CN104718218B - 用于ecl的新型铱基配合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型铱基Ir(III)发光配合物、包含这些配合物作为标记物的缀合物以及它们在例如分析物的基于电化学发光的检测中的应用。

Description

用于ECL的新型铱基配合物

发明背景

本发明涉及新型铱基Ir(III)发光配合物、包含这些配合物作为标记物的缀合物以及其例如在分析物的基于电化学发光的检测中的应用。

电致化学发光（也称为电化学发光并缩写为ECL）是在电极处生成的物类由此经历高能电子转移反应以形成发光的激光态的过程。在1960年代中期，Hercules和Bard等人描述了首次详细的ECL研究。在研究大约50年后，ECL现在已经成为非常有力的分析技术，并广泛应用于例如免疫测定、食品与水的检验和生物战剂检测的领域。

存在大量看上去可用于有机发光器件（OLED）的化合物。这些化合物适于以固体材料使用，或可以溶解在有机流体中。但是，关于其在水性介质中（如检测来自生物样品的分析物所需的那样）的效用尚无结论。

通常，基于ECL的检测方法基于使用包含Ru(II+)作为金属离子的水溶性钌配合物。

尽管在过去数十年中取得了显著的进步，但是仍然非常需要更灵敏的基于电化学发光的体外诊断分析方法。

现在已经令人惊讶地发现，某些铱基Ir(III+)发光配合物代表了用于未来的高灵敏度ECL基检测方法的极有前途的标记物。

发明概述

本发明公开了式II的铱基化学发光化合物

其中在式I（a）和在式I（b）中，分别和独立地，各R1-R16独立地为氢、卤素、氰基或硝基、氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基（sulfanyl）、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基（phosphinoyl）、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐或R17，其中R17是芳基、取代芳基、烷基、取代烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基、取代的烷芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基-烷基、取代氨基-烷基、氨基-烷氧基、取代氨基-烷氧基、氨基-芳基、取代氨基-芳基、氨基-芳氧基、取代氨基-芳氧基，

其中在R1-R12中，或/和在R13-R16中，分别地，两个相邻的R可以形成芳族环或取代的芳族环，其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，或，

其中在R1-R12中，或/和在R13-R16中，分别地，两个相邻的R可以形成脂族环或取代的脂族环，其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，

其中，如果在R1-R17任一个中存在取代的话，R1-R17中的取代基各自独立地选自卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、烷基氨基、烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、烷基芳氧基、聚乙烯氧基、聚丙烯氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，

其中本文中使用的烷基是长度为1-20个碳原子的直链或支链烷基链或包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的长度为1-20个原子的杂烷基链，其中芳基是5、6或7元芳基环体系，或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系，

其中式I（a）中R13-R16的至少一个是–Q1–Y，其中式I（b）中R13-R16的至少一个是Q2，其中Q1是连接基团，且各Q2独立地为连接基团或共价键，其中(n)是1至50的整数，并且其中Y是官能团。

本发明还公开了包含上述化合物和共价键合于其上的亲和结合剂的缀合物。

本发明进一步涉及本发明中公开的化合物或缀合物用于进行发光测量或水溶液中电化学发光反应，尤其是在电化学发光装置或电化学发光检测系统中的用途。

此外，本发明公开了通过体外方法测量分析物的方法，该方法包括以下步骤：（a）提供怀疑或已知包含分析物的样品；（b）使所述样品与本发明的缀合物在适于形成分析物缀合物配合物的条件下接触；和（c）测量步骤（b）中形成的配合物并由此获得分析物的量度。

发明详述

如上所述，需要新型的金属基化学发光化合物，其适用于体外诊断分析。

式II的新型铱基化学发光化合物

本发明涉及式II的铱基化学发光化合物

其中在式I（a）和在式I（b）中，分别和独立地，各R1-R16独立地为氢、卤素、氰基或硝基、氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐或R17，其中R17是芳基、取代芳基、烷基、取代烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基、取代的烷芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基-烷基、取代氨基-烷基、氨基-烷氧基、取代氨基-烷氧基、氨基-芳基、取代氨基-芳基、氨基-芳氧基、取代氨基-芳氧基，

其中在R1-R12中，或/和在R13-R16中，分别地，两个相邻的R可以形成芳族环或取代的芳族环，其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，或，

其中在R1-R12中，或/和在R13-R16中，分别地，两个相邻的R可以形成脂族环或取代的脂族环，其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，

其中，如果在R1-R17任一个中存在取代的话，R1-R17中的取代基各自独立地选自卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、烷基氨基、烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、烷基芳氧基、聚乙烯氧基、聚丙烯氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，

其中本文中使用的烷基是长度为1-20个碳原子的直链或支链烷基链或包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的长度为1-20个原子的杂烷基链，其中芳基是5、6或7元芳基环体系，或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系，

其中式I（a）中R13-R16的至少一个是–Q1–Y，其中式I（b）中R13-R16的至少一个是Q2，其中Q1是连接基团，且各Q2独立地为连接基团或共价键，其中(n)是1至50的整数，并且其中Y是官能团。

在一个实施方案中，式I（a）的R13至R16之一是Q1–Y。

在一个实施方案中，各式I（b）中的R13至R16之一是Q2。

在一个实施方案中，式I（a）的R13至R16之一是Q1–Y，且各式I（b）中的R13至R16之一是Q2。

在一个实施方案中，式I（a）和式I（b）是相同的，分别除式I（a）中的Q1-Y和式I（b）中的Q2之外。

如本领域技术人员已知的那样，R1-R17中的取代基可以被进一步取代，例如，氨基烷基基团中的烷基基团可以进一步被羟基、氨基、羧基或磺基取代。

如本文中（包括所附权利要求书）所用，取代基具有本领域技术人员公知的含义。

烷基优选是长度为1-20个碳原子的直链或支链烷基链，优选具有1-10个碳原子的长度，特别优选具有1-6个碳原子的长度；或包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的长度为1-20个原子的杂烷基链，优选具有1-10个碳原子的长度。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基、异构辛基和十二烷基。在一个特别优选的实施方案中，烷基是甲基或乙基。

术语烷氧基和烷基氧基以及取代的烷基和取代的烷氧基分别可以互换使用。烷氧基和烷基氧基指的是式–OR的部分，其中R优选为如上文所定义的烷基部分。烷氧基部分的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基和异丙氧基。

在一个实施方案中，取代的烷氧基的优选取代基是包含1-40个乙烯氧基（ethylenoxy）单元，或包含1-20个乙烯氧基单元或包含1-10个乙烯氧基单元的乙烯氧基链。

芳基优选是5、6或7元芳基环体系，优选6元芳基环体系，或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系，优选6元杂芳基环体系。在一个特别优选的实施方案中，芳基是苯基。

在一个实施方案中，在式I（a）和在式I（b）中，分别和独立地，各R1-R16独立地为氢、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基或亚砜。

在一个实施方案中，在式I（a）和在式I（b）中，分别和独立地，各R1-R16独立地为氢、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基或亚砜。

在一个实施方案中，在式I（a）和在式I（b）中，分别和独立地，各R1-R16独立地为氢、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺酸盐或亚砜。

在一个实施方案中，式I（a）和/或式I（b）的化合物的R1至R16的至少一个被至少一个亲水性基团取代，特别是被至少一个如下文所定义的亲水性基团取代。

在一个实施方案中，式I（a）和/或式I（b）中包含的苯基菲啶残基的R1至R12的至少一个被至少一个亲水性基团取代，特别是被至少一个如下文所定义的亲水性基团取代。

优选的亲水性基团是氨基；烷基氨基，烷基指的是直链链如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基链或支链烷基链如异丙基、异丁基、叔丁基，优选为直链烷基链如甲基或乙基；取代的烷基氨基，其含有例如一个或两个键合到N-原子上的支链或直链链，其被附加的亲水性基团如羟基或磺基取代，优选这种取代的烷基氨基含有两个羟丙基或羟乙基残基；芳基氨基，芳基指的是芳族残基，如苯基或萘基，优选苯基；取代的芳基氨基，具有如上文所定义的芳基和由亲水性基团构成的附加残基；烷基铵，烷基如上文所定义，优选是三甲基铵残基或三乙基铵残基；取代的烷基铵；羧基；羧酸酯，优选烷基酯如甲基或乙基酯；氨基甲酰基；羟基；取代或未取代的烷氧基，烷基和取代烷基如上文所定义；或芳氧基或取代的芳氧基，芳基和取代芳基如上文所定义；硫烷基；取代或未取代的烷基磺酰基；取代或未取代的芳基磺酰基；磺基；亚磺基；次磺基；氨磺酰基；亚砜；膦酰基；羟基亚膦酰基；羟基-烷基-亚膦酰基；膦酸盐；亚膦酸盐。

优选地，此类亲水性基团选自氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羟基、磺基、次磺基、氨磺酰基、亚砜和膦酸盐，当适用时各自优选如上面段落中所定义。

在一个优选实施方案中，该亲水性基团选自烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羟基、磺基、次磺基、氨磺酰基、亚砜和膦酸盐。

在更特别优选的实施方案中，该亲水性基团选自磺基和氨磺酰基。

在一个实施方案中，式II的式I、式I（a）和/或式I（b）中包含的苯基菲啶残基的R1至R12的至少一个分别被至少一个亲水性基团取代。

在一个实施方案中，R1-R12的至少一个是取代或未取代的基团，该基团选自磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基、亚磺基-烷基、亚磺基-芳基、亚磺基-烷氧基、亚磺基-芳氧基、亚磺基、次磺基-烷基、次磺基-芳基、次磺基-烷氧基、次磺基-芳氧基、次磺基、氨磺酰基-烷基、氨磺酰基-芳基、氨磺酰基-烷氧基、氨磺酰基-芳氧基、氨磺酰基、烷烃磺酰基-烷基、烷烃磺酰基-芳基、烷烃磺酰基、芳烃磺酰基-烷基、或芳烃磺酰基-芳基、或芳烃磺酰基、磺氨基-烷基、磺氨基-芳基、磺氨基-烷氧基、磺氨基-芳氧基、磺氨基、亚磺氨基-烷基、亚磺氨基-芳基、亚磺氨基-烷氧基、亚磺氨基-芳氧基、亚磺氨基、烷烃磺酰基氨基-烷基、烷烃磺酰基氨基-芳基、烷烃磺酰基氨基-烷氧基、烷烃磺酰基氨基-芳氧基、烷烃磺酰基氨基、芳烃磺酰基氨基-烷基、芳烃磺酰基氨基-芳基、芳烃磺酰基氨基-烷氧基、芳烃磺酰基氨基-芳氧基、芳烃磺酰基氨基、烷烃亚磺酰基氨基-烷基、烷烃亚磺酰基氨基-芳基、烷烃亚磺酰基氨基-烷氧基、烷烃亚磺酰基氨基-芳氧基、烷烃亚磺酰基氨基、芳烃亚磺酰基氨基-烷基、芳烃亚磺酰基氨基-芳基、芳烃亚磺酰基氨基-烷氧基、芳烃亚磺酰基氨基-芳氧基、芳烃亚磺酰基氨基、膦酰基-烷基、膦酰基-芳基、膦酰基-烷氧基、膦酰基-芳氧基、膦酰基、羟基亚膦酰基-烷基、羟基亚膦酰基-芳基、羟基亚膦酰基-烷氧基、羟基亚膦酰基-芳氧基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷氧基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳氧基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酰基氨基-烷基、膦酰基氨基-芳基、膦酰基氨基-烷氧基、膦酰基氨基-芳氧基、膦酰基氨基，或者当化学匹配时，上述取代基的盐，其中“烷基”是长度为1-20个碳原子的直链或支链的烷基链或包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的长度为1-20个原子的杂烷基链，并且其中本文中所用的“芳基”是5、6或7元芳基环体系，或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系。

