CN1947013A - 基因检测方法和基因检测装置 - Google Patents

Abstract

提供了一种以高灵敏度检测样品中具有特定序列的基因的基因检测方法及其装置。其包括通过将检测样品中具有特定序列的待检测的基因变性成单链制备基因样品的基因样品制备步骤；将具有与该基因样品的序列互补的碱基序列的单链核酸探针固定在电极上的固定步骤；通过在固定了前述核酸探针构成的电极上添加前述基因样品，在电极上形成前述核酸探针与前述基因样品杂交而成的双链核酸形成步骤；添加具有电化学活性并且通过光照射能共价结合前述双链核酸的插入剂的插入剂添加步骤；通过进行光照射使前述插入剂与前述双链核酸共价结合的光照射步骤；清洗未与前述双链核酸反应的插入剂的清洗步骤；和通过电化学测定检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的测定步骤。

Description

基因检测方法和基因检测装置

技术领域

本发明涉及一种通过读取插入剂的电化学的发光，检测存在于样品中的具有特定的基因序列的目的基因的基因检测方法及其装置。

背景技术

以往的通过电化学方法检测特定基因序列的方法是：将具有与待检测的目的基因互补的碱基序列的单链核酸探针固定在电极表面上，使变性成单链的目的基因样品与该核酸探针杂交后，在该核酸探针与基因样品的反应体系中添加特异性结合于该核酸探针与目的基因样品的双链核酸的、并且具有电化学活性的插入剂。然后，在添加了前述插入剂的反应体系中外加电压进行电化学的测定，通过检测与前述双链核酸结合的插入剂，检测与前述目的基因样品杂交的前述核酸探针，确认目的基因的存在(例如，参照专利文献1和专利文献2)。

这里，所谓前述插入剂是指识别前述双链核酸，与该双链核酸特异性结合的物质。前述插入剂，在任意分子中具有苯基等平板状插入基，该插入基通过介入双链核酸的碱基对和碱基对之间，与双链核酸结合。这种插入剂与双链核酸的结合是通过静电的相互作用或疏水性相互作用的结合，并且是通过以一定的速度重复前述插入剂在前述双链核酸的碱基对间的插入，和从这些碱基对间的脱离的平衡反应的结合。

前述插入剂中有电学性地发生可逆的氧化还原反应的物质。通过使用这种在电化学上发生可逆的氧化还原反应的插入剂，通过电化学变化的测定，可以检测与前述双链核酸结合的插入剂的存在。并且，这种电化学变化可以通过氧化还原时发生的电流和发光等测定。

总之，在以往的基因检测方法中，重要的是前述插入剂仅与双链核酸特异性结合，并且正确检测与前述双链核酸结合的插入剂的量。

但是，以往的基因检测中可以使用的插入剂非特异性地吸附在单链核酸探针和固定了该核酸探针的电极表面。于是，这种非特异性吸附的插入剂在检测与前述双链核酸结合的插入剂的量时形成背景噪音，成为使检测灵敏度降低的原因。

为了解决这个问题，在以往方法中，在前述核酸探针和基因样品的反应体系中添加前述插入剂后形成前述背景噪音，因此现在就需要除去非特异性吸附在单链核酸探针和电极表面的插入剂的清洗处理(例如，参照专利文献2)。

专利文献1：特许第2573443号公报

专利文献2：特许第3233851号公报

发明内容

发明要解决的问题

然而，如前文所述，由于插入剂与双链核酸通过静电相互作用或疏水性相互作用结合，这种结合力弱，因此存在着在前述清洗处理时与双链核酸结合的插入剂会解离，检测灵敏度反而降低这样的问题。

另一方面，在前述清洗处理中，在考虑要与前述双链核酸结合的插入剂不解离时，由于非特异吸附在前述单链的核酸探针和电极表面上的插入剂的除去不充分，会产生无法充分除去背景噪音，检测灵敏度降低的问题。

进而，由于前述插入剂和双链核酸间的结合反应是平衡反应，该插入剂在双链核酸的碱基对间插入的比例低，因此即使不产生前述背景噪音，也存在检测灵敏度低这样的问题。

本发明是为了解决上述问题而完成的，其目的在于提供一种可以以高灵敏度检测样品中的基因的基因检测方法及其装置。

用于解决问题的方法

为了解决前述以往的问题，本发明的基因检测方法是一种检测样品中具有特定序列的基因的基因检测方法，其包括通过将检测样品中待检测的基因变性成单链制备基因样品的基因样品制作步骤，和将具有与前述待测基因序列互补的碱基序列的单链核酸探针固定在电极上的固定步骤，和在固定了前述核酸探针的电极上添加前述单链基因样品，形成前述核酸探针与前述基因样品杂交而成的双链核酸形成步骤，在形成前述双链核酸的电极上添加具有电化学活性并且通过光照射共价结合前述双链核酸的插入剂的插入剂添加步骤，通过进行光照射使前述插入剂与前述双链核酸共价结合的光照射步骤，清洗未与前述双链核酸反应的插入剂的清洗步骤，和前述清洗步骤后通过电化学测定检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的测定步骤。

由此，可以使前述基因样品与核酸探针杂交而成的双链核酸与前述插入剂不可逆并且牢固地结合，并且可以以高灵敏度检测前述样品中的基因。此外，在前述清洗过程中，由于与前述双链核酸结合的插入剂不解离，可以除去与单链核酸探针或者电极表面非特异性吸附的插入剂，因而可以以高灵敏度检测前述样品中的基因。

