JPH09511581A - 化学アッセイ較正方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 化学アッセイ、例えば、ＡＴＰ生物発光アッセイを内部的、外部的両方でそれぞれに光標準化するための方法が開示される。所定の持続時間と強さの可視光フラッシュに露光するとき既知量の遊離検体を放出するアッセイ・プロトコールにおいて所定の量の興味検体の感光性誘導体を使用する。既知量の検体の放出に対するそのアッセイの試験特性の応答を監視することによって、アッセイされる試料中にもともと存在する検体の量を決定すること、または、アッセイされる試料の結果が比較できる光較正体系を作り出すことを許す標準値が算出できる。

Description

【発明の詳細な説明】 化学アッセイ較正方法 本発明は化学アッセイ較正方法に関し、より詳しくは、専用ではないが、アデ ノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）のアッセイのような分析微生物学における重要検 体のアッセイを較正する方法に関する。 分析目的のための物質または微生物の正確な検出と定量化は、実験室用ツール に欠くことはできないものである。製造または工程管理の目的のため、または食 品安全性の理由で、汚染物質または汚染微生物の正確な検出と定量化は、食料、 飲料産業にとって最重要である。微生物量評価は、廃棄物処理の制御、滅菌法の 監視、および空気の質の監視を含めた多数の他の応用においても同様に重要であ る。多くの場合、できるだけ最短時間内に微生物または化学汚染の程度が評価で きることは有利である。 多数のアッセイ技術が対象検体の検出と定量化のために利用可能であり、例え ば、酵素アッセイ、エンザイムーリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ Ａ）、分光分析アッセイ、発光アッセイ、蛍光アッセイ、クロマトグラファッセ イ、試験サンプルの光学的回転での変化の測定に基づくアッセイ、イオン選択性 アッセイ（滴定アッセイを含む）、および比色アッセイが挙げられる。使用され る具体的なアッセイ方法は、主として検出、定量化される検体に依存する。 選択される具体的なアッセイ方法ができるだけ正確であり再現性があるという ことは不可欠である。そういうアッセイの正確さを最大にするには、そのアッセ イの標準化または較正が重要である。様々な要因がそのアッセイ反応に影響を与 えるし、誤りの原因となるかもしれず、これら要因の影響は最小化し、あるいは 考慮しなければならない。 アッセイそれ自体よりもむしろ器具を標準化するために放射活性同位元素を利 用する標準化技術が知られている。そういう放射活性標準化の一例は、Ｂｉｏｌ ｉｎｋＬｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＤＨ Ｌｅａｂａｃｋ、発光測定支援と しての利用簡単な光標準、Ａ．Ａ．Ｓｚａｌａｙ他、（Ｅｄｓ）、３３−３７頁 、 Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ ｅ、ｓｔａｔｕｓ Ｒｅｐｏｒｔ、第７回Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａ ｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ国際シンポジウムの予講、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙと息子達、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、１９９３）に具体化されている 。そういう標準は、定義されたスペクトル範囲の光を放出し長期の保存において 予測可能な崩壊を示すガス性−トリチウム−活性化螢光物質に基づいている。そ ういう考案は、発光測定それ自体の較正において単に助けとなるだけである。 試料および試薬組成の多様性を考慮に入れることができるようにそのアッセイ 自体もまた較正したり標準化したりすることは、等しく重要である。 例えば、アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）は微生物学的アッセイにおいて重 要な検体である。ＡＴＰは生細胞中に見出されるけれども死細胞中には見出され ないのであり、試料中のその存在は微生物汚染を暗示できるのである。 ＡＴＰをアッセイするために広く使われる一つの技術は、ＡＴＰ生物発光技術 である。 アメリカンファイアフライ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）から精製さ れた酵素（ルシフェラーゼ）、サブストレート、物質Ｄ−ルシフェリン、および 十分なマグネシウムイオンと溶解酸素の存在下では、次の反応を起こす。 Ｍｇ−ＡＴＰ＋Ｏ₂＋Ｄ−ルシフェリン １ファイアフライ・ルシフェラーゼ オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ＰＰ_i＋ＣＯ₂ ＋光 （ＡＴＰ＝アデノシン５’三リン酸；Ｍｇ＝マグネシウムイオン；Ｏ₂＝酸素； ＡＭＰ＝アデノシン５’−リン酸；ＰＰ_i＝無機燐酸塩；ＣＯ₂＝二酸化炭素）。 適当な条件下で、その反応によって生じる光の量はＡＴＰ濃度に直接比例し、 敏感な光検出器を利用して検出できる。これがＡＴＰ生物発光アッセイの基本で ある。 ファイアフライ・ルシフェラーゼ反応を利用したＡＴＰのアッセイは、二つの 方法（Ｐ．Ｈ．Ｊａｇｏ、Ｇ．Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ、Ｗ．Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎお よびＪ．Ｒ．Ｍ．Ｈａｍｍｏｎｄ、１９８９、ＡＴＰ発光中における「微生物学 における迅速な方法」、応用細菌学技術体系学会、２６巻、Ｐ．Ｅ．Ｓｔａｎｌ ｅｙ他、（ｅｄｓ）、５３−６１頁）で較正可能である。 ある外部標準化技術によれば、試料とのファイアフライ・ルシフェラーゼ試薬 の反応からの光出力は、標準曲線を利用したＡＴＰの既知量とのファイアフライ ・ルシフェラーゼ試薬の反応から得られる光出力と比較できる。 この技術は便利であり試薬操作を最小にするけれども、また誤差を生じやすい 。なぜなら、ファイアフライ・ルシフェラーゼ反応からの光出力は反応率に直接 関わるからである。そのＡＴＰ濃度は実際反応率を制御する最大較正を作るけれ ども、それは唯一の決定因子ではない。