JPH07506483A - 光架橋によって安定させた２本鎖ｄｎａの変性勾配電気泳動による突然変異検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光架橋によって安定させた２本ｊｊｌＤＮＡの変性勾配電気泳動による突然変異 検出方法 本発明は光活性のある１個または複数個のインターカレーター（挿入物質）を用 いた光架橋により安定させた２本鎖ＤＮＡの、変性勾配ゲル上の電気泳動によっ て突然変異を検出する新しい方法に関するものである。

もっと具体的には、本発明は遺伝子増幅過程で形成されたノ１イブ１ハンドを安 定させるためのプライマーとして、照射により相補核酸配列と架橋生成物を形成 することのできる少な（とも１つの光活性インターカレーターと結合したオリゴ ヌクレオチドを適用し、変性勾配ゲル上の遅延電気泳動によって前記）１イブリ ツドを分析することに関係する。

変性勾配ゲル上の遅延法による突然変異分析はＤＮＡ断片の電気泳動移動度（移 動速度）が断片が完全に変性（１本鎖）、部分的に変性（ループまたはピン）、 または完全に対（２本鎖）になっているかで異なるという事実に基づいている。

２本鎖ＤＮＡは温度上昇によって変性することがある。尿素やホルムアミドなど の変性剤はこの変性を促進し、ハイブリッドの融合温度を下げることができる。

２重鎖ＤＮＡ断片が段階的な変性条件におかれたとき、ハイブリッドの段階的な 変性が認められる。段階的変性の結果として２本鎖ＤＮＡの鎖の様々なドメイン の分離が、一番不安定なドメインから始まって、／％イブリッドの完全な分離に 至る。Ｇ／Ｃ対の豊富な領域がＡ／Ｔ対の豊富な領域よりも安定していることが 示されている。

したがって、ドメイン内にループやピンが現れるか、所与の変性条件で不安定に 達する。

変性剤濃度の変動または温度変動などによって、変性勾配を付けたアクリルアミ ドケル内の電気泳動移動は、変性が遅くゲル上を遠くまで体動する完全なハイブ リッドと融合ループやピンを有する不完全／１イブ１ハンドを判別することがで きる、なぜなら分離したドメインはＤＮＡ断片の電気泳動移動度を停止するが、 著しく遅くするからである。

電気泳動に関与する変性勾配は少なくとも３つの方法によって得られるニーゲル に沿った温度勾配、Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｅ　（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　Ｇｒａｄｉｅ ｎｔ　Ｇｅ１Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法と呼ばれる。

−ゲルに沿った化学的変性剤の勾配、Ｄ　Ｇ　Ｇ　Ｅ　（Ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ 　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｇｅ１Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法と呼ばれる（ 参考資料６参照）。

−経時的温度勾配、Ｔ　Ｓ　Ｇ　Ｅ　（Ｔｅｔｒｐ６ｒａｔｕｒｅ　Ｓｗｅｅｐ 　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法と呼ばれる（Ｋｅｎｊｉ　Ｙｏ ｓｈｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、　Ｖｏｌ、　１９．　ＮｏA　１１゜ ３１５３、１９９１）。

このような増加的（勾配をもつ）変性条件の下で、アクリルアミドゲル上の電気 泳動を行うと、電気泳動移動度の減少によって少な（とも１つの領域の変性を示 す断片を、全く変性しない断片から、または完全に変性したものから分離するこ とができ、このようにして１塩基対の点突然変異まで識別することができる（Ｓ 、　Ｇ。

Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｌ、Ｓ、　ＬｅｒＩＭｌｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　８０．　ｐｐ、１５V９−１５８３゜ ｂｒｃｈ　１９８３．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）；（０，Ａｔｔｒｅｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４．２６６−２７２．１９W９）　； （Ｒ，Ｍ、　Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、３１３．　Ｆ ｅｂｒｕａｎ’　１９８５．　ｐｐ、４９５−４９７）。

これらの技術の原理は、坦面から周知であるにもかがゎらず、遺伝子増幅法が出 現したおかげでやっと最近になって容易に実施できるようになったが、この方法 によって前記の技術で容易に分析できるＤＮＡの断片を簡単に得ることができる 。この遺伝子増幅はハイブリッド形成段階と、延長段階と、変性段階とがら成る サイクルを実行し、Ｐ　ＣＲ（ＰｏｌｙＩＩｌｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａ ｃｔｉｏｎ）サイクルという名前で周知のこのハイブリッド形成／延長／変性サ イクルを、起点のＤＮＡ断片の量を実施されるサイクル数に対して指数関数的に 増加させるために充分な回数だけ反復することから成る。

ハイブリッド形成段階は増幅するＤＮＡ断片の両（３゛）末端に位置する約２０ の塩基の配列にそれぞれ相補的な、２個のプライマーオリゴヌクレオチドを使用 することから成る；適切なハイブリッド形成条件で、２個のプライマーをゲノム ＤＮＡと混合することによってそれぞれのプライマーをＤＮＡ断片上のそれらの 相補的配列の正面に位置づけることができる。