进而，本发明的基因检测方法中的前述电化学的测定是对前述电极外加电压，通过与前述双链核酸共价结合的插入剂测定电化学发光量。

因此可以以高灵敏度检测固定在电极上的双链核酸。其结果是，可以以高灵敏度检测与核酸探针发生杂交反应的基因样品。

进而，本发明的基因检测方法中的前述插入剂包含具有特异性插入前述双链核酸中并且通过光照射形成与该双链核酸共价结合的双链核酸结合部位、具有电化学活性的电化学活性部位、连结前述双链核酸结合部位和前述电化学活性部位的连结部位的化合物。

因此，可以使前述双链核酸与前述插入剂不可逆地且牢固地结合，其结果是，插入前述双链核酸中的插入剂的比例增加，可以以高灵敏度检测待检测的基因样品。

进而，本发明的基因检测方法中的插入剂为在前述双链核酸结合部位具有感光性的插入剂。

因此，通过光照射可以使前述双链核酸与前述插入剂不可逆地且牢固地结合。

进而，本发明的基因检测方法中的前述具有感光性的插入剂是呋喃香豆素(furocoumarin)衍生物。

进而，本发明的基因检测方法中的前述呋喃香豆素衍生物是补骨脂内酯衍生物。

进而，本发明的基因检测方法中的前述具有氧化还原性的化合物为显示电化学发光的化合物。

因此，如果给电极外加电压，与固定在该电极上的双氧化核酸结合的插入剂在发生氧化还原反应的同时发光，测定该电化学发光量，可以检测待检测的基因样品。

进而，本发明的基因检测方法中的显示出电化学发光的化合物是在配体上具有杂环类化合物的金属配合物，红荧烯，蒽，六苯并苯，芘，荧蒽，，菲，苝，联二萘，辛四烯。

进而，本发明的基因检测方法中的前述在配体上具有杂环类化合物的金属配合物是在配体上具有吡啶部位的金属配合物。

进而，本发明的基因检测方法中的前述在配体上具有吡啶部位的金属配合物是金属二吡啶配合物，金属二氮杂菲配合物。

进而，本发明的基因检测方法中的前述在配体上具有杂环类化合物的金属配合物的中心金属是钌，锇。

因此，在给前述电极外加电压时，可以获得更好的电化学发光量，并且可以以更高的灵敏度检测出前述基因样品。

此外，本发明的基因检测装置是检测样品中具有特定序列的基因的基因检测装置，其装备有：固定了具有与前述待检测基因序列互补的碱基序列的单链核酸探针的电极；固定在前述电极上的核酸探针；通过与前述样品中的待检测基因被变性为单链的基因样品杂交形成双链核酸的双链核酸形成槽；和在前述电极上添加具有电化学活性并且通过光照射共价结合前述双链核酸的插入剂，然后光照射使前述插入剂与前述双链核酸共价结合的插入剂添加槽；和通过清洗液除去未与前述双链核酸反应的插入剂的清洗槽；和通过电化学测定检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的检测槽；以及使前述电极在前述双链核酸形成槽，前述插入剂添加槽，前述清洗槽和前述检测槽的各槽内按顺序移动的电极移动部。

由此，可以提供通过经电化学测定检测与由前述基因样品与核酸探针杂交而成的双链核酸不可逆且牢固地结合的插入剂，可以以高灵敏度检测前述样品中的基因的基因检测装置。进而，在前述清洗槽中，使与前述双链核酸结合的插入剂不解离，可以除去非特异吸附在前述单链核酸探针或电极表面的插入剂，因此可以以高灵敏度检测前述样品中的基因。

此外，本发明的基因检测装置是检测样品中具有特定序列的基因的基因检测装置，其装备有：固定了具有与前述待检测基因序列互补的碱基序列的单链核酸探针的电极；和通过将前述待检测基因变性为单链制备基因样品的基因样品制作部；和容纳具有电化学活性并且通过光照射共价结合前述双链核酸的插入剂的插入剂槽；和容纳除去未与前述双链核酸反应的插入剂的清洗液的清洗液槽；和容纳用于检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的电解液的电解液槽；和与前述基因样品制作部，插入剂槽，清洗液槽，电解液槽连接，使固定在前述电极上的核酸探针与前述基因样品形成双链核酸，通过光照射使前述结合剂与前述双链核酸共价结合，用前述清洗液清洗未与前述双链核酸反应的插入剂，通过电化学测定检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的处理槽。

由此，可以提供通过经电化学测定检测与由前述基因样品与核酸探针杂交而成的双链核酸不可逆且牢固地结合的插入剂，可以以高灵敏度检测前述样品中的基因的基因检测装置，此外因为设置一个处理槽，所以可以使基因检测装置小型化。进而，在前述处理层中，在用前述清洗液清洗不与前述双链核酸反应的插入剂时，使与前述双链核酸结合的插入剂不解离，可以除去非特异吸附在前述单链核酸探针或电极表面的插入剂，因此可以提供小型的、可以以高灵敏度检测前述样品中的基因的基因检测装置。

发明效果

如果按照本发明的基因检测方法和装置，检测具有特定序列的基因时，使用具有电化学活性并且通过光照射共价结合前述双链核酸的插入剂，通过光照射使前述插入剂与前述双链核酸共价结合，可以使插入剂与该双链核酸不可逆且牢固地结合，其结果是可以以高灵敏度检测前述基因样品。