在一个实施方案中，R1至R12的至少一个是取代或未取代的基团，该基团选自磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基、氨磺酰基-烷基、氨磺酰基-芳基、氨磺酰基-烷氧基、氨磺酰基-芳氧基、氨磺酰基、烷烃磺酰基-烷基、烷烃磺酰基-芳基、烷烃磺酰基、芳烃磺酰基-烷基、芳烃磺酰基-芳基、芳烃磺酰基、烷烃磺酰基氨基-烷基、烷烃磺酰基氨基-芳基、烷烃磺酰基氨基-烷氧基、烷烃磺酰基氨基-芳氧基、烷烃磺酰基氨基、芳烃磺酰基氨基-烷基、芳烃磺酰基氨基-芳基、芳烃磺酰基氨基-烷氧基、芳烃磺酰基氨基-芳氧基、芳烃磺酰基氨基、膦酰基-烷基、膦酰基-芳基、膦酰基-烷氧基、膦酰基-芳氧基、膦酰基、羟基亚膦酰基-烷基、羟基亚膦酰基-芳基、羟基亚膦酰基-烷氧基、羟基亚膦酰基-芳氧基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳基、羟基-烷基-亚膦酰基-烷氧基、羟基-烷基-亚膦酰基-芳氧基、羟基-烷基-亚膦酰基，或者当化学匹配时，上述取代基的盐，其中“烷基”是长度为1-20个碳原子的直链或支链的烷基链或包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的长度为1-20个原子的杂烷基链，并且其中本文中所用的“芳基”是5、6或7元芳基环体系，或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系。

在一个实施方案中，R1至R12的至少一个是磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基、或其盐（=磺酸盐），其中该抗衡离子优选是来自碱金属族的阳离子。

在一个实施方案中，R1至R12的至少一个是 磺基-烷基、磺基-烷氧基、磺基、或其盐（=磺酸盐），其中该抗衡离子是来自碱金属族的阳离子。

在一个实施方案中，R1至R12的至少一个是磺基-甲基、具有C2至C4烷基链的磺基-烷氧基，或其盐（=磺酸盐），其中该抗衡离子是来自碱金属族的阳离子。

在一个实施方案中，式I（a）和/或式I（b）的基团R1至R12的至少一个是磺基。

在一个实施方案中，R1至R12的一个至三个不为氢。

在一个实施方案中，该抗衡离子是选自锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子和铯阳离子的碱金属阳离子。

在一个实施方案中，该抗衡离子是选自钠阳离子和铯阳离子的碱金属阳离子。

在一个实施方案中，该抗衡离子是铯阳离子。

在一个实施方案中，式I（a）和/或式I（b）中包含的苯基菲啶残基选自下面给出的取代的苯基菲啶。

本文中所用的术语“连接基团”具有本领域技术人员已知的含义，并涉及用于连接分子片段的分子或分子组。连接基团表征为在柔性或刚性骨架上具有两个或多个化学上正交的官能。共价键在本发明的意义上并非连接基团。

在本发明的化合物中，连接基团Q1优选具有1至200个原子的骨架长度。如技术人员将容易理解的那样，式II的连接基团Q1包含n个支化点，Q2键合在该支化点处。换句话说，式I（a）的吡啶环与官能团Y之间的最短连接由1至200个原子组成。

在一个实施方案中，作为骨架，Q1具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C200烷基链，或1至200个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P、S原子组成的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。

在存在环体系的情况下，在评估连接基团长度时取环体系中的最短原子数量。例如，亚苯基环占连接基团中四个原子的长度。

在一个实施方案中，作为骨架，连接基团Q1具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C100烷基链，或1至100个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。

在一个实施方案中，作为骨架，连接基团Q1具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链，或1至50个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。

在再一个实施方案中，作为骨架，连接基团Q1具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链，或1至20个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。

在一个实施方案中，本发明的电化学发光配合物中的连接基团Q1是直链或支链的饱和、不饱和、未取代、取代的C1-C20烷基链，或C1-C20芳基烷基链（其中，例如亚苯基环占据四个碳原子长度），或具有由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的1至20个原子的链，或包含至少一个芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基基团（其中，例如，亚苯基环占四个原子的长度）的具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的1至20个原子的链。

在一个实施方案中，本发明的化合物中的连接基团Q1是饱和的C1-C12烷基链，或C1-C12芳基烷基链，或具有由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的1至12个原子的链，或包含至少一个芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基基团（其中，例如，亚苯基环占四个原子的长度）的具有由碳原子、取代的碳原子和一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的1至12个原子的链。

在一个实施方案中，该连接基团Q1包含肽链。

在一个实施方案中，Q2选自–C₆H₄-(CH₂)₂-和–C₆H₄-(CH₂)₂-CO-。

式I（b）和Q2在式II的化合物中呈现(n)次，(n)是1-50的整数。这些(n)个Q2各自独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C200烷基链，或由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P、S原子组成的1至200个原子的链，或如上所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。

在一个实施方案中，各Q2独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C100烷基链，或由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的1至100个原子的链，或如上所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。

在一个实施方案中，各Q2独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链，或由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的1至50个原子的链，或如上所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。

在一个实施方案中，各Q2独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C20烷基链，或由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的1至20个原子的链，或如上所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。

在一个实施方案中，各Q2独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C12烷基链，或由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的1至12个原子的链，或如上所述的具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链作为骨架的连接基团。

在一个实施方案中，各Q2独立地为共价键或具有饱和的C1-C12烷基链或具有由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的1至12个原子的链作为骨架的连接基团。

在一个实施方案中，该连接基团Q1包含一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，该连接基团Q2包含一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，该连接基团Q1与Q2均包含一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，该连接基团Q1包含一个或多个核苷酸。

在一个实施方案中，该连接基团Q2包含一个或多个核苷酸。

在一个实施方案中，该连接基团Q1与Q2均包含一个或多个核苷酸。

在式II中，(n)是1-50的整数，表明式I（b）和Q2在式II的化合物中呈现(n)次。在某些实施方案中，(n)是2至50、或1至40、或2至40、或3至31的整数。

在式II中，(n)是1-50的整数，表明式I（b）和Q2在式II的化合物中呈现(n)次。在某些实施方案中，(n)是1至49、1至48、1至47、1至46、1至45、1至44、1至43、1至42、1至41、1至40、2至50、2至49、2至48、2至47、2至46、2至45、2至44、2至43、2至42、2至41、2至40、3至39、3至38、3至37、3至36、3至35、3至34、3至33、3至32、3至31、3至30、4至29、4至28、4至27、4至26、4至25、4至24、4至23、4至22、4至21、4至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11或5至10的整数。

在一个实施方案中，在式II中，(n)是1。

在一个实施方案中，在式II中，(n)是2。

在一个实施方案中，在式II中，(n)是3。

在一个实施方案中，包含在本发明的式II的铱基配合物中的官能团Y选自醛、羧酸、羧酸酯、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基、卤素、肼、羟基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。

在一个实施方案中，包含在本发明的式II的铱基配合物中的官能团Y选自羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基、卤素、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。

在一个特别优选的实施方案中，包含在本发明的式II的铱基配合物中的官能团Y选自N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺基。

现在已经令人惊讶和意料不到地发现，式II的铱基化学发光化合物适合作为用于未来的高灵敏度ECL基检测方法的标记物。

在一个实施方案中，本发明涉及式II的化合物，

其中式I（a）和式I（b）是相同的，除了分别在式I（a）中为Q1-Y和在式I（b）中为Q2，

其中，分别在式I（a）中和在式I（b）中，R1至R12的一个至三个独立地为磺基-烷基、磺基-芳基、磺基-烷氧基、磺基-芳氧基、磺基、或其盐（=磺酸盐），其中该抗衡离子优选是来自碱金属族的阳离子，并且其余基团R1至R12是氢，

其中式I（a）中的R13-R16之一是–Q1-Y，并且式I（a）中的其它基团R13至R16是氢，

其中式I（b）中的R13-R16之一是Q2，并且式I（a）中的其它基团R13至R16是氢，其中Q1是连接基团，Q2是连接基团或共价键，

(n)是1至50的整数，和

Y是官能团。

如上定义的式II的化合物的任意实施方案的任意组合被视为在本发明的范围内。

式I的新型铱基化学发光化合物

在另一方面，本发明涉及式I的化合物

其中R1-R16是氢、卤素、氰基或硝基、氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐或R17，其中R17是芳基、取代芳基、烷基、取代烷基、支链烷基、取代的支链烷基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基、取代的烷芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基-烷基、取代氨基-烷基、氨基-烷氧基、取代氨基-烷氧基、氨基-芳基、取代氨基-芳基、氨基-芳氧基、取代氨基-芳氧基，

其中在R1-R12中，或/和在R13-R16中，分别地，两个相邻的R可以形成芳族环或取代的芳族环，其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，或者，

其中在R1-R12中，或/和在R13-R16中，分别地，两个相邻的R可以形成脂族环或取代的脂族环，其中该取代基选自氢、烷基、取代烷基、卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，

其中，如果在R1-R17任一个中存在取代的话，R1-R17中的取代基各自独立地选自卤素、氰基或硝基、亲水性基团如氨基、烷基氨基、烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、烷基芳氧基、聚乙烯氧基、聚丙烯氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、亚砜、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、亚膦酸盐，

其中本文中使用的烷基是长度为1-20个碳原子的直链或支链烷基链或包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的长度为1-20个原子的杂烷基链，其中芳基是5、6或7元芳基环体系，或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系，

