JP7231680B2 - 核酸アッセイにおける改善された融解識別と多重化のためのプローブ - Google Patents

核酸アッセイにおける改善された融解識別と多重化のためのプローブ Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2014年8月11日に出願された米国仮特許出願第62/035,783号の恩典を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
配列表の組み込み
2015年8月11日に作成された、8KB(Microsoft Windows(登録商標)で測定)である、「LUMNP0129WO_ST25.txt」と名付けられたファイルに含まれる配列表は、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み入れられる。
1. 発明の分野
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、核酸の検出に関する。
2. 関連技術の説明
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、生体を使用せずにDNAを酵素的に複製するための分子生物学的技術である。PCRは、遺伝病の検出、遺伝子フィンガープリントの同定、感染症の診断、遺伝子のクローニング、実父確定検査、DNAコンピューティングなど、さまざまなタスクのために医学および生物学の研究室でよく使用されている。PCRは、その比類なき増幅と精度の能力のため、分子生物学者によって核酸検出のための最適な方法として受け入れられている。DNAの検出は、典型的には、PCR反応のエンドポイントまたはプラトー相(plateau phase)で実施され、これは出発テンプレートの定量を困難にする。リアルタイムPCRまたはキネティックPCRは、反応が進行するにつれてアンプリコン濃度を記録することにより、エンドポイントPCR解析の能力を向上させる。アンプリコン濃度は、ほとんどの場合、増幅された標的に関連する蛍光シグナルの変化を介して記録される。リアルタイムPCRはまた、閉鎖系で実施することができるため汚染が限定的であるという点で、エンドポイント検出と比べて有利である。その他の利点としては、より良好な感度、ダイナミックレンジ、速度、および必要なプロセスの減少が挙げられる。
リアルタイムPCR検出法では、いくつかのアッセイ化学が使用されている。これらのアッセイ化学には、二本鎖DNA結合性の色素、二重標識オリゴヌクレオチド、例えばヘアピンプライマー、およびヘアピンプローブの使用が含まれる。しかしながら、現在のリアルタイムPCRの欠点は、その限られた多重化(multiplexing)能力である。現在のリアルタイムPCR技術は、溶液中で遊離しているレポーター蛍光色素を使用する。この設計では、多重(multiplex)反応内の各アッセイにつきスペクトル的に異なる蛍光色素を使用する必要がある。例えば、4種の標的配列を検出するように設計された多重反応は、対照を含めずに、スペクトル識別によって4種の異なる浮遊性の蛍光色素を区別することができる装置を必要とする。こうした要件は、実用的な多重化能力を制限するだけでなく、このような装置が通常は複数の発光源、検出器およびフィルタを必要とするため、コストを増加させる。現在のリアルタイムPCR技術は、約1～6プレックス(plex)の多重化能力を有する。
本発明は、DNAの増幅および検出のためのシステムならびに方法に関する。特に、本発明の態様は、増幅された標的配列の検出に使用するための検出可能なプローブの多重化能力を大いに高めるシステムおよび方法を提供する。
第1の態様では、標的核酸の存在を検出するための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含んでなる：(a)サンプルを切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)標識を含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(d)該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに(e)標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階。特定の局面では、第1の配列領域の標識(i)は、レポーター-クエンチャー対であり、第1の配列領域上へのヘアピンプローブの伸長は、レポーターとクエンチャーの間の距離を変化させる；あるいは、レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドおよび第1の配列領域上へのヘアピンプローブの伸長は、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された相補的非天然ヌクレオチドの組み込みをもたらす。特定の局面では、第2の配列領域の逆相補体である配列(iii)の全部もしくは一部は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的であるか、または該配列(iii)のどこも、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的でない。いくつかの態様では、前記方法は、ヘアピンプローブに対して融解分析(melt analysis)を実施することをさらに含む。
一態様では、標的核酸の存在を検出するための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含んでなる：(a)サンプルを切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに(e)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階。特定の局面では、第2の配列領域の逆相補体である配列(iii)の一部は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的であり得る。いくつかの態様では、前記方法は、ヘアピンプローブに対して融解分析を実施することをさらに含む。
別の態様では、標的核酸の存在を検出するための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含んでなる：(a)サンプルを切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされたプローブを形成させる段階；(c)トランケートされたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(d)レポーターとクエンチャーの間の距離が増加するようにヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに(e)該レポーターからのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階。特定の態様では、レポーター-クエンチャー対の一方のメンバーは、切断可能なプローブの5'末端にある。いくつかの態様では、レポーター-クエンチャー対の一方のメンバーは、第1の配列領域の5'末端にあり、レポーター-クエンチャー対の他方のメンバーは、第1の配列領域の3'末端にある。特定の態様では、レポーターは蛍光色素である。特定の局面では、第2の配列領域の逆相補体である配列(iii)の全部もしくは一部は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的であるか、または該配列(iii)のどこも、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的でない。いくつかの態様では、前記方法は、ヘアピンプローブに対して融解分析を実施することをさらに含む。
特定の局面では、切断可能なプローブは、第2の配列領域と、第2の配列領域の逆相補体である配列との間に、(v)1個以上のヌクレオチドのループ配列をさらに含むことができる。いくつかの局面では、ループ配列は、4～20、6～15または10～15ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの局面では、ループ配列は、少なくとも3～5個連続したAヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、ループ配列は、1つ以上のポリメラーゼ伸長ブロッキング部分を含む。特定の局面では、ループ配列は、1つ以上のヌクレオチドと1つ以上の伸長ブロッキング部分との組み合わせを含み得る。ポリメラーゼ伸長ブロッキング部分は、ループ配列の一部または全部として使用され得る。伸長ブロッキング部分の例には、炭素スペーサーが含まれる。炭素スペーサーは、3～36個の炭素原子の長さであり得るスペーサーを含むことができる。内部オリゴヌクレオチド炭素スペーサーの一般的な例には、3、9および18個の炭素原子の長さのスペーサーが含まれる。炭素スペーサーは、切断可能なプローブが非特異的二本鎖PCR産物を形成するのを防止するために、使用することができる。炭素スペーサーはまた、ヘアピンプローブの融解温度(Tm)を調整するためにも使用することができる。他のポリメラーゼ伸長ブロッキング部分は、非天然のヌクレオチド、リボヌクレオチド、または他の任意の非ヌクレオチド化学部分(chemical moiety)を含み得る。
特定の局面では、第2の配列領域は、6～20ヌクレオチドの長さであり得る。特定の局面では、第2の配列領域の相補体は、6～20ヌクレオチドの長さであり得る。特定の局面では、第1の配列領域は、4～20ヌクレオチドの長さであり得る。標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列は、6～50、10～50または6～30ヌクレオチドの長さであり得る。特定の局面では、切断可能なプローブの1個以上のリボヌクレオチド塩基は、第2の配列領域の逆相補体(本明細書では第2の配列領域の相補体とも呼ばれる)である配列のちょうど3'側に位置し得る。特定の局面では、切断可能なプローブの1個以上のリボヌクレオチド塩基は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列の3'末端から少なくとも4塩基に位置し得る。上述したように、第2の配列領域の逆相補体である配列の全部もしくは一部は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的であるか、または該配列のどこも、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的でない。
特定の局面では、切断可能なプローブは、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含み得る。いくつかの局面では、切断可能なプローブは、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含み得る。
特定の局面では、切断可能なプローブは、非塩基対形成性の修飾を含むことができ、該修飾は、該リボ塩基(ribobase)の3'および/または5'側であって、さもなければ標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的である該プローブの配列内に配置され得る。こうした修飾は、標的配列と塩基対を形成しない天然もしくは非天然のヌクレオチドを含むか、または炭素スペーサーもしくは他の非ヌクレオチド化学部分を含むことができる。該リボヌクレオチドの上流もしくは下流に、しかし、さもなければ標的配列に相補的である該プローブの領域内に、非塩基対形成性の修飾を配置することにより、切断可能なプローブの特異性が改善され得る。非塩基対形成部分は、該リボヌクレオチドから2～20ヌクレオチド上流または下流に位置付けることができる。特定の態様では、非塩基対形成部分は、該リボヌクレオチドの1、2、3、4もしくは5(またはその中の任意の範囲)ヌクレオチド上流または下流に置かれる。
特定の局面では、レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドは、切断可能なプローブの5'末端に位置付けることができる。特定の局面では、切断可能なプローブは、その3'末端に伸長ブロッキング修飾を含み得る。特定の局面では、切断可能なプローブの第2の配列領域は、少なくとも50％のG/C含量を含み得る。特定の局面では、切断可能なプローブの第2の配列領域は、6～15ヌクレオチドの長さであり得る。
特定の局面では、切断可能なプローブの第2の配列領域は、1個以上の非天然塩基を含み得る。特定の局面では、エンドリボヌクレアーゼまたは5'-ヌクレアーゼ切断の後、トランケートされた切断可能プローブと標的核酸は、55℃未満の融解点を有し得る。
特定の局面では、レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーは、レポーターであり得る。特定の局面では、本実施態様で使用するためのレポーターは、フルオロフォアであり得る。したがって、ある場合には、シグナルの変化は、蛍光シグナルの減少であってよい。特定の局面では、標識からのシグナルの変化を検出することは、サンプルの温度を変化させたときのレポーターからのシグナルの変化(または変化率)、例えばシグナルの非消光(unquenching)、を検出することを含み得る。いくつかの局面では、レポーターからのシグナルの変化を検出することは、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げた(または該融解点より低く下げた)ときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含み得る。
特定の局面では、切断可能なプローブを固相支持体に結合させることができる。
前記態様の特定の局面は、少なくとも1個の非天然ヌクレオチド(iv)の使用に関する。いくつかの局面では、非天然ヌクレオチドは、イソ塩基、例えばイソグアニン(isoG)またはイソシトシン(isoC)である。特定の局面では、少なくとも1個の非天然ヌクレオチドまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドはisoGであってよく、他方はisoCであってよい。
さらなる局面において、前記方法は、以下の段階を含むことができる：(a)該サンプルを第2の(またはさらなる)切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の(またはさらなる)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下でヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに(e)切断可能なプローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第2の(またはさらなる)標的核酸を検出する段階。例えば、第1および/または第2の標的核酸の存在を検出することは、連続してまたは本質的に同時に実施することができる。なおさらなる局面では、第1および第2のプローブは、識別可能なレポーターを含み得る。別の局面では、第1および第2のプローブは同じレポーターを含んでもよく、場合によっては、第1および第2のプローブは、識別可能な融解点(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30℃だけ互いに異なる融解点、またはその中から引き出される任意の範囲)を有するヘアピンを含む。
なおもさらなる局面において、前記方法はマルチプレックス(多重化)方法であり、以下の段階を含んでなる：(a)該サンプルを第3、第4、第5または第6の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下でヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに(e)切断可能なプローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階。例えば、第1および/または第2の標的核酸の存在を検出することは、連続してまたは本質的に同時に実施することができる。なおさらなる局面では、第1および第2のプローブは、識別可能なレポーターを含み得る。別の局面では、第1および第2のプローブは同じレポーターを含んでもよく、場合によっては、第1および第2のプローブにより形成されたヘアピンプローブは、識別可能な融解点(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30℃だけ互いに異なる融解点、またはその中から引き出される任意の範囲)を有し得る。一局面では、第1、第2、第3、第4、第5および/または第6のプローブにより形成されたヘアピンプローブは、それぞれ、識別可能な標識または識別可能な融解点をもつことができる。
別の態様では、前記方法は、以下の段階を含むことができる：(a)該サンプルを第2の(またはさらなる)切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対を含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の(またはさらなる)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(d)ヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに(e)レポーターからのシグナルの変化を検出することによって第2の(またはさらなる)標的核酸を検出する段階。例えば、第1および/または第2の標的核酸の存在を検出することは、連続してまたは本質的に同時に実施することができる。なおさらなる局面では、第1および第2のプローブは、識別可能なレポーターを含み得る。別の局面では、第1および第2のプローブは同じレポーターを含んでもよく、場合によっては、第1および第2のプローブは、識別可能な融解点(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30℃だけ互いに異なる融解点、またはその中から引き出される任意の範囲)を有するヘアピンを含む。
なおもさらなる局面において、前記方法はマルチプレックス(多重化)方法であり、以下の段階を含んでなる：(a)該サンプルを第3、第4、第5または第6の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下でヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに(e)切断可能なプローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階。例えば、第1および/または第2の標的核酸の存在を検出することは、連続してまたは本質的に同時に実施することができる。なおさらなる局面では、第1および第2のプローブは、識別可能なレポーターを含み得る。別の局面では、第1および第2のプローブは同じレポーターを含んでもよく、場合によっては、第1および第2のプローブにより形成されたヘアピンプローブは、識別可能な融解点(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30℃だけ互いに異なる融解点、またはその中から引き出される任意の範囲)を有し得る。一局面では、第1、第2、第3、第4、第5および/または第6のプローブにより形成されたヘアピンプローブは、それぞれ、識別可能な標識または識別可能な融解点をもつことができる。
したがって、いくつかのさらなる局面では、前記態様によるマルチプレックス方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36もしくはそれ以上の異なるプローブ、またはその中から引き出される任意の範囲の異なるプローブ、の使用を含むことができ、その際、各異なるプローブからのシグナルを個別に識別することができるように、各プローブは、(1)識別可能な融解点または(2)識別可能な標識のいずれかを有する。一局面では、第1、第2、第3、第4、第5および/または第6の切断可能プローブは、それぞれ、同じ第1の配列領域、第2の配列領域および/または第2の配列領域と第2の配列領域の逆相補体である配列との間の同じループ配列を含むことができる。特定の態様では、ループ領域は1つ以上のポリメラーゼ伸長ブロッキング部分を含み得る。
さらなる態様では、少なくとも第1の切断可能なプローブを含む組成物が提供され、該プローブは、5'から3'の方向に、(i)標識を含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む。特定の局面では、該組成物は、レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含み得る。特定の態様では、第1の配列領域の標識(i)は、レポーター-クエンチャー対であるか、またはレポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドである。
一態様では、少なくとも第1の切断可能なプローブを含む組成物が提供され、該プローブは、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む。特定の局面では、該組成物は、レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含み得る。