此外，如果按照本发明的基因检测方法和装置，通过前述光照射使插入剂与前述双链核酸共价结合后，因为需要为了除去非特异吸附在前述单链核酸探针或电极表面的插入剂而进行清洗处理，与前述双链核酸结合的插入剂不被清洗液解离，所以可以除去非特异吸附在前述单链核酸探针或电极表面的插入剂，并可以以高灵敏度检测前述样品中的基因。

附图说明

图1是表示本发明的实施方式1所涉及的基因检测装置的结构的图。

图2是表示本发明的实施方式2所涉及的基因检测装置的其它结构的图。

图3是表示在由本发明的实施方式1的过程获得的、形成双链核酸的金电极x，和不形成双链核酸的电极y中分别检测出的最大电化学发光量的图。

符号的说明

1：基因样品的制作部

2：电极

3：双链核酸形成槽

4，10：温度控制器

5，25：电极移动部

5a：电极支持臂

5b：臂驱动部

6：基因样品清洗液槽

7：基因样品清洗槽

8：插入剂槽

9：插入剂反应槽

11：UV灯

12：插入剂清洗液槽

13：插入剂清洗槽

14：电解液槽

15：检测槽

16：光电倍增管

17：恒电位器

18：控制部

23：处理槽

27：废液槽

100，200：基因检测装置

具体实施方式

以下，对本发明的基因检测方法进行详细的说明。

并且，所谓在以下实施方式中的基因样品，是从例如血液、白细胞、血清、尿、粪便、精液、唾液、培养细胞、各种器官细胞这样的组织细胞，其它含有基因的任意样品中通过破坏该样品中的细胞分离双链核酸，通过热处理或碱处理使其解离成单链核酸的样品。此外，本实施方式中的基因样品可以是用限制性酶切割，然后通过电泳分离等纯化的核酸片段。

(实施方式1)

下面，对实施方式1中的基因检测方法进行说明。

首先，制备作为检测对象的基因样品。这种基因样品，如上所述，通过破坏任意样品中的细胞使双链核酸游离，通过热处理或碱处理使其变性成单链。

这时，可以按照常规方法进行前述样品中的细胞的破坏。例如，可以通过从外部外加振动，超声波等物理作用进行。此外，还可以使用核酸提取溶液(例如，含有SDS，Triton-X，Tween-20等表面活性剂或皂甙，EDTA，蛋白酶等的溶液等)，使核酸从细胞游离。

接着，生成具有与待检测的基因序列互补的碱基序列的单链核酸探针。

这种核酸探针，可以使用经限制性酶切割从生物样品中提取的核酸，通过电泳分离等纯化的核酸或通过化学合成获得的单链核酸。从生物样品中提取的核酸时，优选通过热处理或碱处理使其解离成单链核酸。

然后，将前述获得的核酸探针固定在电极上。

本发明中使用的电极如果是可作为电极使用的，可以是任意一种，可以例举有，例如金、铂、铂黑、钯、铑等贵金属电极，和石墨、玻璃碳、热解石墨、炭浆、碳纤维等碳电极，和氧化钛、氧化锡、氧化锰、氧化铅等氧化物电极，和Si、Ge、ZnO、CdS、TiO、GaAs等半导体电极等。这些电极上也可以被导电性高分子包被，如果这样包被的话可以制备更稳定的探针固定化电极。

并且，作为在前述电极上固定前述核酸探针的方法，可以使用公知的方法。如果举一例，例如，在前述电极为金时，在固定的核酸探针的5’或3’-末端(优选5’-末端)上导入巯基，通过金与硫的共价结合使前述核酸探针固定在该金电极上。在该核酸探针上导入巯基的方法可以例举有记载在文献(M.Maeda et al.，Chem.Lett.，1805-1808(1994)和B.A.Connolly，Nucleic Acids Res；，13，4484(1985))中的方法。

也就是，将由前述方法获得的具有巯基的核酸探针滴落在金电极上，通过在低温下放置数小时，使该核酸探针固定在电极上，制备出核酸探针。

此外，如果要举其它的例子，例如在前述电极为玻璃碳时，首先通过用高锰酸钾氧化玻璃碳，在电极表面导入羧酸基，由此，核酸探针通过酰胺结合被固定在玻璃碳电极表面。核酸探针被固定在该玻璃碳电极上。将核酸探针固定在该玻璃碳上的实际的固定化方法详细地记载于文献((K.M.Millan et al.，Analytical Chemistry，65，2317-2323(1993))中。

接着，使固定有前述核酸探针的电极与含有前述基因样品的溶液接触。由此，具有与前述固定的核酸探针互补的序列的基因样品与之杂交，在电极上形成双链核酸。由于使基因样品与该核酸探针杂交的方法是周知的，故这里省略说明。

通过这样在电极上形成双链核酸后，在形成该双链核酸的电极上添加插入剂，在前述双链核酸上插入插入剂使之反应。并且，这种添加剂的添加可以在形成双链核酸前，也可以最后在杂交反应前添加到前述样品中。