其中R13-R16的至少一个是–Q–Y，其中Q-Y是马来酰亚胺或其中Q是共价键，或直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C21-C200烷基链，或具有由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的21至200个原子的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链，并且其中Y是官能团。

式I、式I（a）和式I（b）的化合物分别包含两个如经由对式I给出的定义所限定的衍生自苯基菲啶的配体和一个第三配体。

在其它实施方案中，R1至R17具有如上文对式II的化合物的R1至R17所述的相同的含义。

在一个实施方案中，Q-Y是马来酰亚胺。

在一个实施方案中，Q是共价键。

在一个实施方案中，Q是直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C21-C200烷基链，或具有由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的21至200个原子的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。

在一个实施方案中，Q是直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C21-C100烷基链，或具有由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的21至100个原子的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。

在一个实施方案中，Q是直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C21-C50烷基链，或具有由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的21至50个原子的链，或如前所述具有含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的骨架的链。

在一个实施方案中，包含在本发明的式I的铱基配合物中的官能团Y选自醛、羧酸、羧酸酯、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基、卤素、肼、羟基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。

在一个实施方案中，包含在本发明的式I的铱基配合物中的官能团Y选自羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基、卤素、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺。

在一个特别优选的实施方案中，包含在本发明的式I的铱基配合物中的官能团Y选自N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺基。

如上定义的式I的化合物的任意实施方案的任意组合被视为在本发明的范围内。

现在已经令人惊讶和意料不到地发现，式I的铱基化学发光化合物适合作为用于未来的高灵敏度ECL基检测方法的标记物。

制备式II和I的化合物的方法

本发明在一个方面分别涉及制备式I的化合物和式II的化合物的新方法。

式I的化合物例如可以如下合成（基于Lamansky, S., Inorg. Chem. 40 (2001)1704-1711）：合成取代苯基-菲啶二聚体铱配合物；使该二聚体与Q-Y的前体反应以获得式I的产物。

根据该方法，例如如下面的图式1所示那样获得式I的化合物。

图式1：合成式I的化合物。试剂与条件：（i）：Na₂CO₃/2-乙氧基乙醇；m是1至15的整数。

用作起始物料的取代苯基-菲啶二聚体铱配合物可以通过如实施例中所示（参见实施例2）并如例如EP 12179056.2中所述的方法获得。

用作制备苯基-菲啶二聚体铱配合物的起始物料的化合物是市售的，或可以通过本领域技术人员已知的方法获得，例如如实施例中所示（参见实施例1）。

式II的化合物例如可以如下合成（基于Lamansky, S., Inorg. Chem. 40 (2001)1704-1711）：合成取代苯基-菲啶二聚体铱配合物；使该二聚体与含有2-50个第三配体部分的连接基团Q的前体反应以获得式II的产物。

根据该方法，式II的化合物可以例如如下面的图式2中所示那样获得。

图式2：合成式II的化合物。试剂与条件：（i）：Cs₂CO₃，DMF；

在化合物NH₂-UUXUEUXUEUXUU-OH中，U是β-丙氨酸残基，E是谷氨酸残基，并且X是下列残基：

(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸

用作起始物料的取代苯基-菲啶二聚体铱配合物可以通过本领域技术人员已知的方法获得，例如如实施例中所示（参见实施例2）。

用作制备苯基-菲啶二聚体铱配合物的起始物料的化合物是市售的，或可以通过本领域技术人员已知的方法获得，例如如实施例中所示（参见实施例1）。

式II的化合物还可以以另一种方式合成：该取代苯基-菲啶二聚体铱配合物（参见例如实施例2.2）首先进一步与含有官能团(-Q-)Z的第三配体的衍生物反应以获得单体铱配合物。例如在式I中给出了单体铱配合物。但是，为了用于合成式II的配合物，如式I中给出的化合物另外涵盖其中该连接基团Q是如对式II所定义的Q2的那些。该单体铱配合物随后进一步与含有2-50个可以与单体铱配合物的官能团反应以形成共价键的基团的Q2的前体反应；这种方式在再次形成共价键后获得式II的化合物。

根据这种方法，例如可以如下面的图式3中所示获得式II的化合物。

图式3：合成式II的化合物

包含式II或式I的新型化合物的缀合物与本发明的其它方面

在一个方面，本发明涉及分别包含如上文中公开和定义并共价键合到生物物质上的式II的或式I的铱基电化学发光化合物的缀合物。合适的生物物质的实例是细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、核酸、肽核酸（PNA）、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药理物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖。

在一个实施方案中，本发明的缀合物的生物物质，即分别共价键合到式II或式I的化合物上的生物物质是亲和结合剂。亲和结合剂是能够将分子经由这些分子之间的相互吸引结合到另一分子上并由此获得其中该分子彼此靠近的稳定缔合的分子。分子结合的结果是形成分子复合物（complex）。复合物组分之间的吸引键合通常相比在共价键中较弱。在这种情况下，结合剂是亲和结合剂，这意味着其能够结合亲和配合物（complex），即在各种条件下（例如标准条件下的水性介质）稳定的配合物。可以参与分子结合的分子包括但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小的有机分子，如药物。因此，通过分子结合形成的复合物类型包括：蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-激素、蛋白质-药物、抗原-抗体、受体-配体、生物素-抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素（streptavidin）、核酸-互补核酸或受体-受体（拮抗剂）激动剂。

如技术人员将理解的那样，在本发明的缀合物中，式II或式I的化合物的官能团Y分别用于与亲和结合剂上的基团形成共价键，并不再以此形式存在。在亲和结合试剂本身不含有适于与基团Y结合或反应的基团的情况下，此类基团可以依靠既定程序容易地引入到该亲和结合剂中。

在一个方面，本发明涉及分别通过使式II或式I的化合物的官能团Y与本文中定义的亲和结合剂的适当基团（其与该官能团Y为反应性）反应来制备缀合物。该过程可以由技术人员采用技术人员已知的标准方法来进行。

在一个方面，本发明涉及可以通过上述制备缀合物的方法获得的缀合物。

虽不希望受到进一步的限制，但为清楚起见，该亲和结合剂可以包含下列的任意一种：抗原、蛋白质、抗体、生物素或生物素类似物和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、糖和凝集素、酶、多肽、氨基、核酸或核酸类似物和互补核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸（PNA）、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂或受体拮抗剂。例如，该亲和结合剂可以是特异性结合对的一个配偶体（partner），其中所述结合对的另一个配偶体与细胞表面或细胞内结构相联，或者是在细胞表面或细胞内结构上的靶。

在一个实施方案中，该缀合物分别包含式II或式I的化合物，以及结合到其上的亲和结合剂，所述亲和结合剂选自蛋白质、抗原、抗体、生物素、生物素类似物、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、糖、凝集素、酶、多肽、氨基、核酸、核酸类似物、互补核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸（PNA）、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂和受体拮抗剂。

优选地，亲和结合剂是亲和力结合对的配偶体或成员，或者也被本领域技术人员称为特异性结合对的配偶体或成员。

亲和结合剂对其靶，例如特异性结合对的一个成员（如抗体）对该特异性结合对的另一成员（如其抗原），具有至少10⁷ l/mol的亲和力。亲和结合剂优选对其靶具有10⁸ l/mol或甚至更优选10⁹ l/mol的亲合力。

在一个实施方案中，本发明涉及其中该亲和结合剂选自抗原、抗体、生物素或生物素类似物、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、糖、凝集素、核酸或核酸类似物和互补核酸、受体和配体的缀合物。

在一个实施方案中，本发明涉及其中该亲和结合剂选自抗体、生物素或生物素类似物、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、和核酸的缀合物。

在一个实施方案中，该缀合物包含式II或式I的化合物，以及蛋白质、抗原、抗体、生物素、生物素类似物、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、糖、凝集素、酶、多肽、氨基、核酸、核酸类似物、互补核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸（PNA）、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂或受体拮抗剂。

在一个实施方案中，本发明的缀合物包含分别如上文公开和定义的共价连接的式II或式I的化合物，以及亲和结合剂，该亲和结合剂是寡核苷酸或抗体。

生物素类似物是氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。

本文中所用的术语“寡核苷酸”或“核酸”通常是指短的、通常单链的聚核苷酸，其包含至少8个核苷酸和最多大约1000个核苷酸。在一个优选实施方案中，寡核苷酸将具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或30个核苷酸的长度。在一个优选实施方案中，寡核苷酸将具有不超过200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸的长度。

术语寡核苷酸应广义理解，并包括DNA与RNA以及其类似物和改性物。

核酸类似物例如可以含有在标准碱基脱氧腺苷（dA）、脱氧鸟苷（dG）、脱氧胞苷（dC）、脱氧胸苷（dT）、脱氧尿苷（dU）处带有取代基的取代核苷酸。此类取代核酸碱基的实例是：5-取代嘧啶类，如5甲基dC、氨基烯丙基dU或dC、5-(氨基乙基-3-丙烯酰基酰亚胺基)-dU、5-丙炔基-dU或-dC、5卤代-dU或-dC；N取代嘧啶类，如N4-乙基-dC；N取代嘌呤，如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG；8取代嘌呤，如8-[6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或-dA、8卤代dA或dG、8-烷基dG或dA；和2取代dA，如2氨基dA。

核酸类似物可以含有核苷酸或核苷类似物。即天然存在的核酸碱基可以通过使用核酸碱基类似物进行交换，所述核酸碱基类似物例如5-硝基吲哚-d-核苷；3-硝基-吡咯-d-核苷、脱氧肌苷（dI）、脱氧腺苷（dX）；7去氮-dG、-dA、-dI或-dX；7-去氮-8-杂氮-dG、-dA、-dI或-dX；8-杂氮-dA、-dG、-dI或-dX；d-间型霉素；假dU；假异dC；4硫代dT；6硫代dG；2硫代dT；异dG；5-甲基-异-dC；N8-连接的8-杂氮-7-去氮-dA；5,6-二氢-5-杂氮-dC；和亚乙烯基-dA或吡咯并-dC。如对本领域技术人员显而易见的那样，必须以使得双链体形成是特异性的方式选择互补链中的核酸碱基。例如，如果在一个链（例如(a)）中使用5-甲基-异-dC，在互补链（例如(a’)）中必须使用异dG。

在核酸类似物中，寡核苷酸骨架必须被改性以便在核苷间磷酸酯部分中含有取代的糖残基、糖类似物、改性物，和/或是PNA。

寡核苷酸可以例如含有具有取代的脱氧核糖的核苷酸，所述取代的脱氧核糖例如2’-甲氧基、2’-氟、2’-甲基硒基、2’-烯丙氧基、4’-甲基dN（其中N是核酸碱基，例如A、G、C、T或U）。

