CN111742057B - 核酸扩增或与其相关的改进 - Google Patents

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Abstract

披露了进行非等温核酸扩增反应的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在允许杂交事件的条件下将靶序列与一种或多种互补单链引物混合，其中所述引物与靶杂交，所述杂交事件直接或间接导致形成包含两个切口位点的双链体结构，这两个切口位点位于所述双链体的相反两端处或附近；并通过以下步骤进行扩增过程；(b)使用切口酶在所述双链体的链中的每个所述切口位点处产生切口；(c)使用聚合酶延伸带切口的链以便形成新合成的核酸，所述用聚合酶进行的延伸重新产生切口位点；(d)根据需要重复步骤(b)和(c)，以产生所述新合成的核酸的多个拷贝；所述方法的特征在于：进行此方法的温度是非等温的，并且在步骤(b)‑(d)的扩增过程期间，在上限温度和下限温度之间经历多次穿梭，其中在所述上限温度下，所述聚合酶或切口酶中的一种比所述酶中的另一种更具活性，从而使得所述酶在活性方面存在差异，并且在所述下限温度下，所述酶在活性方面的差异变小或逆转。

Description

核酸扩增或与其相关的改进
技术领域
本发明涉及扩增核酸分子的方法，尤其是以定量方式扩增核酸分子的方法。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)是公知的并且是用于扩增核酸分子所使用的标准技术。在反应的最后检测PCR的扩增产物。产物的量趋于达到平台水平，在此水平即使将反应混合物放置更长的时间产物的量也不会增加。因此，在常规PCR中，产物的量不必然与开始时存在于混合物中的扩增靶序列的浓度相关。
为了获得定量数据，进行定量PCR(“qPCR”)，其中实时监测或检测产生的扩增产物的量(因此qPCR也被称为“实时PCR”或甚至“RT-PCR”，然而由于后一缩写会与逆转录酶(Reverse Transcriptase)-PCR混淆而是无帮助的)，同时所述反应仍在积极扩增靶序列。
典型地，扩增的核酸是通过与标记实体(标记通常是荧光团)的相互作用来检测的。此相互作用可以是非特异性的(即，标记实体基本上与任何双链DNA分子结合)或特异性的(即，标记实体优先以核苷酸序列依赖性的方式与所期望的扩增产物中存在的特定核酸序列相互作用)。非特异性标记实体的实例是染料SYBRGreen。特异性标记实体(例如，标记的探针分子)可以是例如“分子导标”，其当经历由与靶序列的杂交诱导的构象变化时发出荧光。
因此，在PCR期间实时监测所观察的荧光水平允许产生定量数据，其中扩增产物的量(例如，像通过检测荧光来测量的)与样品中扩增靶分子的浓度相关。
如美国专利6,814,943中所述的qPCR利用温度范围进行循环。对于qPCR，典型地进行以下程序：约95℃变性，约55℃退火，约70℃延伸。这些是大的温度变化(最高和最低温度之间相差约40℃)。因此，qPCR(像“常规”非定量PCR)需要使用相对复杂的热循环设备。因此，尽管qPCR在研究环境(例如，基因表达的定量)中非常有用，但它并不易适用于即时(“PoC”)诊断测试等。
为了避免热循环的需要，已经设计了许多等温进行的核酸扩增技术。此类扩增技术的非详尽列表包括：信号介导的RNA扩增技术(“SMART”；WO 99/037805)；基于核酸序列的扩增(“NASBA”Compton(康普顿)1991Nature[自然]350,91-92)；滚环扩增(“RCA”例如参见Lizardi等人,1998NatureGenetics[自然遗传学]19,225-232)；环介导的扩增(“LAMP”参见Notomi等人,2000Nucl.AcidsRes.[核酸研究]28,(12)e63)；重组酶聚合酶扩增(“RPA”参见Piepenberg等人,2006PLoSBiology[PLoS生物学]4(7)e204)；链置换扩增(“SDA”)；解旋酶依赖性扩增(“HDA”Vincent等人,2004EMBO Rep.[欧洲分子生物学会报告]5,795-800)：转录介导的扩增(“TMA”)，单引物等温扩增(“SPIA”参见Kurn等人,2005ClinicalChemistry[临床化学]51,1973-81)；自动维持序列扩增(“3SR”)；和切口酶扩增反应(“NEAR”)。
SDA是这样一种技术(由Walker等人,1992Nucl.Acids Res.[核酸研究]20,1691-1696披露)，它涉及一对引物的使用，所述引物包含靶互补部分以及在所述靶互补部分的5’端的针对核酸内切酶的识别及切割位点。引物与相应的互补单链靶分子杂交。使用包含DNA聚合酶和至少一种经修饰的核苷三磷酸的反应混合物，使用引物作为模板来延伸靶链的3'端(同样地，使用靶作为模板延伸引物的3'端)。
靶链的延伸产生核酸内切酶的双链识别位点。然而，因为使用经修饰的三磷酸来延伸靶，所以核酸内切酶不切割两条链，而是在引物中产生单链切口。然后通过DNA聚合酶(典型地是DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段，所述片段缺乏核酸外切酶活性)在切口处延伸3'端。随着带切口的引物延伸，它们置换最初产生的延伸产物。然后，被置换的产物自由地与相反引物杂交，因为它基本上复制了所述相反引物的靶序列。以这种方式，实现了靶序列的两条链的指数扩增。
SDA过程的扩增阶段基本上是等温的-典型地在37℃下进行-这是核酸内切酶和聚合酶的最适温度。然而，在达到扩增阶段之前，必须将双链靶完全解离成其组成单链，以使所述引物对与各自互补的靶链杂交。
这种解离或“解链”通常通过将双链靶加热至高温(通常约90℃)以破坏靶的两条链之间的氢键而完成。然后冷却反应混合物以允许添加扩增反应所必需的酶。由于用于产生单链靶的高温，SDA技术不是很适合PoC环境。
US 6,191,267披露了N.BstNBI切口酶的克隆和表达及其在SDA中代替限制性核酸内切酶和经修饰的三磷酸的用途。
另一种类似于SDA的扩增技术是切口酶扩增反应(或“NEAR”)。
在‘NEAR’中(例如，如US 2009/0017453和EP 2,181,196中所披露的)，正向引物和反向引物(在US 2009/0017453和EP 2,181,196中称为“模板”)与双链靶的相应链杂交并延伸。正向引物和反向引物(过量存在)的另外拷贝与相反引物的延伸产物杂交，并且自身延伸，从而产生“扩增双链体”。如此形成的每个扩增双链体包含朝向每条链的5'端的切口位点(由切口酶产生的)，从而允许合成另外的延伸产物。先前合成的延伸产物可以同时与互补引物的另外拷贝杂交，从而使引物延伸，并因而产生“扩增双链体”的另外拷贝。以这种方式，可以实现指数扩增。
NEAR与SDA的不同之处特别是在于，NEAR不需要初始热解离步骤。触发扩增过程所需的初始引物/靶杂交事件在靶仍然基本上呈双链时发生：认为，初始引物/靶杂交利用靶链的局部解离，这种现象称为“呼吸”(参见Alexandrov等人,2012Nucl.Acids Res.[核酸研究]和由Von Hippel等人,2013Biopolymers[生物聚合物]99(12),923-954的综述)。呼吸是DNA链之间碱基配对的局部和瞬时松动。初始引物/靶异源双链体的解链温度(Tm)典型地远低于反应温度，因此趋势是引物解离，但瞬时杂交持续足够长的时间使聚合酶延伸引物，这会增加异源双链体的Tm并使之稳定。
NEAR中的扩增阶段在恒定的温度下等温进行。实际上，常规的是都在相同的恒定温度下执行初始靶/引物杂交和随后的数轮扩增，所述恒定温度通常在54℃至56℃的范围内。
避免了对热循环的需要意指在PoC环境中NEAR可能比PCR更有用。此外，即使从非常低拷贝数的靶分子(例如少至10个双链靶分子)开始，也可以实现大量扩增产物的合成。