这之后，对添加了插入剂的双链核酸进行光照射，使双链核酸与插入剂间形成共价结合。

以下，对本实施方式1的插入剂进行说明。

本发明中，作为插入剂使用具有以下特征的物质：特异性插入于前述双链核酸并且通过光照射与双链核酸共价结合。

由此，前述插入剂由于与双链核酸牢固且不可逆地结合，因此通过之后的清洗过程，与双链核酸结合的插入剂不从该双链核酸解离，在清洗过程中可以仅除去未反应的插入剂。

进而，本发明中，作为插入剂使用具有电化学活性的特征的物质。

由此，通过源于特异性结合在前述双链核酸的插入剂的电化学信号，可以以高灵敏度检测出该双链核酸的存在。

满足这两种特性的插入剂是具有：特异性插入于前述双链核酸并且通过光照射与双链核酸共价结合的双链核酸结合部位(I)、具有电化学活性的电化学活性部位(F)、以及连结前述双链核酸结合部位(I)和前述电化学活性部位(F)的连结部位(L)的化合物。

例如，本发明的插入剂可以由下述通式(1)表示。

通式：F-L-I...(1)

(式中F表示电化学活性基，L表示连结基，I表示具有通过光照射与双链核酸交联的部位的双链核酸插入基。)

这里，可以作为前述通式(1)表示的双链核酸插入基I使用的物质，可以例举有为特异性插入于双链核酸并且通过光照射与双链核酸共价结合的物质并且具有感光性的插入剂。

然后，作为这种具有感光性的插入剂可以例举有例如呋喃香豆素衍生物，尤为优选补骨脂内酯衍生物。这种补骨脂内酯衍生物如果插入在双链核酸中，就与双链核酸产生非共价性相互作用，如果再照射长波长紫外线(300-400nm)，插入于双链核酸的补骨脂内酯衍生物部分就会与双链核酸牢固且不可逆地结合，从而形成稳定的共价结合。

因此，在后述清洗过程中可以确实地除去固定在电极表面上的、不形成双链核酸的探针，在清洗非特异吸附在该电极表面的插入剂时，结合于双链核酸上的插入剂不会脱落，通过在该清洗过程中进行强洗涤可以确实地除去前述未反应的单链核酸探针和非特异吸附的插入剂。

作为这种补骨脂内酯衍生物的具体实例，可以例举有补骨脂内酯，甲氧基补骨脂内酯，三甲基补骨脂内酯等。

接着，可以作为前述通式(1)所示的电化学活性基F使用的物质如果是可通过电化学检测的物质可以是任意物质，例如，可以例举有通过测定在可逆性氧化还原反应时产生的氧化还原电流可以进行物质的检测的、且具有氧化还原性的化合物。

而且，作为这种具有氧化还原性的化合物，有例如二茂铁，儿茶酚胺，在配体上具有杂环类化合物的金属配合物，红荧烯，蒽，六苯并苯，芘，荧蒽，，菲，苝，联二萘，辛四烯或viologen等。

进而，作为前述具有氧化还原性的化合物的例子列举的在配体上具有杂环类化合物的金属配合物，红荧烯，蒽，六苯并苯，芘，荧蒽，屈，菲，苝，联二萘，辛四烯中也存在在氧化还原反应时产生电化学发光的物质，因此通过测定其发光也可以进行物质的检测。

而且，作为前述在配体上具有杂环类化合物的金属配合物，有含有氧或氮等的杂环类化合物，例如在配体中具有吡啶部位、吡喃部位的金属配合物，尤为优选在配体中具有吡啶部位的金属配合物，而且作为该在配体中具有吡啶部位的金属配合物，有例如金属联二吡啶配合物，金属邻二氮杂菲配合物等。

进而，作为前述在配体上具有杂环类化合物的金属配合物的中心金属，可以例举有例如钌，锇，锌，钴，铂，铬，钼，钨，锝，铼，铑，铱，钯，铜，铟，镧，镨，钕，钐等，并且尤其是，该中心金属为钌，锇的配合物具有良好电化学发光特性，作为这种具有良好电化学发光特性的物质可以例举有例如钌联二吡啶配合物，钌邻二氮杂菲配合物，锇联二吡啶配合物，锇邻二氮杂菲配合物等。

而且，作为前述通式(1)中可以作为连结基L使用的基团如果是连结前述电化学活性基F和前述双链核酸插入基I的基，这种连结序列没有特别的限制，例如，可以列举有烷基，-O-基，-CO-基，-NH-基，磷酸基或它们的组合构成的基团等。

在前述基因样品与前述核酸探针杂交前或后添加这种插入剂，通过光照射，使前述核酸探针与基因样品杂交而成的双链核酸与前述插入剂共价结合后进行电极的清洗处理。

然后通过这种清洗处理，除去固定在电极表面上的未反应的单链核酸探针和非特异吸附在该电极表明上的插入剂。

其结果是，前述杂交的双链核酸中就仅留下特异性共价结合的插入剂，通过测定源于这种插入剂的电化学信号可以以高灵敏度检测出双链核酸的存在。

前述来源于插入剂的电化学信号因添加的插入剂种类而不同，但是在使用产生氧化还原电流的插入剂时，可以用由恒电位器，函数发生器(function generator)等构成的测量系统测定。另一方面，使用产生电化学发光的插入剂时可以使用光电倍增管等进行测量。

下面，用图1对本发明中这种基因检测装置进行说明。图1是表示本发明实施方式1基因检测装置的结构的图。图1中，基因检测装置100有双链核酸形成槽3、基因样品清洗槽7、插入剂反应槽9、插入剂清洗槽13、检测槽15这5种槽。1是从样品中的细胞中制作作为检查对象的基因样品的基因样品制作部，2是固定了具有与检测对象的基因样品互补的序列的单链核酸探针的电极。5由支持前述电极2的电极支持臂5a和驱动该电极支持臂5a的臂驱动部5b构成，其是使前述电极2在前述5个槽3，7，9，13，15的内部按顺序移动的电极移动部，例如可以例举有传送臂，带式传送器等装载器。