糖类似物例如是木糖；2’,4’-桥接核糖如(2'-O, 4'-C亚甲基)-(称为LNA的低聚物)或(2'-O, 4'-C亚乙基)-(称为ENA的低聚物)；L-核糖、L-d-核糖、己糖醇（称为HNA的低聚物）；环己烯基（称为CeNA的低聚物）；阿卓糖醇（称为ANA的低聚物）；稠合到环丙烷环上的三环核糖类似物，其中C3′和C5′原子通过亚乙基桥连接（称为三环DNA的低聚物）；甘油（称为GNA的低聚物）；吡喃葡萄糖（称为Homo DNA的低聚物）；carbaribose（用环戊烷代替四氢呋喃亚单位）；羟甲基-吗啉（称为吗啉代DNA的低聚物）。

大量核苷间磷酸酯部分的修饰同样已知不会干扰杂交性质，并且此类骨架修饰也可以与取代核苷酸或核苷酸类似物结合。实例是硫代磷酸寡核苷酸、二硫代磷酸寡核苷酸、氨基磷酸寡核苷酸和甲基膦酸寡核苷酸。

PNA（具有不含磷酸酯和d-核糖的骨架）也可以用作DNA类似物。

上述修饰的核苷酸、核苷酸类似物以及寡核苷酸骨架修饰在本发明的含义中可以按需合并在寡核苷酸中。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，并明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体），以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。

“分离的”抗体是已经鉴定并从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是干扰对该抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，并可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化（1）至通过例如Lowry法测定的大于该抗体的95重量%，在某些实施方案中至大于99重量%；（2）至足以通过采用例如转杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或（3）至使用例如考马斯蓝或银染色剂在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE获得的均匀性。分离的抗体包括原位在重组细胞中的抗体，因为该抗体的自然环境的至少一种组分将不存在。但是，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

“天然抗体”通常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻（L）链和两个相同的重（H）链组成。各轻链通过一个共价二硫键连接到重链上，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同型的重链中可变。各重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫键。各重链在一端具有可变域（VH），接着是多个恒定域。各轻链在一端具有可变域（VL），在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，且轻链可变域与重链的可变域对齐。特定的氨基酸残基被认为构成了轻链与重链可变域之间的界面。

抗体的“可变区”或“可变域”指的是该抗体的重链或轻链的氨基-末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最易变部分，并含有抗原结合位点。

术语“可变”指的是这样的事实：该可变域的某些部分在抗体中的序列方面存在广泛差异，并用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，这种变异性并非在抗体的整个可变域中均匀分布。其集中在三个区段中，所述区段在轻链和重链可变域中均称为高变区（HVR）。可变域的更高度保守的部分称为框架区（FR）。天然重链和轻链的可变区各自包含通过三个HVR连接的大多采取β-折叠片构型的四个FR区，其形成连接β-折叠片结构或在某些情况下构成β-折叠片结构一部分的环。各链中的HVR通过FR区保持彼此非常靠近，并与来自其它链的HVR一起有助于形成抗体的抗原结合位点（参见Kabat等人, Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第五版, National Institute of Health,Bethesda, MD (1991)）。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。

来自任意脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可以根据其恒定域的氨基酸序列归为两种截然不同类型中的一种，这两种类型称为kappa（κ）和lambda（λ）。

根据它们的重链的恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可以归为不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可以进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的，并通常描述在例如Abbas等人, Cellular and Mol.Immunology, 第4版, W.B. Saunders, Co. (2000)中。抗体可以是更大的融合分子的一部分，所述融合分子由抗体与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价结合构成。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地用于指处于其基本完整形式的抗体，而非如下定义的抗体片段。该术语特别是指具有含Fc区的重链的抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，该部分优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段构成的多特异性抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自具有单个抗原结合位点，以及残余“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并仍能够交联抗原。

“Fv”是含有完整的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv物类由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv（scFv）物类中，一个重链和一个轻链可变域可以通过柔性肽连接基团共价连接以使得该轻链和重链可以以类似于双链Fv物类中的“二聚”结构结合。在这种构型中，各可变域的三个HVR相互作用以便在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总体而言，这六个HVR赋予了对抗体的抗原结合特异性。但是，甚至单一可变域（或仅包含三个对抗原为特异性的HVR的Fv的半部分）也能够识别和结合抗原，尽管亲和力比完整的结合位点低。

该Fab片段含有重链和轻链可变域，并还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域（CH1）。Fab’片段通过在重链CH1域的羧基末端增加几个残基（包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸）而有别于Fab片段。Fab’-SH是本文中对其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’的标志。F(ab’)2抗体片段初始以在其之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段形式制得。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH与VL域，其中这些域存在于单个多肽链中。通常，该scFv多肽进一步包含在VH与VL域之间的多肽连接基团，该连接基团使得该scFv能够形成抗原结合所需的结构。对于scFv的综述，参见例如Plueckthun, In: ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, 卷113, Rosenburg and Moore (eds.),Springer-Verlag, New York (1994) 第269-315页。

术语“双抗体”指的是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含连接到同一多肽链中的轻链可变域（VL）上的重链可变域（VH）（VH-VL）。通过使用过短以至于不允许同一链上两个域之间配对的连接基团，迫使该域与另一链的互补域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体更充分地描述在例如EP 0 404 097；WO1993/01161；Hudson, P.J.等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134；和Holliger, P.等人,PNAS USA 90 (1993) 6444-6448中。三抗体和四抗体也描述在Hudson, P.J.等人, Nat.Med. 9 (2003) 129-134中。

本文中所用的术语“单克隆抗体”指的是获自基本同质的抗体的群的抗体，即包含在该群中的个别抗体除可能的突变（例如可能少量存在的自然发生的突变）外是相同的。由此，修饰词“单克隆”显示了该抗体并非离散抗体混合物的特性。在某些实施方案中，此类单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合性多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合性多肽序列的方法来获得。例如，该选择过程可以是从多个克隆（如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组体DNA克隆的集合）中选择独特的克隆。应当理解的是，所选择的靶标结合性序列可以进一步改变以便例如改进对该靶标的亲合力、人源化该靶标结合性序列、改进其在细胞培养物中的生产、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等等，并且包含改变后的靶标结合性序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常免受其他免疫球蛋白的污染。

如所述那样，本文中公开的化合物和缀合物具有相当有利的性质。例如，公开的化合物或缀合物分别表现出高ECL效率。与许多仅在有机溶剂中分析时显示高ECL效率的ECL标记物相比，如果在含水体系中进行相应测量时也呈现这种高效率。例如，许多OLED染料通常在乙腈中进行分析，并且不溶于水溶液，或者如果可溶的话在水溶液中也不显示有效的电化学发光。

在一个优选实施方案中，本发明涉及本发明中公开的化合物或缀合物分别用于进行在水溶液中的电化学发光反应的用途。水溶液是包含至少90%的水（重量比重量）的任何溶液。显然，此类水溶液可以另外含有诸如缓冲剂化合物、洗涤剂和例如作为ECL反应中的电子给体的叔胺，如三丙胺的成分。

在一个方面，本发明涉及本发明中公开的化合物或缀合物分别在基于电化学发光的检测方法中的用途。

在一个方面，本发明涉及本发明中公开的化合物或缀合物分别在分析物检测中的用途。

本发明的分析物可以是任何无机或有机分子，包括任何相关生物物质。代表本发明的意义上的分析物的合适的生物物质的实例是细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药理物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖。

该分析物可以选自多肽、碳水化合物、以及无机或有机的药物分子。

多肽或蛋白质是基本上由氨基酸组成并具有至少两个通过肽键连接的氨基酸的分子。在将要在本文中公开的方法中研究相关分析物的情况下，该多肽优选将由至少5、6、7、8、9、10、12、15、20、25和30至最多大约10,000个氨基酸组成。优选地，该多肽将含有5至2,000个，还优选10至1,000个氨基酸。

在分析物是核酸的情况下，这些核酸优选是天然存在的DNA或RNA寡核苷酸。

在一个方面，本发明涉及通过体外方法测量分析物的方法，该方法包括以下步骤：（a）提供怀疑或已知包含该分析物的样品；（b）在适于形成分析物缀合物复合物的条件下使所述样品与根据亲和结合剂和本发明中公开的根据式II的化合物之间的缀合物接触；（c）测量步骤（b）中形成的复合物，由此获得该分析物的量度。

在一个实施方案中，测量分析物指的是检测样品中分析物的量。

在一个实施方案中，上述方法中用于检测分析物的测量通过使用基于电化学发光的检测程序进行。同样优选的是在水溶液中实施该方法。

提供下列实施例以帮助理解本发明，其真实范围陈述在所附权利要求中。要理解的是，可以在陈述的程序中作出修改而不背景本发明的精神。

本文中指定的所有专利和出版物全文经此引用并入本文。

实施例

实施例1

合成取代苯基-菲啶

实施例1.1

合成取代2-氨基联苯的一般程序：

采用由Youn, S.W.在Tetrahedron Lett. 50 (2009) 4598-4601中所述的在市售的2-溴苯胺衍生物与相应的芳基硼酸之间的Suzuki-Miyaura偶联反应，可以合成适当的2-氨基联苯，其为进一步反应为菲啶所需要的。

典型程序：

a：10摩尔% PdCl₂(PPh₃)₂、K₂CO₃、DMF/H₂O（5/1），80℃，24小时。

其它实施例：

。

实施例1.2

合成取代菲啶的一般程序：

向2-芳基苯胺1（0.01摩尔）在氯仿（20毫升）中的冰冷却的溶液中加入芳基酰氯2（0.01摩尔） 并在室温下在惰性条件下搅拌30分钟。所得混合物在搅拌下再回流2小时。该反应混合物通过经60分钟的时间逐滴添加吡啶（0.02摩尔在10毫升氯仿中）进行处理。使该混合物冷却至室温并搅拌整夜。混合物用0.5 M HCl充分洗涤，经MgSO₄干燥并在真空中浓缩。粗产物通过快速色谱法（在硅胶上，3:2己烷/乙酸乙酯）提纯从而以66%的收率获得纯产物3。

按照Lion, C.在Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566中描述的程序，将20毫升甲苯中的苯甲酰胺基-2-联苯3（0.01摩尔）和POCl₃（5毫升）在氮气下回流并搅拌18小时。用CH₂Cl₂（30毫升）稀释冷却的反应混合物，并倾倒入冰中，用25%的NH₄OH与蒸馏水洗涤。有机层经MgSO₄干燥并在真空中浓缩，接着进行快速色谱法（硅胶，1:1己烷/乙酸乙酯）获得产物4，6-苯基菲啶。

收率：52%。白色固体。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 7.54-7.85 (m, 9H), 8.10(d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.67(d, J = 8.4 Hz, 1H)。

使用2-萘-2-基-苯基胺替代2-芳基苯胺获得：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.64 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.29 (d, J = 8.1Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.92 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 7.48 Hz, 1H), 7.79-7.75 (m,2H), 7.69 (t, J = 14.0, 8.2 Hz, 1H), 7.63-7.61 (m, 2H), 7.53-7.46 (m, 4H),7.19 (t, J = 14.3, 7.2 Hz, 1H).

