査用検体処理容器の概略を示す図である。
【図４】図３の検体処理容器のうち、ノズル部分を説明する図である。
【符号の説明】
１ 試料添加部材
２ 標識保持部材（被測定物質に対する抗体標識着色粒子保持部）
３ クロマト用膜担体
４ 検出部位（被測定物質に対する抗体固定部）
５ 吸収部材
６ コンテナー
７ 開口部（試料添加口）
８ 検体処理用容器
９ ノズル
１０ キャップ
１１ ろ過部材
１２ 試料通過口
１３ 試料排出口
Claims (9)
- 鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体処理液で前処理することにより調製された試料を免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査するための免疫クロマトグラフィー検査キットであって、
一端に開口部を有し、検体処理液を収容した状態で開口部がキャップによって封じられた検体処理容器と、キャップが外された検体処理容器の開口部に装着可能であり、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルと、３〜１２μｍの膜孔径を有するクロマト用膜担体を備えた免疫クロマトグラフィー用テストストリップと、を備え、
濾過部材は、膜孔径が免疫クロマトグラフィー用テストストリップのクロマト用膜担体の膜孔径の１／１０〜１／１倍の孔径である濾過膜（Ａ）と、膜孔径が濾過膜（Ａ）の１０〜３０倍である濾過膜（Ｂ）とを備えることを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査キット。 - 鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体処理液で前処理することにより調製された試料を免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査するための免疫クロマトグラフィー検査キットであって、
一端に開口部を有し、検体処理液を収容した状態で開口部がキャップによって封じられた検体処理容器と、キャップが外された検体処理容器の開口部に装着可能であり、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルと、免疫クロマトグラフィー用テストストリップと、を備え、
濾過部材は、膜孔径が０．３〜１２μｍの濾過膜（Ａ）と、膜孔径が５〜５０μｍの濾過膜（Ｂ）とを備え、濾過膜（Ａ）の膜孔径が濾過膜（Ｂ）の膜孔径よりも小さいことを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査キット。 - 濾過膜（Ａ）の膜孔径が０．５〜５μｍであり、濾過膜（Ｂ）の膜孔径が１０〜５０μｍである請求項２記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
- ノズルが、更にガラスフィルターを有する請求項１〜３の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
- 濾過膜（Ａ）および濾過膜（Ｂ）が試料排出孔側から順に設けられている請求項１〜３の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
- 濾過膜（Ａ）、濾過膜（Ｂ）およびガラスフィルターが試料排出孔側から順に設けられている請求項４に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
- 免疫クロマトグラフィー用テストストリップが展開型免疫クロマトグラフィー用テストストリップである請求項１〜６の何れか１に記載の免疫クロマトグラフィー検査キット。
- 検体処理液を収容した検体処理容器の開口部から、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を入れる工程、
検体と検体処理液の混合物を収容した検体処理容器の開口部に、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルを装着する工程、
ノズルの試料排出孔を介して供給された試料を、３〜１２μｍの膜孔径を有するクロマト用膜担体を備えた免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査する工程からなり、
濾過部材は、膜孔径が免疫クロマトグラフィー用テストストリップのクロマト用膜担体の膜孔径の１／１０〜１／１倍の孔径である濾過膜（Ａ）と、膜孔径が濾過膜（Ａ）の１０〜３０倍である濾過膜（Ｂ）とを備えることを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査方 法。 - 検体処理液を収容した検体処理容器の開口部から、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を入れる工程、
検体と検体処理液の混和物を収容した検体処理容器の開口部に、一端に試料排出孔を有し、濾過部材を備えたノズルを装着する工程、
ノズルの試料排出孔を介して供給された試料を、免疫クロマトグラフィー用テストストリップによって検査する工程からなり、
濾過部材は、膜孔径が０．３〜１２μｍの濾過膜（Ａ）と、膜孔径が５〜５０μｍの濾過膜（Ｂ）とを備え、濾過膜（Ａ）の膜孔径が濾過膜（Ｂ）の膜孔径よりも小さいことを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査方法。
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