6是容纳清洗电极2表面的未反应的基因样品的清洗液的基因样品清洗液槽，8是容纳插入剂的插入剂槽，12是容纳清洗电极2表面的未反应的插入剂的清洗液的插入剂清洗液槽，14是容纳电解液的电解液槽。

而且，前述基因样品制作部1连接在前述双链核酸反应槽3上，前述基因样品清洗液槽6连接在前述基因样品清洗槽7上，前述插入剂槽8连接在前述插入剂反应槽9上，前述插入剂清洗液槽12连接在前述插入剂清洗槽13上，前述电解液槽14连接在前述检测槽15上。此外，前述插入剂反应槽9中设置有给电极2照射光的UV灯11，前述检测槽15中设置有给电极2外加电压的恒电位器17和测定前述电极2的电化学发光的光电倍增管16，和在控制外加给前述电极2的外加电压的同时从前述光电倍增管16获得测定结果进行分析的控制部18。

此外，前述双链核酸形成槽3，插入剂反应槽9分别嵌合了温度控制器4、10。

下面，对该装置100的操作进行说明。

首先，将含有待检测的基因的被检查细胞装入基因样品制作部1，制成含有将作为检查对象的基因变性为单链的基因样品的样品溶液。然后，将前述含有基因样品的样品溶液送至双链核酸形成槽3，将前述样品溶液滴落在设置于该双链核酸形成槽3中的固定有核酸探针的电极2上。此时在双链核酸形成槽3中通过温度控制器4将槽内温度预先控制在适当温度。

在滴落了前述样品溶液的电极2表面上，与固定在该电极2上的核酸探针具有互补的碱基序列的基因样品杂交，形成双链核酸。

反应结束后，使该电极2从电极移动部5移动到基因样品清洗槽7。

在基因样品清洗槽7中将容纳于前述基因样品清洗液槽6中的清洗液滴落在前述电极2上，用该清洗液除去前述电极2表面未反应的基因样品。

反应结束后，使该电极2从电极移动部5移动到插入剂反应槽9。

插入剂反应槽9中，将容纳于前述插入剂槽8中的插入剂滴落在前述电极2上，使该插入剂插入到前述双链核酸进行反应。此时在插入剂反应槽9中通过温度控制器10将槽内温度预先控制在适当温度。

进而，这之后，在前述插入剂反应槽9中，通过前述UV灯11对滴落了前述插入剂的电极2进行光照射，使前述插入剂与双链核酸共价结合。

反应结束后，使该电极2从电极移动部5移动到插入剂清洗槽13。

在插入剂清洗槽13中，将容纳于前述插入剂清洗液槽12中的清洗液滴落在前述电极2上，用该清洗液除去前述电极2表面未反应的插入剂。

清洗结束后使该电极2从电极移动部5移动到检测槽15。

在检测槽15中，前述电极2连接在恒电位器17上，将容纳于前述电解液14的电解液滴落在前述电极2上。

前述恒电位器17在控制部18的控制下对电极2外加电压，使电化学发光，然后，通过前述光电倍增管16测定该电化学发光，将该测定值输入控制部18，进行分析。

如上所述，如果根据本实施方式1，由于使用具有电化学活性且通过光照射与前述双链核酸共价结合的物质作为插入于由与具有与检测对象的基因互补的序列的核酸探针杂交获得的双链核酸的插入剂，故通过光照射使前述双链核酸与前述插入剂共价结合，可以使该双链核酸与插入剂可逆地且牢固地结合，其结果是可以获得高精确度的测定结果，可以以高灵敏度检测具有特定序列的待检测基因。此外，如果根据本实施方式1，即使清洗电极2表面的未反应的插入剂，由于设法使前述插入剂与双链核酸形成共价结合，因此结合到前述双链核酸的插入剂不解离，由于可以除去非特异吸附在单链核酸探针或电极表面上的插入剂，因此可以以高灵敏度检测前述样品中的基因。

并且，本实施方式1中，作为清洗槽，设置有清洗双链核酸形成过程后的未反应的基因样品的基因样品清洗槽7、和清洗插入剂添加过程后的未反应的插入剂的插入剂清洗槽13的结构，但是即使将清洗槽并为一个槽，成为在同一清洗槽中进行这些清洗处理的结构也可以，或者即使在前述两个清洗处理后只进行前述未反应的插入剂清洗处理。不进行前述未反应的基因样品清洗处理也可以。

进而，前述基因检测装置100中，对电极2进行的每种处理，均设置用于进行这些处理的槽的结构，但是也可以在一个槽里实现所有的处理。

(实施方式2)

前述实施方式1中说明了设置对电极2进行多个处理的多个处理槽，在不同的处理槽中进行各个处理的情况，而本实施方式2中是将处理槽合并为1个，在该1个处理槽中对电极2进行处理的情况。

图2是表示本实施方式2所涉及的基因检测装置的结构的图。图2中，基因检测装置200有对电极2进行处理的处理槽23。25是前述处理槽23内部使前述电极在水平方向移动的电极移动部，例如，可以例举有例如使平台(stage)平行移动的机械装置等。而且，27是排出滞留于前述处理槽23内部的液体的废液槽。