MS: [M+H]⁺ 306.3。

使用萘-碳酰氯替代苯基酰氯获得：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.65 (d, J = 8.1Hz, 1H), 8.27 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H),8.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.97-7.94 (m, 2H), 7.90-7.85 (m, 2H), 7.80-7.69 (m,2H), 7.62 (t, J= 14.2, 7.1 Hz, 1H), 7.59-7.55 (m, 2H).

MS: [M+H]⁺ 306.3。

实施例1.3

合成6-(2-磺苯基)菲啶的程序

可以使用Nicolai, E.在Chem. Pharm. Bull. 42 (1994) 1617-1630中描述的程序，通过将芳基苯胺（0.01摩尔）和2-磺基苯甲酸环酐（0.01摩尔）在CH₃CN中温和加热6小时，由此合成6-(2-磺苯基)菲啶。

在提纯后，该产物可以基于实施例1.2中描述的方法转化为适当的菲啶。

实施例1.4

合成6-苯基-烷基磺酰基菲啶的程序

可以使用Lion, C.在Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566中描述的程序（参见实施例1.2），将烷基磺酰基-芳基苯胺（0.01摩尔）与苯甲酰氯（0.01摩尔）在氯仿中温和加热，由此合成6-苯基-烷基磺酰基菲啶。

在提纯后，该产物可以基于实施例1.2中描述的方法转化为适当的菲啶。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.92 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.75 (d, J = 1.9Hz, 1H), 8.68 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.35 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 8.30 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 15.3, 7.1 Hz, 1H), 7.81-7.73 (m, 3H), 7.64-7.56(m, 3H) 3.12 (s, 3H).

MS: [M+H]+ 334,3。

6-(4-甲基磺苯基)菲啶也可以根据Cymerman, J.在J. Chem. Soc. (1949) 703-707中描述的程序来制备。

实施例1.5

合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶

合成2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-醇甲苯磺酸酯：

程序：（JACS, 2007, 129, 13364）向2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-醇（7克，33.6毫摩尔）和三乙胺（4.9毫升，35.3毫摩尔）在无水CH₂Cl₂（100毫升）中的溶液中加入4-甲苯磺酰氯（6.7克，35.3毫摩尔）和DMAP（120毫克）。该混合物在室温下搅拌20小时。该反应混合物用80毫升HCl（1M）洗涤，并随后用水洗涤。萃取物经无水MgSO₄干燥，过滤，并蒸发滤液。残余物在不经进一步提纯的情况下用于下一步骤。

产量：11.0克（90%）

NMR: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.75 – 7.64 (m, 2H), 7.31 – 7.26 (m,2H), 4.16 – 4.06 (m, 2H), 3.62 (m 2H), 3.59 – 3.40 (m, 10H), 3.30 (s, 3H),2.38 (s, 3H).

¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 144.75 (s), 132.90 (s), 129.77 (s),127.8 (s), 71.82 (s), 70.60 (s), 70.48 (s), 70.47 (s), 70.41 (s), 70.39 (s),69.23 (s), 68.55 (s), 58.90 (s), 21.53 (s)。

合成4-PEG4-苯甲酸乙酯：

程序：（JACS 129 (2007) 13364）化合物2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基4-甲基苯磺酸乙酯（8.1克，22.3毫摩尔）、4-羟基苯甲酸乙酯（3.7克，22.3毫摩尔）、K₂CO₃（15.4克，111.5毫摩尔）和18-冠-6（0.59克，2.2毫摩尔）的混合物在丙酮（120毫升）中回流22小时。将该反应混合物浓缩并用乙酸乙酯萃取。萃取物用H₂O洗涤，经无水MgSO₄干燥并过滤。将滤液蒸发至干，残余物通过柱色谱法在硅胶上提纯（二氯甲烷/甲醇 = 100:1）以获得该化合物（1.93克，88%）。

产量：7克（88%）

NMR:

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.01 – 7.84 (m, 2H), 6.96 – 6.85 (m, 2H),4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.12 (dd, J = 5.4, 4.3 Hz, 2H), 3.82 (dd, J = 5.4,4.2 Hz, 2H), 3.71 – 3.56 (m, 10H), 3.51 – 3.45 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 1.32(t, J = 7.1 Hz, 3H).

¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 166.29 (s), 162.47 (s), 131.45 (s),123.01 (s), 114.11 (s), 71.90 (s), 70.84 (s), 70.60 (s), 70.59 (s), 70.58(s), 70.48 (s), 69.51 (s), 67.54 (s), 60.57 (s), 58.98 (s), 14.35 (s).

MS(+):

[M+Na⁺]⁺ = 计算值379.1727, 实测值379.1743。

合成4-PEG4-苯甲酸：

程序：（JACS, 2007, 129, 13364）将化合物4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酸乙酯（7克，19.6毫摩尔）和KOH（2.3克，41.24毫摩尔）在200毫升EtOH/H₂O（1:1 v/v）中的混合物回流整夜。在冷却后，该混合物用HCl（2N）中和。所得混合物用EtOAc萃取并蒸发至干。使所得白色固体在EtOAc/己烷中重结晶。

产量：5.3克（85%）

NMR：

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 11.17 (s, 1H), 8.14 – 7.89 (m, 2H), 7.03 –6.75 (m, 2H), 4.29 – 4.02 (m, 2H), 3.92 – 3.81 (m, 2H), 3.78 – 3.57 (m, 10H),3.57 – 3.46 (m, 2H), 3.35 (s, 3H).

¹³C{¹H} NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 171.46 (s), 163.24 (s), 132.30 (s),121.98 (s), 114.33 (s), 71.96 (s), 70.91 (s), 70.67 (s), 70.66 (s), 70.64(s), 70.54 (s), 69.55 (s), 67.66 (s), 59.08 (s).

MS(-):

[M-H]^- = 计算值327.1438，实测值327.1456。

合成N-联苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺：

程序：在0℃下向4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酸（3克，9.14毫摩尔）、0.2毫升DMF在30毫升无水DCM中的溶液中加入草酰氯（1.05毫升，12.34毫摩尔）。将该反应混合物在0℃下搅拌1小时。使该溶液浓缩至干。油状残余物在不经进一步提纯的情况下用于下一步骤。

将2-苯基苯胺（1.6克）、吡啶（2.4毫升）在氯仿（80毫升）中的溶液在惰性气氛下冷却至0℃。将20毫升中的(苯基-4-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基氧基)苯甲酰氯（3.1克，9.14毫摩尔）缓慢加入到该溶液中，并使最终混合物达到室温。将该溶液回流2小时并在室温下搅拌整夜。该反应混合物用HCl（1 M、2×100毫升）、NaHCO₃（100毫升）和水（50毫升）萃取。有机相用MgSO₄干燥，并通过色谱法在硅胶中提纯（EtOAc/己烷）。

产量：4.1 （90%）

NMR：

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.49 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 7.94 (s,1H), 7.61 – 7.35 (m, 9H), 7.33 – 7.25 (m, 1H), 7.19 (m, 1H), 6.91 – 6.84 (m,2H), 4.16 – 4.10 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.77 – 3.58 (m, 10H), 3.56 – 3.49 (m,2H), 3.36 (s, 3H).

¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 164.56 (s), 161.65 (s), 138.18 (s),135.12 (s), 132.32 (s), 129.97 (s), 129.39 (s), 129.22 (s), 128.66 (s),128.57 (s), 128.16 (s), 127.13 (s), 124.18 (s), 121.23 (s), 114.57 (s), 71.95(s), 70.89 (s), 70.64 (s), 70.63 (s), 70.54 (s), 69.54 (s), 67.63 (s), 59.04(s), 53.51 (s).

MS(+)

[M+H]⁺ = 计算值480.2386 实测值480.2383；[M+Na]⁺ = 计算值502.2200，实测值502.2204。

合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶：

程序：将N-联苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺（4克，8.34毫摩尔）、POCl₃（10毫升）在10毫升甲苯中回流20小时。使混合物冷却至室温，并加入100毫升的二氯甲烷。将该溶液倾倒入冰中，混合物用NH₄OH（20%）中和。萃取有机相，并相继用蒸馏水和盐水洗涤，并经MgSO₄干燥。所得溶液通过快速色谱法（硅胶，在乙酸乙酯/己烷1:1中，R_f = 0.14）提纯。

产量：1克（25%）

NMR：

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.59 (dd, J = 8.1,1.4 Hz, 1H), 8.23 (dd, J = 8.1, 1.1 Hz, 1H), 8.15 (dd, J = 8.3, 0.7 Hz, 1H),7.84 (ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H), 7.79 – 7.57 (m, 5H), 7.15 – 7.03 (m,2H), 4.29 – 4.19 (m, 2H), 3.93–3.90 (m, 2H), 3.80 – 3.60 (m, 12H), 3.59 –3.49 (m, 2H), 3.37 (s, 3H).

¹³C{¹H} NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 160.92 (s), 159.45 (s), 143.84 (s),133.59 (s), 131.26 (s), 130.61 (s), 130.26 (s), 129.05 (s), 128.90 (s),127.19 (s), 126.85 (s), 125.39 (s), 123.70 (s), 122.29 (s), 122.01 (s),114.68 (s), 72.02 (s), 70.97 (s), 70.74 (s), 70.72 (s), 70.69, 70.62 (s),69.80 (s), 67.68 (s), 59.15 (s).

MS (+) JM358-F5, [M+H]⁺ 计算值 = 462,2280，实测值462.2275。

实施例1.6：

合成3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸铯盐

按照如上所述的程序通过N-(联苯-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺（2克，6.59毫摩尔）的环化制备6-(4-甲氧基苯基)菲啶。该化合物通过色谱法在二氯甲烷/己烷（梯度1:5至1:1）中提纯。收率：87%。

NMR：¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.84 (dd, J =8.2, 1.2 Hz, 1H), 8.18 – 8.05 (m, 2H), 7.97 (ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H),7.86 – 7.62 (m, 5H), 7.23 – 7.07 (m, 2H), 3.88 (s, 3H).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.70 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.61 (dd, J = 8.1,1.3 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 8.3, 0.7 Hz, 1H), 7.86(ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H), 7.81 – 7.56 (m, 5H), 7.18 – 7.02 (m, 2H),3.92 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 160.95 (s), 160.33 (s), 143.72 (s), 133.67(s), 132.12 (s), 131.36 (s), 130.71 (s), 130.20 (s), 129.13 (s), 128.97 (s),127.23 (s), 126.92 (s), 125.40 (s), 123.73 (s), 122.33 (s), 122.03 (s),114.03 (s), 55.57 (s).

