CN104769077B - 用于ecl的新型铱基配合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新型铱基Ir(III)发光配合物、包含这些配合物作为标记物的缀合物以及它们在例如分析物的基于电化学发光的检测中的应用。
Description
发明背景
本发明涉及新型铱基Ir(III)发光配合物、包含这些配合物作为标记物的缀合物以及其例如在分析物的基于电化学发光的检测中的应用。
电致化学发光(也称为电化学发光并缩写为ECL)是在电极处生成的物类由此经历高能电子转移反应以形成发光的激光态的过程。在1960年代中期Hercules和Bard等人描述了首次详细的ECL研究。在研究大约50年后,ECL现在已经成为非常有力的分析技术,并广泛用于例如免疫测定、食品与水的检验和生物战剂检测的领域。
存在大量看上去可用于有机发光器件(OLED)的化合物。这些化合物适于以固体材料使用,或可以溶解在有机流体中。但是,关于其在水性介质中(如检测来自生物样品的分析物所需的那样)的效用尚无结论。
通常,基于ECL的检测方法基于使用包含Ru(II+)作为金属离子的水溶性钌配合物。
尽管在过去数十年中取得了显著的进步,但是仍然存在对更灵敏的基于电化学发光的体外诊断分析方法的巨大需求。
现在已经令人惊讶地发现,某些铱基Ir(III+)发光配合物代表了用于未来的高灵敏度基于ECL检测方法的极有前途的标记物。
发明概述
本发明公开了式I的铱基化学发光化合物
其中,各个R1-R20独立地为氢、卤素、氰基或硝基、氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基(sulfanyl)、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基(sulfeno)、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐(sulfenate)、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基(phosphinoyl)、膦酸盐、亚膦酸盐或R21,其中R21是芳基、取代芳基、烷基、取代烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳基烷基、取代的芳基烷基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基-烷基、取代的氨基-烷基、氨基-烷氧基、取代的氨基-烷氧基、氨基-芳基、取代的氨基-芳基、氨基-芳氧基、取代的氨基-芳氧基,
其中在R1-R12中,或/和在R13-R16中或/和在R17-R20中,分别地,两个相邻的R可以形成芳族环或取代的芳族环,其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团,如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐或,
其中在R1-R12中,或/和在R13-R16中,或/和在R17-R20中,分别地,两个相邻的R可以形成脂族环或取代的脂族环,其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团,如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐,
其中,如果在任意的R1-R21中存在取代,在R1-R21中的取代基各自独立地选自卤素、氰基或硝基、亲水性基团,如氨基、烷基氨基、烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、烷基芳氧基、聚乙烯氧基(polyethylenoxy)、聚丙烯氧基(polypropylenoxy)、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐,
其中如本文所用的烷基是具有1-20个碳原子的长度的直链或支链的烷基链或具有1-20个原子的长度,包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的杂烷基链,其中芳基是5、6或7元芳基环体系,或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系,
其中R13-R20中的至少一个是-Q-Z,其中Q是连接基团或共价键,并且其中Z是官能团,和,
其中X和Y中的至少一个是N,且另一个X或Y独立地为N或C。
本发明还公开了包含上述化合物和共价键合于其上的亲和结合剂的缀合物。
本发明进一步涉及如本发明中所公开的化合物或缀合物,特别是在电化学发光器件或电化学发光检测系统中用于在水溶液中进行发光测量或电化学发光反应的用途。
此外,本发明公开了用于通过体外方法测量分析物的方法,该方法包含以下步骤:(a)提供怀疑或已知包含该分析物的样品;(b)在适于形成分析物缀合物复合物的条件下使所述样品与根据本发明的缀合物接触,和(c)测量步骤(b)中形成的复合物,并由此获得该分析物的量度。
发明详述
如上所述,需要新型的金属基化学发光化合物,其适用于体外诊断分析。
式I的新型铱基化学发光化合物
本发明涉及式I的铱基化学发光化合物
其中,各个R1-R20独立地为氢、卤素、氰基或硝基、氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐或R21,其中R21是芳基、取代芳基、烷基、取代烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳基烷基、取代的芳基烷基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基-烷基、取代的氨基-烷基、氨基-烷氧基、取代的氨基-烷氧基、氨基-芳基、取代的氨基-芳基、氨基-芳氧基、取代的氨基-芳氧基,
其中在R1-R12中,或/和在R13-R16中或/和在R17-R20中,分别地,两个相邻的R可以形成芳族环或取代的芳族环,其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团,如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐或,
其中在R1-R12中,或/和在R13-R16中,或/和在R17-R20中,分别地,两个相邻的R可以形成脂族环或取代的脂族环,其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团,如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐,
其中,如果在任意的R1-R21中存在取代,在R1-R21中的取代基各自独立地选自卤素、氰基或硝基、亲水性基团,如氨基、烷基氨基、烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、烷基芳氧基、聚乙烯氧基、聚丙烯氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐,
其中如本文所用的烷基是具有1-20个碳原子的长度的直链或支链的烷基链或具有1-20个原子的长度,包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的杂烷基链,其中芳基是5、6或7元芳基环体系,或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系,
其中R13-R20中的至少一个是-Q-Z,其中Q是连接基团或共价键,并且其中Z是官能团,和,
其中X和Y中的至少一个是N,且另一个X或Y独立地为N或C。
式I的化合物包含两个衍生自如经由式I所给出的定义所限定的苯基菲啶类的配体和一个第三配体。
在一个实施方案中,式I的R13-R20中的一个是-Q-Z。
如本领域技术人员已知的,在R1-R21中的取代基可以被进一步取代,例如,在氨基烷基-基团中的烷基-基团可以被羟基、氨基、羧基或磺基进一步取代。
如本文,包括随附的权利要求书所用的,取代基具有技术人员公知的含义。
烷基优选地是具有1-20个碳原子长度,优选地具有1-10个碳原子长度,特别优选地具有1-6个碳原子长度的直链或支链烷基链;或具有1-20个原子长度,优选地具有1-10个碳原子长度,包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的杂烷基链。烷基基团的实例包括,但不限于,甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基、异构辛基和十二烷基。在一个特别优选的实施方案中,烷基是甲基或乙基。
术语烷氧基和烷基氧基,以及取代的烷基和取代的烷氧基可以分别互换地使用。烷氧基和烷基氧基表示式-OR的部分,其中R优选地是如上文所定义的烷基部分。烷氧基部分的实例包括,但不限于,甲氧基、乙氧基和异丙氧基。
在一个实施方案中,对于取代的烷氧基优选的取代基是包含1-40个乙烯氧基(ethylenoxy)单元,或包含1-20个乙烯氧基单元或包含1-10个乙烯氧基单元的乙烯氧基链。
芳基优选地是5、6或7元芳基环体系,优选6元芳基环体系,或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系,优选6元杂芳基环体系。在一个特别优选的实施方案中,芳基是苯基。
在一个实施方案中,在式I中的各个R1-R20独立地为氢、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基或亚砜。
在一个实施方案中,在式I中的各个R1-R20独立地为氢、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基或亚砜。
在一个实施方案中,在式I中的各个R1-R20独立地为氢、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺酸盐或亚砜。
在一个实施方案中,根据式I的化合物的R1-R20中至少一个被至少一个亲水性基团取代。
在一个实施方案中,包含在如本文所定义的式I、式II的式I (a)和/或式I (b)中的苯基菲啶残基的R1-R12中的至少一个,分别地,被至少一个亲水性基团,尤其是被至少一个如下文所定义的亲水性基团所取代。
优选的亲水性基团是氨基;烷基氨基,其中烷基表示直链链,如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基链或支链烷基链,如异丙基、异丁基、叔丁基,优选为直链烷基链,如甲基或乙基;取代的烷基氨基,其含有例如一个或两个键合到N-原子上的支链或直链链,其被另外的亲水性基团,如羟基或磺基所取代,优选该取代的烷基氨基含有两个羟丙基或羟乙基残基;芳基氨基,其中芳基表示芳族残基,如苯基或萘基,优选苯基;取代的芳基氨基,具有如上文所定义的芳基和由亲水性基团构成的附加残基;烷基铵,其中烷基如上文所定义,且优选三甲基铵残基或三乙基铵残基;取代的烷基铵;羧基;羧酸酯,优选烷基酯,如甲基或乙基酯;氨基甲酰基;羟基;取代或未取代的烷氧基,其中烷基和取代烷基如上文所定义;或芳氧基或取代的芳氧基,其中芳基和取代芳基如上文所定义;硫烷基;取代或未取代的烷基磺酰基;取代或未取代的芳基磺酰基;磺基;亚磺基;次磺基;氨磺酰基;亚砜;膦酰基;羟基亚膦酰基;羟基-烷基-亚膦酰基;膦酸盐;亚膦酸盐。