一態様では、切断可能なプローブを含む組成物が提供され、該プローブは、5'から3'の方向に、(i)フルオロフォア-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む。
特定の局面では、前記組成物は、ポリメラーゼ、エンドリボヌクレアーゼ酵素、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドをさらに含み得る。
特定の局面では、前記切断可能なプローブは、(v)第2の配列領域と第2の配列領域の逆相補体である配列との間の1個以上のヌクレオチドのループ配列をさらに含み得る。いくつかの局面では、ループ配列は、4～20、6～15または10～15ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの局面では、ループ配列は、少なくとも3～5個連続したAヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、ループ配列は、1つ以上のポリメラーゼ伸長ブロッキング部分を含む。特定の局面では、ループ配列は、1つ以上のヌクレオチドと1つ以上の伸長ブロッキング部分との組み合わせを含むことができる。ポリメラーゼ伸長ブロッキング部分は、ループ配列の一部または全部として使用され得る。伸長ブロッキング部分の例としては、炭素スペーサーが挙げられる。炭素スペーサーは、3～36個の炭素原子の長さであり得るスペーサーを含むことができる。内部オリゴヌクレオチド炭素スペーサーの一般的な例には、3、9および18個の炭素原子の長さのスペーサーが含まれる。炭素スペーサーは、切断可能なプローブが非特異的二本鎖PCR産物を形成するのを防止するために、使用することができる。炭素スペーサーはまた、ヘアピンプローブの融解温度(Tm)を調整するためにも使用することができる。他のポリメラーゼ伸長ブロッキング部分は、非天然のヌクレオチド、リボヌクレオチド、または他の非ヌクレオチド化学部分を含み得る。
さらなる局面では、前記組成物は、上記のような第2の(またはさらなる)切断可能なプローブをさらに含むことができ、その場合に、異なるプローブは、異なるレポーターおよび/または異なる融解点を有することに基づいて、識別可能であり得る。例えば、第2の(またはさらなる)プローブは、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の(またはさらなる)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み得る。特定の局面では、第1および第2のプローブは、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンを形成することができる。特定の局面では、切断可能なプローブは、上述したような(v)ループ配列をさらに含み得る。いくつかの局面では、前記組成物は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36もしくはそれ以上のプローブを含む。
いくつかの局面では、前記態様の方法は、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施することをさらに含み得る。いくつかの局面では、標識からのシグナルの変化を検出することは、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前、実施している間、または実施した後に、該シグナルを検出することを含む。別の局面では、標識からのシグナルの変化を検出することは、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む。この局面では、前記方法は、検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含み得る。
いくつかの局面では、前記態様の方法は、サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含み得る。例えば、サンプル中の標的核酸の量を定量化することは、標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含み得る。
さらなる態様では、本明細書に開示された組成物の1つ以上を含むキットが提供される。例えば、一態様では、該キットは、(a)第1の切断可能なプローブであって、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含む、該プローブと、(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素と、を含んでなる。さらなる局面では、該キットは、少なくとも2、3、4、5または6つのプローブを含む。いくつかの態様では、該プローブは、上述したような(v)ループ配列をさらに含み得る。特定の局面では、該プローブは、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンを形成し得る。いくつかの局面では、該キットは、ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、またはキットの使用説明書をさらに含むことができる。
なおもさらなる態様では、標的核酸の存在を検出するための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含んでなる：(a)サンプルを第1のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、標的核酸を検出する段階。
さらなる局面では、前記方法は、以下の段階を含み得る：(a)該サンプルを第2のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって第2の標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、クエンチャー標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第2の標的核酸を検出する段階。
特定の局面では、切断可能なプローブは、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含み得る。いくつかの局面では、切断可能なプローブは、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含み得る。
なおもさらなる局面において、前記方法はマルチプレックス方法であり、以下の段階を含んでなる：(a)該サンプルを第3、第4、第5または第6のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって第3、第4、第5または第6の標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、クエンチャー標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階。例えば、第1および/または第2の標的核酸の存在を検出することは、連続してまたは本質的に同時に実施することができる。なおさらなる局面では、第1および第2のセットのプローブは、識別可能なレポーターを含み得る。別の局面では、第1および第2のセットのプローブは同じレポーターを含んでもよく、場合によっては、第1および第2のプローブにより形成されたヘアピンプローブは、識別可能な融解点(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30℃だけ互いに異なる融解点、またはその中から引き出される任意の範囲)を有し得る。一局面では、第1、第2、第3、第4、第5および/または第6のセットのプローブにより形成されたヘアピンプローブは、それぞれ、識別可能な標識または識別可能な融解点を有し得る。したがって、いくつかのさらなる局面では、前記態様によるマルチプレックス方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36もしくはそれ以上の異なるセットのプローブの使用を含むことができ、その際、各異なるプローブからのシグナルを個別に識別することができるように、各プローブは、(1)識別可能な融解点または(2)識別可能な標識のいずれかを有する。
特定の局面では、切断可能なプローブの第2の配列領域は、1個以上の非天然塩基を含み得る。特定の局面では、エンドリボヌクレアーゼ切断の後、トランケートされた切断可能プローブと標的核酸は、55℃未満の融解点を有し得る。
特定の局面では、レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーは、レポーター、例えばフルオロフォアなど、であり得る。いくつかの局面では、シグナルの変化は、蛍光シグナルの減少であってよい。
特定の局面では、標識からのシグナルの変化を検出することは、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含むことができる。いくつかの局面では、レポーターからのシグナルの変化を検出することは、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含み得る。
特定の局面では、切断可能なプローブおよび/または捕捉プローブを固相支持体に結合させることができる。
さらなる態様では、第1のセットのプローブを含む組成物が提供され、該プローブのセットは切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む。特定の局面では、該組成物は、レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含み得る。特定の局面では、該組成物は、ポリメラーゼ、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドを含むことができる。
さらなる局面では、前記組成物は第2のセットのプローブをさらに含むことができ、該プローブのセットは切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む。特定の局面では、第1および第2のセットのプローブは、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンを形成することができる。いくつかの局面では、前記組成物は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36またはそれ以上のセットのプローブを含む。
さらなる態様では、キットが提供され、該キットは、(a)切断可能なプローブと捕捉プローブとを含む第1のセットのプローブであって、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、第1のセットのプローブと、(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素と、を含んでなる。さらなる局面では、該キットは少なくとも4セットのプローブを含む。特定の局面では、該セットのプローブは、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンを形成することができる。いくつかの局面では、該キットは、ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプル、またはキットの使用説明書をさらに含み得る。
さらに別の態様では、標的核酸の存在を検出するための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含んでなる：(a)サンプルを第1のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(f)切断可能なプローブの5'末端で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階。
さらなる局面では、前記方法は、以下の段階を含み得る：(a)該サンプルを第2のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(f)切断可能なプローブの5'末端で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって第2の標的核酸を検出する段階。
特定の局面では、切断可能なプローブは、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含み得る。いくつかの局面では、切断可能なプローブは、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含み得る。
さらに別の局面では、前記方法はマルチプレックス方法であり、以下の段階を含んでなる：(a)該サンプルを第3、第4、第5または第6のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットは切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(f)切断可能なプローブの5'末端で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階。例えば、第1、第2および/またはさらなる標的核酸の存在の検出は、連続してまたは本質的に同時に実施することができる。なおも別の局面では、第1、第2および/またはさらなるセットのプローブは、識別可能なレポーターを含み得る。別の局面では、第1、第2および/またはさらなるセットのプローブは、同じレポーターを含んでもよく、場合によっては、第1および第2のプローブによって形成されたヘアピンプローブは識別可能な融解点(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30℃だけ互いに異なる融解点、またはその中から引き出される任意の範囲)を有し得る。一局面では、第1、第2、第3、第4、第5および/または第6のセットのプローブにより形成されたヘアピンプローブは、それぞれ、識別可能な標識または識別可能な融解点を有し得る。したがって、いくつかのさらなる局面では、前記態様によるマルチプレックス方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36またはそれ以上の異なるセットのプローブの使用を含むことができ、その際、各異なるプローブからのシグナルを個別に識別することができるように、各プローブは、(1)識別可能な融解点または(2)識別可能な標識のいずれかを有する。
特定の局面では、切断可能プローブの第2の配列領域は、1個以上の非天然塩基を含み得る。特定の局面では、エンドリボヌクレアーゼ切断の後、トランケートされた切断可能プローブと標的核酸は、55℃未満の融解点を有し得る。
特定の局面では、レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーは、レポーター、例えばフルオロフォアなど、であり得る。いくつかの局面では、シグナルの変化は、蛍光シグナルの減少であってよい。
特定の局面では、標識からのシグナルの変化を検出することは、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含み得る。いくつかの局面では、レポーターからのシグナルの変化を検出することは、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含み得る。
特定の局面では、切断可能プローブおよび/または捕捉プローブを固相支持体に結合させることができる。
さらなる態様では、第1のセットのプローブを含む組成物が提供され、該プローブのセットは切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む。特定の局面では、該組成物は、レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含み得る。特定の局面では、該組成物は、ポリメラーゼ、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドを含み得る。
さらなる局面では、前記組成物は、第2のセットのプローブをさらに含むことができ、該プローブのセットは切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む。特定の局面では、第1および第2のセットのプローブは、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンを形成することができる。いくつかの局面では、該組成物は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36またはそれ以上のセットのプローブを含む。
さらなる態様では、キットが提供され、該キットは、(a)切断可能なプローブと捕捉プローブとを含む第1のセットのプローブであって、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、第1のセットのプローブと、(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素と、を含んでなる。さらなる局面では、該キットは少なくとも4セットのプローブを含む。特定の局面では、該セットのプローブは、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンを形成することができる。いくつかの局面では、該キットは、ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプル、またはキットの使用説明書をさらに含み得る。
別の態様では、標的核酸の存在を検出するための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含んでなる：(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列；を含む、段階；(b)切断可能なプローブおよび上流プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；(c)ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより、切断可能なヘアピンプローブに接触するまで該核酸配列を伸長させ、それにより標的核酸とハイブリダイズしている該プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(d)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；(e)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに(f)該ヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階。特定の局面では、第2の配列領域の逆相補体である配列(iii)の一部分は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的であり得る。特定の態様では、該方法は、ヘアピンプローブに対して融解分析を実施することをさらに含み得る。
別の態様では、標的核酸の存在を検出するための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含んでなる：(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列；を含む、段階；(b)切断可能なプローブおよび上流プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；(c)ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより、切断可能なヘアピンプローブに接触するまで該核酸配列を伸長させ、それにより標的核酸とハイブリダイズしている該プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；(d)トランケートされたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、切断されたヘアピンプローブを形成させる段階；(e)フルオロフォアとクエンチャーが物理的に分離されるように、切断されたヘアピンプローブをそれ自体に伸長させる段階；(f)伸長されたヘアピンプローブからのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階。
前記態様の特定の局面は、少なくとも1個の非天然ヌクレオチドの使用に関する。いくつかの局面では、非天然ヌクレオチドは、イソ塩基、例えばイソグアニン(isoG)またはイソシトシン(isoC)である。この局面において、クエンチャー標識された非天然ヌクレオチドは、同族(cognate)のisoC(またはisoG)である。さらに別の局面では、第1および/または第2のプライマーの少なくとも1つは、標的特異的配列中に少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの局面では、標的特異的配列中の非天然ヌクレオチドは、配列特異的アニーリングを調節し、それによってヌクレオチドの配列特異的増幅のためのプライマー-テンプレートハイブリダイゼーションを高める(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開WO/2011/050278を参照されたい)。