その試料中に存在する抑制物質（例えば 、金属イオン、水素イオン）は反応率を下げ得るし、洗浄剤のような刺激物質は 反応率を上げ得る（Ｗ．Ｊ．ＳｉｍｐｓｏｎおよびＪ．Ｒ．Ｍ．Ｈａｍｍｏｎｄ 、１９９１、Ｊｏｕｒｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．＆Ｂｉｌｏｕｍｉｎ．、６、 ９７−１０６）。さらに、ファイアフライ・ルシフェラーゼ反応自体の固有活性 は、生成または取扱いにおける矛盾により変化するかもしれない。仮に反応率が 影響されないとしても、ある有意な程度に生じた光を吸収する物質が反応混合物 中に存在して誤差を引き起こすかもしれない。いくらかの物質、とりわけＺｎ^2- は、ファイアフライ・ルシフェラーゼの酵素活性を下げるのに加えて、反応中に 生じた光の波長を変化させる。これは、いくつかの型の発光測定器における反応 から検出されるべき光の量の低下の原因となり得る（Ｊ．Ｌ．Ｄｅｎｂｕｒｇお よびＷ．Ｄ．ＭｃＥｌｒｏｙ、１９７８、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ ｈｙｓ．１４１、６６８−６７５）。 標準曲線アプローチを捨てて内部標準化技術の方を選ぶなら、これらの誤差の 原因のすべてを解消できる。その最も単純な形式では、これは少容量の液体に含 まれる既知量のＡＴＰをファイアフライ・ルシフェラーゼ反応に追加することか ら成り立っている。試料およびルシフェラーゼのみからの光出力と、試料および ルシフェラーゼおよびＡＴＰからの光出力とを比較し、それからその試料のＡＴ Ｐ含量を算出する。この方法は、作業者を可変試料組成に関連した分析誤差から 解放する。 しかしながら、この技術の基礎は安定したＡＴＰ標準溶液の使用にある。ＡＴ Ｐ標準溶液の安定性に関しては、多くの議論がある。いく人かの研究家は、その ようなＡＴＰの希釈溶液は不安定であり光から遠ざけておかなければならない、 および／または、氷の上に保存しなければならないと要求している。また、その 溶液のまずい扱いにより問題が生じ得る。ＡＴＰ標準溶液の安定性にとっての最 大の脅威は、その溶液中の汚染微生物の存在である。ＡＴＰは急速に多くの微生 物によって利用され（Ｄ．Ｍ．Ｋａｒｌ、１９８０、Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ ｖ．４４、７９９−７９６）、それゆえ、ＡＴＰ標準溶液からの微生物の排除は 不可欠であり、無菌技術が必須である。前もって秤量されたＡＴＰバイアルは若 干の専門発光試薬製造業者から購入可能であるが、そのＡＴＰバイアルの使用は これら了解された制限のために普及してはいない。これらの問題は、すべて、Ａ ＴＰ生物発光アッセイを食品衛生や空気の質の監視というような安全限界領域に 採用するとき、より重要となる。 ＡＴＰ生物発光技術により例示したけれども、アッセイの標準化する問題は他 のアッセイ方法にも等しく当てはまる。 本発明の目的は、内部光標準化技術の利用により化学アッセイ標準化問題を改 善することである。 本発明によれば、 （ｉ）所定の量の検体の感光性誘導体をアッセイされるべき試料に加える工程と ； （ｉｉ）アッセイの試験特性を測定する工程と； （ｉｉｉ）上記試料／感光性誘導体の混合物を所定の持続時間と強さの可視光フ ラッシュに露光して該感光性誘導体から既知量の検体を放出する工程と； （ｉｖ）上記試験特性を再測定する工程と； （ｖ）必要に応じて（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の工程を零からｎ回繰返す工程と； （ｖｉ）上記試験特性測定における変化を算出する工程と； （ｖｉｉ）（ｖｉ）の工程からの算出値を標準値として使用し、上記試料中にも ともと存在する検体の量を決定する工程と； を含む化学アッセイを内部的に標準化する方法を提供する。 本発明の他の目的は、光較正体系の製造により化学アッセイを標準化する問題 を改善することである。 本発明の他の態様によれば、 （ｉ）所定の量の検体の感光性誘導体を所定の持続時間と強さの可視光フラッシ ュに露光して該感光性誘導体から既知量の検体を放出する工程と； （ｉｉ）アッセイの試験特性を測定する工程と； （ｉｉｉ）必要に応じて（ｉ）と（ｉｉ）の工程を零からｎ回繰返す工程と； （ｉｖ）上記試験特性測定における変化を算出する工程と； （ｖ）（ｉｖ）の工程からの算出値を、それに対してアッセイされる試料の結果 を比較する標準値として使用する工程と； を含む化学アッセイを外部的に標準化する方法を提供する。 ある環境では上記感光性誘導体を乾燥状態で使用するのが望ましいかもしれな いが、上記感光性誘導体は光分解工程の前に溶液中にあるのが好ましい。 多点較正手続きが望ましい環境では、工程（ｉｉｉ）でのその可視光フラッシ ュの強さおよび／または持続時間は光分解に利用可能な感光性誘導体の減量を補 償するように変化させてもよい。 本発明のさらに他の目的は、ＡＴＰ生物発光アッセイを標準化する方法を提供 することである。 本発明のさらに他の態様によれば、 （ｉ）所定の量のＡＴＰの感光性誘導体をファイアフライ・ルシフェラーゼ−ル シフェリン試薬中に組入れる工程と； （ｉｉ）該試薬から発せられる光を測定する工程と； （ｉｉｉ）アッセイされるべき試料を上記試薬と混合する工程と； （ｉｖ）その発光反応によって発せられる光を再測定する工程と； （ｖ）上記試料／試薬混合物を所定の持続時間と強さの可視光フラッシュに露光 して上記感光性誘導体から既知量のＡＴＰを放出する工程と： （ｖｉ）その発光反応によって発せられる光を再測定する工程と； （ｖｉｉ）必要に応じて（ｖ）と（ｖｉ）の工程を零からｎ回（零とｎ回とを含 めて）繰返す工程と； （ｖｉｉｉ）その発光測定における変化を算出する工程と； （ｉｘ）（ｖｉｉｉ）の工程からの算出値を標準値として使用し上記試料中にも ともと存在するＡＴＰの量を決定する工程と； を含むＡＴＰ生物発光アッセイを標準化する方法を提供する。 本方法、非放射活性光標準化技術は、（ｉ）結果の精密さと正確さ；（ｉｉ） 結果の検証；および（ｉｉｉ）ユーザーに親切という点で従来利用可能な標準化 方法よりも有利さを提供する。 増強された精密さは、検体標準追加に関連したピペット滴定誤差の解消に由来 するものであり、かつ、アッセイ希薄に関連した光学的または酵素的急冷におけ るあらゆる変化の補償に由来するものである。単純で確かな標準化プロトコール を付与する能力は、簡単化された結果の検証、食品と標準値制定に関する特に重 要な点、およびある安全限界の適応の形で利益をもたらす。