此类亲水性基团优选地选自氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羟基、磺基、次磺基、氨磺酰基、亚砜和膦酸盐,在适用时,各自优选如上面段落中所定义。
在一个优选的实施方案中,该亲水性基团选自烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羟基、磺基、次磺基、氨磺酰基、亚砜和膦酸盐。
在更特别优选的实施方案中,该亲水性基团选自磺基和氨磺酰基。
在一个实施方案中,R1-R12中的至少一个是取代或未取代的基团,该基团选自磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基、亚磺基-烷基、亚磺基-芳基、亚磺基-烷氧基、亚磺基-芳氧基、亚磺基、次磺基-烷基、次磺基-芳基、次磺基-烷氧基、次磺基-芳氧基、次磺基、氨磺酰基-烷基、氨磺酰基-芳基、氨磺酰基-烷氧基、氨磺酰基-芳氧基、氨磺酰基、烷烃磺酰基-烷基、烷烃磺酰基-芳基、烷烃磺酰基、芳烃磺酰基-烷基、或芳烃磺酰基-芳基、或芳烃磺酰基、磺基氨基-烷基、磺基氨基-芳基、磺基氨基-烷氧基、磺基氨基-芳氧基、磺基氨基、亚磺基氨基-烷基、亚磺基氨基-芳基、亚磺基氨基-烷氧基、亚磺基氨基-芳氧基、亚磺基氨基、烷烃磺酰基氨基-烷基、烷烃磺酰基氨基-芳基、烷烃磺酰基氨基-烷氧基、烷烃磺酰基氨基-芳氧基、烷烃磺酰基氨基、芳烃磺酰基氨基-烷基、芳烃磺酰基氨基-芳基、芳烃磺酰基氨基-烷氧基、芳烃磺酰基氨基-芳氧基、芳烃磺酰基氨基、烷烃亚磺酰基氨基-烷基、烷烃亚磺酰基氨基-芳基、烷烃亚磺酰基氨基-烷氧基、烷烃亚磺酰基氨基-芳氧基、烷烃亚磺酰基氨基、芳烃亚磺酰基氨基-烷基、芳烃亚磺酰基氨基-芳基、芳烃亚磺酰基氨基-烷氧基、芳烃亚磺酰基氨基-芳氧基、芳烃亚磺酰基氨基、膦酰基-烷基、膦酰基-芳基、膦酰基-烷氧基、膦酰基-芳氧基、膦酰基、羟基亚膦酰基-烷基、羟基亚膦酰基-芳基、羟基亚膦酰基-烷氧基、羟基亚膦酰基-芳氧基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷氧基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳氧基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酰基氨基-烷基、膦酰基氨基-芳基、膦酰基氨基-烷氧基、膦酰基氨基-芳氧基、膦酰基氨基,或者,在化学匹配的情况下,上述取代基的盐,其中烷基是具有1-20个碳原子的长度的直链或支链的烷基链或具有1-20个原子的长度,包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的杂烷基链,和其中如本文所用的芳基是5、6或7元芳基环体系,或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系。
在一个实施方案中,R1-R12中至少一个是取代或未取代的基团,该基团选自磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基、氨磺酰基-烷基、氨磺酰基-芳基、氨磺酰基-烷氧基、氨磺酰基-芳氧基、氨磺酰基、烷烃磺酰基-烷基、烷烃磺酰基-芳基、烷烃磺酰基、芳烃磺酰基-烷基、芳烃磺酰基-芳基、芳烃磺酰基、烷烃磺酰基氨基-烷基、烷烃磺酰基氨基-芳基、烷烃磺酰基氨基-烷氧基、烷烃磺酰基氨基-芳氧基、烷烃磺酰基氨基、芳烃磺酰基氨基-烷基、芳烃磺酰基氨基-芳基、芳烃磺酰基氨基-烷氧基、芳烃磺酰基氨基-芳氧基、芳烃磺酰基氨基、膦酰基-烷基、膦酰基-芳基、膦酰基-烷氧基、膦酰基-芳氧基、膦酰基、羟基亚膦酰基-烷基、羟基亚膦酰基-芳基、羟基亚膦酰基-烷氧基、羟基亚膦酰基-芳氧基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷氧基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳氧基、羟基-烷基-亚膦酰基,或者,在化学匹配的情况下,上述取代基的盐,其中烷基是具有1-20个碳原子的长度的直链或支链的烷基链或具有1-20个原子的长度,包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的杂烷基链,和其中如本文所用的芳基是5、6或7元芳基环体系,或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系。
在一个实施方案中,R1-R12中的至少一个是磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基,或它们的盐(=磺酸盐),其中抗衡离子优选是来自碱金属族的阳离子。
在一个实施方案中,R1-R12中的至少一个是磺基-烷基、磺基-烷氧基、磺基,或它们的盐(=磺酸盐),其中抗衡离子是来自碱金属族的阳离子。
在一个实施方案中,R1-R12中的至少一个是磺基-甲基、具有C2-C4烷基链的磺基-烷氧基,或它们的盐(=磺酸盐),其中抗衡离子是来自碱金属族的阳离子。
在一个实施方案中,式I的基团R1-R12中至少一个是磺基。
在一个实施方案中,R1-R12中的1-3个不为氢。
在一个实施方案中,该抗衡离子是选自锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子和铯阳离子的碱金属阳离子。
在一个实施方案中,该抗衡离子是选自钠阳离子和铯阳离子的碱金属阳离子。
在一个实施方案中,该抗衡离子是铯阳离子。
在一个实施方案中,在式I中包含的苯基菲啶残基选自下文所给出的取代的苯基菲啶。
如本文所用的术语“连接基团”具有本领域技术人员已知的含义,并涉及用于连接分子片段的分子或分子组。连接基团的特征在于在柔性或刚性骨架上具有两个或更多个化学上正交的官能。在本发明的意义上,共价键并非连接基团。
在根据本发明的化合物中,Q或者是共价键或者是具有在1和200个原子之间的骨架长度的连接基团。换言之,如果骨架长度在1和200个原子之间,则式I的第三配体的芳族环与官能团Z之间最短的连接由1-200个原子组成。
在存在环体系的情况下,当评估连接基团长度时,采用在环体系中最短的原子数量。例如,亚苯基环占连接基团中4个原子的长度。
在一个实施方案中,Q是共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C200烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P、S原子组成的1-200个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。
在一个实施方案中,Q是共价键或是连接基团,且具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C100烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-100个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。
在一个实施方案中,Q是共价键或是连接基团,且具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-50个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。
在一个进一步的实施方案中,Q是共价键或是连接基团,且具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-20个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。
在一个实施方案中,在本发明的电化学发光配合物中的Q,例如连接基团Q是直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链,或C1-C20芳基烷基链(其中,例如亚苯基环占4个碳原子的长度),或者具有由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子所组成的骨架的1-20个原子的链,或具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子所组成的骨架,其包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或取代的杂芳基基团(其中,例如亚苯基环占4个原子的长度)的1-20个原子的链。
在一个实施方案中,在根据本发明的化合物中的Q,例如连接基团Q是饱和的C1-C12烷基链,或C1-C12芳基烷基链,或具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子所组成的骨架的1-12个原子的链,或具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子所组成的骨架,包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或取代的杂芳基基团(其中,例如亚苯基环占4个原子的长度)的1-12个原子的链。
在一个实施方案中,Q是共价键。在Q是共价键的情况下,官能团Z是R13-R20中的至少一个。在一个实施方案中,R13-R20中的一个是Z。
在一个实施方案中,Q-Z是马来酰亚胺。
在一个实施方案中,该连接基团Q包含一个或多个氨基酸。
在一个实施方案中,该连接基团Q包含一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中,式I中的X和Y均为N。
在一个实施方案中,根据本发明的式I的铱基配合物中包含的官能团Z选自醛、羧酸、羧酸酯、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基基团、卤素、肼、羟基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。
在一个实施方案中,根据本发明的式I的铱基配合物中包含的官能团Z选自羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基基团、卤素、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。
在一个特别优选的实施方案中,根据本发明的式I的铱基配合物中包含的官能团Z选自羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺基。
在一个特别优选的实施方案中,根据本发明的式I的铱基配合物中包含的官能团Z选自N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺基。
在一个实施方案中,本发明涉及式I的化合物,