本明細書に開示された切断可能なプローブの切断および伸長は、等温条件下で実施することができ、該条件下で、切断可能なプローブは、反応条件が実質的に一定の温度に維持されている間に切断され伸長される。切断されたプローブの両断片は、切断前のプローブ-標的よりも低い融解温度を有するので、シグナルの等温増幅が達成され得る。これは、2つの断片を標的から解離させ、別のプローブがハイブリダイズして切断されることを可能にする。このプロセスは繰り返され、複数のプローブが一定の温度で単一の標的から切断されて伸長することを可能にする。この特徴は、融解分析による閉管多重検出に関連する他の方法(独自の融解シグネチャーを得るために5'-ヌクレアーゼ活性に依存し、標的またはアンプリコンのシグナルを等温的に増幅することができない)と比較して、ユニークである。あるいは、本明細書に開示された切断可能なプローブの切断および伸長は、PCRのサイクリング温度条件下などの、非等温条件下で実施することができる。
いくつかの局面では、前記態様の方法は、標的配列を増幅するための増幅ステップを実施することをさらに含み得る。切断可能なプローブの切断および伸長は、増幅プロセスの間またはその後に行うことができる。例えば、増幅は、等温増幅または1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルであり得る。等温増幅技術としては、例えば、鎖置換増幅(SDA)、ループ介在増幅(LAMP)、ローリングサークル増幅(RCA)、およびヘリカーゼ依存増幅(HAD)が挙げられる(例えば、Yan et al., 2014参照)。いくつかの局面では、標識からのシグナルの変化を検出することは、等温増幅または複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前、実施している間、または実施した後に、該シグナルを検出することを含む。別の局面では、標識からのシグナルの変化を検出することは、等温増幅または複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む。この局面では、前記方法は、検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含み得る。
いくつかの局面では、前記態様の方法は、サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含み得る。例えば、サンプル中の標的核酸の量を定量化することは、デジタルPCRを使用すること；標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含み得る。
本方法のさまざまな局面では、レポーターからのシグナルの変化を検出することは、サンプルの温度を変化させたときの、シグナルの非消光などの、該シグナルの変化(または変化率)を検出することを含むことができる。一局面では、サンプルの温度は、サンプル中のプライマーの1つ以上のヘアピンの融解点より高く上げる(またはより低く下げる)ことができる。2つ以上のプライマーセットが存在する場合、サンプルの温度を変化させることは、第1および第2のセットのプライマー中の第1のプライマーの両方のヘアピンの融解点よりも低い温度から、両方のヘアピンの融解点よりも高い温度に、サンプルの温度を上げることを含み得る。
さまざまな局面では、前記態様のプローブは、同じレポーターを含み、かつ識別可能な融解点(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30℃だけ互いに異なる融解点、またはその中から引き出される任意の範囲)を有するヘアピンを含むことができる。
別のさまざまな局面では、前記態様によるマルチプレックス方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36もしくはそれ以上の異なるプローブセットの使用を含むことができ、ここで、各プローブまたはプローブセットは、各異なるプローブまたはプローブセットからのシグナルを個別に識別することができるように、(1)識別可能な融解点を有するヘアピンまたは(2)識別可能なレポーターのいずれかを含む。
さらなる態様では、前記態様の1つ以上のプローブまたはプローブセットを含むキットが提供される。さらなる局面では、該キットは、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、エンドリボヌクレアーゼ(例えば、RNase H)、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、遊離の非天然ヌクレオチド、参照サンプル、および/またはキットの使用説明書をさらに含む。
本明細書で使用する場合、固相支持体は、磁気特性を有するビーズおよび/または溶液中で2次元表面上に静止することを可能にする密度を有するビーズであり得る。該粒子は、磁気的、重力的もしくはイオン的な力によって、または化学的結合によって、または当業者に知られた他の手段によって、2次元表面上に何らかの形で静止することができる。粒子は、ガラス、ポリスチレン、ラテックス、金属、量子ドット、ポリマー、シリカ、金属酸化物、セラミック、または核酸に結合するのに適した他の物質、または核酸に結合することができる化学物質もしくはタンパク質からなり得る。粒子は、棒状、球状または円板状であってよく、他の任意の形状を含んでもよい。粒子はまた、その形状もしくはサイズ、または物理的位置によって識別可能であり得る。粒子は、染料を含む組成物を有することによって、あるいは1種以上の染料もしくは蛍光色素の比または濃度によって、スペクトル的に異なっていてよく、また、粒子コード化のバーコードもしくはホログラフィック画像または他のインプリント形態によって識別可能であり得る。粒子が磁性粒子である場合は、磁場の印加によって該粒子をチャンバの表面に引き寄せることができる。同様に、磁場の除去によって磁性粒子をチャンバの表面から分散させることができる。磁性粒子は、好ましくは常磁性または超常磁性である。常磁性および超常磁性粒子は、磁場が存在しない場合には無視できる程度の磁気しかないが、磁場が印加されると、粒子内の磁区の整列化が誘導され、その結果、粒子が磁場源に引き付けられる。磁場が除去されると、磁区はランダムな配向に戻り、そのため粒子間の磁力または磁力の反発が存在しない。超常磁性の場合、磁区のランダムな配向へのこの戻りは、ほぼ瞬間的であるが、常磁性材料は、磁場の除去後ある期間にわたって磁区の整列を保持すると考えられる。粒子が十分な密度を有する場合、粒子は、重力によってチャンバの底面に引き付けられ、そしてチャンバの撹拌によって、例えば、ボルテックス、超音波処理、または流体移動などによって、チャンバの底面から分散され得る。さらに、磁力、イオン力、吸引力、真空濾過、親和性、親水性もしくは疎水性、またはそれらの任意の組み合わせなどの、他の力によって粒子がチャンバの表面に引き付けられる方法およびシステムでは、粒子の分散をさらに補助するために、チャンバの撹拌を使用することもできる。
レポーターまたは標識剤は、それが結合している分子(例えば、核酸配列)の検出を容易にする分子である。核酸を標識するために使用され得る多数のレポーター分子が知られている。直接的なレポーター分子には、フルオロフォア、クロモフォア、およびラジオフォア(radiophore)が含まれる。フルオロフォアの非限定的な例としては、赤色蛍光スクアリン(squarine)色素、例えば2,4-ビス[1,3,3-トリメチル-2-インドリニリデンメチル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、赤外色素、例えば2,4-ビス[3,3-ジメチル-2-(1H-ベンズ[e]インドリニリデンメチル)]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、またはオレンジ色蛍光スクアリン色素、例えば2,4-ビス[3,5-ジメチル-2-ピロリル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレートが挙げられる。フルオロフォアのさらなる非限定的な例としては、以下が挙げられる：量子ドット、Alexa Fluor(商標)色素、AMCA、BODIPY(商標)630/650、BODIPY(商標)650/665、BODIPY(商標)-FL、BODIPY(商標)-R6G、BODIPY(商標)-TMR、BODIPY(商標)-TRX、Cascade Blue(商標)、CyDye(商標)、例えば、限定するものではないが、Cy2(商標)、Cy3(商標)、Cy5(商標)など、DNAインターカレート色素、6-FAM(商標)、フルオレセイン、HEX(商標)、6-JOE、Oregon Green(商標)488、Oregon Green(商標)500、Oregon Green(商標)514、Pacific Blue(商標)、REG、フィコビリタンパク質、例えば、限定するものではないが、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、Rhodamine Green(商標)、Rhodamine Red(商標)、ROX(商標)、TAMRA(商標)、TET(商標)、テトラメチルローダミン、またはTexas Red(商標)。蛍光シグナルを増強するために、チラミド(PerkinElmer社)などのシグナル増幅試薬を使用することができる。間接的なレポーター分子にはビオチンが含まれ、ビオチンは、検出のためにストレプトアビジン-フィコエリトリンなどの別の分子に結合される必要がある。蛍光共鳴エネルギー転移対または色素-クエンチャー対などの標識の対を用いることもできる。
標識された増幅産物は、直接的または間接的に標識化することができる。直接的な標識化は、例えば、標識されたプライマーを用いるか、標識されたdNTPを用いるか、標識された核酸インターカレート剤を用いるか、または上記の組み合わせによって、達成することができる。間接的な標識化は、例えば、標識されたプローブを増幅産物にハイブリダイズすることによって、達成することができる。
本明細書に開示される方法は、サンプル中の核酸標的(複数可)の初期量を定量化することをさらに含み得る。定量化は、例えば、対数スケールでサイクル数に対して蛍光をプロットすることによって、リアルタイムPCRの対数期の間に存在するDNAの相対濃度を決定することを含むことができる。次に、その結果を、既知量のDNAの連続希釈物のリアルタイムPCRによって作成された標準曲線と比較することにより、DNAの量を決定することができる。さらに、リアルタイムPCRを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせて、微量にしか存在しない(low abundance)RNAを含めて、サンプル中のRNAを定量化することができる。あるいは、定量化は、デジタルPCRによって行うことができる。
標的核酸配列は、関心対象の任意の配列であり得る。標的核酸配列を含むサンプルは、核酸を含有するどのようなサンプルであってもよい。本発明の特定の局面では、サンプルは、例えば、1つ以上の遺伝子変異または多型の有無についてスクリーニングされる対象者である。本発明の別の局面では、サンプルは、病原体の有無について試験される対象者からのものであり得る。サンプルが対象者から得られる場合、それは、吸引、生検、綿棒での採取(swabbing)、静脈穿刺、脊椎穿刺、糞便サンプルまたは尿サンプルなど、当業者に公知の方法によって得ることができる。本発明のいくつかの局面では、サンプルは、水、土壌または大気サンプルのような環境サンプルである。本発明の他の局面では、サンプルは植物、細菌、ウイルス、真菌、原生動物または後生動物に由来するものである。
各増幅サイクルは、変性段階、プライマーアニーリング段階、およびプライマー伸長段階の3段階を有する。増幅サイクルは、所望量の増幅産物が生成されるまで繰り返すことができる。典型的には、増幅サイクルは約10～40回繰り返される。リアルタイムPCRの場合、増幅産物の検出は、典型的には、各増幅サイクルの後に行われる。本発明の特定の局面では、増幅産物の検出は、第2、第3、第4または第5増幅サイクル後ごとに行うことができる。また、わずか2回またはそれ以上の増幅サイクルが分析または検出されるように検出を行ってもよい。増幅サイクルは、増幅の検出が行われるのと同じチャンバ内で行うことができ、その場合、このチャンバは、チャンバ内の温度を、増幅サイクルの変性段階、プライマーアニーリング段階、およびプライマー伸長段階のために調整することができるように、加熱素子を含む必要がある。加熱素子は、典型的には、プロセッサの制御下にある。しかし、増幅の検出が行われるチャンバとは異なるチャンバ内で増幅サイクルを実施することもでき、その場合、「増幅」チャンバは加熱素子を備える必要があるが、「検出」または「撮像」チャンバは加熱素子を備える必要はない。増幅と検出が別々のチャンバで行われる場合、増幅反応が起こる流体は、例えばポンプまたはピストンによって、チャンバ間を移送され得る。ポンプまたはピストンは、プロセッサの制御下にあってよい。あるいは、該流体は、例えばピペットを使用して、手動でチャンバ間を移送され得る。
増幅は、非天然ヌクレオチドを有する少なくとも1つの非天然ヌクレオチドを含む反応混合物中で行うことができる。反応混合物の少なくとも1つの非天然ヌクレオチドは、第1および/または第2のプライマーセットのプライマー中に存在する少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対を形成し得る。任意に、非天然ヌクレオチドは標識に結合されてもよく、該標識はフルオロフォアおよびクエンチャーを含み得る。クエンチャーは、第1および/または第2のプライマーセットのプライマー中に存在するフルオロフォアを消光させることができる。
検出は、集団の1つ以上のポリヌクレオチドの増幅を含むことができる。例えば、検出は、少なくとも1つの非天然ヌクレオチドの存在下で集団の1つ以上のポリヌクレオチドを増幅することを含み得る。その非天然ヌクレオチドは、任意に、オリゴヌクレオチドの混合物の非天然ヌクレオチド(例えば、縮重オリゴヌクレオチド中に存在する非天然ヌクレオチド)と塩基対を形成することができる、非天然ヌクレオチド(例えば、isoCおよびisoG)を有し得る。この非天然ヌクレオチドは標識に結合されてもよい。適切な標識には、フルオロフォアおよびクエンチャーが含まれる。
前記方法は、増幅中に連続してまたはリアルタイムで標的を検出するために使用することができる。前記方法は定量的に使用され得る。
前記態様の特定の局面は、プローブがDNA標的配列にハイブリダイズした場合にリボヌクレオチド(RNA)位置を有するプローブを特異的に切断するエンドリボヌクレアーゼ酵素、ならびに該プローブを特異的に切断するためのこのような酵素の使用に関する。いくつかの局面では、エンドリボヌクレアーゼはRNAse H、例えばRNase HIIである。いくつかの特定の局面では、エンドリボヌクレアーゼは、熱安定性酵素または好熱性ホットスタート酵素(例えば、熱安定性RNase HII酵素および好熱性ホットスタートRNase HII酵素)である。
増幅は、1つ以上の非天然ヌクレオチドの存在下で、および/または非天然ヌクレオチドに結合された少なくとも1つのクエンチャーの存在下で行うことができる。いくつかの態様では、少なくとも1つのクエンチャーに結合された非天然ヌクレオチドは、isoCTPまたはisoGTPであり得る。
いくつかの方法では、第1および第2の標識は異なっていてよい。いくつかの方法では、第1および第2のクエンチャーは異なっていてよく、2つの異なるフルオロフォアを消光させることができる。他の方法では、第1および第2のクエンチャーは同じであってよく、2つの異なるフルオロフォアを消光させることができる。
本明細書に記載される方法は、アンプリコン(例えば、HIVの増幅核酸と対照の増幅核酸の少なくとも一方の増幅核酸)の融解温度を決定することを含み得る。該方法は、標的核酸(増幅された標的核酸を含み得る)にハイブリダイズされた標識プローブを含む核酸複合体の融解温度を決定することを含み得る。融解温度は、アンプリコンまたは核酸複合体を温度勾配にさらし、標識からのシグナルを観察することによって決定することができる。任意に、融解温度は、(a)温度の勾配でアンプリコンをインターカレート剤と反応させ、(b)インターカレート剤からの検出可能なシグナルを観察することによって決定することができる。核酸複合体の融解温度は、(1)プローブを標的核酸にハイブリダイズさせて核酸複合体を形成させること、その際、プローブと標的核酸の少なくとも一方は標識を含む；(2)核酸複合体を温度勾配にさらすこと；および(3)標識からのシグナルを観察すること；によって決定することができる。
前記方法は、適切な反応チャンバ内で適切な条件下に行うことができる。例えば、該方法は、反応チャンバ内で該反応チャンバを開かずに実施することができる。反応チャンバは、反応チャンバのアレイの一部であり得る。いくつかの態様では、該方法のステップを異なる反応チャンバ内で別々に実施してもよい。
本明細書に開示される方法は、液滴中で実施することができる。同様に、本明細書に開示される組成物は、液滴内に配置することができる。例えば、本明細書に開示される切断可能なプローブは、液滴を用いたPCRまたは等温増幅のための多くの個別の反応に分割され得る。こうして、特定の態様では、本明細書に開示される方法は、定量的デジタルPCR反応または他の定量的デジタル増幅反応を行うために、液滴内に区画化される。Vogelstein et al., 1999, 9236-9241ページに記載されるように、デジタルPCR法は、大多数の反応が1つまたはゼロの標的核酸分子を含むように、標的核酸を分配するのに有用であり得る。特定の希釈では、増幅陽性反応の数は、最初に存在するテンプレート分子の数に等しい。
いくつかの態様では、前記方法は、サンプル(例えば、約25マイクロリットルの容量を有するサンプル)中の標的核酸の約100コピー以下を検出可能であり得る。他の態様では、前記方法は、サンプル(例えば、約25マイクロリットルの容量を有するサンプル)中の約500コピー、1000コピー、5000コピー、または10,000コピー以下を検出可能であり得る。
他の態様では、前記方法は、約150サイクル以下のPCR、約100サイクル以下、約90サイクル以下、約80サイクル以下、約70サイクル以下、約60サイクル以下、約50サイクル以下、約40サイクル以下、または約30サイクル以下のPCRでリアルタイム検出を用いて、サンプル(例えば、約25マイクロリットルの容量を有するサンプル)中の標的核酸の約100コピー以下を検出可能であり得る。
本明細書で使用する場合、「a」または「an」は、1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において用語「含む」(comprising)とともに使用された場合、単語「a」または「an」は、1つまたは2つ以上を意味し得る。
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されない限り、または選択肢が相互に排他的でない限り、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、唯一の選択肢と「および/または」を指すという定義を支持する。本明細書で使用する場合、「別の」(another)は、少なくとも第2のまたはそれ以上を意味し得る。
本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用される装置もしくは方法の固有の誤差変動、または研究対象間に存在する変動を含む、ことを示すために使用される。
[本発明1001]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができるレポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(e)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1002]
第2の配列領域(ii)の逆相補体である配列の一部は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
エンドリボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
RNase HがRNase HIIである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
エンドリボヌクレアーゼが熱安定性RNase HII酵素である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
エンドリボヌクレアーゼが好熱性ホットスタートRNase HII酵素である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
切断可能なプローブが、第2の配列領域と、第2の配列領域の逆相補体である配列との間に、(v)1個以上のヌクレオチドのループ配列をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
ループ配列が4～20、6～15または10～15ヌクレオチドの長さである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
ループ配列が、少なくとも3～5個連続したAヌクレオチドを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
切断可能なプローブが、リボヌクレオチド塩基の3'側に位置する伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