延長段階はオリゴヌクレオチドの両（３°）末端がプライマーとして、増幅する 断片のそれぞれのＤＮＡ鎖がマトリクスとしてＤＮＡポリメラーゼに作用するこ とから成る。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチドは増幅する断片の配列が ２倍になるまで（５’）−（３’）方向に伸長される。

変性段階は、次のハイブリッド形成段階を実施する前に、延長段階によって生成 されたハイブリッドの２本鎖を熱の作用によって分離することから成る。

変性ゲル上の遅延技術のおかげで、ＰＣＲによる遺伝子増幅によって、群の中の 突然変異の有無を非常に正確に研究し、突然変異を遺伝子病の有無と相関させる ことができる（Ｒ，Ｌ　５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ 、３２４．１３　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９８６゜ＰＰ１６３−１６６）　、（Ｃ ，ｌｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３８４．２６　Ｎ ｏｖｅｍｂｅｒ　１９８７．@ｐｐ、３８４ −３８６　）。

実際、突然変異を有するかも知れないゲノムの領域を仮定する。その配列が判れ ば、解析モデルによってＤＮＡ断片内に、連続する１つまたは複数個の融合ドメ インを識別し、その融合温度を予測することができる（この点に関しては参考資 料１０を参照）：さらにたとえ点突然変異であっても問題のドメインの融合温度 に対する影響を予測することもできる（この点に関しては参考資料１０を参照） 。

ＰＣＨによる遺伝子増幅のおかげで、プライマーオリゴヌクレオチドの対を正確 に選択することによって、少なくとも２つの融合ドメインを含むＤＮＡ断片を増 幅し、この精製された断片をかなりの量（数百ナノグラム）得ることができる。

化学または熱変性勾配内でこの断片を電気泳動分析することによってドメインの 融合温度を測定することができる。この温度は配列によって異なるので、基準断 片に対して変異断片の移動が異なることを基礎にして、突然変異の有無を識別す ることができる。

この手順の重要な過程は研究する融合ドメインを囲む特殊なプライマーオリゴヌ クレオチドの選択にある。

実際、ヌクレオチドの変異が最初の融合領域にあるとき、即ちゲルの中で、断片 が、変性剤の濃度（または温度）がその融合温度（Ｔｍ）に対応する場所に到達 したときに最初に変性するセグメント内に位置するときにしかその変異は検出で きない。突然変異は最初のものより安定した第２のドメインが存在し、しかもそ れが最初の融合ドメイン内にあるときにしかこの方法によって検出できない。

系統的な方法によって最初の融合ドメイン内に探索されたＤＮＡの配列を位置づ けるために、先行技術においては、増幅プライマーの位置を決定するために適当 なアルゴリズムで二本鎖ＤＮＡの配列を解析し、さらに、ｒＧＣクランプ」とも 呼ばれる、最低４０塩基対からなるＧＣ配列を改良プライマーオリゴヌクレオチ ドの助けを借りて導入することによって、分析する断片の両端の一方を安定化す ることを提案している。このＧＣクランプの導入は変性に強いドメインを作り出 し、それによって不安定なドメインはそれが含む突然変異を分析できるようにな る。

先行技術において、ＧＣ配列を（５′）末端に導入することによって改良したプ ライマーオリゴヌクレオチドを用い、増幅された断片の末端の一方を安定化させ ることが提案されている（Ｋｅｎｊｉ　Ｙｏｓｈｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｖｏｌ、　１９．　Ｎｏ、１１．３１５３．１９９１）　（この点に関しては参 考資料１５を参照）。

このモデルはベータグロビン、凝固因子ＩＸ及びＶＩ　Ｉ　Ｉ、嚢胞性繊維症の 遺伝子の突然変異の診断を専門とする研究所によって特に広く使用されている（ この点に関しては参考資料２．４．７．８．９．１６．１７を参照）。

ところが、ＧＣクランプの合成は困難である。それはプリンの１つであるデオキ シグアニン（文字Ｇで表される）もオリゴヌクレオチドの合成操作の中で一番壊 れやすいヌクレオシドであるからだ。事実、オリゴヌクレオチド合成の際、燐酸 アミド法による各結合サイクルにおいて、ＴＣＡによる酸性環境内での脱トリチ ル化（ｄｅｔｒｙｔｉｌａｔｉｏｎ）操作が実行される。また合成の終わりには 、塩基の保護を解除するために高温アンモニアによる塩基処理を行う。このとき オリゴヌクレオチドの大部分が、特にそれが多数のＧを含んでいるとき、脱プリ ンのためにまさにＧの部位で切断されるのが観察される。

この技術に使用されるＧＣクランプはしばしば非常に長く、場合によっては６０ から８０塩基対に達することがある。したがって、その合成は難しく、プライマ ーオリゴヌクレオチドの調製においてかなりのコスト増になる。

さらにＧＣクランプはドメインの融合する前に末端の解離を防止できるほど必ず しも安定ではなく、したがって、融合した一部のドメインの研究ができない。

本発明はＧＣクランプの難点を解消した、研究するＤＮＡ断片の少な（とも一方 の末端を安定化させるための新しい手段を提供しようとするものである。本発明 において、この目的はＧＣクランプのかわりに安定させる末端部位でＤＮＡの２ 本鎖の間に少なくとも１つの共有結合を導入することによって達成される。