WO 2011/030145(英格曼医疗诊断产品有限公司(Enigma DiagnosticsLimited))披露了首先在预定温度下进行“等温”核酸扩增(特别提到NASBA、SDA、TMA、LAMP、Q-β复制酶、滚环扩增和3SR)的想法，改变反应温度，然后在反应期间使温度至少恢复到预定温度一次。更具体地，所述文件建议在扩增反应期间引起温度振荡或“摆动”，据说这“改善了完成的总时间和测定的信噪比”。使用TMA扩增技术对此想法进行了实验探索以扩增细菌RNA。结果显示，尽管“摆动”反应比真正的等温反应更快地开始扩增靶，但在荧光信号升至初始背景水平以上之前，仍存在约13分钟的延迟。
本发明旨在提供具有优于现有技术的一个或多个优点的、并且特别是能够产生定量数据的新颖的核酸扩增技术。
发明内容
在第一方面，本发明提供了进行非等温核酸扩增反应的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许杂交事件的条件下将靶序列与一种或多种互补单链引物混合，其中所述引物与靶杂交，所述杂交事件直接或间接导致形成包含两个切口位点的双链体结构，这两个切口位点位于双链体的相反两端处或附近；并通过以下步骤执行扩增过程；
(b)使用切口酶在所述双链体的链中的每个所述切口位点处产生切口；
(c)使用聚合酶延伸带切口的链以便形成新合成的核酸，所述用聚合酶进行的延伸重新产生切口位点；
(d)根据需要重复步骤(b)和(c)，以产生所述新合成的核酸的多个拷贝；
其特征在于：进行此方法的温度是非等温的，并且在步骤(b)-(d)的扩增过程期间，在上限温度和下限温度之间经历多次穿梭，其中在所述上限温度下，所述聚合酶或切口酶中的一种比所述酶中的另一种更具活性，从而使得所述酶在活性方面存在差异，并且在所述下限温度下，所述酶在活性方面的差异变小或逆转。
切口酶和聚合酶将具有一定的催化活性的速率。这些将随温度而变化。在特定的温度下，酶的各自的活性速率(以在给定底物浓度下每单位时间每毫克酶反应的底物摩尔数表示)通常将是不同的。每种酶应具有最适温度，在此温度下其活性速率最大。一般而言，反应混合物的温度距离酶的最适温度越远，酶的活性速率就越慢。
一种酶对于另一种酶的相对有利(以便实现聚合酶活性和切口酶之间的差异)可以通过使用允许所述酶的一种比其他酶具有更高活性的温度条件或者通过使用对所述酶的一种比其他酶不利的温度条件来获得。
作为解释，如果在上限温度下所述酶的一种比其他酶具有更高的活性，而在下限温度下其他所述酶具有更高的活性，则认为在所述酶的活性方面的差异是“逆转的”。
在其他实施例中，在上限和下限温度下在酶的活性方面的差异没有逆转，而只是降低了。典型地，在所述上限或下限温度之一下的酶之间的活性方面的差异适当地在下限或上限温度下降低至少5％。更优选地，差异降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。最优选地，差异降低至少50％或至少75％。
为了避免疑问，在此上下文中“酶活性”是指在相同条件下测量的聚合酶和切口酶的“特异性酶活性”(μmol反应的底物min-1 mg-1酶)。
在一个优选的实施例中，本发明第一方面的方法包括使用一组温度条件，其中在所述上限和下限温度之一下，切口酶和聚合酶均是基本上活性的(即，出于本发明的目的，在其他方面相同的条件下，以酶在最适温度下发挥作用的速率的至少50％或更高的速率进行操作；以在其最适温度下其活性速率的优选地60％或更高，更优选地65％或更高；并且最优选地70％或更高)；而在所述下限和上限温度(视情况而定)的其他温度下，切口酶或聚合酶中的至少一种基本上被抑制(即，在其他方面相同的条件下，以酶在其最适温度下发挥作用的速率的49％或更低的速率进行操作；以在其最适温度下其活性速率的优选地低于45％，更优选地低于40％；并且最优选地低于35％)。在一些实施例中，在上限或下限温度之一下切口酶基本上被抑制。在一些实施例中，在上限温度下切口酶基本上被抑制。
在一些实施例中，在上限或下限温度之一下聚合酶基本上被抑制。在一些实施例中，在下限温度下聚合酶基本上被抑制；在其他实施例中，在上限温度下聚合酶基本上被抑制。
可以将反应混合物在上限温度或在下限温度下保持恒定的时间长度称为“停留时间”，并且为了区分它们，可以将其称为“上限温度停留时间”和“下限温度停留时间”。上限温度停留时间和下限温度停留时间可以是相同的或可以是不同的。如果不同，则上限温度停留时间比下限温度停留时间可以更长或更短。
定量分析的关键参数是生成的数据拟合回归线的程度，即确定系数(coefficientof determination，R2)。如果数据的确定系数较差，则不认为所述数据是定量的。出于本发明的目的，如果数据的确定系数等于或大于0.850(典型地等于或大于0.900，优选地等于或大于0.950，更优选地等于或大于0.975，并且最优选地等于或大于0.990)，则认为所述数据是定量的。可以使用由Pfaffl(2001,Nucl.Acids Res.[核酸研究]29(9)e45)所述的方法方便地计算确定系数(R2)。
因此，如果根据前述定义进行核酸扩增反应和/或通过这种反应分析样品的方法产生的数据是定量的，则所述方法被认为是定量的。出人意料地，本发明的方法能够产生定量数据。
本发明的扩增反应优选以通常在表面上类似于被称为“NEAR”的并披露于EP 2,181,196中的方式进行。然而重要地并且完全不同于NEAR技术的是，本发明的方法非等温地进行，并且涉及在上限温度和下限温度之间反复穿梭。
在一些实施例中，上限温度可能相对有利于聚合酶的活性而不是切口酶的活性，而下限温度则相对有利于切口酶的活性而不是聚合酶的活性。然而，令人惊讶地，发明人已发现“温度偏好”可以被完全逆转，使得在一些实施例中，上限温度可以相对有利于切口酶的活性而不是聚合酶的活性，而下限温度可以相对有利于聚合酶的活性而不是切口酶的活性。
不受任何特定理论束缚，似乎是通过适当选择具有不同温度最佳值的聚合酶和切口酶，可以使扩增反应的上限温度相对有利于聚合酶或切口酶，并且反过来关于扩增反应的下限温度也是这样。
不受任何特定理论束缚，发明人进一步假设，通过本发明的方法实现的快速扩增的可能机制引起了切口酶或聚合酶中一种或其他种的活性降低(通过使用对于所述酶而言明显次优的温度)，导致潜在的底物分子的积累。当将反应混合物的温度调节至更接近于所讨论的酶的最佳温度时，酶的活性将显著增强，这与相对高浓度的积累的底物相结合，导致大大地提高反应速率。简单术语而言，这种“快速/慢速”形式的平均反应速率大于使用具有恒定或相对缓慢变化的温度的“稳态”系统可获得的平均反应速率。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以期望切口酶的最适温度与在本发明的方法中使用的聚合酶的最适温度不同(更高或更低)。
典型地，切口酶和聚合酶各自的最适温度应相差至少1℃，优选地至少3℃，更优选地至少5℃，并且最优选地至少10℃。方便地，各自的最适温度相差10℃-30℃范围内、更典型地在10℃-25℃范围内的量。
没有绝对要求聚合酶的最适温度高于切口酶的最适温度。因此，例如，有本发明一些实施例，其中所述反应利用聚合酶(例如，获得自嗜冷性来源)，所述聚合酶最适温度比切口酶的最适温度更低，而在其他实施例中，聚合酶的最适温度比切口酶的最适温度更高。
因此，一般而言，优选地选择上限温度以便相对有利于序列特异性聚合酶介导的延伸阶段(即，在聚合酶和杂交的初始引物/靶双链体之间形成复合物，随后是聚合酶介导的引物的延伸；并且其后几乎立即将相反引物的延伸与延伸的初始引物杂交)。使用升高的温度倾向于减少引物二聚体形成和不期望的错杂双链体的异常扩增。方便地选择聚合酶，以便在上限温度下足够稳定，以在整个反应期间进行引物延伸，而活性没有显著降低。出于本发明的目的，“显著降低”意指聚合酶的特异性酶活性下降50％或更多。
优选地选择下限温度以便允许切口酶切割双链体上的切口位点。典型地(但不是必须)，切口酶的最适温度比聚合酶的最适温度更低，因此，向下限温度的转换典型地使反应温度更接近于切口酶的最适温度。