其中苯基菲啶残基的R1-R12中的1至3个独立地为磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基,或它们的盐(=磺酸盐),其中抗衡离子优选地是来自碱金属族的阳离子,并且R1-R12的其它基团是氢,
其中R13-R20中的一个是-Q-Z,其中Q是连接基团或共价键,且其中Z是官能团,并且式1中R13-R20的其它基团是氢或R21,其中R21是烷基,和
其中X和Y是N。
在一个实施方案中,本发明涉及式I的化合物,其中式I中包含的苯基菲啶残基选自下文所给出的取代的苯基菲啶
和
其中R13-R20中的一个是-Q-Z,其中Q是连接基团或共价键,且其中Z是官能团,并且式1中R13-R20的其它基团是氢或R21,其中R21是烷基,和
其中X和Y是N。
在一个实施方案中,本发明涉及式I的化合物,
其中R1-R12是氢,
其中R13-R20中的一个是-Q-Z,其中Q是连接基团或共价键,且其中Z是官能团,优选羧酸,并且式1中R13-R20的其它基团是氢或R21,其中R21是烷基,和
其中X和Y是N。
如上文所定义的式I的化合物的任何实施方案的任何组合都被认为在本发明的范围内。
现在已令人惊讶和出乎意料地发现式I的铱基电化学发光化合物适合作为用于未来的高灵敏度ECL基检测方法的标记物。
式II的新型铱基化学发光化合物
在一个实施方案中,本发明涉及根据式II的化合物
其中在式I (a)和在式I (b)中,分别地和独立地,R1-R20如式I所定义,
除了以下情况:式I的Q是式II中的Q1或Q2,分别地,其中Q1是连接基团,优选其中式I (a)中R13-R20的至少一个是-Q1-Z和其中Q1是连接基团;
其中式I (b)中R13-R20的至少一个是Q2,并且各个Q2独立地为连接基团或共价键,
其中(n)是1至50的整数,
其中X和Y如式I所定义,
并且其中Z是官能团。
在一个实施方案中,式II中式I (a)的R13-R20中的一个是Q1-Z。
在一个实施方案中,式II中在各个式I (b)中的R13-R20中的一个是Q2。
在一个实施方案中,式II中式I (a)的R13-R20中的一个是Q1-Z,且式II中在各个式I (b)中的R13-R20中的一个是Q2。
式I (a)和式I (b)的化合物分别地包含两个衍生自如经由式I在上文中所给出的定义所限定的苯基菲啶类的配体和一个第三配体。
在一个实施方案中,R1-R20具有如上文对于式II的化合物的R1-R20所描述的相同含义。
在一个实施方案中,式I (a)和式I (b)是相同的,除了分别地式I (a)中的Q1-Z和式I (b)中的Q2之外。
如技术人员将容易地认识到式II的连接基团Q1在连接Q2之处包含n个支化位点。
在一个实施方案中,式II的Q1具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C200烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P、S原子组成的1-200个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。
在一个实施方案中,式II的连接基团Q1具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C100烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-100个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。
在一个实施方案中,式II的连接基团Q1具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-50个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。
在一个进一步的实施方案中,式II的连接基团Q1具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子所组成的1-20个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。
在一个实施方案中,在本发明的电化学发光配合物中式II的连接基团Q1是直链或支链的饱和、不饱和、未取代、取代的C1-C20烷基链,或C1-C20芳基烷基链(其中,例如亚苯基环占4个碳原子的长度),或者具有由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的骨架的1-20个原子的链,或1-20个原子的链,或具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的骨架,包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或取代的杂芳基基团(其中,例如亚苯基环占4个原子的长度)。
在一个实施方案中,根据本发明的化合物中的Q1,例如连接基团Q1是饱和的C1-C12烷基链,或C1-C12芳基烷基链,或具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子所组成的骨架的1-12个原子的链,或具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的骨架,包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或取代的杂芳基基团(其中,例如亚苯基环占4个原子的长度)的1-12个原子的链。
根据式II的化合物中,式I (b)和Q2呈现(n)次,其中(n)是1-50的整数。这些(n)个Q2各自独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C200烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P、S原子组成的1-200个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链的作为骨架的连接基团。
在一个实施方案中,式II的各个Q2独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C100烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-100个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。
在一个实施方案中,式II的各个Q2独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-50个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。
在一个实施方案中,式II的各个Q2独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-20个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。
在一个实施方案中,式II的各个Q2独立地为共价键或具有饱和的C1-C12烷基链,或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1-12个原子的链,或如之前所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。
在一个实施方案中,连接基团Q1包含一个或多个氨基酸。
在一个实施方案中,连接基团Q1包含肽链。
在一个实施方案中,连接基团Q2包含一个或多个氨基酸。
在一个实施方案中,连接基团Q1和Q2均包含一个或多个氨基酸。
在一个实施方案中,连接基团Q1包含一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中,连接基团Q2包含一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中,连接基团Q1和Q2均包含一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中,连接基团Q2选自-C6H4-(CH2)2-和-C6H4-(CH2)2-CO-。
在式II中,(n)是1-50的整数,表明式I (b)和Q2在根据式II的化合物中呈现(n)次。在特定的实施方案中,(n)是从2至50,或从1至40,或从2至40,或从3至31的整数。
在式II中,(n)是1-50的整数,表明式I (b)和Q2在根据式II的化合物中呈现(n)次。在特定的实施方案中,(n)是从1至49,从1至48,从1至47,从1至46,从1至45,从1至44,从1至43,从1至42,,从1至41,从1至40,从2至50,从2至49,从2至48,从2至47,从2至46,从2至45,从2至44,从2至43,从2至42,从2至41,从2至40,从3至39,从3至38,从3至37,从3至36,从3至35,从3至34,从3至33,从3至32,从3至31,从3至30,从4至29,从4至28,从4至27,从4至26,从4至25,从4至24,从4至23,从4至22,从4至21,从4至20,从5至19,从5至18,从5至17,从5至16,从5至15,从5至14,从5至13,从5至12,从5至11,或从5至10的整数。
在一个实施方案中,在式II中,(n)是1。
在一个实施方案中,在式II中,(n)是2。
在一个实施方案中,在式II中,(n)是3。
在一个实施方案中,根据本发明的式II的铱基配合物中包含的官能团Z选自醛、羧酸、羧酸酯、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基基团、卤素、肼、羟基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。
在一个实施方案中,根据本发明的式II的铱基配合物中包含的官能团Z选自羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基基团、卤素、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。
在一个特别优选的实施方案中,根据本发明的式II的铱基配合物中包含的官能团Z选自N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺基。
如上文所定义的式II的化合物的任何实施方案的任何组合都认为在本发明的范围内。
现在已令人惊讶和出乎意料地发现式II的铱基化学发光化合物适合作为用于未来的高灵敏度ECL基检测方法的标记物。
用于制备式I和II的化合物的方法
本发明在一方面涉及用于分别制备式I的化合物和式II的化合物的新型方法。
根据式I的化合物可以,例如按照以下方法合成(基于Lamansky, S., Inorg.Chem. 40 (2001) 1704-1711):合成取代的苯基-菲啶二聚体铱配合物;使该二聚体与Q-Z的前体反应以产生根据式I的产物。
按照该方法,式I的化合物可以,例如,如下文中示意图1所示那样来获得。
示意图1:式I的化合物的合成。试剂和条件:(i):Na2CO3,2-乙氧基乙醇;m是从1至17的整数。
用作起始物料的取代的苯基-菲啶二聚体铱配合物可以通过例如在实施例(参见实施例2)中所示,以及如例如,EP 12179056.2中所描述的方法来获得。