公開番号第２５４０１２２号のフランス特許出願は新規な化合物として、インタ ーカレーターに結合されたオリゴヌクレオチドの配列を記載している。この化合 物はオリゴヌクレオチドの全ての相補的配列に選択的に結合する。塩基プレート と強い親和性を有するインターカレーターの存在が形成されたハイブリッドを安 定化するが、それでもハイブリッドは分離可能である。さらに、ヌクレオチドと 判別される特性を有するインターカレーターではその検出が可能となる。

上述の特許出願に提案されたインターカレーターは核酸に関する技術分野で周知 の化合物であり、一般的にはアクリジン、フロコラマリン、エリブチシン、及び それらの誘導体などの平坦な形状を有する多環式化合物である。

中でも、今後光活性化インターカレーターと称するソラレン（ｐｓｏｒａＷｎｅ ）　（またはフロコラマリン）及びこれらの誘導体は２本鎖ＤＮＡの塩基のプレ ートの間に入り込む能力の他に、約３６０ｎｍで照射されたときに、チミンを始 めとするピリミジン塩基の５．６二重結合と共に、ピロン環の３−４またはフラ ン環の４′−５゛二重結合の間に共有結合を形成する特性を有する。

フランス特許出願第２５４０１２２号に記載のごと（、このように適切な炭素を 含む腕を介してオリゴヌクレオチドに結合した光活性インターカレーターはオリ ゴヌクレオチドと相補的核酸の全配列によって形成された塩基プレートの間に入 る。得られたハイブリッドを３６０ｎｍで照射するとこのようにして活性化され たインターカレーターと相補的核酸配列の間に共有結合が生まれ、安定した架橋 ハイブリッドが作り出される。

さらにＷ０９０／１２０２０という番号で公開された国際特許出願はリボースま たはデオキシリボースを介してフロコラマリンをオリゴヌクレオチドに結合する ことを提案している。

欧州特許出願第３１６０１６号、国際特許出願ＷＯ３９１０６７０２号及びドイ ツ特許出願第３９２８９００号は遺伝子発現阻止のためにソラレンとオリゴヌク レオチドの結合の使用を記載している。

フランス特許出願第２５６８２５４号は核酸配列の選択的阻止のためのインター カレーターに結合したオリゴヌクレオチド化合物の応用、もっと具体的には、核 酸の複製、１つまたは複数個の遺伝子の転写及び／または翻訳の開始、伸長また は終結に関与する遺伝子または配列の発現の生体内での選択的阻止にこれらの化 合物を応用することを記載している。

次に出願人は、ソラレンまたはその誘導体などの少なくとも１つの光活性インタ ーカレーターに結合されたオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲによる生体内の遺伝子 増幅過程においてプライマーとして使用可能であり、このようにして得られたハ イブリッドが、光架橋後、変性勾配ゲル上の遅延電気泳動によつて研究できるよ うに完全に安定化されることを明らかにした。

本発明は従って、分析されるハイブリッドが１つまたは複数個の光活性化インタ ーカレーターを用いた光架橋によって安定化されることを特徴とする、変性勾配 ２本鎖ＤＮＡの電気泳動による突然変異の検出方法である。

本発明の方法によれば、分析されたハイブリッドは２重鎖ＤＮＡ断片の遺伝子増 幅法によって得られ、そのハイブリッド形成過程は、そのうち少な（とも１つの 上で、（５′）末端に１つまたは複数個の光活性インターカレーターが固定され ている２つのプライマーオリゴヌクレオチドで実施される。

ＰＣＲによる遺伝子増幅過程の後、得られたハイブリッドを約３６０ｎｍで照射 することによって、このようにして活性化されたインターカレーターと、相補鎖 上の少なくとも１つの近傍に位置する、チミンを始めとする、ピリミジン塩基の 間に共有結合を作り出すことができる。これらの共有結合は少なくとも１つの光 活性インターカレーターを載せたＤＮＡ鎮と架橋が実現されたマトリクスＤＮＡ 鎖の間に安定した架橋を保証する。

少なくとも１つの光活性インターカレーターが固定されたプライマーオリゴヌク レオチドから成る全体は次式に対応するこの化学式で： 基Ｂは同一でも、異なっていてもよく、それぞれ核酸の１つの基を表す。

Ｙは真っ直ぐな、または−ａｌｋ−分枝したアルコイレン基または次の基を表す ・ 基Ｅは同一でも、異なっていてもよく、それぞれオキソアニオン〇−、チオアニ オンＳ−、アルコキシ族、または−〇−ａｌｋ−Ｚ族を表す−ｍは１と５の間の 整数である。

Ｚはピリミジン基と光架橋を形成することのできる光活性インターカレーターに 対応する基である。

ｎは２と１５０の間の整数である。

ここで注意するのは、式Ｉは配列が増幅するＤＮＡ断片の（３゛）末端の一方に 位置する１５から３０の基の配列を相補する、ヌクレオチドの連鎖であり；ｎは 単に分子内に含まれるヌクレオチドの数を示し、ｎが２から１５０の間に、好適 には１０と３０の間に含まれる数であることである。