切断可能なプローブが、ループ配列中に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1007の方法。
[本発明1012]
第2の配列領域が6～20ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1013]
第1の配列領域が4～20ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1014]
標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列が10～50ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1015]
切断可能なプローブの1個以上のリボヌクレオチド塩基が、第2の配列領域の逆相補体である配列のちょうど3'側に位置する、本発明1001の方法。
[本発明1016]
切断可能なプローブの1個以上のリボヌクレオチド塩基が、標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列の3'末端から少なくとも4塩基に位置する、本発明1001の方法。
[本発明1017]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドが、切断可能なプローブの5'末端に位置する、本発明1001の方法。
[本発明1020]
切断可能なプローブが3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
切断可能なプローブの第2の配列領域が、少なくとも50％のG/C含量を含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
切断可能なプローブの第2の配列領域が6～15ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1023]
切断可能なプローブの第2の配列領域が1個以上の非天然塩基を含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
エンドリボヌクレアーゼ切断の後、トランケートされた切断可能プローブおよび標的核酸は、標的核酸への切断可能プローブのアニーリング温度より低い融解点を有する、本発明1001の方法。
[本発明1025]
エンドリボヌクレアーゼ切断の後、トランケートされた切断可能プローブおよび標的核酸は、55℃未満の融解点を有する、本発明1001の方法。
[本発明1026]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーがレポーターである、本発明1001の方法。
[本発明1027]
レポーターがフルオロフォアである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
シグナルの変化が蛍光シグナルの減少である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
標識からのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1030]
レポーターからのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
切断可能なプローブが固相支持体に結合されている、本発明1001の方法。
[本発明1032]
少なくとも1個の非天然ヌクレオチドまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドがisoGであり、他方がisoCである、本発明1001の方法。
[本発明1033]
さらに、以下の段階：
(a)該サンプルを第2の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができるレポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(e)切断可能なプローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1001の方法。
[本発明1034]
さらに、以下の段階：
(a)前記サンプルを第3、第4、第5または第6の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができるレポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(e)切断可能なプローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1033の方法。
[本発明1035]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、本質的に同時に実施される、本発明1033の方法。
[本発明1036]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、連続して実施される、本発明1033の方法。
[本発明1037]
第1および第2のプローブが、識別可能なレポーターを含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
第1および第2のプローブが、同じレポーターを含む、本発明1033の方法。
[本発明1039]
第1および第2のプローブによって形成されたヘアピンプローブが、識別可能な融解点を有する、本発明1038の方法。
[本発明1040]
第1、第2、第3、第4、第5および第6のプローブによって形成されたヘアピンプローブがそれぞれ、識別可能な標識または識別可能な融解点を有する、本発明1034の方法。
[本発明1041]
第1、第2、第3、第4、第5および第6の切断可能プローブがそれぞれ、同じ第1の配列領域、第2の配列領域および/または第2の配列領域と第2の配列領域の逆相補体である配列との間の同じループ配列を含む、本発明1034の方法。
[本発明1042]
等温増幅を用いて標的核酸を増幅することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1043]
シグナルを等温的に増幅するために切断可能なプローブを使用することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1044]
複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1045]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前と実施した後に、該シグナルを検出することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1049]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することが、標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
第1の切断可能なプローブを含む組成物であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、組成物。
[本発明1051]
第2の切断可能なプローブをさらに含み、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、本発明1050の組成物。
[本発明1052]
第1および第2のプローブが、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
少なくとも4つのプローブを含む、本発明1051の組成物。
[本発明1054]
レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含む、本発明1050の組成物。
[本発明1055]
ポリメラーゼ、エンドリボヌクレアーゼ酵素、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドをさらに含む、本発明1050の組成物。
[本発明1056]
(a)第1の切断可能なプローブであって、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含むプローブ；ならびに
(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素；
を含んでなるキット。
[本発明1057]
少なくとも4つのプローブを含む、本発明1056のキット。
[本発明1058]
前記プローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1057のキット。
[本発明1059]
ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプルまたはキットの使用説明書をさらに含む、本発明1056のキット。
[本発明1060]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに
(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1061]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
エンドリボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1060の方法。
[本発明1063]
RNase HがRNase HIIである、本発明1062の方法。
[本発明1064]
エンドリボヌクレアーゼが熱安定性RNase HII酵素である、本発明1060の方法。
[本発明1065]
エンドリボヌクレアーゼが好熱性ホットスタートRNase HII酵素である、本発明1060の方法。
[本発明1066]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1061の方法。
[本発明1067]
切断可能なプローブ上の捕捉配列が1個以上の非天然塩基を含む、本発明1060の方法。
[本発明1068]
エンドリボヌクレアーゼ切断の前に、切断可能なプローブおよび捕捉プローブが55℃未満の融解点を有する、本発明1060の方法。
[本発明1069]
切断可能なプローブが、3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1060の方法。
[本発明1070]
切断可能なプローブが、リボヌクレオチド塩基の3'側に位置する伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1060の方法。
[本発明1071]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーがレポーターである、本発明1060の方法。
[本発明1072]
レポーターがフルオロフォアである、本発明1071の方法。
[本発明1073]
シグナルの変化が蛍光シグナルの減少である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
標識からのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1060の方法。
[本発明1075]
レポーターからのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1074の方法。
[本発明1076]
捕捉プローブが固相支持体に結合されている、本発明1060の方法。
[本発明1077]
少なくとも1個の非天然ヌクレオチドまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドがisoGであり、他方がisoCである、本発明1060の方法。
[本発明1078]
さらに、以下の段階：
(a)該サンプルを第2のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって第2の標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、クエンチャー標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに
(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1060の方法。
[本発明1079]
さらに、以下の段階：
(a)サンプルを第3、第4、第5または第6のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって第3、第4、第5または第6の標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、クエンチャー標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに
(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1078の方法。
[本発明1080]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、本質的に同時に実施される、本発明1078の方法。
[本発明1081]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、連続して実施される、本発明1078の方法。
[本発明1082]
第1および第2のセットのプローブが識別可能なレポーターを含む、本発明1078の方法。
[本発明1083]
第1および第2のセットのプローブが同じレポーターを含む、本発明1078の方法。
[本発明1084]
第1および第2のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブが識別可能な融解点を有する、本発明1083の方法。
[本発明1085]
第1、第2、第3、第4、第5および第6のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブが、それぞれ、識別可能なレポーターまたは識別可能な融解点を有する、本発明1079の方法。
[本発明1086]
等温増幅を用いて標的核酸を増幅することをさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1087]
複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施することをさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1088]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前と実施した後に、該シグナルを検出することを含む、本発明1087の方法。
[本発明1089]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む、本発明1087の方法。
[本発明1090]
検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含む、本発明1089の方法。
[本発明1091]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含む、本発明1087の方法。
[本発明1092]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することが、標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
第1のセットのプローブを含む組成物であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、組成物。
[本発明1094]
第2のセットのプローブをさらに含み、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、本発明1093の組成物。
[本発明1095]
第1および第2のセットのプローブが、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1094の組成物。
[本発明1096]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1094の組成物。
[本発明1097]
レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含む、本発明1093の組成物。
[本発明1098]
ポリメラーゼ、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドをさらに含む、本発明1093の組成物。
[本発明1099]
(a)第1のセットのプローブであって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、第1のセットのプローブ；ならびに
(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素；
を含んでなるキット。
[本発明1100]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1099のキット。
[本発明1101]
前記セットのプローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1100のキット。
[本発明1102]
ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプルまたはキットの使用説明書をさらに含む、本発明1099のキット。
[本発明1103]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(f)切断可能なプローブの5'側で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに
(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1104]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1103の方法。
[本発明1105]
エンドリボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1103の方法。
[本発明1106]
RNase HがRNase HIIである、本発明1105の方法。
[本発明1107]
エンドリボヌクレアーゼが熱安定性RNase HII酵素である、本発明1103の方法。
[本発明1108]
エンドリボヌクレアーゼが好熱性ホットスタートRNase HII酵素である、本発明1103の方法。
[本発明1109]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3～5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1104の方法。
[本発明1110]
切断可能なプローブ上の捕捉配列が1個以上の非天然塩基を含む、本発明1103の方法。
[本発明1111]
エンドリボヌクレアーゼ切断の前に、切断可能なプローブと捕捉プローブが55℃未満の融解点を有する、本発明1103の方法。
[本発明1112]
切断可能なプローブが、その3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1103の方法。
[本発明1113]
切断可能なプローブが、リボヌクレオチド塩基の3'側に位置する伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1103の方法。
[本発明1114]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーがレポーターである、本発明1103の方法。
[本発明1115]
レポーターがフルオロフォアである、本発明1114の方法。
[本発明1116]
シグナルの変化が蛍光シグナルの減少である、本発明1115の方法。
[本発明1117]
標識からのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1103の方法。
[本発明1118]
レポーターからのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1117の方法。
[本発明1119]
捕捉プローブが固相支持体に結合されている、本発明1103の方法。
[本発明1120]
少なくとも1個の非天然ヌクレオチドまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドがisoGであり、他方がisoCである、本発明1103の方法。
[本発明1121]
さらに、以下の段階：
(a)前記サンプルを第2のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(f)切断可能なプローブの5'側で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに
(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1103の方法。
[本発明1122]
さらに、以下の段階：