根据式II的化合物可以,例如按照以下方法合成(基于Lamansky, S., Inorg.Chem. 40 (2001) 1704-1711):合成取代的苯基-菲啶二聚体铱配合物;使该二聚体与含有1-50个第三配体部分的连接基团Q的前体反应以产生根据式II的产物。
按照该方法,式II的化合物可以,例如,如下文中示意图2所示那样来获得。
示意图2:式II的化合物的合成。试剂和条件:Cs2CO3,DMF。
用作起始物料的取代的苯基-菲啶二聚体铱配合物可以通过例如实施例(参见实施例2)中所示,以及如,例如,EP 12179056.2中所描述的方法来获得。
根据式II的化合物还可以用另一种方法合成:取代的苯基-菲啶二聚体铱配合物(参见例如,实施例2.2)首先与含有官能团(-Q-)Z的第三配体的衍生物进一步反应以得到单体铱配合物。单体铱配合物是例如在式I中给出的。然后使该单体铱配合物进一步与含有1-50个可以与单体铱配合物的官能团反应的基团的Q的前体反应以形成共价键;这样在形成共价键之后同样获得根据式II的化合物。
按照该方法,式II的化合物可以,例如,如下文中示意图3所示的那样来获得。
示意图3:式II的化合物的合成。
包含式I或式II的新型化合物的缀合物和本发明的其它方面
在一个方面,本发明涉及分别包含如上文所公开和定义的式I或式II的铱基电化学发光化合物和共价键合至其上的生物物质的缀合物。合适的生物物质的实例是细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、核酸、肽核酸(PNA)、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药理物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖。
在一个实施方案中,根据本发明的缀合物的生物物质,即分别共价键合到根据式I或式II的化合物上的生物物质是亲和结合剂。亲和结合剂是能够将分子经由这些分子之间的相互吸引结合到另一分子上并由此获得其中这些分子彼此靠近的稳定缔合的分子。分子结合的结果是形成分子复合物(complex)。复合物组分之间的吸引键合通常相比在共价键中较弱。在这种情况下,结合剂是亲和结合剂,这表示其能够结合亲和配合物(complex),即在各自的条件下(例如,在标准条件下的水性介质)稳定的配合物。可以参与到分子结合中的分子包括,但不限于,蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小的有机分子,如药物。因此,通过分子结合形成的复合物的类型包括:蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-激素、蛋白质-药物、抗原-抗体、受体-配体、生物素-抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(streptavidin)、核酸-互补核酸或受体-受体(拮抗剂)激动剂。
如技术人员将理解的那样,在根据本发明的缀合物中,根据式I或式II的化合物的官能团Z分别用于与在亲和结合剂上的基团形成共价键,并不再以此形式存在。在亲和结合剂其本身不含有适于与基团Z结合或反应的基团的情况下,此类基团可以通过依靠既定程序容易地引入到该亲和结合剂中。
在一个方面,本发明涉及通过使式I或式II的化合物的官能团Z与如本文所定义的亲和结合剂的适当基团(其与该官能团Z为反应性)反应来制备缀合物。
该过程可以由技术人员使用技术人员已知的标准方法来进行。
在一个方面,本发明涉及可以通上述制备缀合物的方法可获得的缀合物。
虽不希望受到进一步的限制,但是为了清楚起见,亲和结合剂可以包含任何以下物质:抗原、蛋白质、抗体、生物素或生物素类似物和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、糖和凝集素、酶、多肽、氨基基团、核酸或核酸类似物和互补核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸(PNA)、多糖、金属-离子螯合剂、受体激动剂或受体拮抗剂。例如,亲和结合剂可以是特异性结合对的一个配偶体(partner),其中所述结合对的另一个配偶体与细胞表面或细胞内结构相联,或者是在细胞表面或细胞内结构上的靶。
在一个实施方案中,该缀合物包含式I或式II的化合物,以及结合到其上的亲和结合剂,所述亲和结合剂选自蛋白质、抗原、抗体、生物素、生物素类似物、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、糖、凝集素、酶、多肽、氨基基团、核酸、核酸类似物、互补核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸(PNA)、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂或受体拮抗剂。
优选地,亲和结合剂是亲和力结合对的配偶体或成员,或者也被本领域技术人员称为特异性结合对的配偶体或成员。
亲和结合剂对其靶,例如特异性结合对的一个成员(如抗体)对该特异性结合对的另一成员(如其抗原),具有至少107 l/mol的亲和力。亲和结合剂优选对其靶具有108 l/mol或甚至更优选109 l/mol的亲合力。
在一个实施方案中,本发明涉及其中该亲和结合剂选自抗原、抗体、生物素或生物素类似物、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、糖、凝集素、核酸或核酸类似物和互补核酸、受体和配体的缀合物。
在一个实施方案中,本发明涉及其中该亲和结合剂选自抗体、生物素或生物素类似物、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、和核酸的缀合物。
在一个实施方案中,该缀合物包含式I或式II的化合物,以及蛋白质、抗原、抗体、生物素、生物素类似物、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、糖、凝集素、酶、多肽、氨基基团、核酸、核酸类似物、互补核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸(PNA)、多糖、金属-离子螯合剂、受体激动剂或受体拮抗剂。
在一个实施方案中,根据本发明的缀合物包含分别如上文所公开和定义的共价连接的根据式I或式II的化合物,以及亲和结合剂,该亲和结合剂是寡核苷酸或抗体。
生物素类似物是氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。
如本文所用的术语“寡核苷酸”或“核酸”通常表示短的、一般为单链的、包含至少8个核苷酸和至多大约1000个核苷酸的聚核苷酸。在一个优选的实施方案中,寡核苷酸将具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或30个核苷酸的长度。在一个优选的实施方案中,寡核苷酸将具有不超过200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸的长度。
术语寡核苷酸应广义理解,并包括DNA和RNA,以及它们的类似物和改性物。
例如,核酸类似物可以含有在标准碱基脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)、脱氧胸苷(dT)、脱氧尿苷(dU)处携带取代基的取代的核苷酸。此类取代的核苷酸的实例是:5-取代嘧啶类,如5-甲基dC、氨基烯丙基dU或dC、5-(氨基乙基-3-丙烯酰基酰亚胺基)-dU、5-丙炔基-dU或-dC、5-卤代-dU或-dC;N取代的嘧啶类,如N4-乙基-dC;N取代的嘌呤,如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG;8-取代的嘌呤,如8-[(6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或-dA、8-卤代-dA或-dG、8-烷基-dG或-dA;和2-取代dA,如2-氨基-dA。
核酸类似物可含有核苷酸或核苷类似物。即,天然存在的核酸碱基可以通过使用核酸碱基类似物进行交换,所述核酸碱基类似物如5-硝基吲哚-d-核苷;3-硝基-吡咯-d-核苷、脱氧肌苷(dI)、脱氧腺苷(dX);7-去氮-dG、-dA、-dI或-dX;7-去氮-8-杂氮-dG、-dA、-dI或-dX;8-杂氮-dA、-dG、-dI或-dX;d-间型霉素;假dU;假异dC;4-硫代-dT;6-硫代-dG;2-硫代-dT;异dG;5-甲基-异-dC;N8-连接的-8-杂氮-7-去氮-dA;5,6-二氢-5-杂氮-dC;和亚乙烯基-dA或吡咯并-dC。如对本领域技术人员显而易见的那样,必须以使得双链体形成是特异性的方式选择互补链中的核酸碱基。例如,如果在一条链(例如,(a))中使用5-甲基-异-dC,那么在互补链(例如,(a’))中必须使用异dG。
在核酸类似物中,寡核苷酸骨架必须被改性以便在核苷间磷酸酯部分中含有取代的糖残基、糖类似物、改性物,和/或是PNA。
例如,寡核苷酸可含有具有取代的脱氧核糖的核苷酸,所述取代的脱氧核糖例如2'-甲氧基、2'-氟、2'-甲基硒基、2'-烯丙基氧基、4'-甲基dN(其中N是核酸碱基,例如,A、G、C、T或U)。
例如,糖类似物为木糖;2',4'-桥接核糖,如(2'-O、4'-C亚甲基)-(称为LNA的低聚物)或(2'-O、4'-C亚乙基)-(称为ENA的低聚物);L-核糖、L-d-核糖、己糖醇(称为HNA的低聚物);环己烯基(称为CeNA的低聚物);阿卓糖醇(称为ANA的低聚物);稠合到环丙烷环上的三环核糖类似物,其中C3’和C5’原子通过亚乙基桥连接(称为三环DNA的低聚物);甘油(称为GNA的低聚物);吡喃葡萄糖(称为Homo DNA的低聚物);carbaribose(用环戊烷代替四氢呋喃亚单位);羟甲基-吗啉(称为吗啉代DNA的低聚物)。
大量的核苷间磷酸酯部分的修饰同样已知不会干扰杂化性质,并且此类骨架修饰还可以与取代的核苷酸或核苷酸类似物结合。实例为硫代磷酸寡核苷酸、二硫代磷酸寡核苷酸、氨基磷酸寡核苷酸和甲基膦酸寡核苷酸。
PNA(具有不含磷酸酯和d-核糖的骨架)也可以用作DNA类似物。
上述修饰的核苷酸、核苷酸类似物以及寡核苷酸骨架修饰在本发明的含义中可以按需合并在寡核苷酸中。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,并明确涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们呈现期望的生物学活性即可。