在如本文例示的本发明的方法的一些实施例中，上限温度优选地在50.0℃-64.0℃范围内，更优选在55.0℃-63.0℃的范围内。然而，本领域技术人员将理解，优选地“上限温度”可以取决于存在的酶的身份以及可能还取决于引物和/或预期的扩增靶的长度和序列而变化。
例如，在一些实施例中，上限温度可能高达68℃，但是在以下那些条件：
(a)所述条件通常希望使用热穿梭曲线，其中在上限温度下的停留时间减少(例如，每次穿梭不超过约1-2秒)；以及
(b)此种高上限温度仅在样品中靶序列的拷贝数相对高(例如约103拷贝或更高)的情况下才能运行良好。
在如本文例示的本发明的方法中，下限温度优选地在20.0℃-58.5℃范围内，更优选地在35.0℃-57.9℃范围内。再次，然而，如上所述，本领域技术人员将理解，优选的“下限温度”可以取决于酶存在的身份以及可能还取决于引物和/或预期的扩增靶的长度和序列而变化。
作为一般规则，如本领域技术人员所熟知的，杂交的严格性随温度升高而增加(在极限内)，使得较高的温度通常将减少非特异性相互作用，例如错配引物与样品中存在的非互补的多核苷酸序列之间的相互作用。因此，对于杂交反应，较高的温度通常比下限温度更好，只要所述温度不超过特异性引物/靶序列杂交的解链温度即可。
理想地，在优选的实施例中，上限温度和下限温度之间的温度差将在4℃-12℃范围内，更优选地在4℃-10℃范围内，并且最优选地在4℃-8℃范围内。
通常，尽管不是必须的，但是优选的是将反应混合物在上限温度下(而不是在下限温度下)保持较短的时间段(“停留时间”)，尽管在上限和下限温度下“停留时间”可能是相等的，或者甚至在其他实施例中，在上限温度下的停留时间可能比在下限温度下的停留时间更长-尽管通常不优选这样。
设想，在一定极限内，通常，热穿梭的频率越高，扩增反应将进行得越快。因此，一个完整的热穿梭的持续时间将优选地小于3.0分钟，更优选地小于2.0分钟，并且最优选地小于1.0分钟。最有利地，热穿梭的持续时间将小于45秒，并且最优选地小于30秒。热穿梭的最短持续时间典型地将是至少1秒，优选地至少2秒，并且更优选地至少5秒。一个完整的热穿梭的典型优选的持续时间将在5和30秒之间，优选地在5和20秒之间，并且最优选地在5和15秒之间。
在上限温度下典型优选的停留时间可以在1和10秒之间，优选地1-5秒，并且最优选地1-3秒。
在下限温度下典型优选的停留时间可以在2和40秒之间，更优选地在3和30秒之间，并且最优选地在3和15秒之间。
在上限和下限温度之间进行穿梭的时间优选地基本上保持为最小。设想扩增反应混合物的典型体积将小于500μl，可能小于250μl，并且鉴于上限温度和下限温度典型地相差小于10℃，应该有可能并且优选在约0.5-10.0秒，更优选在1-5秒范围内从下限温度转换为上限温度(反之亦然)。
方便地，多次穿梭中的每一次的持续时间/温度曲线基本相同-这简化了此方法的执行。因此，例如，多次热穿梭的每一次将方便地具有相同的总持续时间、在上限温度下相同的停留时间、在下限温度下相同的停留时间等。
然而，在一些实施例中(尤其是其中实时检测扩增反应的直接或间接一种或多种产物的那些实施例)，可能期望在反应期间改变热穿梭的曲线，因此不是所有的穿梭都是一样的。更具体地，如果扩增反应的一种或多种产物(直接或间接)的实时定量表明反应进行得比期望的慢，则可以将此信息反馈给调节反应混合物温度的热调节设备，使设备调节热穿梭的曲线，以便提高反应速率。例如，如果靶序列存在非常低的拷贝数，则可能需要这样做。设备可以通过提高或降低上限和/或下限温度、和/或提高或降低在上限和/或下限温度下的停留时间来调节热穿梭曲线。设备可以增加或减少在上限和下限温度之间转换的时间(即，增加或减少向上温度转换或向下温度转换或两者的时间)也是可行的。
在将反应混合物的所有必需组分放在一起后，基本上可以立即开始热穿梭。
可替代地，热穿梭可以在延迟间隔之后开始。例如，可能并且潜在期望的是，反应混合物可以在升高的温度(此温度可以与在热穿梭中使用的上限温度相同或不同)下保持。作为说明，这种延迟间隔可以从例如5秒至1或2分钟。
此外，热穿梭可以方便地在扩增反应期间基本连续地进行、或者可以经历一个或多个停顿。典型并且优选地，一旦热穿梭开始将不会中断，直至扩增反应已达到所期望的时间点，典型地是在已获得可检测的荧光(或其他)信号时，并且这有利于定量确定样品中靶序列的量和/或浓度。
扩增反应混合物的热穿梭可以方便地使用自动化的热调节设备来实现，例如用于在PCR中进行热循环的可商购的设备。显然，由设备产生的温度曲线将需要与适用于进行本发明的优选条件匹配。
在第二方面，本发明提供了用于进行核酸扩增的反应混合物，所述混合物包含待扩增的靶序列、两种或更多种引物(所述引物中的一种与靶的第一链互补、并且所述引物中的另一种与靶的第二链互补)、DNA聚合酶和切口酶；所述反应混合物处于与可编程温度调节器件结合的热调节中，所述温度调节器件被编程以在上限温度和下限温度之间进行热穿梭，如先前关于本发明的第一方面所定义的。
在第三方面，本发明提供了确定样品中靶多核苷酸的量和/或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：根据以上定义的本发明的第一方面进行扩增反应以扩增靶，并且以定量方式检测扩增反应的一种或多种直接或间接产物，以便允许确定样品中靶多核苷酸的量和/或浓度。
本发明的方法的扩增过程可以应用于普遍已知的和常规的扩增技术，这些技术包括利用聚合酶和切口酶的SDA和NEAR。
因此，例如，扩增过程可以基于链置换扩增中采用的扩增过程，或者基于NEAR中使用的扩增过程或实际上依赖于产生单链切口及随后从切口链的3’末端延伸的任何其他核酸扩增过程。除了关于扩增期间保持恒定温度的现有技术的教导之外，关于SDA或NEAR的扩增阶段的现有技术的教导通常将同样适用于本发明的方法的扩增过程。
本发明的方法是WO2018/002649中描述的命名为选择性温度扩增反应(或“STAR”)的扩增技术的改进。在优选的实施例中，本发明的方法允许靶序列的实时定量检测，并且在本文中被称为“qSTAR”，尽管这并不旨在指示本发明的方法将提供在所有条件下的定量实时的结果。
优选地，步骤(a)包括将含有双链靶的样品与两种单链引物混合，所述引物中的一种与靶的第一链互补，并且所述引物中的另一种与靶的第二链互补，使得两种引物与靶杂交，并且所述引物的游离3'末端彼此面对。
两种引物可以方便地称为“正向”引物和“反向”引物。
理想地，正向引物和反向引物都将包含切口酶识别位点的序列。典型地，由切口酶产生的切口将正好在切口酶识别位点的外部并且典型地在切口酶识别位点的3'。
在一个优选的实施例中，正向引物将包含在其3'末端处或附近的部分，所述部分与靶序列反义链的3'末端互补并且可与之杂交，而反向引物包含在其3'末端处或附近的部分，所述部分与靶序列有义链的3'末端互补并且可与之杂交。
以此方式，在靶序列的相反末端引入切口酶识别位点，并且基本上如，例如US2009/0017453(其内容通过引用并入本文)披露的以下的方法来完成靶序列(连同切口位点下游的引物的任何插入序列)的扩增：通过进行正向和反向引物的聚合酶延伸的多个循环以形成双链切口酶识别位点，并通过用切口酶对这些位点产生切口，从而允许通过聚合酶等进一步扩展具有切口的引物。
所述靶可以是单链的、双链的，或包含两者的混合物。所述靶可以包括RNA、DNA或两者的混合物。特别地，所述靶可以包含一种或多种经修饰的核苷三磷酸(即，在天然存在的核酸中通常未发现的核苷三磷酸)，尽管这不是必需的并且实际上不是优选的。
所述靶可以选自以下非详尽列表：基因组核酸(此术语涵盖任何动物、植物、真菌、细菌或病毒的基因组核酸)、质粒DNA、线粒体DNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA或合成的寡核苷酸或其他核酸分子。