ユーザーに親切に改 良されたことは、そのようなアッセイを実行するのに異なる検体標準溶液は必要 ではないということとアッセイ試薬を工場較正できるということに由来する。さ らに、そのアッセイの標準化は、興味検体を検出しあるいは定量化するのに使用 される方法とは完全に独立していてかまわない。 生物学的興味の合成化合物の範囲は、感光性化学結合を含む物理学研究での使 用のために発展してきたのである。これらの化合物の一つが短くてしかも強いフ ラッシュに露光されると、反応生成物が放出される。その感光性化合物は「籠入 り」化合物と呼ばれ、その化合物から興味分子や興味イオンを解放することがで きる。それゆえ、ＡＴＰが籠入りＡＴＰから解放され、Ｃａ²⁺が籠入りＣａ²⁺か ら解放される等々。そのような感光性検体誘導体は本発明に適切であり、高強度 写真用フラッシュランプまたはＱスイッチ周波数２倍レーザとの共用は化学アッ セイを標準化する便利で非侵害の手段を提供する。商業的に入手しやすい写真用 フラッシュランプが、籠入り先駆物質から検体分子を効率よく放出させ得るとい う知見はこれまで知られていない。 本発明の第一の好適な方法によれば、所定の量の「籠入り」化合物をアッセイ されるべき試料に、または、アッセイされるべき試料を希釈するのに使われる緩 衝剤に加えることができる。その後、そのアッセイの特別な試験特性が測定され る。その測定された試験特性は当該アッセイに依存するが、発光、熱発生、色変 化や他の特性であるかもしれない。 その後、その混合物を所定の強さと持続時間のフラッシュに露光することによ って、所定の量の遊離化合物がその「籠入り」化合物から放出される。その後、 その試験特性を再測定してもよいし、試験特性測定での変化を算出してもよい。 それから、その算出値を標準値として使用してその試料にもともと存在した検体 の量を決定してもよい。 それとは別に、本発明の他の好ましい方法によれば、「籠入り」化合物の単一 強度溶液中の光分解の程度を変えることによって、ある範囲の標準濃度の興味化 合物を生成することができる。このように、較正体系を、異なる容量の標準検体 溶液をピペットする必要なしに、例えば微滴定板上に準備することができる。こ の形式では、試験アッセイのために従来のアッセイ手続きに従ってもよいが、選 択されたアッセイにおいては、アッセイ工程を実行する前に「籠入り」検体の光 分解によって標準化を達成できよう。 従ってこの一般的光標準化システムは、エンザイム−リンクドイムノソルベン トアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素アッセイ、分光分析アッセイ、蛍光アッセイ、 試験サンプルの光学的回転での変化の測定に基づくアッセイ、（滴定アッセイを 含む）イオン選択性アッセイ、および比色アッセイを含む多様なアッセイシステ ムと共用できる。 最大限の精密さと正確さが試験手続きに要求される場合には、単点較正よりも むしろ多点較正を行う方が望ましいかもしれない。これは、（理想的には微量滴 定板またはそれに相当するものの中で）単一強度「籠入り」化合物の異なる溶液 を別々に光分解することにより較正体系を作成することによって達成できる。例 えば所定の強さと持続時間を持つ一つ、二つ、三つまたは四つのフラッシュを採 用することにより、光分解の程度を変えることで、一組の較正標準が得られる。 しかしながら、測定と較正とを同じ管の中で侵害のないように行わなければな らない場合や検体がプロトコールの始まりのようなアッセイプロトコールの特定 の工程で存在しなければならない場合、このアプローチは適当ではない。しかし ながら、ＡＴＰ生物発光アッセイのような単一管アッセイで多点較正を行うこと は可能である。これは、そういうアッセイプロトコールが、検体が試験溶液中に 放出される点で強いということに由来する。ある環境下では、正確さと精密さと いう意味で、単一管アッセイの多点較正はそういう試験の単点較正よりも優れて いるかもしれない。 そういう手続きを考案する際に、光分解のために入手容易な「籠入り」材料の 総量と光源の強さとの関係を最適化することが重要である。単点較正手続きによ り標準化されるアッセイの場合、反応中できるだけ少ない「籠入り」材料を使用 することと、「籠入り」材料から５０％を越える検体を放出するに十分な強さの 光を使用して「籠入り」材料の検体への変換を最大化することとが望ましい。し かしながら、多点較正手続きにより標準化されるアッセイの場合、光分解の第一 期間に露出中の検体の１−２％の放出を達成できるだけの強さの光を使用して「 籠入り」検体の遊離検体への変換を制限することが不可欠である。その結果、十 分な量の検体が放出されるのを確実にするには、そのアッセイ中に存在する「籠 入り」材料の総濃度が単点較正で使用されるよう設計された試薬における場合よ りも高くなければならない。 固定強度と固定持続時間のフラッシュを使用すると、各シーケンスのフラッシ ュで放出される検体の量は低下する。フラッシュ強度および／または持続時間を 変えることによって、光分解に利用できる「籠入り」材料の減量を補償すること ができ、その結果、同量の検体が各段階で生成され直線的較正体系が作成される 。 実際には、標準的な一組の光分解条件下で放出される検体の量は、検体の非誘 導形を利用して作成された個別作成標準曲線を参照することによって決定できる 。反応中の感光性検体の濃度はある量の検体の放出を達成するように調整でき、 あるいは、フラッシュの強度および／または持続時間は同じ目的を達成するよう に調整できる。 ある材料は、フラッシュガンによって作られるような高強度のフラッシュに露 光されたとき、燐光を発する。そういう燐光の強度は材料に依存する。発光の測 定により検体濃度の評価がなされる試験（例えば、生物発光、化学発光や蛍光に 基づく試験）では、燐光は障害の原因である。そのような障害を最小化しまたは 補正する方法は次のもの（１以上の戦略が一度に利用できることに注意）を含む 。 第一の戦略は、光分解の期間と測定の期間との間に時間遅延をもたらすことで ある。燐光強度の対数は、経過時間の対数の増加に比例して減少する。その結果 、数秒の隙間が測定光放出を多くの型のアッセイに対して受け入れることのでき る値に減じるのに十分である。 第二の戦略は、試料を放射するのに使用される光を濾過する（またはレーザ光 源からのそれのような単一光を使用する）か、またはキューベット材料によって 発せられる光を濾過するかのいずれかである。両戦略は、使用する材料に依存し て、等しい効き目を有するか、あるいは異なる効き目を有するかのどちらかであ る。 