(a)前記サンプルを第3、第4、第5または第6のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(f)切断可能なプローブの5'側で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに
(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1121の方法。
[本発明1123]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、本質的に同時に実施される、本発明1121の方法。
[本発明1124]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、連続して実施される、本発明1121の方法。
[本発明1125]
第1および第2のセットのプローブが識別可能なレポーターを含む、本発明1121の方法。
[本発明1126]
第1および第2のセットのプローブが同じレポーターを含む、本発明1121の方法。
[本発明1127]
第1および第2のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブが、識別可能な融解点を有する、本発明1126の方法。
[本発明1128]
第1、第2、第3、第4、第5および第6のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブがそれぞれ、識別可能なレポーターおよび/または識別可能な融解点を有する、本発明1122の方法。
[本発明1129]
等温増幅を用いて標的核酸を増幅することをさらに含む、本発明1103の方法。
[本発明1130]
複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施することをさらに含む、本発明1103の方法。
[本発明1131]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前と実施した後に、該シグナルを検出することを含む、本発明1130の方法。
[本発明1132]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む、本発明1130の方法。
[本発明1133]
検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含む、本発明1132の方法。
[本発明1134]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含む、本発明1130の方法。
[本発明1135]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することが、標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含む、本発明1134の方法。
[本発明1136]
第1のセットのプローブを含む組成物であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、組成物。
[本発明1137]
第2のセットのプローブをさらに含み、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、本発明1136の組成物。
[本発明1138]
第1および第2のセットのプローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1137の組成物。
[本発明1139]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1137の組成物。
[本発明1140]
レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含む、本発明1136の組成物。
[本発明1141]
ポリメラーゼ、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドをさらに含む、本発明1136の組成物。
[本発明1142]
(a)第1のセットのプローブであって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、第1のセットのプローブ；ならびに
(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素；
を含んでなるキット。
[本発明1143]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1142のキット。
[本発明1144]
前記セットのプローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1143のキット。
[本発明1145]
ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプルまたはキットの使用説明書をさらに含む、本発明1142のキット。
[本発明1146]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされたプローブを形成させる段階；
(c)トランケートされたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、トランケートされたヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)フルオロフォアおよびクエンチャーが物理的に分離されるように、トランケートされたヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに
(f)該レポーターからのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1147]
レポーター-クエンチャー対の一方のメンバーが、切断可能なプローブの5'末端にある、本発明1146の方法。
[本発明1148]
さらに、以下の段階：
(a)該サンプルを少なくとも第2の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対を含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の(またはさらなる)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)ヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに
(e)該レポーターからのシグナルの変化を検出することによって第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1146の方法。
[本発明1149]
第1の切断可能なプローブと第2の切断可能なプローブが、(i)同じレポーターを有し、かつ(2)第1および第2の切断可能なプローブの切断と伸長の後に異なる融解温度(Tm)を有する、本発明1148の方法。
[本発明1150]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブおよび上流プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；
(c)該核酸配列を、切断可能なヘアピンプローブに接触するまで、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで伸長させ、それにより標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(e)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(f)該ヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1151]
ヘアピンプローブに対して融解分析を実施することをさらに含む、本発明1150の方法。
[本発明1152]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブおよび上流プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；
(c)該核酸配列を、切断可能なヘアピンプローブに接触するまで、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで伸長させ、それにより標的核酸とハイブリダイズしている該プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(d)トランケートされたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、切断されたヘアピンプローブを形成させる段階；
(e)フルオロフォアとクエンチャーが物理的に分離されるように、切断されたヘアピンプローブをそれ自体に伸長させる段階；ならびに
(f)伸長されたヘアピンプローブからのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい態様を示すものの、単なる例示として提供されることを理解すべきである。というのは、本発明の精神および範囲内のさまざまな変更および修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含められる。本発明は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と併せて、これらの図面の1つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
前記態様のプローブシステムを示す非限定的な例示的概略図。図1A：切断可能なプローブは、その5'末端にレポーター標識されたisoGヌクレオチド(「isoG*」)、第1の配列領域(「タグA」)、第2の配列領域(「タグB」)、ループ配列、タグBの逆相補体である配列領域(「タグB相補体」)、および標的アンプリコンに相補的な配列(「A」として示される)を含む。切断可能なプローブはまた、「A」配列中に1個以上のリボヌクレオチド(黒塗りの四角で示される)を含み、かつ3'末端に伸長をブロックする修飾(「P」として示される)を含み得る。標的アンプリコンの存在下で、切断可能プローブはアンプリコンにハイブリダイズし、リボヌクレオチド位置でRNase Hにより切断される。切断後、該プローブはタグBとタグB相補配列によってそれ自体にハイブリダイズし、ヘアピンを形成することができる。該プローブの伸長により、タグA配列に相補的な配列が合成され、クエンチャー標識されたisoC(「isoCQ」)が組み込まれる。得られたヘアピンプローブは、標識されたisoGの蛍光を消光する。 前記態様のプローブシステムを示す非限定的な例示的概略図。図1B：プローブは、例えば、その配列領域の配列と長さを調節することによって、独自の融解温度(Tm)を有するように設計され得る。したがって、異なる融解温度を有する(かくして、異なる温度で消光することのない)識別プローブに対して融解分析を行うことができる。 可変ステム、ループ、TmおよびΔGを含む、前記態様の非限定的な例示的プローブ構築物。図1に詳述したようにプローブを設計した。各プローブの配列を示す(上から下に示されるSEQ ID NO: 1～11)。タグA配列は太字で示され、ステムは3つのセグメント：配列特異的(B、下線付きヌクレオチド)、ユニバーサル配列(C、イタリック体のヌクレオチド)、および伸長可能なユニバーサル配列(A、太字フォントのヌクレオチド)で構成され、フルオロフォア標識されたイソ塩基で終結する。 前記態様の非限定的で例示的な標的特異的プローブの設計(上から下に示されるSEQ ID NO: 12～21)。ステムの3つのセグメントは、図2のように示される。 グラフは、図2に示される構築物のヘアピンの折りたたみを評価するために使用された温度勾配を示す。 グラフは、アニーリング温度を段階的に下げたときの(例えば、図4参照)、RTx-5構築物についての時間の関数としての蛍光の消光を示す。完全な消光は71℃の温度段階で観察された。 グラフは、アニーリング温度を段階的に下げたときの(例えば、図4参照)、RTx-10構築物についての時間の関数としての蛍光の消光を示す。完全な消光は62℃の温度段階で観察された。 グラフは、アニーリング温度を段階的に下げたときの(例えば、図4参照)、RTx-11構築物についての時間の関数としての蛍光の消光を示す。完全な消光は41℃の温度段階で観察された。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-1およびRTx-2から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-1およびRTx-2から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-1およびRTx-2から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-7およびRTx-8から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-7およびRTx-8から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-7およびRTx-8から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-9、RTx-10およびRTx-11から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-9、RTx-10およびRTx-11から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、50℃、62℃および68℃で構築物RTx-9、RTx-10およびRTx-11から得られた増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。 グラフは、全長プローブFL-RTx-2-20 (A)の増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。対照：水＝細い実線、臨床陰性検体＝破線。試験プローブの結果は太い実線で示される。 グラフは、FL-RTx-2-12AT1 (B)の増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。対照：水＝細い実線、臨床陰性検体＝破線。試験プローブの結果は太い実線で示される。 グラフは、FL-RTx-2c (C)の増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。対照：水＝細い実線、臨床陰性検体＝破線。試験プローブの結果は太い実線で示される。 グラフは、FL-RTx-2-12-AT-4 (D)の増幅曲線(上のパネル)と融解曲線(下のパネル)を示す。対照：水＝細い実線、臨床陰性検体＝破線。試験プローブの結果は太い実線で示される。 前記態様のプローブシステムを示す非限定的な例示的概略図。レポータープローブは、その5'末端にレポーター標識されたisoCヌクレオチド(「isoC*」)、第1の配列領域(「領域1」)、isoGおよび/またはisoC位置を含む配列(「イソプライマー」)、ならびにアンプリコンに相補的な配列(「A」として示される)を含む。アンプリコンに相補的な配列はまた、少なくとも1つのリボヌクレオチド位置を含む。標的アンプリコンの存在下では、レポータープローブはアンプリコンにハイブリダイズして、RNase Hによってリボヌクレオチド位置で切断される。切断後、レポータープローブは、捕捉オリゴヌクレオチド(「捕捉オリゴ」)にハイブリダイズすることができ、その捕捉オリゴは、イソプライマーと任意で「A」配列の部分に相補的な捕捉セグメントと、その後にミラータグ領域および3'未標識isoCを含む。レポータープローブの伸長により、捕捉オリゴ上のミラー領域1に相補的な配列が合成され、クエンチャー標識されたisoG(「isoGQ」)が組み込まれる。伸長されたレポータープローブは、今や、領域1と領域1の相補配列を含み、これは、該プローブにヘアピンを形成させ、それによって標識isoCの蛍光を消光させる。プローブは、例えば、第1の配列領域の配列と長さを調節することによって、独自の融解温度(Tm)を有するように設計することができる。したがって、異なる融解温度を有する(かくして、異なる温度で消光することのない)識別プローブに対して融解分析を行うことができる。 融解分析中に得られたデータの逆微分(inverted derivative)のグラフ。 同じフルオロフォアを使用した多重プローブについての融解プロファイルデータ。 プローブがフルオロフォア(「F」)とクエンチャー(「Q」)の両方およびリボ切断(「R」)部位を含む、前記態様のプローブシステムを示す非限定的な例示的概略図。リボ切断部位での切断後、伸長はフルオロフォアとクエンチャーの分離をもたらし、その結果、検出可能なシグナルの変化が観察され得る。 プローブがフルオロフォア(「F」)とクエンチャー(「Q」)の両方を含む、前記態様のプローブシステムを示す非限定的な例示的概略図。5'ヌクレアーゼ切断とその後の伸長は、フルオロフォアとクエンチャーの分離をもたらし、その結果、検出可能なシグナルの変化が観察され得る。 プローブが第2の配列領域と第2の配列領域の逆相補体である配列(BおよびB')との間に位置する1個以上のヌクレオチドのループ配列を含み、該ループ配列が標的核酸の配列に相補的である、前記態様のプローブシステムを示す非限定的な例示的概略図。
例示的な態様の説明
融解分析アッセイは、アンプリコンのアイデンティティーを識別するために融解ピークまたはアニーリングピークを利用するが、こうした融解ピークは、同じ温度付近で融解しかつ標的の天然の配列組成の影響を受けるアンプリコンでは、容易に区別できない。独自の融解プロファイルを有するヘアピン配列を作成することによって、多重化が単一のカラーチャンネルで実現可能であり、かくして、複数のカラーチャンネルを用いたさらなる多重化が可能になる。
サンプル中の核酸を検出するための方法およびキットが開示される。典型的には、該方法は、フルオロフォアから放出されたシグナルなどの、シグナルを検出することを含む。また、標的核酸の検出のために使用され得るオリゴヌクレオチド、特にプローブが開示される。特に、前記態様の方法は、フルオロフォアあたり複数の融解曲線を作成することにより多重化を容易にするために、伸長可能なプローブを使用する。いくつかの場合には、該プローブは、3'末端に配列特異的尾部と、フルオロフォア標識されたイソ塩基で終結する5'末端に伸長可能なユニバーサル配列とを含む、ヘアピン構造からなる。他のプローブベースの化学とは異なり、配列特異的セグメントは、標的の同定および検出のためのヘアピンの放出に使用される。いくつかの局面では、ヘアピンの放出は、該プローブの配列特異的尾部がテンプレートにハイブリダイズしたときに作成されるRNA/DNAハイブリッドの切断に基づいている。したがって、配列特異的セグメントのいずれの塩基もヘアピン構造に組み込まれないか、ほんのわずかな(例えば、3～4個の)塩基がヘアピン構造に組み込まれるにすぎず、ヘアピン構造は主に標的非依存性の配列からなる。ヘアピンの伸長可能なセグメントの長さを変えることによって、さまざまなサイズを有するヘアピンが生み出され、フルオロフォアあたり複数の融解曲線を作成することが可能になる。
I. 定義
本明細書で使用する「核酸」は、一本鎖または二本鎖の、DNAまたはRNAのいずれか、およびそれらの任意の化学修飾を意味する。修飾には、限定するものではないが、核酸リガンド塩基にまたは全体としての核酸リガンドに付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、および流動性(fluxionality)を組み込む、他の化学基を提供するものが含まれる。このような修飾としては、限定するものではないが、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨード-ウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、および普通ではない塩基対合の組み合わせ、例えばイソ塩基、が挙げられる。したがって、本明細書に記載の核酸は、標準塩基のアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)だけでなく、非標準または非天然のヌクレオチドをも含む。水素結合性の塩基対を形成する非標準または非天然ヌクレオチドは、例えば、米国特許第5,432,272号、第5,965,364号、第6,001,983号、第6,037,120号、および第6,140,496号に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み入れられる。「非標準ヌクレオチド」または「非天然ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドへの組み込みを受け易く、かつ塩基対を形成するために水素結合によって、または疎水性、エントロピーもしくはファンデルワールス相互作用によって相補的な非標準または非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、A、G、C、TまたはU以外の塩基を意味する。いくつかの例には、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,037,120号に示されるような、iso-C/iso-G、K/X、K/P、H/J、およびM/Nの塩基対組み合わせが含まれる。