MS [ESI-MS (+)]: [M+H⁺]^- 实测值286.1231，计算值286.1226。

4-菲啶-6-基-苯酚：通过使用HBr实现6-(4-甲氧基苯基)菲啶的脱保护。将6-(4-甲氧基苯基)菲啶（1克，3.5毫摩尔）在15毫升HBr中的悬浮液（47%）在100℃下回流12小时。使该混合物冷却至室温，倾倒入冰水中并用Na₂CO₃中和。滤出所得沉淀物并用水和Et₂O洗涤。该固体通过使用二氯甲烷/MeOH的色谱柱提纯。收率：90%。

NMR: ¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 9.84 (s, 1H), 8.92 (d, J = 8.2 Hz, 1H),8.82 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 8.20 – 8.11 (m, 1H), 8.08 (dd, J = 8.1, 1.2Hz, 1H), 8.02 – 7.88 (m, 1H), 7.84 – 7.64 (m, 3H), 7.64 – 7.49 (m, 2H), 7.06– 6.89 (m, 2H).

MS [ESI-MS (-)]: [M-H⁺]^- 实测值270.0922，计算值270.0924。

向4-(菲啶-6-基)苯酚（320毫克，1.18毫摩尔）在DMF（4毫升）中的溶液中加入Cs₂CO₃（482.2毫克，1.48毫摩尔）和1,3-丙基磺酸内酯（159毫克，1.30毫摩尔）。将该反应混合物在室温下搅拌整夜。使该反应混合物浓缩至干，残余物通过色谱柱（二氧化硅）使用二氯甲烷/MeOH（梯度10:1至5:1）提纯。收率：72%

NMR：¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8.98 – 8.87 (m, 1H), 8.83 (dd, J =7.9, 1.6 Hz, 1H), 8.12 (m, 2H), 7.97 (ddd, J = 8.3, 7.0, 1.3 Hz, 1H), 7.85 –7.69 (m, 3H), 7.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.19 (t, J= 6.5 Hz, 2H), 2.64 – 2.57 (m, 2H), 2.15 – 1.97 (m, 2H).

MS [EI-MS (-)]: [M-Cs⁺]^- 计算值392.0956，实测值392.0962。

实施例2

合成氯-交联二聚体配合物的一般程序：

Nonoyama, M.在J. Organomet. Chem. 86 (1975) 263-267中公开了该一般程序。

如下合成铱二聚体：IrCl₃•3H₂O和2.5当量的6-苯基菲啶在120℃下在氮气下在2-乙氧基乙醇/水混合物（3:1 v/v）中加热18小时。冷却至室温后，将沉淀物滤去，并相继用甲醇和Et₂O洗涤，干燥以获得所需二聚体。

实施例2.1

具有未取代的苯基菲啶的配合物

[(6-苯基菲啶)₂IrCl]₂。

收率：71%。棕色固体。¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6.45 (d, J = 6.8, 4H),6.58 (t, J = 7.1, 13.9 Hz, 4H), 6.95 (t, J = 7.1, 14.2 Hz, 4H), 7.56 (t, J =7.4, 16.0 Hz, 4H), 7.68 (t, J = 8.1, 16.2 Hz, 4H), 7.93 (t, J = 8.0, 14.6 Hz,4H), 8.07-8.13 (m, 8H), 8.80 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 8.93-9.01 (m, 12H)。

实施例2.2

具有取代的苯基菲啶的配合物

将6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶（1克，2.16毫摩尔）、IrCl₃·3H₂O（346毫克，0.98毫摩尔）在16毫升2-EtOEtOH:H₂O（12:4）中的混合物在氮气气氛下回流整夜。将该反应混合物冷却至室温并加入60毫升水以获得油状沉淀物。弃去上清液，向残余物中加入50毫升水。将混合物搅拌1小时以获得红棕色沉淀物。将该固体过滤并用水（50毫升）和Et₂O（30毫升）洗涤。使棕色固体溶解在较少量的二氯甲烷中并在添加Et₂O时沉淀。其在未经进一步提纯的情况下用于下一步骤。

产量：550毫克（50%）

NMR：

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 8.36 (dd, J = 8.0,5.2 Hz, 8H), 7.90 (dd, J = 14.7, 7.7 Hz, 8H), 7.81 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.79– 7.67 (m, 4H), 6.78 – 6.65 (m, 4H), 6.32 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 4H), 5.89-5.83 (m, 4H), 5.28 (d, J = 2.5 Hz, 4H), 3.67-3.10 (m, 100H, PEG链, 含有某些杂质)

MS(ESI-MS(+))：

[M+2Na⁺]²⁺ 计算值1171.3463，实测值1171.3473；[(C^N)₂Ir]⁺ = 计算值1113.3877，实测值1113.3892。

用3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸铯盐合成双-铱配合物

将配体3-(4-(菲啶-6-基)苯氧基)丙烷-1-磺酸铯（500毫克，0.92毫摩尔）和IrCl₃（159.5毫克，0.45毫摩尔）在2-EtOEtOH:水（3:1, 16毫升）混合物中的混合物在氮气气氛下回流36小时。将该反应混合物过滤，并将滤液浓缩至干。残余物在不经进一步提纯的情况下用于下一步骤。

MS [ESI-MS(-)]：[Ir(C^N)₂-2Cs⁺]^- 计算值975.13858，实测值975.13882。

实施例3

A）合成羧基亚烷氧基-吡啶甲酸衍生物：

将3-羟基-2-吡啶甲酸（0.01摩尔）、4-溴丁酸乙酯或6-溴己酸乙酯（0.021摩尔）和碳酸钾（5当量）在DMF（20毫升）中的混合物的混合物在90℃下在氮气下加热20小时。在冷却后，将该反应混合物倾倒入冰水混合物中并用二氯甲烷（30毫升）萃取三次，经无水MgSO₄干燥，过滤并将溶剂蒸发至干。通过快速色谱法（二氧化硅，己烷/乙酸乙酯3:1）提纯获得产物（基于专利US 5,219,847）。

形成的酯通过NaOH在MeOH（pH = 10）中水解。随后将溶液的pH调节至6.0并在室温下搅拌整夜。将溶剂在真空中移除，残余物从己烷/丙酮中结晶以获得所需产物。

3-(羧基-戊氧基)-吡啶-2-甲酸。收率：51%。灰色固体。¹H NMR (DMSO-d₆, 400MHz) δ 1.39-1.45 (m, 2H), 1.51-1.57 (m, 2H), 1.67-1.74 (m, 2H), 2.19-2.23 (m,2H), 4.04-4.07 (m, 2H), 7.47-7.50 (m, 1H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.13 (d,J = 8.1 Hz, 1H)。

B）合成5-[4-(2-羧基-乙基)-苯基]-吡啶-2-甲酸

在氩气气氛下，向4毫升1,2-二甲氧基乙烷中添加5-溴-吡啶-2-甲酸（93毫克，0.46毫摩尔）、4-(2-羧乙基)苯硼酸（106毫克，0.55毫摩尔）、0.51毫升2M的碳酸钠水溶液和双-(三苯基膦)二氯化钯(II)（20毫克，0.03毫摩尔）。将该混合物在90℃下搅拌整夜，冷却并用水骤冷。加入乙酸乙酯，并用1 M的盐酸将混合物调节至pH = 2。在用乙酸乙酯萃取三次后，使合并的有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空中蒸发。残余物通过硅胶色谱法提纯（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇5: 1）。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.00 (d, J = 2 Hz, 1H), 8.25 (dd, J = 8.2,2.3 Hz, 1H), 8.11 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J =8.2 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 15, 7.5 Hz, 2H), 2.61 (t, J = 15.1, 7.6 Hz, 2H).

MS: [M+H]⁺ 272.3。

实施例4

合成铱配合物的一般程序

将氯-交联二聚体配合物0.5毫摩尔、吡啶甲酸酯1.25毫摩尔和Na₂CO₃ 3毫摩尔混合到2-乙氧基乙醇（12毫升）中并在120℃下加热15小时。向冷却的混合物中加入蒸馏水（25毫升），然后将粗产物滤出并用水洗涤，接着用部分正己烷和Et₂O洗涤。产物通过柱色谱法提纯（二氧化硅，正己烷/二氯甲烷）以获得红色粉末。（基于Lamansky, S., Inorg. Chem.40 (2001) 1704-1711）

Ir(6-苯基菲啶)₂ 吡啶-2-甲酸

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.17 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 9.09 (d, J = 8.2Hz, 1H), 8.71 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.62 (t, J = 14.8, 7.8 Hz, 2H), 8.43-8.33(m, 4H), 8.23 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.92-7.77 (m, 4H), 7.65 (t, J = 15, 7.9Hz, 2H), 7.57-7.46 (m, 3H), 7.36 (t, J = 14.8, 7.8 Hz, 1H), 7.19-7.16 (m,2H), 7.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.04 (t, J = 14.2, 6.8 Hz, 1H), 6.92 (t, J =14.1, 6.7 Hz, 1H), 6.80 (t, J = 13.7, 6.8 Hz, 1H), 6.67 (t, J = 13.7, 6.6 Hz,1H), 6.51 (d, J = 6.8 Hz, 1H).

MS: [M+H]+ 实测值824.1891, 计算值824.1886；[M+Na+]+ 实测值846.1701, 计算值846.1706。

Ir(6-苯基菲啶)₂ 5-(甲氧基)吡啶-2-甲酸：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.15 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 9.09 (d, J = 8.2Hz, 1H), 8.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.61 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.44-8.35 (m,3H), 8.21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 2.7, 1H), 7.91-7.86 (m, 2H),7.82-7.80 (m, 2H), 7.68 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.57-7.53 (m, 3H), 7.36 (t, J =15.2, 7.2 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 15.1, 7.6 Hz, 1H), 7.08-6.93 (m, 4H), 6.78(t, J = 14.9, 7.6 Hz, 1H), 6.65 (t, J = 14.8, 7.6 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 7.6Hz, 1H), 3.63 (s, 3H).