“分离的”抗体是已经鉴别并且从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是干扰对该抗体的研究、诊断或者治疗用途的材料,并可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方案中,将抗体纯化(1)至通过例如Lowry方法测定的大于该抗体的95 wt%,和在某些实施方案中至大于99 wt%;(2)足以通过采用例如转杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,或(3)至使用例如考马斯蓝或银染色剂在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE获得的均匀性。分离的抗体包括原位在重组细胞中的抗体,因为该抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。但是,通常,分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”通常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。各轻链通过一个共价二硫键连接到重链上,而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同型的重链中可变。各重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫键。各重链在一端具有可变域(VH),接着是多个恒定域。各轻链在一端具有可变域(VL),在其另一端具有恒定域;轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐,且轻链可变域与重链的可变域对齐。特定的氨基酸残基被认为构成了轻链与重链可变域之间的界面。
抗体的“可变区”或“可变域”是指该抗体的重链或轻链的氨基-末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最易变部分,并含有抗原结合位点。
术语“可变”指的是这样的事实:该可变域的某些部分在抗体中的序列方面存在广泛差异,并用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是,这种变异性并非在抗体的整个可变域中均匀分布。其集中在三个区段中,所述区段在轻链和重链可变域中均称为高变区(HVR)。可变域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含通过三个HVR连接的大多采取β-折叠片构型的四个FR区,其形成连接β-折叠片结构或在某些情况下构成β-折叠片结构一部分的环。各链中的HVR通过FR区保持彼此非常靠近,并与来自其它链的HVR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人, Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第五版, National Institute of Health,Bethesda, MD (1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合,但是表现出各种效应子功能,如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。
来自任意脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定域的氨基酸序列归为两种截然不同类型中的一种,这两种类型称为kappa(κ)和lambda(λ)。
根据它们的重链的恒定域的氨基酸序列,抗体(免疫球蛋白)可以归为不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些还可以进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的,并通常描述在例如Abbas等人, Cellular and Mol.Immunology, 第4版, W.B. Saunders, Co. (2000)中。抗体可以是更大的融合分子的一部分,所述融合分子由抗体与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价结合构成。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地用于指处于其基本完整形式的抗体,而非如下定义的抗体片段。该术语特别是指具有含Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,该部分优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;以及由抗体片段构成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,其各自具有单个抗原结合位点,以及残余“Fc”片段,其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了F(ab’)2片段,其具有两个抗原结合位点并仍能够交联抗原。
“Fv”是含有完整的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中,双链Fv物类由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物类中,一个重链和一个轻链可变域可以通过柔性肽连接基团共价连接以使得该轻链和重链可以以类似于双链Fv物类中的“二聚”结构结合。在这种构型中,各可变域的三个HVR相互作用以便在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总体而言,这六个HVR赋予了对抗体的抗原结合特异性。但是,甚至单一可变域(或仅包含三个对抗原为特异性的HVR的Fv的半部分)也能够识别和结合抗原,尽管亲和力比完整的结合位点低。
该Fab片段含有重链和轻链可变域,并还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’s片段通过在重链CH1域的羧基末端增加几个残基(包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸)而有别于Fab片段。Fab’-SH是本文中对其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’的标志。F(ab’)2抗体片段初始以在其之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段形式制得。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH与VL域,其中这些域存在于单个多肽链中。通常,该scFv多肽进一步包含在VH与VL域之间的多肽连接基团,该连接基团使得该ScFv能够形成抗原结合所需的结构。对于scFv的综述,参见例如Plueckthun, n: ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, 卷113, Rosenburg and Moore (eds.),Springer-Verlag, New York (1994) 第269-315页。
术语“双抗体”指的是具有两个抗原结合位点的抗体片段,该片段包含连接到同一多肽链中的轻链可变域(VL)上的重链可变域(VH)(VH-VL)。通过使用过短以至于不允许同一链上两个域之间配对的连接基团,迫使该域与另一链的互补域配对,并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体更充分地描述在例如EP 0 404 097;WO1993/01161;Hudson, P.J.等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134;和Holliger, P.等人,PNAS USA 90 (1993) 6444-6448中。三抗体和四抗体也描述在Hudson, P.J.等人, Nat.Med. 9 (2003) 129-134中。
本文中所用的术语“单克隆抗体”指的是获自基本同质的抗体的群的抗体,即包含在该群中的个别抗体除可能的突变(例如可能少量存在的自然发生的突变)外是相同的。由此,修饰词“单克隆”显示了该抗体并非离散抗体混合物的特性。在某些实施方案中,此类单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体,其中靶标结合性多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合性多肽序列的方法来获得。例如,该选择过程可以是从多个克隆(如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组体DNA克隆的集合)中选择独特的克隆。应当理解的是,所选择的靶标结合性序列可以进一步改变以便例如改进对该靶标的亲合力、人源化该靶标结合性序列、改进其在细胞培养物中的生产、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等等,并且包含改变后的靶标结合性序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外,单克隆抗体制剂的优点在于它们通常免受其他免疫球蛋白的污染。
如上所述,本文所公开的化合物和缀合物具有相当有利的性质。例如,所公开的化合物或缀合物分别表现出高ECL效率。与许多仅在有机溶剂中分析时显示高ECL效率的ECL标记物相比,如果在含水体系中进行相应测量时也呈现这种高效率。例如,许多OLED染料通常在乙腈中进行分析,并且不溶于水溶液,或者如果可溶的话在水溶液中也不显示有效的电化学发光。
在一个优选实施方案中,本发明涉及本发明中公开的化合物或缀合物分别用于进行在水溶液中的电化学发光反应的用途。水溶液是包含至少90%的水(重量比重量)的任何溶液。显然,此类水溶液可以另外含有诸如缓冲剂化合物、洗涤剂和例如作为ECL反应中的电子给体的叔胺(如三丙胺)的成分。
在一个方面,本发明分别涉及如本发明中所公开的化合物或缀合物在基于电化学发光的检测方法中的用途。
在一个方面,本发明分别涉及如本发明中所公开的化合物或缀合物在分析物检测中的用途。
根据本发明的分析物可以是任何无机或有机分子,包括任何相关生物物质。代表本发明的意义上的分析物的合适的生物物质的实例是细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药理物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖。
该分析物可以选自多肽、碳水化合物、以及无机或有机的药物分子。
多肽或蛋白质是基本上由氨基酸组成并具有至少两个通过肽键连接的氨基酸的分子。在将要在本文中公开的方法中研究相关分析物的情况下,该多肽优选将由至少5、6、7、8、9、10、12、15、20、25和30至最多大约10,000个氨基酸组成。优选地,多肽将含有5-2,000个氨基酸,还优选10-1,000个氨基酸。
在分析物为核酸的情况下,这些核酸优选地为天然存在的DNA或RNA寡核苷酸。
在一个方面,本发明涉及通过体外方法测量分析物的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供怀疑或已知包含所述分析物的样品;(b)在适于形成分析物缀合物复合物的条件下,使所述样品与根据亲和结合剂和本发明中公开的分别根据式I或式II的化合物之间的缀合物接触;和(c)测量步骤(b)中形成的复合物,并由此获得分析物的量度。