これらの非標準または非天然ヌクレオチド対の水素結合は、天然塩基の水素結合に類似しており、その場合、2つまたは3つの水素結合が、対になっている非標準または非天然ヌクレオチドの水素結合アクセプターと水素結合ドナーとの間に形成される。天然塩基とこれらの非標準または非天然ヌクレオチドの違いの1つは、水素結合アクセプターと水素結合ドナーの数および位置である。例えば、シトシンはドナー/アクセプター/アクセプター塩基であり、グアニンは相補的なアクセプター/ドナー/ドナー塩基であるとみなすことができる。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,037,120号に示されるように、iso-Cはアクセプター/アクセプター/ドナー塩基であり、iso-Gは相補的なドナー/ドナー/アクセプター塩基である。
オリゴヌクレオチド中で使用するための他の非天然ヌクレオチドには、例えば、Ren, et al., 1996およびMcMinn et al., 1999(両方とも参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるような、例えば、ナフタレン、フェナントレン、およびピレン誘導体が含まれる。これらの塩基は、安定化のために水素結合を利用しないが、代わりに、塩基対を形成するために疎水性またはファンデルワールス相互作用に依存する。
本明細書で使用する用語「サンプル」は、その最も広い意味で使用される。サンプルは、体組織または体液、例えば、限定するものではないが、血液(もしくは血液の画分、例えば血漿、血清など)、リンパ液、粘液、涙、尿および唾液を含むことができる。サンプルは、細胞、染色体、オルガネラ、またはウイルスからの抽出物を含み得る。サンプルは、DNA(例えば、ゲノムDNA)、RNA(例えば、mRNA)、および/またはcDNAを含むことができ、そのいずれも増幅核酸を提供するために増幅され得る。サンプルは、溶液中の核酸、または(例えば、マイクロアレイの一部として)基板に結合された核酸を含むことができる。サンプルは、環境地点(例えば、水域、土壌など)から得られた物質、または媒介物(fomite)(すなわち、ある宿主から別の宿主に病原体を伝染させる無生物(inanimate object))から得られた物質を含むことができる。
用語「核酸の供給源」は、核酸(RNAまたはDNA)を含む任意のサンプルを指す。標的核酸の特に好ましい供給源は、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、痰および精液を含むがこれらに限定されない、生物学的サンプルである。
本明細書で使用する用語「検出限界」は、検出および定量化することができる、核酸などの、アナライトの最低のレベルまたは量を指す。検出限界は、モル値(例えば、2.0nMの検出限界)、グラム測定値(例えば、特定の反応条件の下での、2.0μgの検出限界)、コピー数(例えば、1×105コピー数の検出限界)、または当技術分野で公知の他の表現として表すことができる。
核酸分子に関して本明細書で使用する用語「単離された」は、核酸分子の天然源に存在する生物および生物学的物質(例えば、血液、細胞、血清、血漿、唾液、尿、便、痰、鼻咽頭吸引物など)から分離された核酸分子を指す。cDNA分子などの、単離された核酸分子は、組換え技術によって産生された場合には他の細胞材料または培養培地を実質的に含まず、化学的に合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。いくつかの態様では、ポリペプチド/タンパク質をコードする核酸分子もまた、単離または精製され得る。核酸の単離方法は当技術分野で周知であり、全核酸単離/精製法、RNA特異的単離/精製法、またはDNA特異的単離/精製法を含むことができる。
本明細書で使用する用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の化合物の配置を指す。用語「素子」および「アレイ素子」は、マイクロアレイ上に規定された固有の位置を有するポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の化合物を指す。
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドは、特定の間隔で主として同一のモノマー単位からなる主鎖上に塩基の配列を有する分子であると理解される。塩基は、該オリゴヌクレオチドの塩基に相補的な塩基の配列を有する核酸との結合に入ることができるように、主鎖上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位の主鎖を有する。区別は、2'位にヒドロキシル基を有しない「dNTP」からなるオリゴデオキシリボヌクレオチドと、2'位にヒドロキシル基を有する「NTP」からなるオリゴリボヌクレオチドとの間でなされ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えばアリル基、で置換された誘導体を含むことができる。
オリゴヌクレオチドは、少なくとも2個のヌクレオチドを含む核酸である。本明細書に開示される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも約10個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも約15個のヌクレオチドを含む。本明細書に開示される方法に好適なオリゴヌクレオチドは、約10～25個のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、「プライマー」として機能するように設計することができる。「プライマー」は、相補的塩基対合によって標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る短い核酸、通常はssDNAオリゴヌクレオチドである。次いで、プライマーは、DNAポリメラーゼ酵素などのポリメラーゼ酵素によって標的DNAまたはRNA鎖に沿って伸長させることができる。プライマー対は、(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による)核酸配列の増幅(および同定)のために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、「プローブ」として機能するように設計することができる。「プローブ」は、同一の、対立遺伝子の、または関連する核酸配列を検出するために使用されるオリゴヌクレオチド、その相補体、またはその断片を指す。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に結合されたオリゴヌクレオチドを含み得る。典型的な標識としては、蛍光色素、クエンチャー、放射性同位体、リガンド、シンチレーション剤、化学発光剤、および酵素が挙げられる。
オリゴヌクレオチドは、サンプル中の標的核酸配列に特異的であるように設計することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の「アンチセンス」核酸配列を含むように設計される。本明細書で使用する用語「アンチセンス」は、特定の標的核酸配列の「センス」(コード)鎖と塩基対合することが可能な任意の組成を指す。アンチセンス核酸配列は、標的核酸配列に「相補的」であり得る。本明細書で使用する場合、「相補性」は、塩基対合によってアニーリングする2つの一本鎖核酸配列間の関係を表す。例えば、5'-AGT-3'は、その相補体である3'-TCA-5'と対合する。いくつかの態様では、プライマーまたはプローブは、さまざまな位置にミスマッチを含むように設計され得る。本明細書で使用する「ミスマッチ」とは、標準的なワトソン-クリック塩基対を含まないヌクレオチド対、または水素結合を優先的に形成しないヌクレオチド対を意味する。ミスマッチは、標的中の特定の塩基(複数可)に向かい合って置換された天然ヌクレオチドまたは非天然もしくは非標準ヌクレオチドを含み得る。例えば、プローブまたはプライマー配列5'-AGT-3'は、標的配列3'-ACA-5'と単一のミスマッチを有する。プローブまたはプライマーの5'「A」は、標的の3'「A」とミスマッチである。同様に、標的配列5'-AGA-3'は、プローブまたはプライマー配列3'-(iC)CT-5'と単一のミスマッチを有する。ここでは、天然の「T」の代わりにiso-Cに置換されている。しかし、配列3'-(iC)CT-5'は、配列5'-(iG)GA-3'とミスマッチではない。
オリゴヌクレオチドはまた、縮重オリゴヌクレオチドとして設計することもできる。本明細書で使用する「縮重オリゴヌクレオチド」とは、異なる配列の混合物を含むオリゴヌクレオチドの集団、プール、または大多数を含むことを意味し、その場合、配列の相違は集団の各オリゴヌクレオチドの特定の位置で起こる。種々の置換は、どのような天然または非天然のヌクレオチドを含んでもよく、任意の所定位置にさまざまな可能なヌクレオチドを含むことができる。例えば、上記の縮重オリゴヌクレオチドは、代わりに、R＝iCまたはiG、あるいはR＝AまたはGまたはTまたはCまたはiCまたはiGを含み得る。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと水素結合を形成することが可能である。こうした塩基には、A、G、C、TおよびUのような天然塩基、ならびにイソシトシンおよびイソグアニンのような人工的な、非標準または非天然のヌクレオチドが含まれる。本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドの第1の配列は、第1の配列の連続塩基(5'から3'へと読む)が第2の配列の連続塩基(3'から5'へと読む)に照らして塩基対合のワトソン・クリック規則に従う場合、第2の配列のオリゴヌクレオチドと100％相補的であると言える。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換を含み得る。例えば、天然塩基の代わりに人工塩基を用いて、その人工塩基が天然塩基と同様の特異的相互作用を示すようにしてもよい。
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸配列に対して「相同性」を有する核酸配列に特異的であり得る。本明細書で使用する「相同性」とは、2つ以上のポリヌクレオチド配列または2つ以上のポリペプチド配列の間の配列類似性または、相互交換可能に、配列同一性を指す。ポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント」および「同一性％」という用語は、標準化アルゴリズム(例えば、BLAST)を用いてアライメントされた少なくとも2つのポリヌクレオチド配列間の残基一致率を指す。
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドは、適切な条件下でその標的核酸に「ハイブリダイズする」であろう。本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」は、オリゴヌクレオチド一本鎖が規定されたハイブリダイゼーション条件下で塩基対合により相補鎖とアニーリングするプロセスを指す。「特異的ハイブリダイゼーション」は、2つの核酸配列が高度の相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容されるアニーリング条件下で形成され、後続の洗浄ステップの後にハイブリダイズしたままである。核酸配列の許容されるアニーリング条件は、当業者がルーチンに決めることができ、例えば、約6×SSCの存在下に65℃で起こり得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、一部には、洗浄ステップが実施される温度を基準にして表すことができる。このような温度は、典型的には、特定のイオン強度およびpHで特定の配列の熱融解点(Tm)より約5℃～20℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする(規定されたイオン強度およびpHの下での)温度である。最近傍パラメータ(nearest-neighbor parameter)などのTmを計算するための式、および核酸ハイブリダイゼーションの条件は、当技術分野で公知である。
本明細書で使用する「標的」または「標的核酸」は、プローブまたはプライマーのようなオリゴヌクレオチドとの少なくとも部分的な相補性を有する配列を含む核酸分子を指す。「標的」配列は、遺伝子またはゲノムの一部を含み得る。
本明細書で使用する場合、「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはその任意の断片を指し、かつ天然に存在する分子または合成の分子を指す。これらの用語はまた、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、かつセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を表し得る、ゲノム起源または合成起源のDNAもしくはRNA、またはDNA様もしくはRNA様の物質を指す。DNA配列に関して「RNA等価物」は、窒素含有塩基チミンの全ての存在がウラシルに置き換えられ、かつ糖骨格がデオキシリボースの代わりにリボースで構成されることを除いて、参照DNA配列と同じヌクレオチドの直鎖状配列からなる。RNAは、本明細書に記載の方法で使用され、かつ/または本明細書に記載の方法で使用するために逆転写によってcDNAに変換され得る。
本明細書で使用する「増幅」または「増幅する」とは、核酸配列のさらなるコピーの作成を指す。増幅は、一般に、当技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて実施される。用語「増幅反応システム」は、標的核酸配列のコピー数を増やすためのインビトロ手段を指す。用語「増幅反応混合物」は、標的核酸を増幅するために使用される種々の試薬を含む水溶液を指す。これらは、酵素(例えば、熱安定性ポリメラーゼ)、水性緩衝液、塩類、増幅プライマー、標的核酸、ヌクレオシド三リン酸、および任意に、少なくとも1つの標識プローブ、および/または任意に、増幅された標的核酸の融解温度を決定するための少なくとも1つの作用剤(例えば、二本鎖核酸の存在下で蛍光の変化を示す蛍光インターカレート剤)を含み得る。
本明細書に記載の増幅方法は、「リアルタイムモニタリング」または「連続モニタリング」を含むことができる。これらの用語は、PCRのサイクルの間に、好ましくは温度遷移の間に、複数回モニタリングすることを指し、より好ましくは、各温度遷移において少なくとも1つのデータ点を取得することを指す。用語「ホモジニアス検出アッセイ」は、増幅と検出が連結されたアッセイを記載するために使用され、「リアルタイムモニタリング」または「連続モニタリング」を含み得る。
核酸の増幅は、核酸またはこれらの核酸の部分領域の増幅を含むことができる。例えば、増幅は、適切なプライマー配列を選択し、PCRを使用することにより、30～50、50～100、または100～300塩基長の核酸の部分を増幅することを含み得る。さらなる局面では、増幅は、等温増幅技術(すなわち、熱サイクリングを必要としない)を使用して達成することができる。例えば、ループ介在等温増幅(LAMP)のような等温核酸増幅法は、米国特許第6,410,278号および米国特許出願公開第20080182312号に提供されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
開示された方法は、サンプル中の少なくとも1つ以上の核酸を増幅することを含み得る。開示された方法では、リアルタイム法を用いて増幅をモニタリングすることができる。
増幅混合物は、天然ヌクレオチド(A、C、G、TおよびUを含む)および非天然または非標準ヌクレオチド(例えば、iCおよびiGなど)を含み得る。DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された、それぞれ、デオキシリボースまたはリボースを含む。各デオキシリボースまたはリボースは、糖に連結された塩基を含む。天然に存在するDNAおよびRNAに組み込まれる塩基は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、チミジン(T)、シトシン(C)、およびウリジン(U)である。これらの5つの塩基は「天然塩基」である。ワトソンとクリックによって精巧に考えられた塩基対合の規則によれば、天然塩基はハイブリダイズしてプリン-ピリミジン塩基対を形成し、その場合にGはCと、AはTまたはUと対になる。これらの対合規則は、オリゴヌクレオチドと相補的オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションを容易にする。
天然塩基による塩基対の形成は、各塩基対の2塩基間に2つまたは3つの水素結合が生成することによって促進される。各塩基は、2つまたは3つの水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターを含む。塩基対の水素結合はそれぞれ、一方の塩基上の少なくとも1つの水素結合ドナーと他方の塩基上の水素結合アクセプターとの相互作用によって形成される。水素結合ドナーは、例えば、少なくとも1個の水素が結合されているヘテロ原子(例えば、酸素または窒素)を含む。水素結合アクセプターは、例えば、孤立電子対を有するヘテロ原子(例えば、酸素または窒素)を含む。
本明細書で使用される天然または非天然ヌクレオチドは、修飾された天然または非天然ヌクレオチドを形成するために、非水素結合部位での置換によって誘導体化することができる。例えば、天然ヌクレオチドは、支持体への結合のために、ヌクレオチドの非水素結合原子に反応性官能基(例えば、チオール、ヒドラジン、アルコール、アミンなど)を結合させることによって誘導体化され得る。他の可能な置換基には、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、アルキル基(例えば、メチルまたはエチル)などが含まれる。
本明細書に開示される方法による非天然ヌクレオチドの使用は、サンプル中に存在する核酸配列の検出と定量の域を越えて拡張可能である。例えば、非天然ヌクレオチドは、核酸に関連した反応を触媒する多くの酵素によって認識され得る。ポリメラーゼはオリゴヌクレオチド鎖の重合と伸長を継続するために相補的ヌクレオチドを必要とするが、他の酵素は相補的ヌクレオチドを必要としない。非天然ヌクレオチドがテンプレート中に存在し、かつその相補的な非天然ヌクレオチドが反応混合物中に存在しない場合、ポリメラーゼは、非天然ヌクレオチドを通り越して伸長プライマーを伸長させようとするとき、典型的には失速する(または、場合によっては、十分な時間量が与えられた場合には塩基を誤って取り込む)だろう。しかし、リガーゼ、キナーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼなどの、核酸に関連した反応を触媒する他の酵素は、非天然ヌクレオチドが関与する反応を触媒することができる。非天然ヌクレオチドのこのような特徴は、本開示の方法およびキットに利用することができ、本開示の範囲内である。
非天然ヌクレオチドを含むことができる、本明細書に開示されるヌクレオチドは、標識(例えば、クエンチャーまたはフルオロフォア)に結合され得る。結合は当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
本方法のオリゴヌクレオチドはプライマーとして機能し得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは標識される。例えば、オリゴヌクレオチドは、検出可能なシグナルを発するレポーター(例えば、フルオロフォア)で標識することができる。オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、A、C、G、TまたはUではない塩基(例えば、iCまたはiG)を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み得る。このオリゴヌクレオチドがPCRのためのプライマーとして使用される場合、増幅混合物は、クエンチャー(例えば、Dabcyl)で標識された少なくとも1個のヌクレオチドを含むことができる。標識されたヌクレオチドは、少なくとも1個の非天然または非標準ヌクレオチドを含み得る。例えば、標識されたヌクレオチドは、A、C、G、TまたはUではない塩基(例えば、iCまたはiG)を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み得る。
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピンのような分子内構造を形成しないように設計することができる。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピンのような分子内構造を形成するように設計することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした後で変化し、かつ任意で、標的核酸がオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅された後で変化する、ヘアピン構造を形成するように設計することができる。