ピリミジン基と光架橋を形成することのできる光活性インターカレーターＺは核 酸関連技術で周知の化合物であり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド上で、二重螺旋 のＤＮＡまたはＲＮＡ構造内に１挟み込まれ」、照射の下にピリミジン基との架 橋生成物を形成することのできることが化合物である。

これらのインターカレーターは、一般的に、平坦な形状を有し、光活性二重結合 、またはアジド−Ｎ３を有する多環式化合物である。これらの化合物としては、 例えば、８−メトキシソラレン、５−メトキシソラレン、４゛ヒドロキシメチル −４，５’、８−トリメチルソラレン、３−カルベトキシソラレン、アンゲリシ ン、ピリド（３，４−ｃ）ソラレン、ピリド（３，４−ｃ）　８−メチルソラレ ンの誘導体が挙げられる。

Ｚの意味の中で、特に次の２つが使用される・−オキシ−８−ソラレン族、 −オキシー５−ソラレン族。

これらの化合物は周知の方法（Ｆ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｉｎ　Ｏｌｉｇｏｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎａｎａｌｏｇｕｅｓ　：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ； 　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９１）、　ｐｐ、 ２８３|３０８）　、特 にいわゆる「燐酸アミド」合成法によって調製できる。

構造式（１）において、次のようなヌクレオチド簡約表現を用いる：これは下記 の構造式に相当する。

この上に（３°）及び（５°）末端が記載されている。

第１の実施態様によれば、構造式（１）において、プライマーオリゴヌクレオチ ドの（５゛）末端に位置する基Ｂはアデニン（Ａ）であることが望まし０゜第２ の実施態様によれば、構造式（１）内でプライマーオリゴヌクレオチドの（５° ）末端に位置する連続する基Ｂの少なくとも２つがアデニンであることが望まし Ｌ）。

実際、増幅によって得られた１１イブリ・ソドに照射すると、それにより活性化 されたインターカレーターと相補鎖上の直ぐ近傍に位置するチミン（Ｔ）の間に 共有結合を作り出すことができる。

好適には、Ｚ基はオキシ−８−ソラレン族及びオキシ−５−ソラレン族から選択 される。

本発明の方法の好適な実施形態によれば、プライマーオリゴヌクレオチドの内の １つだけが光活性インターカレーターに接合される。

本発明による突然変異検出法は、そのハイブリッド形成過程が、１つまたは複数 個の光活性インターカレーター族が少なくともその一方に固定されている２つの プライマーオリゴヌクレオチドによって実施される、分析するＤＮＡ断片の遺伝 子増幅を最初に実行し、次いで、得られたハイブリッドを照射し、突然変異のな い、あるいは既知の突然変異を含む基準ＤＮＡ標本の同一条件での電気泳動と、 予め照射した前記ハイブリッドの変性勾配ゲル上の遅延電気泳動の結果を比較し て突然変異が起きていないかを検出することから成る。

変性勾配ケル上の遅延電気泳動は温度勾配、化学変性勾配、または経時的温度勾 配によって実施することが望ましい。

本発明のもう１つの目的は、オリゴヌクレオチドの（３′）末端がＤＮＡポリメ ラーゼのプライマーの役割を果たすＤＮＡ断片の遺伝子増幅に、その（５°）末 端に少な（とも１つの光活性化インターカレーターが固定されているオリゴヌク レオチドを応用することである。

本発明のさらにもう１つの目的は、少なくとも１つの光活性インターカレーター を使って光架橋によって安定化されたハイブリッドを、／Ｘイブリッド形成過程 が光活性インターカレーター族が少なくともその一方に固定されている２つのプ ライマーオリゴヌクレオチドによって実施される２重鎖ＤＮＡ断片の遺伝子増幅 法によってハイブリッドが調製される、変性勾配ゲル上の遅延電気泳動によって 突然変異を検出するのに応用することである。

上述の特徴の他に本発明は後述の、本発明の実現と実施の例の説明の途中で現れ るその他の特徴もあるが、これらの実施例はいかなる形でも特許請求の範囲を制 限するものではない。

■−プライマーの調製 次の例は嚢胞性線維症の遺伝子のエクソン１０の一部（ＣＦＴＲ）のＰＣＲによ る遺伝子増幅に関するものである。プライマーとして、下記配列の、それぞれ２ ０の塩基から成る２つのオリゴヌクレオチドを使用する・プライマー１　：　ｄ −（５’）ＧＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＧ　（３’） プライｖ−２：ｄ−（３°）ＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＡＣＧＧＴＴＧ　（５ ’） エクソン１０の研究された部分に対応するＤＮＡ断片の２本鎖の（３′）末端に 位置する短い配列の２つの相補プライマーは前記断片とハイブリッド形成される 。

オリゴヌクレオチドの３゛ＯＨ末端はＤＮＡポリメラーゼに対するプライマーの 役割を果たす、断片のそれぞれの鎖は相補鎖を合成する酵素に対するマトリクス の役割を果たす。