在一个实施方案中,测量分析物表示测量分析物在样品中的量。
在一个实施方案中,上述方法中用于检测分析物的测量通过使用基于电化学发光的检测程序进行。同样优选的是在水溶液中实施该方法。
提供以下的实施例以帮助理解本发明,其真实范围陈述在所附权利要求中。应理解的是,在不背离本发明的主旨的情况下,可以在陈述的程序中进行修改。
本文所指定的所有专利和出版物经此引用以其全文并入本文。
实施例
实施例1
合成取代苯基-菲啶
实施例1.1
合成取代2-氨基联苯的一般程序:
采用由Youn, S.W.在Tetrahedron Lett. 50 (2009) 4598-4601中描述的,在市售的2-溴苯胺衍生物和相应的芳基硼酸之间的Suzuki-Miyaura偶联反应,可以合成适当的2-氨基联苯,其为进一步反应为菲啶所需要的。
典型程序:
a: 10摩尔% PdCl2(PPh3)2,K2CO3,DMF/H2O (5/1),80℃,24小时。
其它实施例:
。
实施例1.2
合成取代菲啶的一般程序:
向2-芳基苯胺1(0.01 mol)在氯仿(20 ml)中的冰冷却溶液中加入芳基酰氯2(0.01 mol)并在惰性条件下在室温搅拌30分钟。使所得的混合物在搅拌下再回流2小时。通过在60分钟的期间内逐滴加入吡啶(0.02 mol,在10 ml氯仿中)来处理该反应混合物。使该混合物冷却至室温,并搅拌整夜。将混合物用0.5 M HCl充分洗涤,经MgSO4干燥并在真空中浓缩。粗产物通过快速色谱法在硅胶上提纯(3 : 2己烷/乙酸乙酯),从而以66%的收率得到纯产物3。
按照由Lion, C.在Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566中所述的程序,使20 ml的甲苯中的苯甲酰胺基-2-联苯3(0.01 mol)和POCl3(5 ml)在氮气下回流并搅拌18小时。用CH2Cl2(30 ml)稀释冷却的反应混合物,并倒入冰中,用25%的NH4OH和蒸馏水洗涤。有机层经MgSO4干燥,并在真空中浓缩,然后进行快速色谱法(硅胶,1 : 1己烷/乙酸乙酯)得到产物4,6-苯基菲啶。
收率:52%。白色固体。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.54-7.85 (m, 9H), 8.10(d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.67(d, J = 8.4 Hz, 1H)。
使用2-萘-2-基-苯基胺代替2-芳基苯胺获得:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.64 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.29 (d, J = 8.1Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.92 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 7.48 Hz, 1H), 7.79-7.75 (m,2H), 7.69 (t, J = 14.0, 8.2 Hz, 1H), 7.63-7.61 (m, 2H), 7.53-7.46 (m, 4H),7.19 (t, J = 14.3, 7.2 Hz, 1H).
MS: [M+H]+ 306.3。
使用萘-碳酰氯代替苯基酰氯获得:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.65 (d, J = 8.1Hz, 1H), 8.27 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H),8.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.97-7.94 (m, 2H), 7.90-7.85 (m, 2H), 7.80-7.69 (m,2H), 7.62 (t, J= 14.2, 7.1 Hz, 1H), 7.59-7.55 (m, 2H).
MS: [M+H]+ 306.3。
实施例1.3
合成6-(2-磺基苯基)菲啶的程序
使用如Nicolai, E.在Chem. Pharm. Bull. 42 (1994) 1617-1630中所述的程序,通过使芳基苯胺(0.01 mol)与2-磺基苯甲酸环酐(0.01 mol)在CH3CN中温和加热6小时可以合成6-(2-磺基苯基)菲啶。
在提纯后,可以基于实施例1.2中描述的方法将该产物转化为适当的菲啶。
实施例1.4
合成6-苯基-烷基磺酰基菲啶的程序
使用如Lion, C.在Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566中所述的程序,可以通过使烷基磺酰基-芳基苯胺(0.01 mol)与苯甲酰氯(0.01 mol)在氯仿中温和加热来合成6-苯基-烷基磺酰基菲啶,参见实施例1.2。
在提纯后,可以基于实施例1.2中描述的方法将该产物转化为适当的菲啶。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.92 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.75 (d, J = 1.9Hz, 1H), 8.68 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.35 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 8.30 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 15.3, 7.1 Hz, 1H), 7.81-7.73 (m, 3H), 7.64-7.56(m, 3H) 3.12 (s, 3H).
MS: [M+H]+ 334,3。
通过按照Cymerman, J.在J. Chem. Soc. (1949) 703-707中所述的程序还可以制备6-(4-甲基磺基苯基)菲啶。
实施例1.5
合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶
合成2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-醇甲苯磺酸酯
程序:(JACS, 2007, 129, 13364)向2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-醇(7 g,33.6mmol)和三乙胺(4.9 ml,35.3 mmol)在无水CH2Cl2(100 ml)中的溶液中添加4-甲苯磺酰氯(6.7 g,35.3 mmol)和DMAP(120 mg)。将混合物在室温搅拌20小时。该反应混合物先后用80mL的HCl(1 M)和水洗涤。萃取物经无水MgSO4干燥,过滤并蒸发滤液。残余物不经过进一步纯化即用于后续步骤。
产量:11.0 g(90%)
NMR:
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.75 – 7.64 (m, 2H), 7.31 – 7.26 (m, 2H),4.16 – 4.06 (m, 2H), 3.62 (m 2H), 3.59 – 3.40 (m, 10H), 3.30 (s, 3H), 2.38(s, 3H).
13C{1H} NMR (101 MHz, CDCl3) δ 144.75 (s), 132.90 (s), 129.77 (s),127.8 (s), 71.82 (s), 70.60 (s), 70.48 (s), 70.47 (s), 70.41 (s), 70.39 (s),69.23 (s), 68.55 (s), 58.90 (s), 21.53 (s)。
合成4-PEG4-苯甲酸乙酯:
程序:(JACS, 2007, 129, 13364)使化合物2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基4-甲基苯磺酸乙酯(8.1 g,22.3 mmol)、4-羟基苯甲酸乙酯(3.7 g,22.3 mmol)、K2CO3(15.4g,111.5 mmol)和18-冠-6(0.59 g,2.2 mmol)的混合物在丙酮(120 ml)中回流22小时。将该反应混合物浓缩并用乙酸乙酯萃取。将萃取物用H2O洗涤,经无水MgSO4干燥并过滤。将滤液蒸发至干,并且残余物通过柱色谱法在硅胶上(二氯甲烷/甲醇=100 : 1)提纯,得到化合物(1.93 g,88%)。
产量:7 g(88%)
NMR:
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01 – 7.84 (m, 2H), 6.96 – 6.85 (m, 2H),4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.12 (dd, J = 5.4, 4.3 Hz, 2H), 3.82 (dd, J = 5.4,4.2 Hz, 2H), 3.71 – 3.56 (m, 10H), 3.51 – 3.45 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 1.32(t, J = 7.1 Hz, 3H).
13C{1H} NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.29 (s), 162.47 (s), 131.45 (s),123.01 (s), 114.11 (s), 71.90 (s), 70.84 (s), 70.60 (s), 70.59 (s), 70.58(s), 70.48 (s), 69.51 (s), 67.54 (s), 60.57 (s), 58.98 (s), 14.35 (s).
MS(+):
[M+Na+]+ = 计算值379.1727,实测值379.1743。
合成4-PEG4-苯甲酸:
程序:(JACS, 2007, 129, 13364)使化合物4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酸乙酯(7 g,19.6 mmol)和KOH(2.3 g,41.24 mmol)在200 mL的EtOH/H2O(1 : 1,v/v)中的混合物回流整夜。在冷却后,将混合物用HCl(2N)中和。所得的混合物用EtOAc萃取并蒸发至干。使所得的白色固体在EtOAc/己烷中重结晶。
产量:5.3 g(85%)
NMR:
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.17 (s, 1H), 8.14 – 7.89 (m, 2H), 7.03 –6.75 (m, 2H), 4.29 – 4.02 (m, 2H), 3.92 – 3.81 (m, 2H), 3.78 – 3.57 (m, 10H),3.57 – 3.46 (m, 2H), 3.35 (s, 3H).