特别地，所述方法可以另外包括初始逆转录步骤。例如，RNA(例如病毒基因组RNA、或细胞mRNA、或来自一些其他来源的RNA)可以通过本领域技术人员熟知的方法使用逆转录酶来合成DNA或cDNA。然后可以将DNA用作本发明的方法中的靶序列。原始RNA典型地会被逆转录酶的核糖核酸酶活性降解，但是如果需要，可在逆转录完成后添加另外的RNA酶H。RNA分子通常以比相应的(例如基因组)DNA序列更大的拷贝数存在于样品中，因此可以方便地从RNA分子制备DNA转录物以便有效地增加DNA序列的拷贝数。
“靶序列”是靶核酸中的碱基序列，并且可以指双链靶的有义链和/或反义链，并且除非上下文另有规定，否则还涵盖与初始靶核酸的以扩增的拷贝数再生的或复制的延伸产物或扩增产物相同的碱基序列。
靶序列可以存在于任何种类的样品中，例如生物或环境样品(水、空气等)。生物样品可以是例如食物样品或临床样品。临床样品可包括以下这些：尿液、唾液、血液、血清、血浆、粘液、痰液、泪液或粪便。
在与引物接触之前，样品可以或可以不经过处理。这种处理可包括以下一个或多个方面：过滤、浓缩、部分纯化、超声处理、化学裂解等。此类方法是本领域技术人员熟知的。
本发明的方法涉及使用切口位点和用于在切口位点处产生切口的手段。“切口”是完全或至少部分双链核酸分子的仅一条链的磷酸二酯骨架的切割。切口位点是分子中产生切口的位置。
在优选的实施例中，“切口识别位点”将存在于切口位点处、内部或旁边。(在此上下文中“旁边”意指切口识别位点的最近碱基在切口位点的10个碱基内，优选在切口位点的5个碱基内)。
切口识别位点可以包含限制性核酸内切酶识别位点的至少一条链，并且切口位点可以包含核酸碱基序列的至少一条链，所述核酸碱基序列当作为双链分子存在时，被限制性核酸内切酶切割。典型地，限制性核酸内切酶将切割双链核酸分子的两条链。在本发明中，通过在切口位点处或附近掺入一个或多个经修饰的碱基可以避免双链断裂，这些经修饰的碱基使得核酸链不易被限制性核酸内切酶切割。以这种方式，通常切割双链核酸分子的两条链的限制性核酸内切酶可用于将单链切口引入双链分子中。适于实现此目的的经修饰的碱基等是本领域技术人员熟知的，并且包括例如所有α磷酸修饰的核苷三磷酸和α硼代修饰的核苷三磷酸，具体地讲；2’-脱氧腺苷5’-O-(硫代三磷酸)、5-甲基脱氧胞苷5’-三磷酸、2’-脱氧尿苷5’-三磷酸、7-脱氮-2’-脱氧鸟苷5’-三磷酸、2’脱氧鸟苷-5’-O-(1-硼代三磷酸)和其他核苷三磷酸。包含经修饰的碱基的三磷酸盐可以存在于用于执行扩增过程的反应混合物中，使得在后续数轮扩增期间在相关的位置掺入经修饰的碱基，以防止形成可被核酸内切酶切割的双链位点。
然而，在优选的实施例中，通过切口酶在切口位点产生切口。切口酶是在正常情况下仅在双链核酸分子中产生单链断裂的分子。切口酶典型地具有切口识别位点，并且切口位点可以在切口识别位点内，或者可以是识别位点的5’或3’。许多切口酶是本领域技术人员已知的并且是可商购获得的。切口酶的实例的非详尽列表包括：Nb.Bsml、Nb.Bts、Nt.Alwl、Nt.BbvC、Nt.BstNBI和Nt.Bpu101。后一种酶可从赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)商购获得；其他的可从例如新英格兰生物学实验室公司(NewEngland Biolabs)获得。
在优选的实施例中，在方法开始时将切口酶引入反应混合物中(例如，在使样品与引物和DNA聚合酶接触的一分钟内)。然而，在一些情况下，可能需要在较长的延迟后将切口酶引入反应混合物中(例如，以使温度降至更接近切口酶的最适温度)。
本发明的方法涉及使用DNA聚合酶。优选但不是必须地，本发明的方法包括使用至少一种嗜热DNA聚合酶(即，具有超过60℃的最适温度)。优选地，DNA聚合酶是链置换聚合酶。优选地，DNA聚合酶不具有核酸外切酶活性。优选地，DNA聚合酶是没有核酸外切酶活性的链置换聚合酶，并且还优选地是嗜热的。
优选的DNA聚合酶的实例包括Bst聚合酶、DNA聚合酶、9oN聚合酶、Manta1.0聚合酶(凯杰公司(Qiagen))、BstX聚合酶(凯杰公司)、SD聚合酶(Bioron股份有限公司)、Bsm DNA聚合酶、大片段(赛默飞世尔科技公司)、Bsu DNA聚合酶、大片段(NEB公司)、以及“Isopol”TM聚合酶(来自ArcticZymes)。
下表给出了切口酶和DNA聚合酶的组合的实例，以及使用示例性酶组合用于进行本发明的方法的建议的上限和下限温度。尽管此表列出了特异性DNA聚合酶，但这些特异性DNA聚合酶仅是示例性的，并且在规定温度范围内任何链置换无核酸外切酶活性(具有活性的聚合酶)就足够了，例如：Deep Vent(外切)，Bst DNA聚合酶I、II和III，Manta 1.0 DNA聚合酶，Bst X DNA聚合酶，Bsm DNA聚合酶，IsoPol DNA。聚合酶
在一些实施例中，本发明的方法可以方便地包括预扩增或富集步骤。这是使靶序列与正向引物和反向引物以及DNA聚合酶接触但无切口酶的步骤。这典型地持续约1至5分钟并产生约1,000倍的靶序列的初始(线性)扩增，如果靶序列以低拷贝数存在于样品中，这可能是特别有用的。
在一些实施例中，使用嗜中温DNA聚合酶诸如得自海洋泉古菌亲缘种(Cenarchaeum symbiosum)的Exo-Minus克列诺DNA聚合酶或Exo-Minus嗜冷DNA聚合酶，在低于50℃的温度下进行预扩增或富集步骤，随后将混合物加热至高于50℃的温度，以使不耐热DNA聚合酶变性或失活，然后添加嗜热DNA聚合酶用于下游扩增。
典型地，本发明的方法包括检测步骤，其中检测扩增过程的一种或多种直接或间接产物并任选地进行定量，这表明样品中靶的存在性和/或量。已知有许多适合的检测和/或定量技术，包括：凝胶电泳、质谱法、横向流捕获、掺入带标记的核苷酸、嵌入或其他荧光染料、酶标记、电化学检测技术、分子导标和其他探针，尤其是特异性杂交的寡核苷酸或其他含核酸的分子。
在检测步骤中检测到的一种或多种产物在本文中可称为“检测靶”。与检测步骤相关的“靶”不一定与扩增过程中的“靶”相同，实际上两种分子通常至少在某种程度上是不同的，尽管它们可能具有一些共同的序列(通常为10至20个碱基)，其中检测靶包含核酸分子或寡核苷酸。
核酸检测方法可以采用允许特异性检测双链DNA的染料。在与DNA或RNA结合时表现出增强荧光的嵌入染料是熟知的。染料可以是例如DNA或RNA嵌入荧光团，并且可以尤其包括以下这些：吖啶橙、溴化乙锭、Pico Green、碘化丙啶、SYBR I、SYBR II、SYBR Gold、TOTO-3(噻唑橙二聚体)Oli Green和YOYO(噁唑黄二聚体)。
核酸检测方法还可以采用直接掺入到检测靶序列中的或含有与所关注的检测靶互补或基本互补的序列的探针中的带标记核苷酸。合适的标记可以是放射性的和/或荧光的，并且可以由本领域常规的任何方式分辨。可以被检测但是以其他方式起天然核苷酸的作用(例如，被天然酶识别并且可以作为天然酶的底物)的带标记核苷酸将与经修饰的核苷酸不同，后者不起天然核苷酸的作用。
可以使用分子导标来检测和监测靶核酸和核酸序列的存在性和/或量。分子导标是发夹状寡核苷酸，其一端含有荧光团，相反一端含有淬灭染料(“淬灭剂”)。发夹的环包含与检测靶序列互补或基本上互补的探针序列，而茎通过对位于探针序列任一侧的自身互补或基本上自身互补的序列的退火来形成。
荧光团和淬灭剂结合在导标的相反两端处。在阻止分子导标与其靶杂交的条件下或当分子导标在溶液中游离时，荧光团和淬灭剂彼此接近，从而防止荧光。当分子导标遇到检测靶分子时，发生杂交；环结构转变成稳定的、更刚性的构象，导致荧光团和淬灭剂分离，从而发生荧光(Tyagi等人1996,Nature Biotechnology[自然生物技术]14:303-308)。由于探针的特异性，荧光的产生基本上完全归因于预期的扩增产物/检测靶的存在。
作为一般规则，分子导标在较低的杂交温度下效果更好，因为信噪比随温度升高而降低。这是因为在下限温度下，分子导标的自互补“茎”部分保持牢固杂交，从而使淬灭剂淬灭荧光团，但是随着温度的升高，分子的茎部分可以开始熔化，从而导致非特异性荧光背景的“噪音”增加。