第三の戦略は、光標準化プロトコール中に特定された発光条件に露光されたと き燐光に低ポテンシャルを持つ材料を選択することである。 普通の実験室使用の材料は、写真用フラッシュランプ形の標準多色光に露光さ れたとき実質的に燐光特性が違っている。 さらに他の戦略は、燐光の結果として発せられた光に対して光分解後得られた 結果を訂正することである。これは、（ｉ）材料の固有燐光は既知であること、 （ｉｉ）材料は標準仕様に合わせて選択されること、（ｉｉｉ）光への露出後測 定がなされる時間が標準化されること、の条件で電子計算装置を使用して達成で きる。 多くの「籠入り」生成物は、商業的に得られる場合でも平凡な技術を利用して 生成される場合でも、多かれ少なかれ「非籠入り」生成物で汚染される。光標準 化技術の最適性能を実現しようとするなら、「非籠入り」生成物の存在は技術的 に無視できるレベルに減じなければならない。籠入りＡＴＰの場合、その籠入り ＡＴＰを可溶、固定化いずれかの形のアピラーゼのようなＡＴＰ低下酵素を反応 させることによって汚染ＡＴＰ分子を除くことができる（ファイアフライ・ルシ フェラーゼと反応しないＡＤＰとＡＭＰに変換できる）。あるいはまた、その「 籠入り」ＡＴＰを含むリシフェリン−ルシフェラーゼ試薬を８−２０時間以上４ ℃で培養してもよい。この時間中、ファイアフライ・ルシフェラーゼはＡＴＰの 加水分解を触媒するが「籠入り」ＡＴＰのレベルには影響しない。ＡＴＰは、ま た、クロマトグラフィ、選択性析出、または抽出を含む予備的化学において現在 知られる技術のいずれかを利用して除去することができる。類似自然の技術は、 多くの場合一般に知られた方法を使ってアッセイを光標準化する目的のために利 用するのに先だって他の「籠入り」型検体を扱うのに利用できる。 ある場合には、その「籠入り」材料をさらに精製することが望ましいかもしれ ない。例えば、ＡＴＰの１−（２−ニトロフェニル）エチルエステルの場合には 、光不安定な「籠」として使用されるそのニトロフェニル基は二つの可能な構成 でＡＴＰに加えられるので、商業的に入手容易な材料は一対の透空異性体から成 る。これらの立体異性体は同一の光化学特性を有するけれども、いくつかの応用 では、その立体異性体の一つのみを使用することによって有利さが得られるかも しれない。例えば、各立体異性体のα−、β−、γ−サイクロデキストリンのよ うなアッセイ試薬の成分との反応、あるいは、より具体的には包合錯体を作るそ の能力は各立体異性体の場合で異なっているであろう。ある商業的に入手容易な ファイアフライ・ルシフェラーゼ試薬はサイクロデキストリンを含む（例えば、 Ａ．Ｌｕｎｄｉｎ、Ｊ．ＡｎｓｏｎおよびＰ．Ｋａｕ、サイクロデキストリンに より中和されたＡＴＰ抽媒、Ａ．Ｋ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、（Ｅｄｓ）、３９９ −４０２頁、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ ｅｓｃｅｎｃｅ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐ ｅｃｔｓ、第８回Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍ ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ国際シンポジウムの予講、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙと息子達、 Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、１９９４を参照）。籠入り物質の立体異性体は、周知の 技術を利用して、それぞれに分離できる。 ある環境では、固定量のその「籠入り」化合物はアッセイを実行するのに使用 される設備の用具上に冷凍乾燥できる。そういう用具の例としては、使い捨てピ ペットチップ、使い捨て試料キューベットや使い捨て紙ディスクまたは紙片が挙 げられる。使用においては、試験試料や分析試薬のような液体と接触したときに その用具上に冷凍乾燥された「籠入り」化合物は溶解する。「籠入り」化合物は 乾燥状態であろうと溶液状態であろうと、所定の量の検体を光分解により各時間 にその「籠入り」分子から放出できる。この種の標準化戦略は、その「籠入り」 化合物が水溶液中で適当な安定性を欠く場合に特別に価値あるものである。乾燥 状態では、ほとんどの「籠入り」化合物の加水分解や酸化に対する安定性は顕著 に増す。 酵素活性によって検体が異なる化合物に変換されるような酵素アッセイでは、 その検体の変換はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのようなフラビンヌク レオチドの還元またはＡＴＰのような化合物の生成と対になっているかもしれな い。「籠入り」型の「第二」検体（例えば、ＮＡＮＤまたはＡＴＰ）は反応混合 物に含まれ、任意のときに光分解によって放出することができる。その結果、ア ッセイの標準化が標準材料の異なる溶液を準備する必要なしに達成され、時間と 作業者の労苦とを節約する。 一つ以上の上記戦略を使って標準化できる検体の例としては、ＡＴＰ、アデノ シン一燐酸（ＡＭＰ）、環状アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）、アデノシン二燐酸 （ＡＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、（Ｄ−ルシフェリンのような）発 光反応のための物質、（Ｌ−ルシフェリンのような）発光反応抑制物質、（蓚酸 のような）有機酸類、（アラキドン酸(arachadonic acid)のような）脂肪酸類、 （フェニルアラニンのような）アミノ酸類、（グルコースのような）糖類、（グ ルコース−６−フォスフェートのような）糖のリン酸エステル、（アトラジンの ような）殺虫剤、（オクラトキシンＡのような）自然発生毒物、（ベンジルペニ シリンのような）抗生物質、そして、（ドーパミン、ノルエピネフリン、セロト ニン、テストステロンやインターフェロンのような）薬理学的興味化合物が挙げ られる。このリストは余すところなく挙げるのを意図したものではなく、説明の ためのものである。 ＡＴＰを放出するＡＴＰの様々な感光性誘導体が合成されている。これらＡＴ Ｐ誘導体の一例は光加水分解性エステル結合を含むＡＴＰのニトロフェノールエ ステルである（図１）。この化合物群の他の構成要素はそのニトロフェノールと 置換できた。