前述处理槽23中，在槽内部设置固定了核酸探针的电极2和使该电极2在水平方向上移动的电极移动部25，进而在槽上部连接前述基因样品制作部1、基因样品清洗液槽6、插入剂槽8、插入剂清洗液槽12、电解液槽14、和废液槽27。

此外，前述处理槽23中设置对电极2照射光的UV灯11和测定该电极2的电化学发光的光电倍增管16，其嵌合了温度控制器4。

进而，在该装置200中，设置对电极2外加电压的恒电位器17和在控制外加给前述电极2的外加电压的同时从前述光电倍增管16获得测定结果进行分析的控制部18。

下面，对该装置200的操作进行说明。

首先，将含有待检测的基因的被检查细胞装入基因样品制作部1，制成含有将作为检查对象的基因变性为单链的基因样品的样品溶液。然后，将前述含有基因样品的样品溶液送至处理槽23，将前述样品溶液滴落在设置于该处理槽23中的固定有核酸探针的电极2上。此时在处理槽23中通过温度控制器4将槽内温度预先控制在适当温度。

在滴落了前述样品溶液的电极2表面上，与固定在该电极2上的核酸探针具有互补的碱基序列的基因样品杂交，形成双链核酸。

反应结束后，将容纳于前述基因样品清洗液槽6中的清洗液滴落在前述电极2上，用该清洗液除去前述电极2表面未反应的基因样品。此时，电极移动部25使该电极2水平方向移动到所定位置以使由基因样品清洗液槽6传送的清洗液适当滴落到前述电极2上。此外，滴落在前述电极2上的清洗液回收于废液槽27中。

清洗结束后，容纳于前述插入剂槽8中的插入剂滴落在前述电极2上，使该插入剂插入于前述双链核酸反应。此时，电极移动部25使该电极2水平方向移动到所定位置以使由插入剂槽8传送的插入剂适当滴落到前述电极2上。此外，在处理槽23中通过温度控制器4预先将槽内温度控制于适当温度。

反应结束后，将容纳于前述插入剂清洗液槽12中的清洗液滴落在前述电极2上，用该清洗液除去前述电极2表面未反应的插入剂。此时，电极移动部25使该电极2水平方向移动到所定位置以使由插入剂清洗液槽12传送的清洗液适当滴落到前述电极2上。此外，滴落在前述电极2上的清洗液回收于废液槽27中。

清洗结束后，前述电极2与恒电位器17连接，容纳于前述电解液槽14的电解液滴落在前述电极2上。此时，电极移动部25使该电极2水平方向移动到所定位置以使由电解液槽14传送的电解液适当滴落到前述电极2上。

前述恒电位器17在控制部18的控制下对电极2外加电压，使电化学发光。然后，通过前述光电倍增管16测定该电化学发光，将该测定值输入控制部18，进行分析。

如上所述，如果根据本实施方式2，由于设法使用具有电化学活性且通过光照射与前述双链核酸共价结合的物质作为插入于由与具有与检测对象的基因互补的序列的核酸探针杂交获得的双链核酸的插入剂，故通过光照射使前述双链核酸与前述插入剂共价结合，可以使该双链核酸与插入剂可逆地且牢固地结合，其结果是可以获得高精确度的测定结果，可以以高灵敏度检测具有特定序列的待检测基因。此外，如果根据本实施方式2，即使清洗电极2表面的未反应的插入剂，由于设法使前述插入剂与双链核酸形成共价结合，因此结合到前述双链核酸的插入剂不解离，由于可以除去非特异吸附在单链核酸探针或电极表面上的插入剂，因此可以以高灵敏度检测前述样品中的基因。

并且，本实施方式2中，设置有清洗双链核酸形成过程后的未反应的基因样品的基因样品清洗槽6和清洗插入剂添加过程后的未反应的插入剂的插入剂清洗槽12的结构，但是即使将处理层23设置的清洗液槽并为一个槽，也可以在同一清洗槽中进行双链核酸形成过程后的清洗未反应的基因样品的处理以及光照射过程后的清洗未反应的插入剂的处理，也可以在前述两个清洗处理后只进行前述插入剂清洗处理不进行前述基因样品清洗处理。

实施例1

下面，公开了本发明的实施例，但本发明不受这些实施例的限制。

(1)核酸探针在金电极表面上的固定

玻璃基板上通过溅镀装置(アルバツク制SH-350)形成钛10nm，在衬底上形成金200nm，通过光刻术步骤形成电极图案，从而制备金电极。用ピラニア溶液(过氧化氢∶浓硫酸＝1∶3)清洗电极表面1分钟，用纯水清洗后，通过吹氮使之干燥。

核酸探针中，使用具有位于自人来源的Cytochrome P-450的基因序列的5’-端的第629-668位的CCCCCTGGAT CCAGATATGC AATAATTTTCCCACTATCAT的序列且通过5’-端的磷酸基修饰了巯基的40个碱基的寡聚脱氧核苷酸(宝生物制)。然后，使该核酸探针溶解于10mM的PBS(pH7.4的磷酸钠缓冲液)，调整至100μM。

将这样调整的核酸探针的溶液滴落在前述金电极上，于饱和湿度下，室温下放置4小时，通过使巯基与金结合，从而将核酸探针固定在金电极上。

(2)杂交

基因样品中，使用与前述核酸探针互补的在5’-末端具有ATGATAGTGG GAAAATTATT GCATATCTGG ATCCAGGGGG的序列的寡聚脱氧核苷酸(宝生物制)。然后，使该核酸样品溶解于混合了10mM的PBS和2XSSC的杂交溶液，调整至20μM。