分子导标是高度特异性的，并且可以区分差异在于单个碱基的核酸序列(例如，单核苷酸多态性)。分子导标可以用不同颜色的荧光团和不同的检测靶互补序列合成，使得同一反应中的若干不同的检测靶能够被同时检测和/或定量，从而允许单个PoC测定的“多重化”以检测多种不同的病原体或生化标记物。对于定量扩增过程，分子导标可以在扩增后特异性结合到扩增的检测靶，并且因为非杂交的分子导标不发荧光，所以不必分离探针-靶杂交体就能定量测定扩增产物的量。所产生的信号与扩增产物的量成比例。这可以实时完成。与其他实时格式一样，必须针对每个引物/探针组优化特定的反应条件，以确保准确度和精确度。
还可以通过荧光共振能量转移(FRET)对检测靶核酸和核酸序列的产生或存在进行检测和监测。FRET是以下两种荧光团之间的能量转移机制：供体和受体分子。简而言之，供体荧光团分子在特定的激发波长下被激发。当供体分子返回其基态时由供体分子产生的随后发射可以将激发能量转移到受体分子(通过长程偶极-偶极相互作用)。FRET是量化分子动力学的有用工具，例如，在如分子导标所见到的一样的DNA-DNA相互作用中。为了监测特异性产物的产生，探针可以在一端用供体分子标记，在另一端用受体分子标记。探针-检测靶的杂交引起供体和受体的距离或取向的变化，并观察到FRET性质的变化。(JosephR.Lakowicz.“Principles of Fluorescent Spectroscopy”[荧光光谱学原理],PlenumPublishing Corporation[普莱南出版公司],第2版,(1999年7月1日))。
检测靶核酸的产生或存在也可以通过横向流装置检测和监测。横向流装置是熟知的。这些装置通常包括固相流体可渗透的流动路径，流体通过毛细管力流过所述流动路径。实例包括但不限于试纸测定和具有各种适当涂层的薄层色谱板。固定在流动路径中或流动路径上的是用于样品、结合伴侣或涉及样品的结合伴侣的缀合物的各种结合试剂，以及信号产生系统。分析物的检测可以按若干不同的方式实现，这些方式包括：酶检测、电化学检测、纳米粒子检测、比色检测和荧光检测。酶检测可涉及酶标记的探针，这些探针与横向流装置表面上的互补或基本上互补的核酸检测靶杂交。可以用合适的标记物处理所得的复合物以产生可读信号。纳米粒子检测涉及可以使用胶体金、乳胶和顺磁性纳米粒子的珠粒技术。在一个实例中，珠粒可以与抗生物素抗体缀合。靶序列可以直接生物素化，或者靶序列可以与序列特异性生物素化探针杂交。金和乳胶产生肉眼可见的比色信号，而顺磁性粒子在磁场中激发时产生非视觉信号并且可由专门的阅读器解读。
基于荧光的横向流检测方法也是已知的，例如，双重荧光素和生物素标记的寡核苷酸探针方法，或使用量子点。
核酸也可以捕获在横向流装置上。捕获手段可包括抗体依赖性和抗体非依赖性方法。抗体非依赖性捕获通常使用两个结合伴侣之间的非共价相互作用，例如，生物素化探针与链霉亲和素捕获分子之间的高亲和力和不可逆键合。捕获探针可以直接固定在横向流膜上。
本发明的整个方法或至少所述方法的扩增过程部分可以在反应容器(例如传统的实验室塑料试剂管，例如得自)中进行，或者可以在固相载体中和/或上进行。固相载体可以是多孔的或无孔的。在特别的实施例中，固相载体可包含多孔膜材料(诸如硝酸纤维素等)。更特别地，固相载体可包含多孔横向流测定装置或形成多孔横向流测定装置的一部分，如上所述。替代性地，固相载体可包含微流体型测定或形成微流体型测定的一部分，其中将一根或多根固体窄孔毛细管用于沿测定装置输送液体。
在优选的实施例中，可以使用护理点(PoC)测定装置进行本发明的方法的全部或至少部分。PoC设备典型地具有以下特征：制造便宜，在单次使用后丢弃，通常是独立的，不需要任何其他设备或器材来执行测定或解读测定，并且理想地，不需要临床知识或培训便可使用。
由于在典型的实施例中，热穿梭的上限和下限温度之间的温差很小，因此本发明的方法特别适合使用PoC型设备来进行。因此，相对而言，相对简单的热穿梭/温度调节足以进行qPCR。
尽管如此，本发明的扩增方法也可以代替qPCR在基于实验室的系统(而不是PoC设备)中使用，并且典型地可以比进行qPCR更快地获得定量结果。
本文披露了适用于本发明的引物的实例。可以适用于本发明的方法的其他实例披露于，尤其是US 2009/0017453、US 2013/0330777和EP 2,181,196中，其内容通过引用并入本文。本领域技术人员将能够容易地设计适合于扩增其他靶序列的其他引物而无需过多的实验。
如别处所解释的，本发明中使用的引物将优选地不仅包含靶互补部分，还包含切口核酸内切酶结合位点和切口位点，以及稳定部分。
用于本发明的方法的引物可包含经修饰的核苷酸(即，在天然存在的核酸分子中未发现的核苷酸)。此类经修饰的核苷酸可以方便地存在于引物的靶互补部分和/或引物中的其他位置。经修饰的核苷酸的优选实例是2'-修饰的核苷酸，尤其是2’O-甲基修饰的核苷酸，尽管许多其他经修饰的核苷酸是本领域技术人员已知的。
现在将通过说明性实例并参考附图进一步描述本发明的特征，其中：
图1A和图1B分别是适用于执行本发明的方法的核酸扩增反应的起始阶段和指数扩增阶段的示意图；
图2是示出了在执行本发明的方法期间反应混合物的典型温度曲线的图(以℃为单位的温度相对于以分钟为单位的时间)；
图3是可用于执行本发明的方法的引物寡核苷酸分子的典型实施例的示意图；
图4-5C是根据本发明的方法，使用不包含或包含不同数目的2’0-甲基化的碱基的引物分子进行扩增反应的(减去背景的)荧光(以任意单位计)相对于时间(秒)的图。
图6是示出了用于根据本发明的方法，和根据WO 2018/002649中披露的STAR方案(中图)或等温反应方案(右图)进行的方法以实现扩增的平均时间(AT，以分钟为单位计)(如通过产生高于背景阈值的荧光信号所判断得)的散点图；
图7和图8分别是用于表征本发明的方法的聚合酶活性测定和切口活性测定的示意图；
图9A和图9B是在各种温度下进行的聚合酶活性测定(图9A)或切口活性测定(图9B)的相对荧光(以任意单位计)相对于时间(以分钟计)的平均值(三个重复)的图；
图10A-11D是使用各种不同聚合酶使用常规PCR条件(图10A、10B)或根据本发明的“qSTAR”热穿梭条件(但不存在切口酶)(图11A-11D)尝试的扩增反应的相对荧光(任意单位)相对于循环数的图；
图12和图13示出了自使用未知浓度的起始样品，通过进行常规qPCR扩增(图12)或根据本发明的方法的“qSTAR”扩增(图13)获得的数据，结果总结在图13B中；
图14A-14D是荧光(任意单位)相对于时间(秒)的图，其示出了根据本发明的方法在不同温度范围内进行的扩增反应的结果；
图15是荧光(任意单位)相对于时间(分钟)的图，其示出了根据本发明的方法在38℃-45℃的温度下进行的扩增反应的结果；以及
图16是荧光(任意单位)相对于时间(分钟)的图，其示出了根据本发明的方法使用逆转录的RNA靶序列进行的扩增反应的结果。
实例
实例1：用于测试温度选择性定量扩增反应(qSTAR)的方案
通过如WO 2018/002649中所述的选择性温度扩增反应(STAR)或其他类似相关的DNA/RNA扩增技术(例如PCR、SDA或等温扩增技术)来定量基因表达将是不可靠的。产生的产物的量达到与初始起始样品中的靶DNA的量不直接相关的平台水平。通过建立可控温度穿梭对扩增反应的区域效应，可以使用链置换聚合酶和切口核酸内切酶实现定量扩增，其中扩增产物与DNA、RNA或其他已知核酸的初始起始量直接相关。根据本发明，基于切口酶的温度选择性扩增反应在本文中被称为温度选择性定量扩增反应(quantitative SelectiveTemperature Amplification Reaction，qSTAR)。除非另有说明，否则以下进一步描述所述方案。
酶、寡核苷酸和靶
将沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)用作开发qSTAR机制的初始靶。沙眼衣原体血清型J(ATCC VR-886)基因组DNA获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))。用引物qSTARctF61a(SEQ IDNO:1 5’-CGACTCCATATGGAGTCGATTTCCCCGAATTA-3’)和qSTARctR61c(SEQ ID NO:25’-GGACTCCACACGGAGTCTTTTTCCTTGTTTAC-3’)扩增隐蔽性质粒的可读框6区。如EP No.0728218中所述，使用分子导标qSTARctMB1(SEQ ID NO:3,5’-FAM/ccattCCTTGTTTACTCGTATTTTTAGGaatgg/BHQ1-3’)检测所得的DNA模板。Bst X DNA聚合酶购自凯杰公司(马萨诸塞州贝弗利的贝弗利(Beverly，MA))。Nt.BstNBI切口核酸内切酶购自新英格兰生物学实验室公司(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))，并且描述于美国专利号6,191,267。除非另有说明，否则相同的聚合酶和切口核酸内切酶也用于本文所述的其他实例中。
寡核苷酸和分子导标由集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)(爱荷华州克拉尔维尔(Coralville，IA))和生物合成公司(Bio-Synthesis)(德克萨斯州刘易斯维尔(Lewisville，TX))合成。在qSTAR反应中使用的引物的一般特征如WO 2018/002649中所述。
在本发明的一个实施例中的反应中发现的寡核苷酸和扩增机制的总结包括：(i)靶核酸分子；(ii)两种或更多种引物寡核苷酸分子，其包含一些数目的与靶核酸分子互补的寡核苷酸，以及(iii)引物中的可被切口酶产生切口的位点。所述方法涉及在选择性温度扩增条件下，使靶核酸分子与聚合酶、两种或更多种引物寡核苷酸(其中每一种与靶核苷酸分子上的互补序列特异性结合)、和切口酶接触，生成可检测的扩增子，所述扩增子包含已与引物寡核苷酸结合的靶序列的至少一部分。整个qSTAR反应可以被理解为经历两个不同的阶段；即起始和指数扩增，分别在图1A和1B中示意性地示出。起始阶段是蛋白质-引物双链体的初始形成，由所述双链体可以发生指数扩增的初始延伸。指数阶段是切口酶与聚合酶一起激活导致指数扩增的时间。在图1A中，发生引物与靶核酸的初始接触(步骤a)，然后发生聚合酶延伸(步骤b)，此步骤产生正向起始模板(c)。相反链引物与新产生的正向起始模板结合(步骤d)，从而在朝向并通过起始模板的切口位点的方向上延伸(步骤e)。此起始可以同时发生在正向链和反向链上。可以将此初始过程理解为主要涉及聚合酶延伸，但是基本上几乎没有或没有切口酶。
在图1A中，靶显示为单链。这是出于清楚和简单的目的。实际上，执行本发明的方法无需使用高温来“熔化”或分离双链靶多核苷酸的链-而是，引物能够通过利用链之间氢键的局部松弛(这种现象称为“呼吸”)的优势与(双链)靶分子结合。
在(在此实施例中，较低的)第二选择性温度下，在两条链中的任一条链上均有利于切口，从而使链置换聚合酶朝着相反引物延伸并穿过切口位点。切口/聚合酶延伸的这一循环导致指数双链体的形成(图1B)。然后，由于从切口和延伸处产生的每个新模板成为另一种引物的靶，所述指数双链体将被注入双向扩增。将温度穿梭回聚合酶特异性延伸的起始阶段，从而在离散相中限制背景扩增并控制指数扩增。
通过控制温度，并且因此控制聚合酶和切口核酸内切酶的活性，申请人已经获得了用于快速和可控扩增的方法，允许定量未知靶输入。
图2示出了根据本发明的扩增反应的一个实施例的典型温度曲线(℃相对于时间(以分钟计))。在说明的实施例中，聚合酶的最适温度比切口酶的最适温度更高。上限温度是63℃，下限温度为57℃。在下限温度下的停留时间(约5秒)比在上限温度下的停留时间(约2秒)更长。每次完整的温度穿梭持续约8-9秒，从而每分钟完成约7次热穿梭。在穿梭的一半上限温度(>60℃)中，反应的起始阶段(参见图1B)是有利的，并且占主导地位。本领域技术人员将理解，扩增反应的两个阶段之间没有急剧的温度差异，并且图2中所示的分隔线仅是帮助理解。
定量选择性温度扩增的方案令人惊讶地导致定量、快速、特异性和高产率的扩增反应，其性能显著高于先前现有的方法，如将在下面进一步更详细的解释和说明的。
扩增条件
基本的qSTAR混合物包含两种引物：聚合酶和切口酶(上文提及的)。将反应以25μl的最终体积进行，所述体积包括1.0μM的正向引物、0.5μM的反向引物、0.25μM的分子导标、10μl的qSTAR主混合物(Master Mix)和5μl的DNA样品。qSTAR主混合物含有以下试剂；12.5mM MgSO4、90mM Tris-HCl(pH8.5)、300μM每种dNTP、20mM NH4OAc、30mM NaOAc、2mMDTT、0.02％ Triton X-100、15U切口核酸内切酶和60U聚合酶。在两个不连续的温度阶段之间控制反应温度，以利用固有的酶活性。主要由聚合酶活性组成的起始阶段在62℃的升高的温度下持续2秒。(在此温度下，切口酶在很大程度上被抑制-参见图9B)。在聚合酶和切口酶均具有中等或高活性的指数阶段在57℃保持5秒。一次完整的穿梭的总时间为15秒。由于设备在温度变化方面的限制，因此这在每个温度下停留时间超过一倍(更多响应的仪器允许在上限和下限温度之间快速穿梭)。使用Agilent Mx3005 P qPCR设备(安捷伦公司(Agilent))进行扩增和qSTAR产物检测。
每个反应均进行预孵育，以使试剂达到反应温度并测试温度对扩增动力学、酶性能和信号荧光的影响。
扩增程序
进行扩增反应的确切步骤如下：1)制备主混合物；2)制备具有靶或无靶的引物；3)取决于每块板要进行的反应次数，将引物混合物添加到96孔板的A-G排中；4)将主混合物添加到同一96孔板的H排中；5)密封板并进行15秒的预反应孵育；6)将主混合物从H排转移到每个引物混合物排；7)密封并启动预选的温度分布和数据收集。
在反应期间，如下所述，使用分子导标在每个指数阶段结束时测量扩增产物。监测反应混合物中分子导标的荧光，以测量在反应期间产生的特异性产物的量，所述产物与分子导标结合，将荧光团与猝灭剂进行分离，从而产生荧光。
实例2：使用未经修饰的引物的结果
为了证明这种新型扩增技术的潜力，使用跨越6个对数基因组DNA输入的每个靶稀释液重复四次，并且对无靶对照(NTC)重复两次，来进行qSTAR。使用未经修饰的引物(即不含任何化学修饰的异常核酸碱基的引物分子)的实验结果示于图4中。通过暗线(“ntc”)指示“无靶对照”的信号量(减去背景的荧光)。通过相应的线指示在存在20cp、200cp、2k、20k、200k和2M拷贝的靶(沙眼衣原体基因组DNA)的情况下产生的信号量。
qSTAR反应显示了靶输入的线性确定系数，同时还证明了在速度、灵敏度和总荧光方面的改进。令人惊讶和出乎意料的是，可以通过控制两个接近但明显不同的温度区域之间的反应温度实现靶输入之间的这种改进和分离。
在不将发明人限制于任何特定理论的情况下，据信，扩增的改进可归因于至少两个特征。在大多数核酸扩增反应中，最终形成引物二聚体，从而竞争有限的试剂，并且在低靶浓度下，引物二聚体可以潜在地变成反应的主要扩增途径。限制或延迟引物二聚体的形成，即使是抑制少量形成，也提供了显著的益处。由于扩增反应的快速性质，延迟引物二聚体的形成允许优选的扩增途径占优势(即模板产生)，从而改进扩增的所有方面。通过在升高的温度下引发反应，这些模板途径变得占优势，甚至是优选的。这可以通过qSTAR方法中改进的灵敏度和速度、改进的荧光信号、更紧密的复制以及提高的速度而看出。
起始阶段期间，反应在升高的温度(62℃)下进行。这种升高的温度选择性地抑制了切口酶，而没有对其造成永久性功能性破坏(如结合扩增和图9B所示的，在其他地方描述的)。此起始阶段期间，由于反应温度相对接近聚合酶的最适温度，因此相对有利于聚合酶，允许快速和特异性延伸。
在反应的起始阶段后，将温度降低至接近切口酶的最适温度的温度，从而导致效率提高并使得模板的产生增加。由于所期望的模板途径比偏离的途径占优势，因此特异性和敏感性大大提高，qSTAR的温度穿梭和酶的选择性活性调节进一步促进了所述特异性和敏感性。