適当なＡＴＰ誘導体のさらに他の例は１−（４，５−ジメトキシ− ２−ニトロフェニル）ジアゾエタン（ＤＭＮＰＥ）である。 籠入りＡＴＰは、筋肉生化学の研究を含めて多様な領域に関係した多数の研究 応用中で使用されている。（Ｙ．Ｅ．Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｍ．Ｇ．Ｈｉｂｂａｒｄ 、Ｊ．Ａ．ＭｃＣｒａｙおよびＤ．Ｒ．Ｔｒｅｎｔｈａｍ、１９８２、Ｎａｔｕ ｒｅ、３００、７０１−７０５）。それは生化学または微生物学アッセイを較正 す る目的で以前より示唆され使用されていたわけではない。 籠入りＡＴＰからのＡＴＰの収率はｐＨ範囲６−９を越えるｐＨに無関係であ ることが示されており、さらに、籠入りＡＴＰは、それが中性ｐＨで水溶性であ り柔らかい昼光への数分の露出の間に大きくは光分解されないという点で、取扱 いに便利であるということが示されている（Ｊ．Ａ．ＭｃＣｒａｙ、Ｌ．Ｈｅｒ ｂｅｔｔｅ、Ｔ．ＫｉｈａｒａおよびＤ．Ｒ．Ｔｒｅｎｔｈａｍ、１９８０、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７７、７２３７−７２４１） 。 本発明の方法によりＡＴＰ生物発光反応を較正するためには、籠入りＡＴＰ化 合物を所定の濃度でファイアフライ・ルシフェラーゼ試薬に含める。ファイアフ ライ・ルシフェラーゼは籠入りＡＴＰに対して何の酵素活性も示さないし（例１ 参照）、それゆえ、加えられるＡＴＰがないなら、そういうルシフェラーゼ製剤 から発せられる光はない。その試薬は次のようにＡＴＰの高感度アッセイをなす ため使用してよい。 試料とその試薬とは使い捨て発光測定キューベット中で混合される。その試料 はいすれかの起源の水溶液から構成されていてもよいし、生有機体からＡＴＰを 放出するよう設定された様々な製剤のいずれかと処理された結果として生成され た特別に準備された「抽出物」であってもよい。その発光反応から発せられる光 が発光測定器を使用して測定される。その後、そのキューベットを、その内容物 とともに例えば写真用フラッシュランプから届けられた高強度の可視光フラッシ ュに露光することによって既知量のＡＴＰがその反応混合物中に放出される。そ の後、そのキューベットは発光測定器中に戻されルシフェラーゼ反応からの発光 がもう一度測定される。そのフラッシュはその存在する籠入りＡＴＰからの既知 量のＡＴＰの放出を引き起こすから、この既知量のＡＴＰの存在による光の量は 差によって計算できる。その後、その反応混合物中にもともと存在していたＡＴ Ｐの量を算出できる。 次の非限定な例は本発明の性格をより明確に記述することを意図する。例１ ＡＴＰアッセイの標準化のための籠入りＡＴＰの使用 籠入りＡＴＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．、ＵＳＡ、ｐｒｏｄ．ｎｏ．１１９１ ２７、５ｍｇ）を０．５ｍｌ無菌脱イオン水中に溶解した。生じた原液を、必要 になるまで−２０℃で貯蔵冷凍した。使用前に、無菌脱イオン水で１０００分の １に希釈した。３ｍｌの商業的に入手容易なルシフェラーゼ−リシフェリン試薬 （バイオトレースＸＴ試薬、Ｂｉｏｔｒａｃｅ Ｌｔｄ．、Ｂｒｉｄｇｅｎｄ、 ＵＫ）に、２００μｌの無菌脱イオン水を加えて対照試薬を作成または２００μ ｌの籠入りＡＴＰ原液を加えて籠入りＡＴＰ試薬を作成した。その後、それら試 薬を２０℃で１−６時間培養（インキュベート）した。 それら試薬の準備後様々な時間で、無菌脱イオン水（３００μｌ）を清浄な使 い捨て発光測定キューベットに移し替えて１００μｌの対照試薬または籠入りＡ ＴＰ試薬を加えた。２秒遅延後１０秒間光反応を積算するバイオトレースＭ３発 光測定器（Ｂｉｏｔｒａｃｅ Ｌｔｄ．、Ｂｒｉｄｇｅｎｄ、ＵＫ）を使って反 応から発せられた光を定量した。その後、ある容量のＡＴＰ溶液（２０μｌ、０ ．１μＭ）をその反応混合物に加えて光出力を第二時間の間測定した。その後、 そのキューベットをその内容物とともにハニメックス３２５Ａ２フラッシュガン （Ｈａｎｉｍｅｘ、ＵＫ）からの強いフラッシュに露光してその反応からの光出 力を第三時間の間測定した。 表１の結果は、得られた光出力値を示す。これらの結果から次の数点を強調す る。（ｉ）籠入りＡＴＰが存在せず１ｐｍｏｌのＡＴＰから１３０２ＲＬＵであ る試薬と９５．２ｐｍｏｌの籠入りＡＴＰの存在下で１ｐｍｏｌのＡＴＰから１ ３０４ＲＬＵである試薬の両方（平均ｎ＝５）に対して記録された１ｐｍｏｌ添 加ＡＴＰに観察された類似応答によって示されるように、籠入りＡＴＰはファイ アフライ・ルシフェラーゼ上の活性場を巡ってＡＴＰとは競合しなかった。（ｉ ｉ）１ｐｍｏｌのＡＴＰに対する試薬の応答はフラッシュ後（フラッシュ前に１ ３０８ＲＬＵであるのに対してフラッシュ後は１２７６ＲＬＵであった：その差 は単にその反応に関連した発光における自然減衰に帰せられる）も変化しないこ とによって示されるように、その高強度フラッシュはファイアフライ・ルシフェ ラーゼ反応率に影響しなかった。（ｉｉｉ）その籠入りＡＴＰ試薬の高強度フラ ッシュに対する露光は１アッセイにつき１．１７１ｐｍｏｌのＡＴＰに相当する そのアッセイでのＡＴＰ含量の増加を生み出した。それらアッセイはこの応答に 基づき較正できた。（反応に加えられたその１ｐｍｏｌの遊離ＡＴＰに関して） このようなアッセイの較正は、時間に関してランダムに分布された誤差を持つ、 １アッセイにつき１．００±０．０８ｐｍｏｌ（平均±Ｓ．Ｄ、ｎ＝５）のＡＴ Ｐの値を与えた。（１時間の試薬年齢でのデータを使用した）標準曲線技術によ って標準化された対照アッセイの場合では、１アッセイにつき０．９３±０．０ ６ｐｍｏｌ（平均±Ｓ．Ｄ、ｎ＝５）のＡＴＰの値が得られ、そしてその個々の 値は（リシフェラーゼ酵素活性の低下のため）試薬準備以来時間に関して著しい 短縮を示した。 一旦リシフェラーゼ酵素中に導入されると、籠入りＡＴＰは自然加水分解によ るか酵素の働きの結果としてかのいずれかで、かつ／または光分解によってＡＴ Ｐを放出したかもしれなかった。例１に示す諸結果は、前二者によるＡＴＰの放 出は無視できるということ、およびフラッシュガンによって作られた高強度のフ ラッシュの露光でＡＴＰは存在するその籠入りＡＴＰから急速に生成されるとい うこととを示す。 表１への注 １．（ハニメックス３２５Ａ２フラッシュガン、Ｈａｎｉｍｅｘ、ＵＫによって 提供された）高強度フラッシュは空のキューベットからの発光を引き起こさない し、水または籠入りＡＴＰのような試験溶液または籠入りＡＴＰのないルシフェ ラーゼ−ルシフェリン試薬を含むキューベットからも発光を引き起こさなかった 。 ２．その「ＡＴＰ光標準」（籠入りＡＴＰ）は高強度フラッシュに対する露光で １アッセイにつき１．１７１ｐｍｏｌのＡＴＰを生成した。 これはそのアッセイ中に存在する籠入りＡＴＰの１．２３％の変換率を意味す る。 ３．光標準化技術がそういう試薬の使用とうまく合うことを示す試料母材として 、水の代わりに洗浄剤に基づくＡＴＰ抽出剤（水はけ希釈剤ＸＴ、Ｂｉｏｔｒａ ｃｅ Ｌｔｄ．、Ｂｒｉｄｇｅｎｄ、ＵＫ）の存在下にそれらアッセイを行った とき、同様の結果が得られた。例２ 第二の実験では、同様のアッセイの組が行われた。これら実験では、対照およ び籠入りＡＴＰルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬は使用前に６時間インキュベ ートされていた。ＡＴＰの添加および／または光のフラッシュ前に試薬が加えら れる試料混合物は、無菌脱イオン水または水と０．１Ｍの３，３’−ジメチルグ ルタル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．００）との混合物であった。これら実験条 件は最終アッセイであるｐＨ値範囲を作成するように構成される。表２の結果は 、増量した緩衝液の存在下では、１ｐｍｏｌのＡＴＰを含む反応からの光出力は 低下したことを示す。こうして、標準曲線アプローチを採用して、かつ、結果が 試料母剤として水を使用して得られたものを参照したなら、実質的な誤差は明ら かであった。極端に言えば、１アッセイにつき０．０５ｐｍｏｌのＡＴＰの値、 すなわち、真の値の１２分の１しか得られなかった。光標準化技術に基づく結果 は、同様に誤差を受けやすいが、それはより小さな規模の誤差であった。 次のデータは光標準化技術の利用のさらなる証拠を提供する。各１００μｌ試 薬が４３．１ｐｍｏｌ籠入りＡＴＰ（すなわち、４３１ｎｍｏｌ／ｌ）を含むよ うな濃度になるように、籠入りＡＴＰをバイオトレースＭＬＸ試薬（Ｂｉｏｔｒ ａｃｅ、ＵＫ）に添加することによって、籠入りＡＴＰを含んだリシフェラーゼ ／リシフェリン試薬を作成した。この試薬は４３．１ｐｍｏｌ籠入りＡＴＰ（す なわち、４３１ｎｍｏｌ／ｌ）を含有した。この試薬を一晩中４℃で培養して背 景発光を減らした。アッセイを次のように行った。ＡＴＰを一連の管に（１０μ ｌ無菌脱イオン水の管当たり１ｐｍｏｌ）それぞれ添加後、ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴ Ａ緩衝液（緩衝液の元のｐＨ値は７．７５であった）中２９０μｌの三塩化酢酸 (Trichloroacteic acid)（ＴＣＡ）溶液を添加した。その溶液中のＴＣＡの最終 濃度は、それぞれ２．５ｇ／ｌ、１．２５ｇ／ｌと０．２５ｇ／ｌであった。 各試料の場合、１００μｌの修飾されたリシフェラーゼ−ルシフェリン試薬を 添加することによって発光を始めた。その結果としての光出力をバイオトレース ・マルチライト・発光測定器で記録した。それから、キューベットをその発光測 定器から取り外して、我々自身が設計（シリアル番号００５）した装置中に取り 付けられたフラッシュランプを使用して高強度のフラッシュに露光した。その後 、そのキューベットを発光測定器に戻して、反応によって作られた光を第二時間 の 間記録した。 各光分解工程が１．１５ｐｍｏｌのＡＴＰの形成を行うと仮定して各管のＡＴ Ｐ含量を算出した。全試験を２回繰返して実行した。 次の結果が得られた。 その結果はＴＣＡが高濃度で存在したとき、ＴＣＡが発光を強く抑制したとい うことを示す。発光のみに基づくＡＴＰ含量の評価は、重大な誤差があったであ ろう。しかしながら、光標準化に基づく結果は、再現性がありかつ精密であった 。例３ 籠入りＡＴＰと光量変化を利用した既知濃度の連の標準溶液の作成 籠入りＡＴＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）を１４．４μｍｏｌ／ｌの最 終濃度になるように無菌脱イオン水中に溶解した。溶液の部分（３００μｌ）を 清浄な使い捨てキューベットに移し替えてから、ハニメックスフラッシュガンを 使って１フラッシュから１０フラッシュまでの間のフラッシュに露光した。光分 解後、１００μｌのルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬（バイオトレースＭＬＸ 試薬、Ｂｉｏｔｒａｃｅ ｐｌｃ、ＵＫ）を加えることによってそれら溶液を分 析した。その発せられた光を、２秒遅延後１０秒間光信号を積算するバイオトレ ース・マルチライト・発光測定器を使って定量した。 （この諸結果は図２に示されている。） 図２の結果は「較正曲線」をこのように作成できたことを示す。この曲線は、 等しい容量の異なる濃度のＡＴＰ標準溶液を別々のキューベットにピペットする ことによって作成されたはずの曲線に類似している。上述のような光標準化技術 は、実質的に作業者の労苦を節約しつつ同結果を達成できることを認めた。その 技術はまた自然に非侵害である。例４ キューベット燐光の証明 Ｌｕｍａｃ ｂｖ（Ｌａｎｄｇｒａａｆ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ） とＢｉｏｔｒａｃｅ ｐｌｃ（Ｂｒｉｄｇｅｎｄ、ＵＫ）によって供給されたも のを含む、異なる型のキューベットを我々自身が設計した試料室中に取り付けら れた写真用フラッシュガンからの高強度多色フラッシュに露光した。露光後すぐ に、各キューベットをバイオトレース・マルチライト・発光測定器の試料室に移 し替えて、その結果としての（キューベット材料の燐光と関連した）発光を１０ ０秒間以上測定した。各実験を三度繰返した。（図３はキューベット燐光の経時 減衰を示す。） 図３の結果はＬｕｍａｃキューベットからの燐光の強さがＢｉｏｔｒａｃｅキ ューベットからの燐光の強さよりもかなり大きかったことを示す。さらに、燐光 の時間過程は同型のキューベットに対して一致していた。静電気防止マットを使 用した実験は、キューベットからの発光が静電気の放電の結果ではないことを示 した。 様々なフィルタを光源に施すことによって、燐光の程度を最小化できた。Ｌｕ ｍａｃ ｂｖから得られたキューベットを、いくつかの場合にまず最初にフィル タにかけられた高強度のフラッシュに露光した後、それらキューベットをバイオ トレース・マルチライト・発光測定器中に置いた。発せられた光を時間毎に定量 した。図４はフィルタにかけられた光に露光されたキューベットに対するキュー ベット燐光の経時減衰を示す。