オリゴヌクレオチドは、増幅産物中にプライマーとして取り込まれたときに消光を示す、フルオロフォアで標識することができる。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが増幅産物中にプライマーとして組み込まれた後に検出可能なシグナルを(例えば、本来的に、または蛍光誘導もしくは蛍光発光によって)発することができる。そのようなプライマーは当技術分野で公知である(例えば、LightCyclerプライマー、Amplifluor(商標)プライマー、Scorpion(商標)プライマー、およびLux(商標)プライマー)。オリゴヌクレオチドを標識するために使用されるフルオロフォアは、二本鎖核酸にインターカレートされたときにシグナルを発することができる。このように、フルオロフォアは、オリゴヌクレオチドが核酸を増幅するためのプライマーとして用いられた後にシグナルを発することができる。
開示された方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、サンプル中の少なくとも1つの核酸を増幅するためのプライマーとして、また、サンプル中の少なくとも1つの核酸を検出するためのプローブとして適切であり得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なシグナルを生成し得る少なくとも1つの蛍光色素で標識される。蛍光色素は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のための蛍光ドナーとして機能し得る。検出可能なシグナルは、オリゴヌクレオチドが標的核酸を増幅するために使用された場合に消光され得る。例えば、増幅混合物は、フルオロフォアから発せられた検出可能なシグナルのためのクエンチャーにより標識されたヌクレオチドを含むことができる。任意で、オリゴヌクレオチドは、蛍光アクセプター(例えば、FRETの場合)として機能し得る第2の蛍光色素またはクエンチャー色素で標識されてもよい。オリゴヌクレオチドが第1の蛍光色素と第2の蛍光色素で標識される場合、シグナルは第1の蛍光色素、第2の蛍光色素、またはその両方から検出することができる。シグナルは、(例えば、アンプリコン、標的核酸にハイブリダイズしたプローブを含む複合体、ヘアピン、またはTプローブ複合体の融解温度を決定するために)温度の勾配で検出され得る。
開示された方法は、適切なオリゴヌクレオチド数を用いて実施することができる。複数のオリゴヌクレオチド(例えば、2つ以上のオリゴヌクレオチド)を使用する場合、異なるオリゴヌクレオチドは、検出可能なシグナルを生成することができる異なる蛍光色素で標識され得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、2つの異なる蛍光色素のうちの少なくとも1つで標識される。さらなる態様では、オリゴヌクレオチドは、3つの異なる蛍光色素のうちの少なくとも1つで標識される。
いくつかの態様では、異なる蛍光色素のそれぞれは、オリゴヌクレオチドの標識に用いられた異なる蛍光色素の他のどの蛍光色素によって発せられたシグナルとも区別することができるシグナルを発する。例えば、異なる蛍光色素は、少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ互いに異なる発光極大波長を有し得る。いくつかの態様では、異なる蛍光色素のそれぞれは、異なる波長エネルギーによって励起される。例えば、異なる蛍光色素は、少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ互いに異なる吸収極大波長を有し得る。
蛍光色素が本方法において核酸の融解温度を決定するために使用される場合、その蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用された異なる蛍光色素の他のどの蛍光色素によって発せられたシグナルとも区別され得るシグナルを発することができる。例えば、核酸の融解温度を決定するための蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用された他のどの蛍光色素の発光極大波長とも少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ異なる発光極大波長を有し得る。いくつかの態様では、核酸の融解温度を決定するための蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用された異なる蛍光色素の他のどの蛍光色素とも異なる波長エネルギーによって励起され得る。例えば、核酸の融解温度を決定するための蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用されたどの蛍光色素の吸収極大波長とも少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ異なる吸収極大波長を有し得る。
本方法は、サンプル中の少なくとも1つの核酸(例えば、アンプリコン、または標的核酸にハイブリダイズしたプローブを含む核酸複合体)の融解温度を決定することを含むことができ、それは核酸を同定するために使用され得る。融解温度の決定は、アンプリコンまたは核酸複合体を温度勾配にさらし、フルオロフォアからの検出可能なシグナルを観察することを含み得る。任意で、本方法のオリゴヌクレオチドが第1の蛍光色素で標識される場合、検出された核酸の融解温度を決定することは、第1の蛍光色素とは異なる第2の蛍光色素からのシグナルを観察することを含んでもよい。いくつかの態様では、検出された核酸の融解温度を決定するための第2の蛍光色素は、インターカレート剤である。適切なインターカレート剤としては、限定するものではないが、以下を挙げることができる：SYBR(商標)Green 1色素、SYBR色素、Pico Green、SYTO色素、SYTOX色素、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー1、エチジウムホモダイマー2、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジン誘導体、エチジウム-アクリジンヘテロダイマー、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、シアニン単量体、7-アミノアクチノマイシンD、YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、シアニン二量体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、およびこれらの混合物。適切な態様では、選択されたインターカレート剤はSYBR(商標)Green 1色素である。
開示された方法において、増幅された標的核酸またはレポータープローブ-テンプレート対のそれぞれは、異なる融解温度を有し得る。例えば、増幅された標的核酸またはレポータープローブ-テンプレート対のそれぞれは、他の増幅された標的核酸またはレポータープローブ-テンプレート対のいずれの融解温度とも1～10℃だけ、例えば少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約2℃、さらにより好ましくは少なくとも約4℃だけ、異なる融解温度を有する。
本明細書で使用する「標識」または「レポーター分子」は、核酸を標識するのに有用な化学的または生化学的モイエティ(moiety)である。「標識」および「レポーター分子」には、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、消光剤、放射性核種、酵素、基質、補因子、シンチレーション剤、阻害剤、磁性粒子、および当技術分野で公知の他のモイエティが含まれる。「標識」または「レポーター分子」は、測定可能なシグナルを生成することができ、オリゴヌクレオチドに共有的または非共有的に結合させることができる。
本明細書で使用する「蛍光色素」または「フルオロフォア」は、光によって励起されて蛍光を発することができる化学基である。いくつかの適切なフルオロフォアは、光によって励起されてリン光を発することができる。色素は、蛍光ドナー色素からの蛍光シグナルを消光させることができるアクセプター色素を含み得る。開示された方法で使用することができる色素としては、限定するものではないが、以下のようなフルオロフォアが挙げられる：赤色蛍光スクアリン色素、例えば2,4-ビス[1,3,3-トリメチル-2-インドリニリデンメチル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、赤外色素、例えば2,4-ビス[3,3-ジメチル-2-(1H-ベンズ[e]インドリニリデンメチル)]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、またはオレンジ色蛍光スクアリン色素、例えば2,4-ビス[3,5-ジメチル-2-ピロリル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート。フルオロフォアのさらなる非限定的な例としては、以下が挙げられる：量子ドット、Alexa Fluor(商標)色素、AMCA、BODIPY(商標)630/650、BODIPY(商標)650/665、BODIPY(商標)-FL、BODIPY(商標)-R6G、BODIPY(商標)-TMR、BODIPY(商標)-TRX、Cascade Blue(商標)、CyDye(商標)、例えば、限定するものではないが、Cy2(商標)、Cy3(商標)、Cy5(商標)など、DNAインターカレート色素、6-FAM(商標)、フルオレセイン、HEX(商標)、6-JOE、Oregon Green(商標)488、Oregon Green(商標)500、Oregon Green(商標)514、Pacific Blue(商標)、REG、フィコビリタンパク質、例えば、限定するものではないが、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、Rhodamine Green(商標)、Rhodamine Red(商標)、ROX(商標)、TAMRA(商標)、TET(商標)、テトラメチルローダミン、またはTexas Red(商標)。
蛍光色素またはフルオロフォアは、別の反応性分子への連結を容易にするように修飾された誘導体を含むことができる。こうして、蛍光色素またはフルオロフォアは、アミン反応性誘導体、例えば、フルオロフォアのイソチオシアネート誘導体および/またはスクシンイミジルエステル誘導体を含み得る。
開示された方法のオリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドは、クエンチャーにより標識することができる。消光(クエンチング)には、動的消光(例えば、FRETによる)、静的消光、またはその両方が含まれ得る。適切なクエンチャーとしてDabcylが挙げられる。適切なクエンチャーにはダーククエンチャーも含まれ、これは、「BHQ」の商品名で販売されるブラックホールクエンチャー(例えば、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2およびBHQ-3、Biosearch Technologies社, Novato, CA)を含むことができる。ダーククエンチャーはまた、「QXL(商標)」(Anaspec社, San Jose, CA)の商品名で販売されるクエンチャーを含み得る。ダーククエンチャーはまた、2,4-ジニトロフェニル基を含むDNP型非フルオロフォアを含み得る。
本明細書に開示される方法および組成物は、区画化された反応において使用され得る。反応を区画化するための1つのアプローチは、液滴を用いることによるものであり、液滴は、第2の流体によって、または第2の流体と1つ以上の表面によって、完全に取り囲まれた第1の流体の分離された体積である。分子診断およびライフサイエンスの研究分野において、これは典型的には2つの非混和性の液体である。本明細書で開示されるさまざまな態様は、非水性連続相中に複数の水性液滴を含む油中水型エマルションを使用する。水性液滴の全てまたはサブセットは、関心対象のアナライトを含むことができる。エマルションは、しばしば1種以上の界面活性剤の存在下で、2つの非混和性相(例えば、水と油)を混合することによって形成される。エマルションの基本的なタイプは、水中油型(o/w)、油中水型(w/o)、および両連続型である。液滴ベースの生物学的アッセイでは、エマルションは、典型的には、水相中にアッセイ試薬(例えば、PCRプライマー、塩類、酵素など)が含まれる油中水型エマルションである。「油」相は、単一の油であっても、異なる油の混合物であってもよい。適切な非水性流体はどれも、本明細書に開示されるエマルションの非水性連続相を形成し得る。いくつかの態様では、非水性連続相は、鉱油、シリコーン油、またはフッ素化油(例えば、Fluorinert(登録商標)FC-40 [Sigma-Aldrich社])を含む。
液滴は、さまざまな技術によって画像化することができる。画像化を容易にするために、液滴を含む組成物は、液滴が表面上に実質的に単層で配置されるように、表面上に分散させることができる。イメージング表面は、例えば、スライド上またはチャンバ内、例えばガラスもしくは石英チャンバ内であり得る。液滴、ならびに液滴内の標識されたアナライトまたは反応産物(例えば、ヘアピンプローブ)は、イメージングシステムを用いて検出することができる。例えば、検出は、標識されたヘアピンプローブから発せられた蛍光波長および/または蛍光強度を画像化することを含み得る。液滴がまた、コード化マイクロスフェアのような、コード化された粒子を含む態様では、イメージングは、コード化粒子のデコーディング画像(decoding image)を撮り、かつ液滴中のプローブを検出するためにアッセイ画像を撮ることを含むことができる。デコーディング画像とアッセイ画像との比較は、フルオロフォアの組み合わせを用いることによって、より大きな多重化能力を可能にする。本発明の方法は、直接または間接的に標識された増幅産物からのシグナルを、サンプル中のDNAまたはRNAの濃度と相関させることをさらに含むことができる。本明細書に開示された方法および組成物とともに使用するのに適したイメージングシステムの例は、米国特許第8,296,088号および米国特許出願公開第2012/0288897号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
上述したように、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、液滴内で行うことができる反応の例である。特に、液滴はデジタルPCR(dPCR)技術において有用である。dPCRは、サンプル中に含まれる個々の核酸分子が、マイクロウェルプレートの各ウェル、エマルションの分散相、または核酸結合表面のアレイなどの、多くの個別の領域に局在するように、サンプルを区画化することを含む。各区画(例えば、液滴)は、0またはゼロより多い分子を含み、それぞれ陰性または陽性の反応を提供する。従来のPCRとは異なり、dPCRは、サンプル中の標的核酸の初期量を決定するために増幅サイクル数に依存しない。したがって、dPCRは、標的核酸を定量するための指数関数的データへの依存を排除し、絶対的定量をもたらす。エマルション中のビーズ上で核酸をクローン的に増幅するビーズエマルションPCRは、反応物を液滴に分けるdPCR技術の一例である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,048,627号および第7,842,457号を参照されたい。dPCRが以下に詳述するようなエマルション中で行われる場合、そのエマルションは熱サイクル条件に耐えることができるように熱安定性でなければならない。
エマルション中でdPCRを行うにはさまざまな方法がある。例えば、1つのアプローチでは、DNAサンプルを適切な濃度に希釈し、PCR試薬(プライマー、dNTPなど)と混合し、上記のようにエマルション中の液滴内にカプセル化すると、多数の離散した反応サンプルが得られる。その液滴をPCR熱サイクルにかけ、アンプリコンを上述のように蛍光(または他の適切なレポーター)イメージングによって検出する。本発明の切断可能なプローブの態様においては、アンプリコンはプローブの蛍光(または他の適切なレポーター)によって検出される。
液滴の熱サイクルは、当技術分野で知られた適切な技術によって実施することができる。例えば、加熱と冷却が可能な管またはチャンバ内で液滴を熱サイクリングする。いくつかの態様では、本方法は、核酸テンプレートを増幅するために連続流増幅を利用する。さまざまな連続流増幅法が報告されている。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,927,797号は、連続流PCRと共に使用される油中水型エマルションを記載している。等温反応(例えば、ローリングサークル増幅、全ゲノム増幅、NASBA、または鎖置換増幅)もまた、液滴内で行うことができる。このシステムを用いて、温度を上昇または下降させながら液滴をモニタリングし、液滴あたりの融解プロファイルを取得することができ、これは、多重化された検出と定量を可能にするであろう。プローブそれ自体を液滴内で用いて、シグナルを等温的に増幅することができ、その結果、PCRまたは他の等温増幅反応などの、他の形態の増幅は、液滴内の低コピー数の標的を検出するのに必要でなくなる。
II. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含められる。当業者には理解されるように、以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において良好に機能すると本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その好ましい実施形態を構成すると見なすことができる。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、依然として同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
実施例1 － マルチプローブプローブシステム
分子アッセイのための溶液相多重化戦略は、＞10の標的を検出するための複数の蛍光融解曲線の作成と併せて複数のフルオロフォアの使用に依存している。本明細書に開示されたさまざまな態様は、伸長可能なヘアピンプローブを利用してチャンネルあたり複数の融解曲線を作成することによって、より高い多重化能力が達成され得る、リアルタイムプローブベースの化学を提供する。このシステムで使用するためのプローブの例を図1Aに示す。この例では、切断可能なプローブは、その5'末端にレポーター標識されたisoGヌクレオチド(「isoG*」)、第1の配列領域(「タグA」)、第2の配列領域(「タグB」)、ループ配列、タグBの逆相補体である配列領域(「タグB相補体」)、および標的アンプリコンに相補的な配列(「A」として示される)を含む。切断可能なプローブはまた、「A」配列中に1個以上のリボヌクレオチド(黒塗りの四角で示される)を含み、かつ3'末端に伸長をブロックする修飾(「P」として示される)を含み得る。標的アンプリコンの存在下で、切断可能プローブはアンプリコンにハイブリダイズし、リボヌクレオチド位置でRNase H2(アニーリングされたRNA/DNAハイブリッド中のリボヌクレオチドを認識して切断する)により切断される。切断後、該プローブはタグBおよびタグB相補配列によってそれ自体にハイブリダイズして、ヘアピンを形成することができる。該プローブの伸長により、タグA配列に相補的な配列が合成され、クエンチャー標識されたisoC(「isoCQ」)が組み込まれる。得られたヘアピンプローブは、標識isoGの蛍光を消光させる。プローブは、例えば、第1および第2の配列領域の配列と長さを調節することによって、独自の融解温度(Tm)を有するように設計され得る。したがって、タグAおよびタグBのステム構造の組成と長さは、ヘアピンプローブの所望の融解温度で分割するように変えることができる(図1B参照)。
材料および方法
プローブの設計パラメータ
複数の切断可能なプローブの構築物は、伸長可能なヘアピンの最適な設計パラメータを決定するために、(切断後に)標的配列特異的尾部なしで設計した。該配列特異的尾部の目標Tmは、反応温度(約58℃)よりも10℃高かった。ヘアピン構築物は、RNA/DNAハイブリッドの切断後に単分子構造の形成を可能にするために、Tm＞60℃を有するように設計した。これらの構築物は、切断後のヘアピンのループサイズ(塩基数)、ステムサイズ、ギブズ(Gibbs)自由エネルギーおよびTmの要件を決定するような設計であった。構築された特定のプローブの例を示す(図2)。これらの概念実証実験では、ループの両側に2つのシトシン「クランプ」が付いているマルチアデニン残基のループを使用した(イタリック体のフォント間の配列)。
1. プローブの折りたたみ
温度勾配を用いて、95℃～41℃の範囲の温度にわたってヘアピンの蛍光強度の低下をモニタリングすることにより、これらの構築物の折りたたみ(folding)プロファイルを評価した。図2の構築物を、BTP-KCl pH9.1緩衝液、2.5mM dNTP、2.5mM MgCl2、1mM Dabcyl-isoGおよびTitanium Taq酵素(Clontech社)を含有する反応混合物に添加した。95℃での初期変性ステップの後、反応温度を、各間隔で10秒間保持しながら3℃刻みで95℃から41℃に低下させた。各構築物について完全な消光が観察された温度を、ヘアピンの折りたたみ温度として記録した。
2. ヘアピンループ形成の効率：プローブの折りたたみ、伸長および消光