将这样调整的溶解了基因样品的杂交溶液滴落到固定了前述核酸探针的金电极上，在40℃的恒温槽中使之反应4小时，形成双链核酸。由此获得形成双链核酸的金电极x。

进而，在本实施例中，作为比较对象，制成不形成双链核酸的金电极y。这种不形成双链核酸的金电极y，通过使用具有与前述核酸探针非互补的序列的基因样品(以下称为“比较基因样品”)进行与获得形成前述双链核酸的金电极x时相同的处理。并且，其中，作为前述比较基因样品，使用具有40mer的Poly-A(宝生物制)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA的序列的基因样品。

(3)插入剂的添加

插入剂中使用下述化1所示补骨脂内酯修饰钌配合物。

补骨脂内酯修饰钌配合物的合成可以通过以下方法获得。

首先，将通过公知的方法(Biochemistry，Vol.16，No 6，1977)合成的4-氯甲基-4，5，8-三甲基补骨脂内酯(0.5g，1.81mmol)溶于氢氧化钠溶解二甲基甲酰胺(干燥)，160℃下一边搅拌一边滴落1，4-二氨基丁烷(0.32g，3.63mmol)，使之反应12小时。蒸馏去除溶剂后，通过硅胶色谱法处理纯化粗生成物，获得生成物A(收率40％)。

接着，将溶解于60.0mL THF中的2.50g(1.35×10^-2mol)4，4’-二甲基-2，2’联二吡啶溶液注入氮气的容器中后，滴落16.9mL的2M的二异丙基酰胺锂溶液(2.70×10^-2mol)，一边冷却一边搅拌30分钟。另一方面，同样，在于氮气流中干燥的容器中加入7.61g的1，2-二溴乙烷(4.05×10^-2mol)和10mL的THF，一边冷却一边搅拌。

使先前的溶解于THF的4，4’-二甲基-2，2’联二吡啶溶液与2M二异丙基酰胺锂溶液反应的反应液慢慢滴落到这种插入了1，2-二溴乙烷和THF的容器中，使之反应2.5小时。然后，用2N的盐酸中和这种反应溶液，蒸馏去除THF后用氯仿提取，进而用硅胶柱纯化通过蒸馏前述溶剂获得的粗生成物，获得生成物B(收率47％)。

然后，将前述生成物A(0.50g，1.52mmol)和前述生成物B(0.49g，1.68mmol)溶于氢氧化钠溶解二甲基甲酰胺(干燥)，160℃下搅拌18小时。然后，蒸馏去除这种搅拌的溶剂后，通过硅胶色谱法处理纯化粗生成物，获得生成物C(收率38％)。

进而，在二甲基甲酰胺(80.0mL)中回流氯化钌(III)(2.98g，0.01mol)和2，2’联二吡啶(3.44g，0.022mol)后，蒸馏去除溶剂。然后，加入丙酮，收集经冷却一晚获得的黑色沉淀物，加入170mL乙醇水溶液(乙醇∶水＝1∶1)，进行1小时的加热回流。过滤后，加入20g氯化锂，蒸馏乙醇，再冷却一晚。析出的黑色物质通过吸引过滤收集，获得生成物D(收率68.2％)。

然后，将前述生成物C(0.30g，0.56mmol)和前述生成物D(0.32g，0.66mmol)溶于二甲基甲酰胺中然后回流6小时，反应后通过蒸馏溶剂获得的黑紫色物质中加入蒸馏水使之溶解，通过过滤出去未反应的配合物后，蒸馏去除溶剂。

通过硅胶色谱法处理纯化所得的粗生成物，获得补骨脂内酯修饰钌配合物(收率68％)。表1是以前述方式获得的补骨脂内酯修饰钌配合物的质子NMR(¹H-NMR)的结果。

表1

¹H-NMR(300MHz，DMSOd-6)

σ：

1.4-1.8  (6H，m)

2.4-2.6  (12H，m)

2.74     (2H，t)

3.8-3.1  (6H，m)

4.31     (2H，s)

6.32     (1H，s)

7.38     (2H，d)

7.54     (7H，m)

7.77     (4H，m)

8.16     (4H，t)

8.70     (2H，d)

8.88     (4H，d)

用10mM的PBS将这样获得的补骨脂内酯修饰钌配合物调整成2μM。

将该调整的溶液分别添加到前述形成双链核酸的金电极x和不形成双链核酸的金电极y上，在4℃的冷藏库中进行30分钟的暗反应。

(4)双链核酸和插入剂的共价结合

30分钟后，用UV crosslinker(フナコシ制UVPLCL1000L型)分别对前述金电极x，y照射波长为365nm，5mW/cm2的紫外线10分钟。共价结合后，用10mM的PBS分别振动清洗金电极x，y 10分钟，除去未反应的Ru配合物。

(5)电化学测定

在以上过程后，在前述金电极x，和不形成双链核酸的金电极y上分别滴落混合了0.1M的PBS和0.1M的三乙胺的电解液。

然后，对金电极x，y外加电压，进行此时产生的源于插入剂的电化学发光的测定。

并且，电压的外加以0V至1.3V扫描，进行1秒钟的电化学测定。电化学发光量的测定用光电倍增管(浜松ホトニクス制H7360-01)进行，测定最大发光量。

图3表示由本实施例1的电化学测定获得的结果。根据图3可知形成双链核酸的金电极x上的发光量显著高于在不形成双链核酸的金电极y上的发光量。表明了如果使用本发明的插入剂，就可以以高灵敏度进行双链核酸的检测。