MS: [M+H]⁺ 854.2。

Ir(6-苯基菲啶)₂ 4-(羟基甲基)吡啶-2-甲酸：

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.14 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.96 (d, J = 8.0Hz, 1H), 8.87 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.73 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8,68 (d, J = 7.8Hz, 1H), 8.51 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.26-8.24 (m,2H), 8.10 (t, J = 14.7, 7.3 Hz, 1H), 8.02-7.96 (m, 3H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz,1H), 7.62 (t, J = 15.2, 7.1 Hz, 1H), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.39-7.37 (m, 2H),7.16 (t, J = 15.3, 7.2 Hz, 1H), 7.10-7.04 (m, 2H), 6.86 (d, J = 6.8 Hz, 1H),6.78 (t, J = 14.2, 7.1 Hz, 1H), 6.67 (t, J = 14.9, 7.3 Hz, 1H), 6.35 (d, J =6.8 Hz, 1H), 5.32 (s, 1H), 4.33 (s, 2H).

MS: [M+H]⁺ 854.2。

Ir(6-苯基菲啶)₂ 3-羟基吡啶-2-甲酸：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 9.06 (d, J = 8.2Hz, 1H), 8.65-8.57 (m, 3H), 8.46-8.41 (m, 2H), 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.21(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.94-7.78 (m, 5H), 7.72 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.58-7.55(m, 2H), 7.40 (t, J = 14.0, 7.0 Hz, 1H), 7.15 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H),7.05-6,95 (m, 5H), 6.77 (t, J = 13.7, 7.0 Hz, 1H), 6.66 (t, J = 13.6, 6.4 Hz,1H), 6.50 (d, J = 6.6 Hz, 1H).

MS: [M+H]⁺ 839.2。

Ir(6-苯基-苯并菲啶)₂ 吡啶-2-甲酸

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.04 (m, 4H), 8.82 (m, 2H), 8.77-8.70 (m,1H), 8.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.29-8.27 (m, 2H), 8.15-8.09 (m, 4H), 7.85 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 7.78-7.71 (m, 4H), 7.65 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.62-7.553 (m,2H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.23-7.17 (m, 1H), 7.13-7.05 (m, 3H), 7.05-7.00 (m,1H), 6.83 (dd, J = 10.8, 4.0 Hz, 1H), 6.68 (dd, J = 10.9, 3.8 Hz, 1H), 6.51(dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H).

MS: [M+H]⁺ 924.2。

Ir(6-苯基菲啶)₂ 2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸：

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.24 (m, 1H), 9.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H),8.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.88 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H),8.68 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.45 (d, J = 7.9 Hz, 1H),8.34 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.13-8.00 (m, 4H), 7.92(dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 2H), 7.54-7.42 (m, 3H),7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.17 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H), 7.10-7.06 (m, 3H),7.02 (t, J = 15.7, 7.3 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 6.77 (t, J = 14.0,7.1 Hz, 1H), 6.71 (t, J = 14.8, 7.0 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 2.86(t, J = 15.2, 7.5 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 15.4, 7.7 Hz, 2H).

MS: [M+H]⁺ 972.3。

合成Ir(6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶)₂ 吡啶-2-甲酸

将Ir-二聚体（150毫克，0,065毫摩尔）、吡啶甲酸（17毫克，0.137毫摩尔）和Na₂CO₃（70毫克，0.65毫摩尔）在20毫升二氯甲烷/乙醇（4:1）中的悬浮液回流整夜。在冷却后，将该混合物浓缩至干。残余物通过快速色谱法在二氯甲烷/MeOH（梯度由100:0至10:1）中提纯。该化合物在二氯甲烷/Et₂O中重结晶。

收率：30%。

NMR：

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.06 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.98 (d, J = 8.1Hz, 1H), 8.61 (m, 3H), 8.46 – 8.21 (m, 4H), 8.13 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.83(m, 4H), 7.61 (m, 2H), 7.57 – 7.41 (m, 3H), 7.30 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.24 –7.12 (m, 1H), 6.89 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 6.61(dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 2.6 Hz,1H), 3.85 – 3.41 (m, 32H), 3.34 (s, 3H), 3.33 (s, 3H).

MS: [2M+2Na]²⁺计算值1258.4012，实测值1258.4030。[M+H]⁺ 计算值1236.4197，实测值1236.4227。

合成Ir(6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶)₂ 羧乙基苯基-吡啶-2-甲酸

将Ir-二聚体（双铱配合物）与6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶（96毫克，0.041毫摩尔）、5-[4-(2-羧基-乙基)-苯基]-吡啶-2-甲酸（25毫克，0.092毫摩尔）和Na₂CO₃（28毫克，0.26毫摩尔）在12毫升二氯甲烷:EtOH（5:1）混合物中的混合物回流整夜。向冷却的反应混合物中加入二氯甲烷（30毫升）。向混合物中加入水，并将水相酸化直到达到pH 6。使有机相经MgSO₄干燥，浓缩至干，且残余物通过色谱柱提纯（二氧化硅，二氯甲烷/MeOH）。

收率：30%

NMR：¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.13 (bs, 1H), 9.23 – 9.11 (m, 1H),9.07 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.98 – 8.90 (m, 1H), 8.89 – 8.78 (m, 1H), 8.75 –8.67 (m, 1H), 8.70 – 8.62 (m, 2H), 8.47 (dd, J = 8.6, 1.3 Hz, 1H), 8.44 –8.36 (m, 2H), 8.23 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.13 – 7.90 (m, 5H), 7.67 – 7.46 (m,3H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.15 – 7.08 (m, 2H),7.02 (ddd, J = 8.4, 6.9, 1.3 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 9.0, 2.6 Hz, 1H), 6.73(dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 2.6 Hz,1H), 3.76 (dtd, J = 36.3, 10.8, 5.3 Hz, 4H), 3.45 - 3.10 (m, 28 H), 3.17 (s,3H), 3.14 (s, 3H), 2.87 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.60 – 2.50 (m, 2H).

MS: [M+H]⁺ 计算值1384.47231 实测值1384.47466。[M+Na]⁺ 计算值1406.45426，实测值1406.45556。

合成铯盐形式的Ir(3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸盐)₂ 吡啶-2-甲酸配合物

将化合物双-铱配合物与3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸铯盐（100毫克，0.039毫摩尔）、吡啶甲酸（10毫克，0.082毫摩尔）、Cs₂CO₃（35毫克，0.107毫摩尔）在DMF（10毫升）中的混合物在氮气气氛下在80℃下搅拌整夜。将该反应浓缩至干并用Sephadex LH-20和作为洗脱剂的DMF提纯。产量：20毫克（20%）

NMR：¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 9.15 – 9.00 (m, 2H), 8.91 (d, J = 8.7Hz, 1H), 8.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.66 (dd, J = 12.6, 8.6 Hz, 2H), 8.48 (d,J = 8.2 Hz, 1H), 8.38 – 8.28 (m, 2H), 8.21 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.11 – 8.02(m, 1H), 8.03 – 7.82 (m, 4H), 7.70 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.64 – 7.36 (m, 5H),7.06 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 8.7,2.2 Hz, 1H), 6.32 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.81 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.97 – 3.54(m, 4H), 2.41 – 2.22 (m, 4H), 1.91 – 1.55 (m, 4H).

MS [ESI-MS(-)]: [Ir(C^N)₂(pic)-2Cs⁺]^2- 计算值548.58196，实测值548.58446

ECL结果：64978（10纳摩尔） 参比Ru(bpy)3 = 10000计数，在10纳摩尔浓度中。

合成Ir(3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸盐)₂ 羧乙基苯基-吡啶-2-甲酸配合物

将二聚体或双-铱配合物与3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸铯盐（100毫克，0.0392毫摩尔）、5-[4-(2-羧基-乙基)-苯基]-吡啶-2-甲酸（23毫克，0.0823毫摩尔）和Cs₂CO₃（64毫克，0.196毫摩尔）在DMF（10毫升）中的混合物在氮气气氛下在80℃下加热整夜。将该反应混合物滤出。残余物用MeOH洗涤，并将滤液均浓缩至干燥。该配合物在使用硅胶60RP-18（MeOH:水1:1）的TLC中具有Rf = 0.45。该配合物进一步通过制备型HPLC使用RP-18柱和水:乙腈梯度提纯。

MS [ESI-MS(-)]: [Ir(C^N)₂(5-[4-(2-羧基-乙基)-苯基]-吡啶-2-甲酸)-2Cs⁺+Na⁺]^- 计算值1268.20571，实测值1268.20099

MS [HPLC-MS(+)]:[Ir(C^N)₂(RC5-[4-(2-羧基-乙基)-苯基]-吡啶-2-甲酸)-3Cs⁺+3H⁺]⁺ 计算值1248.4，实测值1248.4。

实施例5

采用新型铱配合物的ECL

在ELECSYS^®分析仪（Roche Diagnostics GmbH）中评估了几种金属配合物的电化学发光信号。在不存在抗生蛋白链菌素涂覆的顺磁性微粒的情况下均匀地进行了测量。0.1毫克/毫升DMSO的各金属配合物的储备溶液用PBS缓冲液稀释，得到10纳摩尔溶液。该10纳摩尔溶液作为样品在ELECSYS^®分析仪上处理。20微升样品与90微升试剂1（ProCell）和90微升试剂2（ProCell）一起在37℃下培育9分钟，并随后对电化学发光信号进行定量。

ECL结果：

参比Ru(bpy)3 = 10000计数，在10纳摩尔浓度中

- Ir(6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶)₂ 吡啶-2-甲酸 = 31258计数，10纳摩尔浓度

- Ir(6-苯基菲啶)₂ 4-(羟基甲基)吡啶-2-甲酸 = 45512计数，在10纳摩尔浓度中。

Ir(6-苯基菲啶)₂ 4-(羟基甲基)吡啶-2-甲酸：

。

实施例6

合成具有生物缀合反应性基团的铱配合物

将Ir(6-苯基菲啶)₂ 2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸（15毫克）溶解在无水乙腈5毫升和无水吡啶0.01毫升的混合物中。加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）（1.5当量），并将混合物在氮气下在室温搅拌整夜。将该溶液加入到氯仿（10毫升）中，用0.5 M HCl（1×2毫升）、饱和NaHCO₃水溶液（1×2毫升）和水（2×5毫升）洗涤，经MgSO₄干燥，并在真空中浓缩以获得红色粉末。

Ir(6-苯基菲啶)₂ 2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸N-琥珀酰亚胺酯：

¹H-NMR (400 MHz, CD₃CN) δ 9.25 (m, 1H), 9.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.83(d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.75-8.68 (m, 1H), 8.60-8.54 (m, 3H), 8.47 (d, J = 8.1Hz, 1H), 8.43 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.06 (t, J =15.4, 7.2 Hz, 1H), 7.97-7.95 (m, 3H), 7.77-7.70 (m, 2H), 7,61 (t, J = 15.2,7.0 Hz, 1H), 7.52-7.44 (m, 3H), 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.18 (t, J = 15.2,7.0 Hz, 1H), 7.12-7.09 (m, 3H), 7.04-6.98 (m, 2H), 6.78 (t, J = 14.9, 7.2 Hz,1H), 6.71 (t, J = 14.8, 7.5 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3,07-3,01 (m,4H), 2,80 (s, 4H).