13C{1H} NMR (75 MHz, CDCl3) δ 171.46 (s), 163.24 (s), 132.30 (s),121.98 (s), 114.33 (s), 71.96 (s), 70.91 (s), 70.67 (s), 70.66 (s), 70.64(s), 70.54 (s), 69.55 (s), 67.66 (s), 59.08 (s).
MS(-):
[M-H]- = 计算值327.1438,实测值327.1456。
合成N-联苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺:
程序:在0℃下,向4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酸(3 g,9.14mmol)、0.2 mL的DMF在30 mL无水DCM中的溶液中加入草酰氯(1.05 mL,12.34 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。使溶液浓缩至干。油状残余物不经过进一步提纯即用于后续步骤中。
在惰性气氛下,使2-苯基苯胺(1.6 g)、吡啶(2.4 mL)在氯仿(80 mL)中的溶液冷却至0℃。将20 mL中的(苯基-4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酰氯(3.1 g,9.14 mmol)缓慢地加入到该溶液中,并使最终混合物达到室温。使溶液回流2小时,并在室温下搅拌整夜。该反应混合物用HCl(1 M,2 × 100 mL)、NaHCO3(100 mL)和水(50 mL)萃取。用MgSO4干燥有机相,并通过色谱法在硅胶中(EtOAc/己烷)提纯。
产量:4.1(90%)
NMR:
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.49 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 7.94 (s,1H), 7.61 – 7.35 (m, 9H), 7.33 – 7.25 (m, 1H), 7.19 (m, 1H), 6.91 – 6.84 (m,2H), 4.16 – 4.10 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.77 – 3.58 (m, 10H), 3.56 – 3.49 (m,2H), 3.36 (s, 3H).
13C{1H} NMR (101 MHz, CDCl3) δ 164.56 (s), 161.65 (s), 138.18 (s),135.12 (s), 132.32 (s), 129.97 (s), 129.39 (s), 129.22 (s), 128.66 (s),128.57 (s), 128.16 (s), 127.13 (s), 124.18 (s), 121.23 (s), 114.57 (s), 71.95(s), 70.89 (s), 70.64 (s), 70.63 (s), 70.54 (s), 69.54 (s), 67.63 (s), 59.04(s), 53.51 (s).
MS(+)
[M+H]+ = 计算值480.2386,实测值480.2383; [M+Na]+ = 计算值502.2200,实测值502.2204。
合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶:
程序:使N-联苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺(4 g,8.34 mmol)、POCl3(10 ml)在10 ml甲苯中回流20小时。使混合物冷却至室温,并加入100 ml的二氯甲烷。将该溶液倒入冰中,并用NH4OH(20%)中和混合物。萃取有机相,并相继用蒸馏水和盐水洗涤,并用MgSO4干燥。所得的溶液通过快速色谱法(硅胶,在1 : 1的乙酸乙酯/己烷中,Rf=0.14)提纯。
产量:1 g(25%)
NMR:
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.59 (dd, J = 8.1,1.4 Hz, 1H), 8.23 (dd, J = 8.1, 1.1 Hz, 1H), 8.15 (dd, J = 8.3, 0.7 Hz, 1H),7.84 (ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H), 7.79 – 7.57 (m, 5H), 7.15 – 7.03 (m,2H), 4.29 – 4.19 (m, 2H), 3.93–3.90 (m, 2H), 3.80 – 3.60 (m, 12H), 3.59 –3.49 (m, 2H), 3.37 (s, 3H).
13C{1H} NMR (75 MHz, CDCl3) δ 160.92 (s), 159.45 (s), 143.84 (s),133.59 (s), 131.26 (s), 130.61 (s), 130.26 (s), 129.05 (s), 128.90 (s),127.19 (s), 126.85 (s), 125.39 (s), 123.70 (s), 122.29 (s), 122.01 (s),114.68 (s), 72.02 (s), 70.97 (s), 70.74 (s), 70.72 (s), 70.69, 70.62 (s),69.80 (s), 67.68 (s), 59.15 (s).
MS (+) JM358-F5, [M+H]+ 计算值 = 462,2280,实测值 462.2275。
合成3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸铯盐
按照如上所述的程序通过N-(联苯-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(2 g,6.59 mmol)的环化来制备6-(4-甲氧基苯基)菲啶。该化合物通过色谱法在二氯甲烷/己烷(梯度1 : 5至1: 1)中提纯。收率:87%。
NMR: 1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.84 (dd, J =8.2, 1.2 Hz, 1H), 8.18 – 8.05 (m, 2H), 7.97 (ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H),7.86 – 7.62 (m, 5H), 7.23 – 7.07 (m, 2H), 3.88 (s, 3H).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.70 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.61 (dd, J = 8.1,1.3 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 8.3, 0.7 Hz, 1H), 7.86(ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H), 7.81 – 7.56 (m, 5H), 7.18 – 7.02 (m, 2H),3.92 (s, 3H).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 160.95 (s), 160.33 (s), 143.72 (s), 133.67(s), 132.12 (s), 131.36 (s), 130.71 (s), 130.20 (s), 129.13 (s), 128.97 (s),127.23 (s), 126.92 (s), 125.40 (s), 123.73 (s), 122.33 (s), 122.03 (s),114.03 (s), 55.57 (s).
MS [ESI-MS (+)]: [M+H+]- 实测值286.1231,计算值286.1226。
4-菲啶-6-基-苯酚:通过使用HBr来实现6-(4-甲氧基苯基)菲啶的去保护。在100℃下,使6-(4-甲氧基苯基)菲啶(1 g,3.5 mmol)在15 mL(HBr,47%)中的悬浮液回流12小时。使该混合物冷却至室温,倒入冰水中,并用Na2CO3中和。滤出所得的沉淀物,并用水和Et2O洗涤。固体通过使用二氯甲烷/MeOH的色谱柱提纯。收率:90%。
NMR: 1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 9.84 (s, 1H), 8.92 (d, J = 8.2 Hz, 1H),8.82 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 8.20 – 8.11 (m, 1H), 8.08 (dd, J = 8.1, 1.2Hz, 1H), 8.02 – 7.88 (m, 1H), 7.84 – 7.64 (m, 3H), 7.64 – 7.49 (m, 2H), 7.06– 6.89 (m, 2H).
MS [ESI-MS (-)]: [M-H+]- 实测值270.0922,计算值270.0924。
向4-(菲啶-6-基)苯酚(320 mg,1.18 mmol)在DMF(4 ml)中的溶液中加入Cs2CO3(482.2 mg,1.48 mmol)和1,3-丙基磺酸内酯(159 mg,1.30 mmol)。使反应混合物在室温下搅拌整夜。将反应混合物浓缩至干,并且残余物使用二氯甲烷/MeOH(梯度10 :1至5 :1)通过色谱柱(二氧化硅)来提纯。收率:72%
NMR: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.98 – 8.87 (m, 1H), 8.83 (dd, J =7.9, 1.6 Hz, 1H), 8.12 (m, 2H), 7.97 (ddd, J = 8.3, 7.0, 1.3 Hz, 1H), 7.85 –7.69 (m, 3H), 7.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.19 (t, J= 6.5 Hz, 2H), 2.64 – 2.57 (m, 2H), 2.15 – 1.97 (m, 2H).