エクソン１０の研究された部分の配列は２つのプライマーオリゴヌクレオチドに よって囲まれたところを下記に示す。

ｄ−（５’ｌ　−Ｔ　ｒ　〒　ｍＴＡＡＡＡＴＴＡＡＧｃＡｃｄ−＋３’ｌ　Ｃ ＴＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＴＣＣＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＧＴＧＡＧＴＧ ＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴ　Ｃ Ａ　ＣＣＴ　Ｔ　ＣＴ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ａ　 Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｔ　ＣＡ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　ＣbＴ Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｇ　ＣＡ　ＣＣＡ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ 　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　ＣＴ　Ｔ　Ｔ　f　Ｇ　Ｔ ＡＡＴＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣ ＣＡＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＧＴＣＡ ＴＣＡＡＣＡ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＣＴ　Ａ　ＣＴ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ 　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　ＣＴ　Ｔ　Ｃニ一二二トと＝ＡＧＣＡＴＧＣＣＡ ＡＣ（３’１ ＋＋１＋：１１ｒ１″：！’−ｒ−，（（５＋）ＰＣＲ法でハイブリッド形成／ 延長／変性をｎ回反復した後形成されたハイブリッドを安定させるために、先行 技術ではプライマー１の（５゛）末端に接いだ４０塩基のＧＣクランプを使用す る。

このＧＣ末尾は例えば次の配列を持っ：ｄ（５′）ＧＣＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＧ ＧＣＣＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧ本発明はこのＧＣ末 尾をオキシ−５−ソラレン族で置換することを提案する。

それは下記の構造式をもつヘキサフォスフオシエステル族の介在によりプライマ ー１の５゛末端に結合する。

照射の際に、ソラレンとプライマー１のＡＡヌクレオチドの２つの相補ＴＴヌク レオチドの間の共有結合の形成を助けるために、前記プライマー１の（５′）の 最初のヌクレオチドＧを抹消した。

１１−ＰＣＲによる遺伝子増幅 下記の研究は一方では、プライマー１の上にソラレンが存在することによって増 幅過程が妨げられず、単一の断片が正確に合成されることを示し、他方では光架 橋の有効性を示すことを目的とする。

１）増幅 反応混合物・ 一ゲノムＤＮＡ　２５０　ｎ　ｇ −プライマー１　４００ｐモル ープライマー２　４００ｐモル ーｄＡＴＰ　０．　４ｍＭ −ｄＧＴＰ　０．４ｍＭ −ｄＣＴＰ　Ｏ，４ｍＭ −ｄＴＴＰ　、０．４ｍＭ −Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ９５０ｍＭ −ＫＣＩ　５０ｍＭ −（ＮＨｌ）−３Ｏ４１６ｍＭ ＭｇＣＩｙ　７ｍ −ＢＳＡ　０．２ｍｇ／ｍ１ −Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ　２．　５Ｏ−ＨｚＯＱＳＰ　４００μＩ 反応混合物はパラフィン油で覆われ、次いでプログラム式インキュベータ内に置 かれ、下記のサイクルに掛けられる。

９３℃で１分間 ６０℃で１分間 ７０℃で１０分間 次いで、パラフィン油が除去される。

２）照射 増幅物質１００μｌをガラス板に堆積させる。照射は標本の上方５ｍｍに置いた Ｖｉｌｂｅｒ　Ｌｏｕｒｍａｔ　ＶＬ−４ＬＣ（３６５ｎｍ）型の紫外線ランプ で１２分間行う。

３）増幅、照射物質の分析 ａ）非変性ポリアクリルアミドゲル上の分析非照射増幅物質１０μｌと照射増幅 物質１０μｍを分子量マーカー標本（ｐＢＲ３２２／Ｈａｅ　Ｉ　Ｉ　Ｊ）とも に８％ポリアクリルアミドゲルの上に置く。

図４は臭化エチジウムのゲルで処理した後の電気泳動の結果を示している一トラ ック１は分子量マーカー（ｐＢＲ３２２／Ｈａｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉ）に対応する。

−トラック２は非照射増幅物質に対応する。

−トラック３は照射増幅物質に対応する。

トラック２と３の部位に約１５０対の塩基から成る単一の帯が認められる。この 結果は増幅がソラレンの存在によって妨げられず、さらに照射された断片の劣化 が一切起こらなかったことを示している。

ｂ）変性条件でのポリアクリルアミドゲル上での分析分析はポリアクリルアミド ８％、尿素８Ｍ、５０℃の定温電気泳動のゲル上で実施した。

電気泳動の結果は図２に示したニ ートラック１は分子量マーカー（ｐＢＲ３２２／Ｈａｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉ）の堆積に 対応する。

一トラック２は照射し、堆積前に１００℃で５分間変性させた標本１０μｌの堆 積に対応する。

一トラック３は照射した、非変性標本１０μｌの堆積に対応する。

−トラック４は照射しないで、堆積前に１００℃で５分間変性させた標本１０μ ｍの堆積に対応する。

一トラック５は照射していない、非変性標本１０μｌの堆積に対応する。

照射した増幅物質は変性せず、ＤＮＡ断片の８０から９０％が非照射断片の分子 量の２倍の分子量を有することが判る：これは照射断片の（５゛）末端の架橋が 、完全変性の後に、完全に対になったＤＮＡ断片の大きさの２倍の１本鎖ＤＮＡ を明らかにすることができることを示している。