MS: [M+H]⁺ 1069.3。

实施例7

合成与生物素的铱-配合物缀合物

将Ir(6-苯基菲啶)₂ 2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸NHS酯（12毫克）和4毫克N-生物素基-3,6-二氧杂辛烷-1,8-二胺三氟乙酸酯溶解在5毫升无水DMF中。加入吡啶（0.016毫升，在2毫升DMF中）并将混合物在氮气下在室温下搅拌整夜。将该溶液加入到氯仿（10毫升）中，用0.5 M HCl（1×2毫升）、饱和NaHCO₃水溶液（1×2毫升）和水（2×5毫升）洗涤，经MgSO₄干燥，并在真空中浓缩以获得红色粉末。该产物通过柱色谱法（二氧化硅，正己烷/乙酸乙酯）提纯以获得红色粉末。

MS: [M+H]⁺ 1328.6。

实施例8

合成铱-多聚标记物（polylabel）

N-Fmoc-3-(2-叔丁氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸

如H. Hilpert在Helvetica Chimica Acta 1987, 第1307-1311页中所述，双乙基酯保护的外消旋氨基酸3-(2-乙氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯以相比于文献四倍的规模制备，并获得612毫克材料。如通过¹H-NMR所述表征该化合物。该外消旋氨基酸3-(2-乙氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯随后溶解在乙腈中并用0.1 N氢氧化钠通过剧烈搅拌该混合物来处理5小时，其优先水解2-乙氧基基团。相关化合物3-(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯通过制备C4反相色谱法用标准乙腈-水梯度从该混合物中分离，洗脱系列峰为3-(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸、3-(2-乙氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸和3-(2-乙氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯。在冷冻干燥所有合一的含有馏分的(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯后可以获得大约250毫克无色油状冻干物，这些馏分通过TLC（氯仿/甲醇/乙酸 = 9:1:1；UV检测）识别为(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯。为了叔丁基化(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯的2-羧基，将其240毫克溶解在10毫升乙酸叔丁酯中。随后加入1.2摩尔过量的在水中的高氯酸的70%溶液。在室温搅拌5天后，混合物用冰冷的0.5 N盐酸萃取。萃取液用3N氢氧化钠碱化并用二氯甲烷萃取。在用氯化镁干燥后，将有机相蒸发，蒸馏残余液体获得大约200毫克3-(2-叔丁氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯。为了可逆地保护3-(2-叔丁氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯的氨基基团，将180毫克该化合物溶解在10毫升二氧杂环己烷中，随后加入溶解在二氧杂环己烷中的300毫克Fmoc-OSu（Novabiochem/Merck）。最后，加入相对于3-(2-叔丁氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸乙酯两倍当量的碳酸氢钠。在剧烈搅拌3小时后，反应体积用相同体积的1N氢氧化钠溶液稀释以分离该羧基的乙酯。在5小时后，通过蒸发极大地减少该反应混合物的体积。将整个相酸化并用乙酸乙酯萃取数次。在用硫酸钠干燥后，将有机相完全蒸发以获得大约200毫克的无色油状的N-Fmoc-3-(2-叔丁氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸（D）。

ß-丙氨酰基（alaninyl）-ß-丙氨酰基-3-(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酰基-ß-丙氨酰基-谷氨酰基-ß-丙氨酰基-3-(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酰基-ß-丙氨酰基-谷氨酰基-ß-丙氨酰基-3-(2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酰基-ß-丙氨酰基-ß-丙氨酸或NH2-UUXUEUXUEUXUU-OH（E）

在Multisynthec的多重肽合成器SYRO II上在具有0.5毫摩尔/克载量的Novabiochem/Merck的15毫克4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基-树脂的几个反应器上经由Fmoc-(芴基甲氧基羰基)-固相肽合成制备该化合物（E）。对具有氨基酸序列N-Fmoc-3-(2-叔丁氧基羰基-4-吡啶基)-DL-丙氨酸中的X的各个位置、对具有U Fmoc-ß-丙氨酸的各个位置和对具有E Fmoc-谷氨酸（叔丁基酯）的各个位置偶联到固定在合成树脂上的生长的肽上。通过以下方法使90微摩尔的各N-Fmoc氨基酸偶联两次：将其与100微摩尔1-羟基苯并三唑一起溶解在270微升二甲基甲酰胺中，随后加入100微摩尔N,N-二异丙基碳二亚胺作为偶联剂，并随后在该肽合成器的反应容器中将该树脂分散到该溶液中。各偶联步骤持续1小时。在20分钟内用二甲基甲酰胺中的50%的哌啶溶液在各偶联步骤后进行临时Fmoc-基团的裂解。在各反应步骤后用二甲基甲酰胺进行洗涤步骤。在合成后用95%三氟乙酸和5%乙二硫醇（ethandithiole）的混合物在2小时内从该树脂上裂解最终制成的肽（E）并裂解掉永久性叔丁基酯保护基。在滤去树脂珠粒后，通过加入冷的二异丙醚来使产物沉淀，沉淀物通过过滤分离，再溶解到乙酸中并通过冷冻干燥法冻干。所得的30毫克粗材料通过反相HPLC提纯，获得大约15毫克至少95%纯的材料。通过分析反相HPLC和ESI-MS进行表征。

合成基于Ir(3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸盐)₂ (2-羧基-4-吡啶基)-DL-丙氨酰基配合物的多聚标记物

将二聚体化合物双-铱配合物与1.5摩尔过量的3-(4-菲啶-6-基-苯氧基)-丙烷-1-磺酸铯盐、NH2-UUXUEUXUEUXUU-OH、Cs₂CO₃（对二聚体或双配合物三摩尔过量）在DMF中的混合物在80℃下在氮气气氛下搅拌整夜。将该反应混合物浓缩至干，且反应产物进一步通过制备型HPLC提纯。

Claims (12)

1.式II的铱基化学发光化合物

其中在式I（a）和在式I（b）中，分别和独立地，各R1-R16独立地为氢、卤素、氰基或硝基,氨基、取代氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基铵、取代的烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、硫烷基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐、次膦酸盐或R17，其中R17是芳基、取代芳基、烷基、取代烷基、芳烷基、取代的芳烷基、烷芳基、取代的烷芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基-烷基、取代氨基-烷基、氨基-烷氧基、取代氨基-烷氧基、氨基-芳基、取代氨基-芳基、氨基-芳氧基、取代氨基-芳氧基，

其中，如果在R1-R17任一个中存在取代的话，R1-R17中的取代基各自独立地选自卤素、氰基或硝基、选自下列的亲水性基团：氨基、烷基氨基、烷基铵、羧基、羧酸盐、羧酸酯、氨基甲酰基、羟基、烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、烷基芳氧基、聚乙烯氧基、聚丙烯氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亚磺基、次磺基、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、氨磺酰基、膦酰基、羟基亚膦酰基、羟基-烷基-亚膦酰基、膦酸盐和次膦酸盐基团，

其中所述烷基是长度为1-20个碳原子的直链或支链烷基链或包含1-4个选自O、N、P和S的杂原子的长度为1-20个原子的杂烷基链，其中芳基是5、6或7元芳基环体系，或包含1-3个选自O、S和N的杂原子的5、6或7元杂芳基环体系，

其中式I（a）中R13-R16的至少一个是–Q1–Y，其中式I（b）中R13-R16的至少一个是Q2，其中Q1是连接基团，且各Q2独立地为连接基团或共价键，其中(n)是1至50的整数，

其中Y是选自下列的官能团：醛、羧酸、羧酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯和氨基，以及

其中R1-R12的至少一个是磺基烷基、磺基芳基、磺基烷氧基、磺基芳氧基，磺基或其磺酸盐，其中抗衡离子是来自碱金属的阳离子，和其中所述连接基团Q1具有直链或支链的饱和、未取代或取代的1至100个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链作为骨架，或

具有直链或支链的饱和、未取代或取代的1至100个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链作为骨架，并且所述骨架含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述连接基团Q1具有直链或支链的饱和、未取代或取代的1至50个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链作为骨架，或

具有直链或支链的饱和、未取代或取代的1至50个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链作为骨架，并且所述骨架含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系。

3.如权利要求2所述的化合物，其中所述连接基团Q1具有直链或支链的饱和、未取代或取代的1至20个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链作为骨架，或

具有直链或支链的饱和、未取代或取代的1至20个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链作为骨架，并且所述骨架含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系。

4.如权利要求1至3的任一项所述的化合物，其中Q2各自独立地为共价键或具有直链或支链的饱和、未取代或取代的由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的1至20个原子的链作为骨架，或

具有直链或支链的饱和、未取代或取代的1至20个原子的由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的链作为骨架，并且所述骨架含一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环体系的连接基团。

5.如权利要求1至3的任一项所述的化合物，其中Q2独立地为共价键或具有饱和的具有由碳原子、取代碳原子和/或一个或多个选自O、N、P和S的原子，或取代的N、P或S原子组成的骨架的1至12个原子的链作为骨架的连接基团。

6.包含如权利要求1至5的任一项所述的化合物和共价键合于其上的亲和结合剂的缀合物。

7.权利要求6的缀合物，其中所述亲和结合剂选自抗原和抗体、生物素、氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素，和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、糖和凝集素、核酸或5-取代嘧啶、N-取代嘧啶、N-取代嘌呤、8-取代嘌呤和2-取代的脱氧尿嘧啶和互补核酸，以及受体和配体。

8.如权利要求6或7所述的缀合物，其中所述亲和结合剂是核酸或抗体。

9.如权利要求1至5的任一项所述的化合物或如权利要求6至8的任一项所述的缀合物在制备用于进行在水溶液中的电化学发光反应的标记物的用途。

10.如权利要求1至5的任一项所述的化合物或如权利要求6至8的任一项所述的缀合物在制备用于基于电化学发光的检测方法的标记物的用途。

11.如权利要求1至5的任一项所述的化合物或如权利要求6至8的任一项所述的缀合物制备用于分析物的检测的标记物的用途。

12.如权利要求6至8的任一项所述的缀合物在制备用于通过体外方法测量分析物的方法的试剂中的用途，所述方法包括以下步骤：

a）提供怀疑或已知包含所述分析物的样品；

b）在适于形成分析物缀合物复合物的条件下使所述样品与作为标记物的如权利要求6至8的任一项所述的缀合物接触；和

c）测量步骤（b）中形成的复合物，并由此获得该分析物的量度。