将反应混合物在62℃至57℃之间连续穿梭，以得到可用于精确定量的可控的快速扩增技术。
本发明的新颖的非等温扩增方法提供了对许多类型的现有扩增反应(包括等温反应和依靠高温进行双链体解离的那些反应)的实质性改进。通过由“温度门控”控制酶活性并优化反应动力学，本发明的方法改进了扩增的一致性和控制，同时增加了检测的灵敏度，以允许可靠及精准的定量。
实例3：使用2’O-甲基修饰的引物的结果
如美国专利6,794,142和6,130,038中所述，已知使用2'O-甲基修饰的引物可减少扩增期间引物二聚体的形成。US 2005-0059003描述了位于SDA引物的3’端的2'O-甲基修饰的使用，表明Bst DNA聚合酶I和衍生物可以有效地利用2'-修饰的核糖核苷酸作为用于DNA合成的引物。包含一个或多个2'修饰的核苷酸(例如，2'-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟代、2'-烯丙基、2'-O-[2(甲基氨基)-2-氧乙基]、2'-羟基(RNA)、4'-硫代、4'-CH3-O-2'-桥、4'-(CH3)3-O-2'-桥、2'-LNA和2‘-O-(N-甲基氨基甲酸酯2'-Suc-OH))的靶特异性引物区会改进扩增反应。使用如前述实例所述的酶选择性温度穿梭(62℃-57℃)以及朝向引物的3’的2’-O-甲基化的单碱基或2’-O-甲基化碱基串进行反应(在图3中示意说明)。
使用在3’端包含一个或多个2’修饰的核苷酸的引物的扩增结果示出于图5A-5C中。跨越所有五个对数输入gDNA浓度，以最少四次重复进行反应，并进行无靶对照反应。如图所示，跨越五个对数范围的反应是定量的，并且确定系数大于0.99(为简洁起见，将数据省略)。通过使用由Pfaffl在“A new mathematical model for relative quantificationin real-time RT-PCR[用于实时RT-PCR的相对定量的新型数学模型]”(2001,Nucl.AcidsRes.[核酸研究]29(9)e45)中所述的相似的方法来计算确定系数。通过鉴定指数阶段EP超过背景荧光的起始位置来确定扩增的EP的起点。通过平均每个反应的前三个读数来计算背景荧光。然后基于当每个反应的相对荧光达到2,000时的时间来确定EP。使用每个反应的已知输入，使用线性回归算法对EP进行评估，以确定跨越对数值的确定系数。生成此标准曲线并计算线性度，典型地qSTAR反应生成R方根为.99或更大。
数据表明(图5A)，使用并入了单个2’O-甲基化的核苷酸的引物会使扩增反应停滞，减慢反应速度以便跨越所有输入浓度获得更好的分辨率。此外，使用qSTAR方法不仅改进了2’O-甲基扩增的使用，还说明了此方法具有已知扩增修饰的功能。如图5B和图5C所示，沿着引物并入另外的2’O-甲基化的碱基改进了扩增的分离，或自基线上升以允许更高的分辨率，从而改进技术的定量能力。本质上，通过减慢由使用2’O-甲基化的碱基而引起的反应，来改进每种浓度之间的分离：例如，使用未修饰的引物时，具有从基线上升中的一个循环分离的反应在使用并入了2’o-甲基化碱基的引物时示出了2个循环的分离。这表明尽管在本发明的示例性方法中2’O-甲基修饰确实减少了非特异性、偏离的扩增的产生，但是这些修饰的更大益处是控制反应速率以便允许更高的分辨率和更多定量的扩增。
在不将申请人限制于任何特定理论的情况下，假设通过在引物区中使用一个或多个2'修饰的核苷酸获得的潜在改进主要归因于扩增起始阶段的增强。初始延伸阶段期间，两个事件有助于说明本发明的扩增反应中2'修饰的核苷酸的活性。首先，已知2'O-甲基化碱基可降低DNA/DNA双链体的解链温度，通过趋于抑制模板::模板相互作用从而减少由引物之间相互作用形成的非特异性复合物的聚合酶延伸的机会而导致更可控的起始。第二，当核苷酸进入结合袋时，聚合酶可能停滞。在非生产性反应(即，脱靶或引物二聚体形成)中，停滞效应足以使异常延伸最小化，因为模板结合接近其解链温度。因此，2'修饰能够限制非期望扩增途径，因为反应已陷入困境。qSTAR能够利用2'修饰并更好地调节靶扩增来调整反应，从而改进定量能力。这种聚合酶停滞进一步解释了为什么qSTAR与2'O-甲基修饰相结合可相互促进。在本发明的示例性方法中发现的起始聚合酶温度区域(除了减少引物二聚体的形成以外)以可控和可靠的方式减慢了起始。此外，由于qSTAR反复穿梭于下限温度，所以随着反应的进行，可以减少由2'修饰引起的解链温度的降低。
实例4：可重复性
为了验证qSTAR技术，进行了大型重复研究，所述研究对qSTAR性能相对于STAR的性能和如美国专利9,562,263中所述的已公布的等温条件进行比较。对于包含靶的反应使用100次以上的重复实验，对于不含靶的对照反应混合物使用16次重复实验，进行了扩增(qSTAR相比STAR相比等温)。所有条件都使用相同的缓冲液、聚合酶、切口酶和靶。如图6中的散点图所示，qSTAR和STAR扩增示出了实现达到荧光阈值水平(TL)的扩增的平均时间(AT)的明显改进、灵敏度的改进和各重复实验之间的标准偏差的降低(与等温扩增反应相比)。根据本发明进行的反应的AT时间为2.38分钟，而根据常规等温方案进行的反应的AT值为4.12分钟，差异具有统计显著性(双尾测试)。(注意-失败的反应显示为10分钟的扩增时间-反应进行的最长时间)。此外，在速度方面，qSTAR方法是对STAR方法的改进。qSTAR技术表明了最紧密的重复、最高的灵敏度、最快的扩增速度以及最少的异常值。不将申请人限制于任何特定理论，扩增时间的显著缩短被认为是由于改进的反应起始(从而允许更有效的低拷贝扩增)、最小化的引物二聚体事件，并且增加的特异性产物延伸允许比以前披露的方法更快地产生产物。通过利用切口酶和聚合酶的活性来获得更紧密的重复，从而为所期望的模板的特异性、快速和可控扩增产生多种机会。
实例5：qSTAR功能
本发明的方法的特性特征包括在扩增过程中通过使用小的温度变化来调节酶活性，所述温度变化远小于例如在qPCR进行期间经历的变化。为了验证切口酶在起始阶段具有降低的活性，但在指数阶段具有高活性，发明人开发了两种独特的蛋白质活性测定法：聚合酶活性测定(“PAA”)和切口活性测定(“NAA”)。
聚合酶活性测定设计、酶和寡核苷酸：
用于PAA的合成寡核苷酸由集成DNA技术公司(爱荷华州克拉尔维尔)合成。设计由三个寡核苷酸组成；模板寡核苷酸(NEF)(SEQ ID NO:45’-/56-FAM/ACCGCGCGCACCGAGTCTGTCGGCAGCACCGCT-3’)、引物寡核苷酸(PO)(SEQ ID NO:55’-AGCGGTGCTGCCGACA-3’)、和淬灭寡核苷酸(POQ)(SEQ ID NO:6 5’-GGTGCGCGCGGT/3BHQ_1/-3’)。这三种寡核苷酸在溶液中共同形成各自具有独特功能的复合物，如图7所示。NEF具有5'荧光团，POQ具有吸收5'模板寡核苷酸荧光团释放的光子的3'淬灭部分。PO作为链置换聚合酶延伸和置换淬灭寡核苷酸的起始位点，由于淬灭寡核苷酸不再接近模板寡核苷酸，从而允许产生荧光。高活性链置换聚合酶与较低活性聚合酶或缺乏链置换活性的聚合酶相比，以增加的速率产生荧光信号。
聚合酶活性测定条件
基本的聚合酶活性分析(PAA)混合物含有具有5'-FAM修饰的模板寡核苷酸(NEF)、退火至模板的3-末端的引物寡核苷酸(PO)、带有退火至模板的5’-末端的3'-BHQ1修饰的淬灭寡核苷酸(POQ)、以及测试中的聚合酶(上文提及的)。将反应以25μl的最终体积进行，所述体积包括0.2μM NEF、0.3μM PO、0.7μM POQ和1X PAA主混合物。在1X浓度下，PAA主混合物含有以下试剂；12.5mM MgSO4、90mM Tris-HCl(pH8.5)、300μM每种dNTP、15mM NH4CH3CO2、15mM Na2SO4、5mM DTT、0.2mg/ml BSA、0.02％Triton X-100、20mM Rb2SO4、10mM L-Threonine、和0.03U/μl聚合酶。等温进行反应以在特定温度下确定所选酶的活性。用Agilent Mx3005P qPCR设备(安捷伦公司)进行PAA。每个反应已进行预反应孵育，以使试剂达到一定温度以测试所选温度的影响，并防止由于加热的反应发生任何变化。对每个反应评估扩增动力学、酶性能和信号荧光。