ｌｌｌ一本発明の方法による突然変異検出の実例１）３塩基対の欠失の分析 図３はハイブリッドを安定させるためにＧＣ末尾、またはソラレンを使用してＣ ＦＴＲ遺伝子（嚢胞性線維症）のエクソン１０についての正常なりＮＡ（Ｎｌ） と変異体（ΔＦ　５０８）の標本のＤＧＧＥ　（１０％から６０％の変性勾配） 比較分析の結果を示している。ソラレンを使用する場合、ソラレンはメチレンの ６個の集合（ＣＨ２）−から成る腕を介して核酸の５°末端に結びつけられ、こ の構造をＰｓｏ−ｍ６．　５°→３°と記す。

１０％から６０％の変性勾配は下記の組成の変性８０％母溶液から実現する。

３２％ホルムアミド、ＴＡＥ　ＩＸ　（ＴＡＥ　ＩＸ＝Ｔｒ　ｉ　ｓ　４０ｍＭ 、酢酸ナトリウム２０ｍＭ、ＥＤＴＡ　１ｍＭ、ｐＨ７，４）内の尿素５．６Ｍ ０アクリルアミド濃度は６．５％（アクリルアミド／ビスアクリアルアミド・３ ７．５／１）。

移動時間は３時間、かけた電圧は１６０ｖである。

−トラック１は変異体ＤＮＡ　ΔＦ　５０８を含む標本の堆積に対応する。ＧＣ クランプによるハイブリッドの安定化。

−トラック２．３．６．７．８は正常なりＮＡ　Ｎｌを含む標本の堆積に対応す る。ＧＣクランプによるハイブリッドの安定化。

−トラック４．５．９は同じ比率でＮ１とΔＦ　５０８の２種類を含む標本の堆 積に対応する。ＧＣクランプによるハイブリッドの安定化。

−トラック１０．１１．１２はそれぞれ同じ比率でＮｌとΔＦ　５０８の２種類 を含む標本の堆積に対応する。それぞれ１５．１０．５分間３６０ｎｍで照射し た後ワラ１／ンによるハイブリッドの安定化。

−トラック１３は同じ比率でＮ１とΔＦ　５０８の２種類を含む標本の堆積に対 応する。標本の照射なしでソラレンによるハイブリッドの安定化。

ソラレンで安定化したとき、ＧＣクランプによる従来技術の安定化条件を使用し て得られたのと同じような結果が得られることが判る。ホモ二重鎖とへテロ二重 鎖の分離性は優れており、２つの変異体がはっきりと判別できる（正常な対立遺 伝子と突然変異対立遺伝ＰΔＦ　５０８）。原点からの移動距離だけが異なる。

ＤＮＡ断片の８０から９０％が３６０ｎｍの照射作用を受けた後変化したことが 判る。

２）点突然変異の分析 図４はハイブリッドを安定させるためにソラレン（Ｐ　ｓ　ｏ−ｍ６．　５’− ３°）を使用してＣＦＴＲ遺伝子（嚢胞性繊維症）のエクソン１０についての正 常なりＮＡ（Ｎｌ）と変異体（ΔＦ　５０８及び１５０６Ｖ）の標本のＤＧＧＥ （１０％から６０％の変性勾配、勾配の組成は上述の３対の塩基の欠失の分析に 用いたものと同じ、１６０Ｖで３時間）分析の結果を示している。

変異体１５０６ＶはＣＦＴＲのエクソン１０内のヌクレオチド（ｎｔ　１６４８ Ａ−Ｇ）の置換に対応する。

この実験において、ＤＮＡは一方が光活性インターカレーターとしてソラレンを 含有する２つのプライマーを使用してＰＣＲによって増幅され、増幅後、時間を 変えて３６０ｎｍの紫外線を照射した。

−トラック１から４は同じ比率でＮｌとΔＦ５０８の２種類を含む標本の堆積に 対応する。それぞれ５０．４０．３０．２０分間３６０ｎｍで標本を照射した後 ソラレンによるハイブリッドの安定化。

−トラック５から９は同じ比率でＮ１と１５０６Ｖの２種類を含む標本の堆積に 対応する：それぞれ５０．４０．３０．２０分間３６０ｎｍで標本を照射した後 ソラレンによるハイブリッドの安定化。

ヒトのＤＮＡ標本内にヘテロ接合体の状態で存在するヌクレオチドの置換（ＣＦ ＴＲのエクソン１０内のｎｔ　１６４８　Ａ−４Ｇ）は異なる形で移動するホモ 二重鎖とへテロ二重鎖の存在するとき容易に検出できる。

３）変性勾配に垂直な電気泳動系内の比較分析図５はそれぞれ同じ比率でＮｌと ΔＦ　５０８の２種類を含み、一方が予めＧＣ尾部を有するプライマーの存在に よって増幅され、他方がソラレンに結合されたプライマーによって増幅された２ つの標本のＯから８０％の変性勾配に垂直な電気泳動系内の分析を示している。

図６において、ＡはＧＣ尾部の存在するとき増幅されたＤＮＡ標本の融合曲線を 示し、Ｂはソラレンに接合されたプライマーで増幅されたＤＮＡ標本の融合曲線 を示し、点線の曲線は非安定化ＤＮＡに対応している。