フィルタにかけられた光への応答は、分光の紫外 線領域の光がキューベット燐光の原因であることを示した。ある範囲の材料をフ ィルタにかけられていない光によって誘導された燐光で調べた。そういった材料 からの初期発光は（バイオトレース・マルチライト・発光測定器で１０秒積算を 使って測定して）３０ＲＬＵから５２３９ＲＬＵの範囲であった。これら結果の 数点を証明する。 １．キューベットの燐光は、光標準化アッセイに使用される照明状態に露光され た試料から生ずる重大な発光に至り得る。 ２．異なる型のキューベットは、高強度の光に露光後、燐光を発する能力に違い がある。 ３．光をフィルタにかけることによって（「籠入り」材料からの検体の放出を始 めるために必要な光の波長に注意を払わねばならないけれども）燐光を最小化す ることができる。 ４．キューベットからの燐光の減衰率は、対数プロットとして描くと、直線的で ある。例５ ＡＴＰ崩壊酵素を使った籠入りＡＴＰからの遊離ＡＴＰの放出 籠入りＡＴＰ溶液（１４．３ｍｍｏｌ／ｌ；１０μｌ）を５μｌ／ｍｌのアピ ラーゼ溶液を含む１ｍｌのルミット緩衝液（ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ／Ｍｇ緩衝液 、ｐＨ７．７５；Ｌｕｍａｃ ｂｖ）に加えた。そのジャガイモ・アピラーゼは Ｌｕｍａｃ ｂｖから得られた商業的製剤（Ｓｏｍａｓｅ）であって、１瓶のア ピラーゼに１ｍｌのルミット緩衝液を加えることによって再構成された。様々な 時点で、２０μｌのこの溶液を３００μｌの無菌脱イオン水を含む清浄な使い捨 て発光測定器キューベットに移し替えた。その試料により発せられる光をバイオ トレース・マルチライト・発光測定器（Ｂｉｏｔｒａｃｅ、ＵＫ）を使って測定 した。その後そのキューベットを発光測定器から取り外して我々自身が設計した フラッシュ装置中に置いた。写真用フラッシュ管から単一フラッシュを受けた後 、そのキューベットを発光測定器に戻して発光をもう一度測定した。対照実験は 、アピラーゼ溶液よりもむしろ籠入りＡＴＰの試料にルミット緩衝液を加えた反 応からの光出力を監視した。 次の諸結果が得られた。 これらの結果は、籠入りＡＴＰの供給から汚染ＡＴＰを除くためにアピラーゼ か使用できることを示す。また、アピラーゼは籠入りＡＴＰに攻撃しない。結果 の違いは使用したＡＴＰの高レベルでの測定誤差に帰せられる。例６ 使い捨て試料キューベット中に凍結乾燥「籠入り」材料を使った試験の標 準化 籠入りＡＴＰ（１４．３μｍｏｌ／ｌ；１０μｌ）を１ｍｌのＨＥＰＥＳ／Ｅ ＤＴＡ／Ｍｇ緩衝液、ｐＨ７．７５（ルミット緩衝液、Ｌｕｍａｃ ｂｖ）に移 し替え５μｌのジャガイモ・アピラーゼ溶液を加えた。そのジャガイモ・アピラ ーゼはＬｕｍａｃ ｂｖから得られた商業的製剤（Ｓｏｍａｓｅ）であって、１ 瓶のアピラーゼに１ｍｌのルミット緩衝液を加えることによって再構成された。 そのアピラーゼを含む籠入りＡＴＰを２０℃で４０分間培養してから、ルミット 緩衝液で１：１に希釈した。その溶液の部分（１μｌ）をそれぞれ（Ｂｉｏｔｒ ａｃｅ ｐｌｃから得られた）清浄な使い捨てプラスチック・キューベットに移 し替えた。この手続きによって、各キューベットには１４３ｐｍｏｌの籠入りＡ ＴＰが含められた。その後、それらキューベットを真空デシケータ中に置いて真 空下５５℃で２時間凍結乾燥した。 凍結乾燥後、それらキューベットを次のように試験した。無菌脱イオン水（３ ００μｌ）を各キューベットに移し替えた後、１００μｌのルシフェラーゼ／ル シフェリン試薬（バイオトレースＭＬＸ試薬、Ｂｉｏｔｒａｃｅ ｐｌｃ）を加 えた。発せられた光をバイオトレース・マルチライト・発光測定器を使って記録 して後、ＢＲＦインターナショナルボックス（シリアル番号００２）で構成され た装置に含まれた写真用フラッシュランプを使って存在する籠入りＡＴＰからＡ ＴＰを放出した。次の諸結果が反復キューベット上で得られた。 ＡＴＰは、また、キューベットに試料や試薬を加える前にフラッシュによって キューベットに含まれる凍結乾燥材料から放出できた。そういった試験を行った 際に、次の諸結果が得られた。 これらの結果は、非常に少ない量の水が存在していてもＡＴＰを籠入りＡＴＰ から放出できるということを示している。こうして、必要に応じて、アッセイの どの液体工程にも先だって籠入り分子からＡＴＰまたは他の検体を放出するアッ セイ・プロトコールを考案できた。ある場合には、これはある試験を標準化する のに便利な方法であるかもしれない。例７ 籠入りアラキドン酸と光量変化を利用した一連の既知濃度の標準溶液の作 成 籠入りアラキドン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ ；製造番号Ａ−７０６２）を最終濃度が１４．４μｍｏｌ／ｌになるようＨＥＰ ＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．７５）に溶解した。その溶液の部分（１００μ ｌ）を清浄な使い捨て管にそれぞれ移し替えてから、ハニメックスフラッシュガ ンを使って１フラッシュから１０フラッシュまでの間のフラッシュに露光した。 光分解後、ＨＰＬＣ、ＣＣ／ＭＳ、ＴＬＣや特定の酵素法のような、アラキドン 酸を定量するにふさわしい任意の方法でそれら溶液を分析した。 「較正曲線」はこのように作成できるが、この曲線は、等しい容量の異なる濃 度の標準溶液を別々に瓶にピペットすることによって作成されたはずの曲線に類 似している。上述のような光標準化技術は、実質的に作業者の労苦を節約しつつ 同結果を達成することを許した。その技術はまた自然に非侵害である。例８ 籠入りペニシリンＶと光量変化を利用した一連の既知濃度の標準溶液の作 成 籠入りペニシリンＶ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ ；製造番号Ｐ−７０６１）を最終濃度が１４．４μｍｏｌ／ｌになるようＨＥＰ ＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．７５）に溶解した。その溶液の部分（１００μ ｌ）を清浄な使い捨て管にそれぞれ移し替えてから、ハニメックスフラッシュガ ンを使って１フラッシュから１０フラッシュまでの間のフラッシュに露光した。 光分解後、ペニシリンＶを定量するにふさわしい任意の方法、例えば、ＥＬＩＳ Ａ試験を使ってそれら溶液を分析した。 「較正曲線」はこのように作成できるが、この曲線は、等しい容量の異なる濃 度の標準溶液を別々に瓶にピペットすることによって作成されたはずの曲線に類 似している。上述のような光標準化技術は、実質的に作業者の労苦を節約しつつ 同結果を達成することを許した。