ヘアピン形成の効率は、3つの温度で各構築物の消光速度を測定することによって評価した。図2の構築物を、BTP-KCl pH9.1緩衝液、2.5mM dNTP、1mM isoG-dabcylおよびTitanium Taq酵素(Clontech社)を含有する反応混合物に添加した。95℃で2分間の活性化ステップの後、反応物を50℃、62℃および68℃で30分間インキュベートして、ヘアピンの折りたたみ、伸長およびisoG-dabcylの取り込みを可能にした。この後に、60℃で30秒および95℃への漸増上昇の融解曲線サイクリングプロトコルが続いた。反応の効率は、消光が達成されたときに得られるCt値によって決定された。
3. 全長プローブを用いたシングルプレックスRT-PCR
増幅反応において検出用にマルチプローブRTxプローブを用いることの実現可能性は、最初に、シングルプレックス(singleplex)RT-PCR反応で評価した。全長プローブ(配列特異的尾部を有する)の複数の設計を、(図2～3)で評価されたヘアピン設計に基づいて作成した。配列特異的セグメントの目標Tmは、反応のアニーリング温度よりも約10℃高かった。プライマー(表1)およびプローブの配列は、インフルエンザBウイルスのマトリックス遺伝子に基づいていた。インフルエンザB株：B/Malaysia/2506/04(Zeptometrix社)から抽出した核酸を、ワンステップRT-PCR反応においてテンプレートとして用いた。具体的には、PCRプライマー(フォワード180nM、リバース60nM)およびプローブ(120nM)を、BTP-KCl pH9.1緩衝液、2.5mM dNTP、2.5mM MgCl2、1mM Dabcyl-isoG、Titanium Taq酵素(Clontech社)ならびにMMLV(Promega社)およびRNase H(IDT社)を含有する反応混合物に添加した。増幅および融解曲線分析のために、以下のサイクリング条件を使用した：50℃で5分；95℃で10分；95℃で10秒、58℃で20秒を45サイクル、その後60℃で30秒および95℃で1秒の融解プログラムが続き、40℃での冷却ステップで終了する。
(表1) PCRプライマー
Figure 0007231680000001
結果
ヘアピンループの融解プロファイル
図2のヘアピンプローブの融解プロファイルを作成して、種々の構築物の折りたたみ温度を決定した。これは、95℃から41℃までの温度勾配にわたって蛍光強度の低下をモニタリングすることによって測定した(図4)。3つの例示的な構築物RTx-5、RTx-10およびRTx-11の消光プロファイルを示すグラフを、それぞれ、図5～7に示す。全ての研究の結果を以下の表2に示す。ヘアピン構築物RTx-1、2、3、5、6、7および8は、伸長ヘアピンの算出されたTm約71℃(IDT社)に対応する71℃の温度ステップによって完全に消光されることが見出された。ヘアピン構築物RTx-4、9および10は62℃で消光され、ヘアピンRTx-11は41℃で消光される。
(表2) 種々のヘアピンプローブの折りたたみ温度の要約
Figure 0007231680000002
ステムループのTm、ΔG値、ループサイズおよびステムサイズを比較すると、データは、ヘアピンの形成に影響を及ぼす主要因がステム中の塩基の数であることを示唆している。二次的な要因は、ヘアピンの折りたたみに関連するギブズ自由エネルギーであり得るが、それは、正確な折りたたみTmを有する構築物のΔGが62℃および41℃のTmを有する構築物よりも低いためである。
ヘアピンループ形成の効率
増幅
図2のヘアピン構築物を使用して、さまざまな温度でのヘアピン形成の効率を決定した。その結果は上記の観察結果を裏付けるものである。反応速度は、プローブRTx-1、2、7および8では非常に速い(図8および図9)。より遅い反応速度はプローブRTx-9および10について観察され、Ct値は5～10の範囲内であり、完全消光について記録された最高Ct値はRTx-11の場合で、30～35であった(図10)。これらのヘアピンは、形成と伸長により低い温度を必要とし、そのため折りたたみに必要な時間がより長くなる。
融解曲線分析
ヘアピン構築物RTx-1、2、3および4の融解曲線分析は、温度を上げることがより鋭い融解曲線をもたらすことを示す(図8)。これは、記録されたTmのわずかなシフトを伴う。同様に、より鋭い融解曲線は構築物RTx-5および6の場合に62℃で作成されたが、Tmのシフトは観察されない。構築物RTx-7および8の融解曲線とTmは、他のヘアピンについて観察された傾向から外れている(図9)。幅広い重複する融解曲線は、構築物RTx-9、10および11で作成され(図10)、上で得られたデータに対応する。
全長プローブを用いたシングルプレックスRT-PCR
全長プローブの設計は、図2および図3からのヘアピン構築物に関するデータに基づいて開発された。目標とする最小ステムサイズは8塩基であり、ループについては12～20残基であり、ヘアピンループについては55～66.4℃のTmであった。
検出
全てのプローブは、34～35 Ctの範囲のCt値をもたらした(図11A～11D)。ほとんどのプローブの融解曲線は、1種の存在、主に伸長されたヘアピンの存在を示した。マイナーな、高いTmピークが一部のプローブについて検出された。
同じ蛍光強度が、FL-RTx-2-12AT1およびFL-RTx-2-12AT2を除いて、全てのプローブについて記録された。これらのプローブの計算されたヘアピンループTmは、反応温度(58℃)に非常に近い。反応温度を低下させることによって、形成されるヘアピン分子の数が改善され、より良好な検出が提供され得る。
特異性
2つの陰性対照が含められた(図11A～11D)。テンプレート陰性対照(水)を含める目的は、RNase H2による全長プローブの切断に起因する非特異的なヘアピンの形成を検出することであった。プローブFL-RTx-2-12-AT-4(図11D)のみが、プローブの非特異的切断を示唆しうるヘアピンと同じサイズのバックグラウンド非特異的融解曲線を示した。使用した2つ目の陰性対照は、無症候性の患者から採取した臨床的陰性検体であった。その目的は、無関係なテンプレートの存在下でプローブの特異性を評価することであった。いずれのプローブも該テンプレートとの非特異的相互作用を示さなかった。
実施例2 － さらなるヘアピンプローブ検出システム
ヘアピンプローブ検出システムのさらなる例を図12に示す。レポータープローブは、その5'末端にレポーター標識されたisoCヌクレオチド(「isoC*」)、第1の配列領域(「領域1」)、isoGおよび/またはisoC位置を含む配列(「イソプライマー」)、ならびにアンプリコンに相補的な配列(「A」として示される)を含む。アンプリコンに相補的な配列はまた、少なくとも1つのリボヌクレオチド位置を含む。標的アンプリコンの存在下では、レポータープローブはアンプリコンにハイブリダイズして、RNase Hによってリボヌクレオチド位置で切断される。切断後、レポータープローブは、捕捉オリゴヌクレオチド(「捕捉オリゴ」)にハイブリダイズすることができ、その捕捉オリゴは、イソプライマーおよび任意で「A」配列の部分に相補的な捕捉セグメントと、その後にミラー領域1および3'未標識isoCを含む。レポータープローブの伸長により、捕捉オリゴ上のミラータグに相補的な配列が合成され、クエンチャー標識されたisoG(「isoGQ」)が取り込まれる。伸長されたレポータープローブは、今や、タグおよびタグ相補配列を含み、これは、該プローブにヘアピンを形成させ、それによって標識isoCの蛍光を消光させる。プローブは、例えば、第1の配列領域の配列と長さを調節することによって、独自の融解温度(Tm)を有するように設計することができる。したがって、異なる融解温度を有する(かくして、異なる温度で消光することのない)識別プローブに対して融解分析を行うことができる。
図12のアッセイシステムはまた、捕捉プローブがイソ塩基を必要としないように、さらに修飾され得る。このシステムでは、レポータープローブは、その5'末端にレポーター標識されたisoCヌクレオチド(「isoC*」)、第1の配列領域(「領域1」)、isoGおよび/またはisoC位置を含む配列(「イソプライマー」)、ならびにアンプリコンに相補的な配列(「A」として示される)を含む。アンプリコンに相補的な配列はまた、少なくとも1つのリボヌクレオチド位置を含む。標的アンプリコンの存在下では、レポータープローブはアンプリコンにハイブリダイズして、RNase Hによってリボヌクレオチド位置で切断される。切断後、レポータープローブは、捕捉オリゴヌクレオチド(「捕捉オリゴ」)にハイブリダイズすることができ、その捕捉オリゴは、イソプライマーおよび任意で「A」配列の部分に相補的な捕捉セグメントと、その後にミラー領域1(領域1配列の一部と同一である)を含む。レポータープローブの伸長により、捕捉オリゴ上のミラー領域1に相補的な配列が合成される。次いで、切断可能なプローブは、領域1配列とミラー領域1に相補的な配列との塩基対合によってヘアピンを形成することができる。ヘアピン配列のさらなる伸長は、クエンチャー標識されたisoG(「isoGQ」)を取り込む。プローブは、例えば、第1の配列領域の配列と長さを調節することによって、独自の融解温度(Tm)を有するように設計することができる。したがって、異なる融解温度を有する(かくして、異なる温度で消光することのない)識別プローブに対して融解分析を行うことができる。
図15は、プローブがフルオロフォア(F)とクエンチャー(Q)の両方を含む別の態様を示す。一本鎖であるときの第1の配列領域の立体配座は、フルオロフォアのクエンチャーへの近接がフルオロフォアからのシグナルの検出可能な消光をもたらすようなものである。標的の存在下では、プローブは標的にハイブリダイズし、リボヌクレアーゼによってリボヌクレオチド位置で切断される。この特定の態様では、第2の配列領域の相補体、リボヌクレオチド(複数可)、および該リボヌクレオチドの3'側の標的特異的領域が標的に対して相補的である。プローブの切断後、切断されたプローブの第2の配列領域と第2の配列領域の相補体は互いにハイブリダイズして、ヘアピン構造を形成する。切断されたプローブの3'末端を第1の配列領域上に伸長させることによって、フルオロフォアをクエンチャーから遠くに離して配置する立体配座を有する二本鎖分子が生成され、その結果として、シグナルの検出可能な変化を観察できるようになる。
図16は、プローブがフルオロフォア(F)とクエンチャー(Q)の両方を含む別の態様を示す。一本鎖であるときの第1の配列領域の立体配座は、フルオロフォアのクエンチャーへの近接がフルオロフォアからのシグナルの検出可能な消光をもたらすようなものである。標的の存在下では、プローブは標的にハイブリダイズし、上流プライマーを伸長するポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって切断される。この特定の態様では、第2の配列領域の相補体は標的に相補的ではない。プローブの切断後、切断されたプローブの第2の配列領域と第2の配列領域の相補体は互いにハイブリダイズして、ヘアピン構造を形成する。切断されたプローブの3'末端を第1の配列領域上に伸長させることによって、フルオロフォアをクエンチャーから遠くに離して配置する立体配座を有する二本鎖分子が生成され、その結果として、シグナルの検出可能な変化を観察できるようになる。
図17は、プローブがレポーター-クエンチャー対の一方のメンバーを含み、この特定の例ではそれがフルオロフォア(F)である態様を示す。さらに、該プローブは、第1の配列領域、第2の配列領域、ループ領域、第2の配列領域の相補体、1個以上のリボヌクレオチド、および該リボヌクレオチドの3'側の標的特異的領域を含む。この特定の態様では、ループ領域、第2の配列領域の相補体、リボヌクレオチド(複数可)、および該リボヌクレオチドの3'側の標的特異的領域が標的に対して相補的である。
実施例3 － 逆転写PCRにおける伸長ブロッカーを有するヘアピンプローブの使用
フォワード(Fwd)およびリバース(Rev)プライマーをウェル内でATG0015プローブまたはT-FL-RTx2cプローブのいずれかと組み合わせたが、該プローブは、ATG0015プローブがループ領域に3炭素スペーサー(iSpC3)を含み、T-FL-RTx2cは含まない点でのみ異なっていた。これらをPCRマスターミックスと混合して、熱サイクリングとその後に融解分析を行った。
Figure 0007231680000003
逆転写PCRをテンプレートなしで行って、融解分析中にシグナルの変化を引き起こす非特異的相互作用をモニタリングした。以下のPCRマスターミックスを25μLの反応のために調製し、ABI Fast 7500リアルタイムサーマルサイクラーで作動させた。温度プロファイルは、50℃で5分保持、95℃で2分20秒保持、44サイクルの95℃で10秒および57℃で23秒を含んでいた。融解分析には、60℃から95℃までのランピング(ramping)および0.5℃ごとの読み取りが含まれていた。
(表3) PCRマスターミックス
Figure 0007231680000004
図13は、融解分析中に得られたデータの逆微分を示す。ループ領域に3炭素スペーサーを欠くT-FL-RTx2cプローブには、77℃に非特異的融解ピークが存在する。
理論に束縛されるものではないが、50℃での低温逆転写酵素ステップの間、この例でのリバース(Rev)プライマーは、ループ領域の下流のプローブにハイブリダイズして、該プライマーがループを通って伸長し、標識されたイソ塩基に向かい合ってクエンチャーを取り込むことを可能にすると考えられる。このハイブリダイゼーションはまた、リボ塩基を切断させ、プローブがプライマーに沿って伸長することをも可能にする。二本鎖産物はPCR反応中に増幅される。伸長ブロッカーはループ領域にわたるプライマーの非特異的伸長を防止し、これは、クエンチャー/フルオロフォア対の形成を妨げるだけでなく、十分なTmを有する二本鎖産物がPCRで58℃のアニーリングステップ中に増幅されるのを防ぐ。
実施例4 － 単一の色素を用いた多重化
本研究は、同じフルオロフォアを有するが、伸長された種々のヘアピンプローブのTmが異なっている、複数のヘアピンプローブの使用能力を実証した。インフルエンザA、インフルエンザBまたはアデノウイルスのいずれかに特異的で、同じフルオロフォア(FAM)を有する、3つの異なるプローブを同じPCRチューブ内で一緒に試験した。インフルエンザA、インフルエンザBまたはアデノウイルスのいずれかの抽出ウイルス培養物を含有する陽性対照サンプルを、マルチプレックスPCR反応成分を含む個々のPCRチューブに入れた。これらの標的は反応につき1000コピーで試験した。切断可能なプローブの配列を表4に示す。
(表4) プローブ配列
Figure 0007231680000005
以下のPCRマスターミックス(表5)を25μLの反応のために調製し、Life Technologies社のQuant StudioリアルタイムPCRサーマルサイクラーで作動させた。温度プロファイルは、50℃で5分保持、95℃で2分20秒保持、44サイクルの95℃で10秒および57℃で23秒を含んでいた。融解分析には、60℃から95℃までのランピングおよび0.5℃ごとの読み取りが含まれていた。
(表5) PCRマスターミックス
Figure 0007231680000006
図14は、同じマルチプレックスPCR反応混合物を用いた、6つの個々の反応(1000コピー/反応での3つの標的のそれぞれに対して1つの陽性サンプル、および3つのテンプレートなし対照(NTC)サンプル)の融解プロファイルデータを示す。図14に見て取れるように、インフルエンザA(FluA)、インフルエンザB(FluB)、およびアデノウイルス(Adeno)に特異的な切断可能プローブのそれぞれは、同じ蛍光チャンネルにおいて明確に区別される融解プロファイルをもたらした。したがって、この例では、3種の異なるウイルスが、同じ蛍光標識を使用したとき、融解プロファイルによって識別された。
本明細書に開示され特許請求された方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく実施および達成され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されているが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本方法に対して、および本明細書に記載された方法の段階または該段階の順序において、変形を適用することができることは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤は、同じまたは類似の結果を達成しつつ、本明細書に記載の薬剤と置き換えて使用できることが明らかであろう。当業者には明らかなこのような類似の置換および修飾は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものに補足的な例示的手順または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Figure 0007231680000007

Claims (10)

  1. 標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
    (a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)該第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列、を含む、段階；
    (b)該切断可能なプローブおよび上流プライマーを該標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；
    (c)該上流プライマーを、該切断可能なプローブに接触するまで該ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで伸長させ、かつ該標的核酸にハイブリダイズしている該プローブを切断して、トランケートされた切断されたプローブを形成させる段階；
    (d)該トランケートされた切断されたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
    (e)該レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識され、かつ該第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
    (f)該伸長されたヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって該標的核酸を検出する段階
    を含んでなる方法。
  2. 伸長されたヘアピンプローブに対して融解分析を実施することをさらに含む、請求項１記載の方法。
  3. 切断可能なプローブが、第2の配列領域と、該第2の配列領域の逆相補体である配列との間に、1個以上のヌクレオチドのループ配列をさらに含み得る、請求項１記載の方法。
  4. 切断可能なプローブが3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、請求項１記載の方法。
  5. 標的核酸の存在を検出する段階が、温度を伸長されたヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、請求項１記載の方法。
  6. 標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
    (a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)該第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列、を含む、段階；
    (b)該切断可能なプローブおよび上流プライマーを該標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；
    (c)該上流プライマーを、該切断可能なプローブに接触するまで該ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで伸長させ、かつ該標的核酸にハイブリダイズしている該プローブを切断して、トランケートされた切断されたプローブを形成させる段階；
    (d)該トランケートされた切断されたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
    (e)フルオロフォアとクエンチャーを物理的に分離させるように、該第1の配列領域をテンプレートとして使用して該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
    (f)該伸長されたヘアピンプローブからのシグナルの変化を検出することによって該標的核酸を検出する段階
    を含んでなる方法。
  7. 切断可能なプローブが、第2の配列領域と、該第2の配列領域の逆相補体である配列との間に、1個以上のヌクレオチドのループ配列をさらに含み得る、請求項6記載の方法。
  8. 切断可能なプローブが3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、請求項6記載の方法。
  9. 標的核酸の存在を検出する段階が、温度を伸長されたヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、請求項6記載の方法。
  10. 伸長されたヘアピンプローブに対して融解分析を実施する段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
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