２つの標本の融合曲線は、重ね合わせることはできないが、同じような外観であ ることが判る。特に、ホモ二重鎖（Ｈ）についてもヘテロ二重鎖（ｈ）について も、配列の５０％が変性した変性剤（Ｔｍ）の百分率は非常に近い。

参考資料 １、　Ａｂｒａｍｓ　ＥＳ、　Ｍｕｒｄａｕｇｈ　ＳＥｒ　Ｌｅｒｍａｎ　ＬＳ ；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１９９０；　７　：　４６３−４７５゜２、　Ａｔｔｒｅ ｅ　Ｏ，Ｖｉｄａｕｄ　Ｄ、　Ｖｉｄａｕｄ　Ｍ、　Ａｍｓｅｌｅｍ　５ｒＬａ Ｖｅｒ９ｎｅ　Ｊ、　Ｇｏｏｓｓｅｎｓ　Ｍ；　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１９８９； 　４　：　２６６−２７２゜３゜Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ　Ｍ、Ｄｉｓｉｂｉｏ　 Ｇ、　Ｃｏｘ　ＤＲ，Ｍｙｅ：ｓＲＭ；　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １９９１；　１９（刀　：　１４７５−１４８０゜４、　Ｄｅｖｏｔｏ　Ｍ、　 Ｒｏｎｃｈｅｔｔｏ　Ｐ、　Ｆａｎｅｎ　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、；５、　Ｆｉｓｈ ｅｒ　ＳＧ、　Ｌｅｒｍａｎ　ＬＳ；　Ｃｅ１ｌ　１９７９；　１６　：６、　 Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＧ、　Ｌｅｒｍａｎ　ＬＳ；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ。

Ｓｃ工、　１９８３；　ｓｏ　：　１５７９゜１、　Ｇｏｏｓｓｅｎｓ　Ｍ、　 Ｆａｎｅｎ　Ｐ、　Ａｔｔｒｅｅ　Ｏ，Ｖｉｄａｕｄ　Ｍ；Ａｎｎ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ’ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、　１９９０；　６１２　：　７４−８０゜８、 　Ｋｏｇａｎ　ＳＣ，Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ　に　Ｂｌｏｏｄ　１９８８；７２　 ：９、　Ｋｏｇａｎ　ＳＣ，Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ　に　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　ＡｃａｄＳｃｉ、ＵＳＡ　１９９０；　８７（Ｍａｒｃｈｌ　：　２０９２− ２０９６゜ユＯ，Ｌｅｒｍａｎ　ＬＳ、Ｓｉユｖｅｒｓｔｅｉｎ　Ｋ、Ｉｎ　： 　Ｗｕ　Ｒ，ｅｄ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８７　：４Ｂ２−５０１．　ｖｏｌ、　１５５゜１ １、Ｍｙｅｒｓ　ＲＭ、Ｌｕｍｅｌｓｋｙ　Ｎ；　Ｌｅｒｍａｎ　Ｌ、Ｍａｎｉ ａｔｉｓＴＨＮａｔｕｒｅ　１９８５；　３１３　：　４９５−４９８゜１１　 Ｍｙｅｒｓ　ＲＭ、Ｆｚｓｈｅｒ　ＳＧｒ　Ｌｅｒｍａｎ　ＬＳｒ　Ｍａｎｌａ ｔ工ＳＴ；　Ｎｕｃｌ、Ａｃｊ、ｄｓ　Ｒｅｓ、１９８５；　１３　：　３１３ １−３ＮＳ。

１３、　Ｍｙｅｒｓ　ＲＭ、　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＧ、　Ｍａｎｉａｔ、ｉｓ　Ｔ 、　ＬｅｒｍａｎＬＳ；　Ｎｕｃｌ、入ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１９８５；　１３　 ：　３１１１１４、　Ｍｙｅｒｓ　ＲＭ、　５ｈｅｆｆｉｅｌｄ　ＶＣ，Ｃｏｘ 　ＤＲ，Ｉｎ　：Ｅｈｒｌｉｃｈ　ＨＡ、　ｅｄ、　ＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｄ ＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　５ｔｏｃｋｔｏｎＰ ｒｅｓｓ、　１９８９　＋　７１−８８゜１５、５ｃｈｅｆｆｉｅｌｄ　ＶＣ， Ｃｏｘ　ＤＲ，Ｌｅｒｍａｎ　ＬＳ、　ＭｙｅｒｓＲＭ；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　１９８９；　８６　：　２３２−２３ ６１６、Ｔｒａｙｓｔｍａｎ　ＭＤ、Ｈ工ｇｕｃｈｉ　Ｍ、Ｋａｓｏｅｒ　Ｃ。

Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ　ＳＥ、　Ｋａｚａｚｉａｎ　ＨＨ；　Ｇｅｎｏｒｎｉ ｃｓ　１９９０；　６　：　２９３−３０１゜１７、Ｖｉｄａｕｄ　Ｍ、ｒａｎ ｅｎ　Ｐ、Ｍａｒｔｉｎ　Ｊ、Ｇｈａｎｅｍ　Ｎ。