MS [EI-MS (-)]: [M-Cs+]计算值392.0956,实测值392.0962。
实施例2
合成氯代-交联的二聚体配合物的一般程序:
Nonoyama, M.在J. Organomet. Chem. 86 (1975) 263-267中公开了该一般程序。
如下合成铱二聚体:在氮气下使IrCl3•3H2O和2.5当量的6-苯基菲啶在120℃下在2-乙氧基乙醇/水混合物(3 : 1,v/v)中加热18小时。冷却至室温后,将沉淀滤去,并相继用甲醇和Et2O洗涤、干燥以提供所需的二聚体。
实施例2.1
具有未取代的苯基菲啶的配合物
[(6-苯基菲啶)2IrCl]2。
收率:71%。棕色固体。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 6.45 (d, J = 6.8, 4H),6.58 (t, J = 7.1, 13.9 Hz, 4H), 6.95 (t, J = 7.1, 14.2 Hz, 4H), 7.56 (t, J =7.4, 16.0 Hz, 4H), 7.68 (t, J = 8.1, 16.2 Hz, 4H), 7.93 (t, J = 8.0, 14.6 Hz,4H), 8.07-8.13 (m, 8H), 8.80 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 8.93-9.01 (m, 12H)。
实施例2.2
具有取代的苯基菲啶的配合物
使6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶(1 g,2.16 mmol)、IrCl3·3H2O(346 mg,0.98 mmol)在16 ml的2-EtOEtOH : H2O(12 : 4)中的混合物在氮气气氛下回流整夜。使反应混合物冷却至室温,并加入60 ml的水以获得油状沉淀物。弃去上清液,并将50 ml水加入到残余物中。将混合物搅拌1小时,获得棕红色沉淀物。将固体过滤,并用水(50 ml)和Et2O(30 ml)洗涤。将棕色固体溶解在较少量的二氯甲烷中,并通过添加Et2O沉淀。其不经过进一步提纯即用于后续步骤。
产量:550 mg(50%)
NMR:
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.74 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 8.36 (dd, J = 8.0,5.2 Hz, 8H), 7.90 (dd, J = 14.7, 7.7 Hz, 8H), 7.81 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.79– 7.67 (m, 4H), 6.78 – 6.65 (m, 4H), 6.32 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 4H), 5.89-5.83 (m, 4H), 5.28 (d, J = 2.5 Hz, 4H), 3.67-3.10 (m, 100H, PEG链,含有某些杂质)
MS(ESI-MS(+)):
[M+2Na+]2+ 计算值1171.3463, 实测值1171.3473; [(C^N)2Ir]+ = 计算值1113.3877, 实测值1113.3892。
用3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸铯盐合成双-铱配合物
使配体3-(4-(菲啶-6-基)-苯氧基)丙烷-1-磺酸铯(500 mg,0.92 mmol)与IrCl3(159.5 mg,0.45 mmol)在2-EtOEtOH : H2O(3 : 1,16 ml)混合物中的混合物在氮气气氛下回流36小时。将反应混合物过滤,并使滤液浓缩至干。残余物不经过进一步提纯即用于后续步骤。
MS [ESI-MS(-)]:[Ir(C^N)2-2Cs+]- 计算值975.13858,实测值975.13882。
实施例3
合成作为氯盐的Ir(6-苯基菲啶)2羧基丙基苯基-联吡啶配合物
在氮气气氛下将二聚体[(6-苯基菲啶)2IrCl]2(163 mg,0.110 mmol)、4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4'-基)-丁酸(60 mg,0.232 mmol)的混合物在2-乙氧基乙醇(15 ml)中在回流下加热整夜。产物用水沉淀并滤出。用Et2O洗涤残余物。该配合物在TLC(二氯甲烷/MeOH 10: 1)中具有Rf = 0.57。产物通过使用二氯甲烷/MeOH(梯度10 :1至5 :1)的色谱柱(二氧化硅)来提纯。收率:25%
NMR: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.22 – 89.17 (t, J = 6.0 Hz, 2H),8.86-8.80 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 8.66-8.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.53-8.48 (m,2H), 8.40 – 8.38 (m, 2H), 8.11-7.99 (m, 6H), 7.62-7.59 (d, J = 9.0 Hz, 2 H),7.52-7.46 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 7.38-7.34(t, J = 6.0 Hz, 2H), 7.29-7.24(t, J =9.0 Hz, 2H),7.13-7.09 (m, 2H), 6.90 – 6.85 (m, 2H), 6.90 – 6.85 (m, 2H), 6.88– 6.75 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 2.21 – 2.17 (m, 2H), 1.83 – 1.77 (m, 2H), 1.55 –1.42 (m, 2H).
MS [ESI-MS(+)]: [M]+ 计算值957.27936,实测值957.27754。
Claims (12)
1.式I的铱基化学发光化合物
其中,各个R1-R20独立地为氢、卤素、氰基或硝基、氨基、取代的氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐或R21,其中R21是芳基、取代的芳基、烷基、取代的烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳基烷基、取代的芳基烷基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基-烷基、取代的氨基-烷基、氨基-烷氧基、取代的氨基-烷氧基、氨基-芳基、取代的氨基-芳基、氨基-芳氧基、取代的氨基-芳氧基,
其中在R1-R12中,或/和在R13-R16中或/和在R17-R20中,分别地,两个相邻的R任选形成芳族环或取代的芳族环,其中取代基选自氢、烷基、取代的烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团,或,
其中在R1-R12中,或/和在R13-R16中,或/和在R17-R20中,分别地,两个相邻的R任选形成脂族环或取代的脂族环,其中取代基选自氢、烷基、取代的烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团,
其中,如果在任意的R1-R21中存在取代,在R1-R21中的取代基各自独立地选自卤素、氰基或硝基、亲水性基团,
其中所用的烷基是具有1-20个碳原子的长度的直链或支链的烷基链或具有1-20个原子的长度并包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的杂烷基链,其中芳基是5、6或7元芳基环体系,或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系,
其中R13-R20中的至少一个是-Q-Z,其中Q是连接基团,并且其中Z是官能团,和,
其中X和Y中的至少一个是N,且另一个X或Y独立地为N或C,
其中Q具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C200烷基链;由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P、S原子组成的1至200个原子的链;具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C200烷基链;或具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P、S原子组成的1至200个原子的链,
其中官能团Z选自醛、羧酸、羧酸酯、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基、卤素、肼、羟基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺,
其中R1-R12中的至少一个是磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基,或它们的磺酸盐,其中抗衡离子优选是来自碱金属族的阳离子。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中Q具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C100烷基链;由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1至100个原子的链;具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C100烷基链;或具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1至100个原子的链。
3.根据权利要求2所述的化合物,其中Q具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链;由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1至50个原子的链;具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链;或具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子,或取代的N、P或S原子组成的1至50个原子的链。
4.根据权利要求1所述的化合物,其中Q具有作为骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链;由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N和S的原子组成的1至20个原子的链;具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链;或具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N和S的原子组成的1至20个原子的链。
5.包含根据权利要求1-4的任一项所述的化合物的缀合物,所述化合物共价键合至亲和结合剂。
6.根据权利要求5的缀合物,其中所述亲和结合剂选自抗原和抗体、生物素或氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素、和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、糖和凝集素、核酸或含有在标准碱基脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)、脱氧胸苷(dT)、脱氧尿苷(dU)处携带取代基的取代的核苷酸和互补核酸,以及受体和配体。
7.根据权利要求5或6所述的缀合物,其中所述亲和结合剂是核酸或抗体。
8.根据权利要求1至4的任一项所述的化合物或根据权利要求5至7的任一项所述的缀合物用于进行在水溶液中的电化学发光反应的用途。
9.根据权利要求1至4的任一项所述的化合物或根据权利要求5至7的任一项所述的缀合物在基于电化学发光的检测方法中的用途。
10.根据权利要求1至4的任一项所述的化合物或根据权利要求5至7的任一项所述的缀合物在分析物的检测中的用途。
11.通过体外方法测量分析物的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供怀疑或已知包含分析物的样品;
b)在适于形成分析物缀合物复合物的条件下使所述样品与根据权利要求5至7的任一项所述的缀合物接触;和
c)通过使用基于电化学发光的检测程序测量步骤b)中形成的复合物,并由此获得该分析物的在样品中的量。
12.根据式II的化合物
其中R1-R20如权利要求1中式I所限定的,例外情况在于式I的Q在式II中分别是Q1或Q2,其中Q1是连接基团,其中式I(b)中R13-R20的至少一个是Q2,且各个Q2独立地为连接基团或共价键,其中n是1至50的整数,其中X和Y如式I所限定的,并且其中Z是官能团。
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