工业上的可利用性

本发明中的这种基因检测方法可以以高灵敏度检测具有特定序列的基因，可以应用于基因诊断，传染病诊断，基因组创新药物等用途。

                            序列表

<110>松下电器产业株式会社

<120>基因检测方法和基因检测装置

<130>P38717-P0

<150>JP 2004-128940

<151>2004-04-23

<160>3

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<223>用巯基修饰5’-末端磷酸基团

<400>1

ccccctggat ccagatatgc aataattttc ccactatcat  40

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>智人

<400>2

atgatagtgg gaaaattatt gcatatctgg atccaggggg  40

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  40

Claims (14)

1、一种基因检测方法，其特征在于其为一种检测样品中具有特定序列的基因的基因检测方法，该方法包括以下步骤：

通过将检测样品中待检测的基因变性成单链制备基因样品的基因样品制作步骤；

将具有与前述待测基因序列互补的碱基序列的单链核酸探针固定在电极上的固定步骤；

在固定了前述单链核酸探针的电极上添加前述单链基因样品，形成前述核酸探针与前述基因样品杂交的双链核酸的双链核酸形成步骤；

在形成前述双链核酸的电极上添加具有电化学活性并且通过光照射能共价结合前述双链核酸的插入剂的插入剂添加步骤；

通过进行光照射使前述插入剂与前述双链核酸共价结合的光照射步骤；

清洗未与前述双链核酸反应的插入剂的清洗步骤；

和前述清洗步骤后通过电化学测定检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的测定步骤。

2、权利要求1中记载的基因检测方法，其特征在于前述电化学测定是对前述电极外加电压，通过与前述双链核酸共价结合的插入剂测定电化学发光量的测定。

3、权利要求1中记载的基因检测方法，其特征在于前述插入剂包含具有特异性插入前述双链核酸中并且通过光照射与该双链核酸形成共价结合的双链核酸结合部位、具有电化学活性的电化学活性部位、连结前述双链核酸结合部位和前述电化学活性部位的连结部位的化合物。

4、权利要求3中记载的基因检测方法，其特征在于所述插入剂是前述双链核酸结合部位具有感光性的插入剂。

5、权利要求4中记载的基因检测方法，其特征在于前述具有感光性的插入剂是呋喃香豆素衍生物。

6、权利要求5中记载的基因检测方法，其特征在于前述呋喃香豆素衍生物是补骨脂内酯衍生物。

7、权利要求3中记载的基因检测方法，其特征在于前述电化学活性部位是具有氧化还原性的化合物。

8、权利要求7中记载的基因检测方法，其特征在于前述具有氧化还原性的化合物是显示电化学发光的化合物。

9、权利要求8中记载的基因检测方法，其特征在于前述显示电化学发光的化合物是在配体上具有杂环类化合物的金属配合物、红荧烯、蒽、六苯并苯、芘、荧蒽、、菲、苝、联二萘、辛四烯。

10、权利要求9中记载的基因检测方法，其特征在于前述在配体上具有杂环类化合物的金属配合物是在配体上具有吡啶部位的金属配合物。

11、权利要求10中记载的基因检测方法，其特征在于前述在配体上具有吡啶部位的金属配合物是金属二吡啶配合物，金属二氮杂菲配合物。

12、权利要求9中记载的基因检测方法，其特征在于前述在配体上具有杂环类化合物的金属配合物的中心金属是钌，锇。

13、一种基因检测装置，其特征在于该装置是检测样品中具有特定序列的基因的基因检测装置，其装备有：

固定了具有与前述待检测基因序列互补的碱基序列的单链核酸探针的电极；

固定在前述电极上的核酸探针和与前述样品中的待检测基因被变性为单链的基因样品杂交形成双链核酸的双链核酸形成槽；

在前述电极上添加具有电化学活性并且通过光照射能共价结合前述双链核酸的插入剂，然后光照射使前述插入剂与前述双链核酸共价结合的插入剂添加槽；

通过清洗液除去未与前述双链核酸反应的插入剂的清洗槽；

通过电化学测定检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的检测槽；

以及使前述电极在前述双链核酸形成槽，前述插入剂添加槽，前述清洗槽和前述检测槽的各槽内按顺序移动的电极移动部。

14、一种基因检测装置，其特征在于该装置是检测样品中具有特定序列的基因的基因检测装置，其装备有：

固定了具有与前述待检测基因序列互补的碱基序列的单链核酸探针的电极；

通过将前述待检测基因变性为单链制备基因样品的基因样品制作部；

容纳具有电化学活性并且通过光照射共价结合前述双链核酸的插入剂的插入剂槽；

容纳除去未与前述双链核酸反应的插入剂的清洗液的清洗液槽；

容纳用于检测与前述双链核酸共价结合的插入剂的电解液的电解液槽；

和与前述基因样品制作部、前述插入剂槽、前述清洗液槽、前述电解液槽连接的处理槽，前述处理槽使固定在前述电极上的核酸探针与前述基因样品形成双链核酸，通过光照射使所述插入剂与前述双链核酸共价结合，用前述清洗液清洗未与前述双链核酸反应的插入剂，通过电化学测定检测与前述双链核酸共价结合的插入剂。

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