Ｎ１ｃｏｌａｓ　Ｓ、Ｇｏｏｓｓｅｎｓ　Ｍ；　）ｌｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、１９９ ０；　８５（４１：　４４６−１８、Ｗｅｂｅｒ　ＣＫ、５ｈａｆｆｅｒ　ＤＪ 、Ｓｉｄｍａｎ　ＣＬ；　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９り１１；　１９（１２１：　３３３１−３３３５゜Ｆ ｉｇ　、　１ Ｆ’ｉｇ、２ ：、パ１２ＨＨ？ｔ（７ｊ＋　４０　°０　°”　’　−１−３６０ｎｍての照 射時間（分）Ｆｉｑ、４ 変性剤濃度 国際調査報告　ＯｒＴ／ｃＤ　Ｏｔｌｏｎｎ２ｎフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃｔ、６　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　２７／４４ ７ ３３１５８　Ａ　７０５５−２Ｊ ７３６３−２Ｊ （７２）発明者　シャシニョール、マルセルフランス共和国、エフ−４５４００ セモワイ。

リュ　デ　グラビニエール、１５８ Ｉ ＧＯＩＮ　２７／２６　３１５　Ｚ （７２）発明者　エヌグウイエン、タンク、トウオングツランス共和国、エフ− ４５５１０ヴイエンヌーオンーヴアル、ルート　ドウ　ティギー、３１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）分析されたハイブリッドが光活性化された１個または複数個のインターカレ ーターを用いた光架橋によって安定化されていることを特徴とする、変性勾配２ 本鎖ＤＮＡの電気泳動によって突然変異を検出する方法。 ２）分析されたハイブリッドは少なくともその１つに１個または複数個の光活性 化インターカレーターが固定されている２個のプライマーオリゴヌクレオチドに よってハイブリッド形成段階が実施された、２本鎖ＤＮＡの断片の遺伝子増幅過 程によって得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３）１個または複数個の光活性インターカレーターが固定されたプライマーオリ ゴヌクレオチドから成る全体が次式に対応することを特徴とする請求項２に記載 の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）この化学式で： 基Ｂは同一でも、異なっていてもよく、それぞれ核酸の１つの基を表す。 Ｙは真っ直ぐな、または−ａｌｋ−分枝したアルコイレン基または次の基を表す ： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 基Ｅは同一でも、異なっていてもよく、それぞれオキソアニオンＯ−、チオアニ オンＳ−、アルコキシ族、または−Ｏ−ａｌｋ−Ｚ族を表す；ｍは１と５の間の 整数である。 Ｚはピリミジン基と光架橋を形成することのできる光活性インターカレーターに 対応する基である。 ｎは２と１５０の間の整数である。 ４）Ｚ基が、平坦な形状を有し、光活性二重結合、またはアジド−Ｎ３を有する 多環式化合物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５）Ｚ基が、８−メトキシソラレン、５−メトキシソラレン、４′ヒドロキシメ チル−４，５′８−トリメチルソラレン、３−カルベトキシソラレン、アンゲリ シン、ピリド（３，４−ｃ）ソラレン、ピリド（３，４−ｃ）８−メチルソラレ ンの誘導体の中から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６）Ｚ基がオキシ−８−ソラレン族またはオキシ−５−ソラレン族であることを 特徴とする請求項４に記載の方法。 ７）ｎが１０から３０の間に含まれる整数であることを特徴とする請求項２から ６のいずれか一つに記載の方法。 ８）式（Ｉ）において、プライマーオリゴヌクレオチドの（５′）末端に位置す る基Ｂがアデニンであることを特徴とする請求項２から７のいずれか一つに記載 の方法。 ９）式（Ｉ）内でプライマーオリゴヌクレオチドの（５′）末端に位置する連続 する基Ｂの少なくとも２つがアデニンであることを特徴とする請求項２から７の いずれか一つに記載の方法。 １０）プライマーオリゴヌクレオチドの内の１つだけが１個または複数個の光活 性インターカレーターに接合されることを特徴とする請求項２から９のいずれか に記載の方法。 １１）ハイブリッド形成過程が分析するＤＮＡ断片の１つまたは複数個の光活性 インターカレーター族が少なくともその一方に固定されている２つのプライマー オリゴヌクレオチドによって実施される遺伝子増幅を実行し、次いで、得られた ハイブリッドを照射し、突然変異のない、あるいは既知の突然変異を含む基準Ｄ ＮＡ標本の同一条件での電気泳動と予め照射した前記ハイブリッドの変性勾配ゲ ル上の遅延電気泳動の結果を比較して突然変異が起きていないかを検出すること を特徴とする、請求項１から１０のいずれか一つに記載の変性勾配２本鎖ＤＮＡ の電気泳動によって突然変異を検出する方法。 １２）変性勾配ゲル上の遅延電気泳動が温度勾配、化学変性剤勾配、または経時 的温度勾配によって実施されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 １３）少なくとも１つの光活性インターカレーターを使って光架橋によって安定 化されたハイブリッドの、ハイブリッド形成過程が１個または複数個の光活性イ ンターカレーター族が少なくともその一方に固定されている２つのプライマーオ リゴヌクレオチドによって実施される２本鎖ＤＮＡ断片の遺伝子増幅法によって ハイブリッドが調製される、変性勾配ゲル上の遅延電気泳動による突然変異検出 への応用。