その技術はまた自然に非侵害である。 例７、例８に類似の方法で使用できた他の籠入り検体の例としては、籠入りア スパラギン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ；製造番 号Ａ−２５０５）、籠入りＬ−リジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉ ｎｃ．、ＵＳＡ；製造番号Ｂ−７０９９）、籠入りＬ−エピネフリン（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ；製造番号Ｄ−７０５７）、籠入 りＬ−ドーパミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ；製 造番号Ｄ−７０６４）、籠入りＬ−フェニルアラニン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ ｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ；製造番号Ｄ−７０９３）や籠入りＤ−ルシフェ リン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ；製造番号Ｌ−７ ０８５）が挙げられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パイ，ジュリアン，マーク イギリス、アールエイチ１ ２デーユー サリー、レッドヒル、リングウッド アベ ニュー、リングウッド ロッジ ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化学アッセイを内部的に標準化する方法であって、 （ｉ）所定の量の検体の感光性誘導体をアッセイされるべき試料に加える工程と ； （ｉｉ）アッセイの試験特性を測定する工程と； （ｉｉｉ）上記試料／感光性誘導体の混合物を所定の持続時間と強さの可視光フ ラッシュに露光して該感光性誘導体から既知量の検体を放出する工程と； （ｉｖ）上記試験特性を再測定する工程と； （ｖ）必要に応じて（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の工程を零からｎ回繰返す工程と； （ｖｉ）上記試験特性測定における変化を算出する工程と； （ｖｉｉ）（ｖｉ）の工程からの算出値を標準値として使用し、上記試料中にも ともと存在する検体の量を決定する工程と； を含む方法。 ２．上記検体の感光性誘導体は籠入り型検体であることを特徴とする請求項１に 記載の方法。 ３．上記検体の感光性誘導体は該検体の非籠入り型誘導体によって汚染を減らす ように前処置されることを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４．上記検体の非籠入り型誘導体は担体上に凍結乾燥されることを特徴とする請 求項１、２または３に記載の方法。 ５．アッセイ材料または設備のいかなる固有燐光をも補償する追加工程を含むこ とを特徴とする上記請求項のいずれか１つに記載の方法。 ６．化学アッセイを外部的に標準化する方法であって、 （ｉ）所定の量の検体の感光性誘導体を所定の持続時間と強さの可視光フラッシ ュに露光して該感光性誘導体から既知量の検体を放出する工程と； （ｉｉ）アッセイの試験特性を測定する工程と； （ｉｉｉ）必要に応じて（ｉ）と（ｉｉ）の工程を零からｎ回繰返す工程と； （ｉｖ）上記試験特性測定における変化を算出する工程と； （ｖ）（ｉｖ）の工程からの算出値を、それに対してアッセイされる試料の結果 を比較する標準値として使用する工程と； を含む方法。 ７．上記検体の感光性誘導体は籠入り型検体であることを特徴とする請求項６に 記載の方法。 ８．上記検体の感光性誘導体は該検体の非籠入り型誘導体によって汚染を減らす ように前処置されることを特徴とする請求項７に記載の方法。 ９．上記検体の非籠入り型誘導体は担体上に凍結乾燥されることを特徴とする請 求項６、７または８に記載の方法。 １０．アッセイ材料または設備のいかなる固有燐光をも補償する追加工程を含む ことを特徴とする請求項６ないし９のいずれか１つに記載の方法。 １１．ＡＴＰ生物発光アッセイを標準化する方法であって、 （ｉ）所定の量のＡＴＰの感光性誘導体をファイアフライ・ルシフェラーゼ−ル シフェリン試薬中に組入れる工程と； （ｉｉ）該試薬から発せられる光を測定する工程と； （ｉｉｉ）アッセイされるべき試料を上記試薬と混合する工程と； （ｉｖ）その発光反応によって発せられる光を再測定する工程と； （ｖ）上記試料／試薬混合物を所定の持続時間と強さの可視光フラッシュに露光 して上記感光性誘導体から既知量のＡＴＰを放出する工程と； （ｖｉ）その発光反応によって発せられる光を再測定する工程と； （ｖｉｉ）必要に応じて（ｖ）と（ｖｉ）の工程を零からｎ回（零とｎ回とを含 めて）繰返す工程と； （ｖｉｉｉ）その発光測定における変化を算出する工程と； （ｉｘ）（ｖｉｉｉ）の工程からの算出値を標準値として使用して上記試料中に もともと存在するＡＴＰの量を決定する工程と； を含む方法。 １２．上記ＡＴＰの感光性誘導体は籠入り型ＡＴＰであることを特徴とする請求 項１１に記載の方法。 １３．上記籠入り型ＡＴＰはＡＴＰのニトロフェノール・エステルであることを 特徴とする請求項１２に記載の方法。 １４．上記籠入りＡＴＰを含むルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬は汚染ＡＴＰ 分子を除くように４℃で８−２０時間以上培養することによって前処置されるこ とを特徴とする請求項１１、１２または１３に記載の方法。 １５．上記籠入りＡＴＰは汚染ＡＴＰ分子を除くようにＡＴＰ崩壊酵素で前処置 されることを特徴とする請求項１１、１２または１３に記載の方法。 １６．アッセイ材料または設備のいかなる固有燐光をも補償する追加工程を含む ことを特徴とする請求項１１ないし１５のいずれか１つに記載の方法。 １７．上記籠入りＡＴＰは担体上に凍結乾燥されることを特徴とする請求項１１ ないし１５のいずれか１つに記載の方法。 １８．ＡＴＰ生物発光アッセイを標準化するためのキットであって、 １）アッセイ緩衝液と； ２）ＡＴＰの感光性誘導体と；そして ３）ファイアフライ・ルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬と； を含むキット。 １９．請求項１３に記載のキットであって、さらに ４）発光測定器と；そして ５）高強度光源と； を含むキット。