切口活性测定(NAA)设计、酶和寡核苷酸：
用于NAA的合成寡核苷酸由集成DNA技术公司(爱荷华州克拉尔维尔)合成。所述测定涉及两种寡核苷酸；模板寡核苷酸(NEQ)(SEQ ID NO:75’-ACCGCGCGCACCGAGTCTGTCGGCA/3BHQ_1/-3’)和引物寡核苷酸(POF,SEQ ID NO:85’-/56-FAM/CTGCCGACAGACTCGGTGCGCGCGGT-3’)。这些寡核苷酸在溶液中共同形成各自具有独特功能的复合物，如图8所示。模板寡核苷酸具有用于对核酸内切酶活性产生切口的切口位点，并且在下游具有3’淬灭剂。引物寡核苷酸具有互补的切口位点序列和5'荧光团。当在溶液中时，两者形成复合物，所述复合物完成切口结合位点以使切口核酸内切酶被切割。寡核苷酸淬灭剂切口位点的3’通过切口核酸内切酶产生切口后，现在具有低解链温度。因为反应是在高于此解链温度下进行的，所以使含有猝灭剂的缩短片段从复合物中释放，导致未猝灭的荧光。切口酶越活跃，产生的荧光信号就越快且越大。
切口活性测定条件
基本的NAA混合物含有具有3’-BHQ1修饰的模板寡核苷酸(NEQ)和具有退火至模板的5’-FAM修饰的引物寡核苷酸(POF)、以及待测试的切口核酸内切酶。将反应以25μl的最终体积进行，所述体积包括1.3μM NEQ、1.6μM POF和1X NAA主混合物。在1X浓度下，NAA主混合物含有以下试剂：12.5mM MgSO4、90mM Tris-HCl(pH 8.5)、15mM NH4CH3CO2、15mM Na2SO4、5mM DTT、0.2mg/ml BSA、0.02％ Triton X-100、20mM Rb2SO4、10mM L-苏氨酸、和0.008U/μl切口核酸内切酶。等温进行反应以在特定温度下确定所选酶的活性。用Agilent Mx3005PqPCR设备(安捷伦公司)进行NAA。每个反应已进行预反应孵育，以使试剂达到一定温度以测试所选温度的影响，并防止由于加热的反应发生任何变化。对每个反应评估扩增动力学、酶性能和信号荧光。
酶的温度曲线
图9A示出了六个等温条件下的聚合酶活性测定。在63℃下，聚合酶具有最强的活性和动力学，如通过荧光曲线和总荧光的斜率确定的。随后每次温度下降(60℃、55℃、50℃和45℃)表明活性都会降低直至达到40℃。在这种低温下，聚合酶的活性似乎基本上不存在。
图9B示出了六个等温条件下的切口活性测定。与聚合酶测定不同(聚合酶测定是示出了qSTAR方法的优选温度范围的上限端有明显的最佳温度)，切口活性测定示出了qSTAR方法的优选温度范围的下限端有最佳温度(约55℃)，同时表明在63℃下几乎没有活性。所有其他温度显示出切口酶具有一定程度的活性。
来自这些测定的数据证明了qSTAR技术的独特性质。与其他依靠链置换和/或温度分离的扩增方法不同，qSTAR独特地使用“温度门控”来调节酶活性并控制快速扩增。认识到这些酶和温度依赖性对活性的独特特征，发明人开发了新型快速、特异性、可控的扩增技术，所述技术可以在六分钟内定量未知样品的输入。
不受任何特定理论束缚，据信在此实例中，qSTAR涉及切口酶的活性调节，因为它在两个温度之间扩增。在上述示例性系统中，63℃和57℃是优选的温度选择(基于当前蛋白质活性曲线)，因为它们允许可控扩增，这是任何定量技术的需求。进一步据信，控制两种中任一种酶的活性是所期望的，以管理已知的有效扩增事件用于定量未知核酸材料。
实例6：使用qPCR聚合酶的qSTAR扩增结果
为了证明qSTAR相对于其他扩增技术(例如PCR)的出乎意料的特性，与常见PCR聚合酶进行了比较，表明常见的PCR聚合酶和方法在qSTAR方法中无活性。如下所述，将四种PCR聚合酶(Vent、DeepVent、Taq和Phusion)用于qPCR方法中的扩增，并与qSTAR方法进行比较。因为分子导标仅测量特定单链DNA产物的总量的增加，所以不能独立于预期的扩增产物测量非特异性扩增产物。为了测量所有扩增产物(例如包括产生于引物二聚体形成的扩增产物)的产生，将反应在SYBR Green I的存在下进行。SYBR Green I是已知用于检测单链DNA、RNA和双链DNA的最灵敏的染料之一。由于SYBR Green I具有低的固有荧光，因此对于检测特异性和非特异性反应中的总扩增是很好的选择，以证明常见的PCR聚合酶在qSTAR方法中是无活性的。
qPCR/qSTAR测定设计、主混合物和寡核苷酸：
用于内部qPCR分析(Ctx)的合成寡核苷酸由集成DNA技术公司(爱荷华州克拉尔维尔)合成，并设计用于扩增沙眼衣原体基因组DNA。所述设计由两种寡核苷酸组成；正向引物寡核苷酸(Ctx_L.F1,SEQ ID NO:9AAAAAGATTTCCCCGAATTAG)和反向引物寡核苷酸(Ctx_L.R1_3'(-2),SEQ ID NO:10 AGTTACTTTTTCCTTGTTT)。寡核苷酸由集成DNA技术公司(爱荷华州克拉尔维尔)合成。将SYBR Green I核酸染色剂(龙沙罗克兰公司，P/N 50513)用作插入染料，用于检测双链DNA(dsDNA)产品。使用的PCR主混合物和聚合酶来自新英格兰生物学实验室公司(马萨诸塞州伊普斯威奇)；10X Thermopol反应缓冲液、Vent(外切-)DNA聚合酶(P/N M0257S)、Deep Vent(外切-)(P/N M0257S)和Taq DNA聚合酶(P/N M0267S)、5XPhusion HF缓冲液和Phusion HF DNA聚合酶(P/N M0530S)。沙眼衣原体(菌株：UW-36/Cx)的基因组DNA(P/N VR-886D)是通过ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)购买的。
qPCR/qSTAR测定条件
基本的内部qPCR测定(Ctx)混合物含有正向引物寡核苷酸、反向引物寡核苷酸、dsDNA嵌入染料、已知浓度的基因组DNA模板、1X浓度的商业PCR主混合物及其相应的聚合酶(上述)。将反应以25μl的最终体积进行，所述体积包括0.3μM F1、0.3μM R1、0.1X SYBRGreen I、1X商业PCR主混合物、0.03U/μl聚合酶和5,000拷贝的基因组DNA模板。
使用两种方法进行内部qPCR测定；复制型qSTAR技术或常规qPCR技术的温度曲线。在qSTAR方法中，在两个不连续的温度阶段之间控制反应温度，以利用酶的活性。起始阶段基本上(仅聚合酶活性)是在62℃的升高的温度下持续两秒钟。指数阶段(聚合酶和切口酶活性)接近于在57℃下持续五秒钟的切口酶活性的最佳温度。整个穿梭的总时间是15秒，由于设备在温度变化方面的限制，因此这在最高和最低温度下停留时间超过一倍。使用2个步骤程序进行qPCR反应；95℃持续15秒，然后60℃持续60秒，循环50次。使用Agilent Mx3005P qPCR设备(安捷伦公司)进行扩增和qSTAR产物检测。
结果
在图10A-B中示出了与无靶对照(“ntc”)相比，五千拷贝的基因组沙眼衣原体DNA的qPCR扩增的实时数据。使用此qPCR方法清楚地看到所有聚合酶的扩增或活性。还应注意，四种聚合酶中的三种在无靶条件下显示出活性，这可能是由于引物二聚体形成。如果qSTAR方法类似于qPCR或先前报道的热循环扩增技术，则可以预期使用qSTAR方法的这些聚合酶中的全部或最少一种是活性的。
在图11A-11D中，实时数据表明所有上述四种聚合酶均无法在qSTAR温度穿梭方案下在无靶或使用10、100、1K、10K拷贝的基因组沙眼衣原体DNA的反应中显示出任何活性。令人惊讶的是，这些聚合酶中的一种(全部在其最佳温度范围内使用)，在孵育期间甚至不能显示出少量的活性。不将发明人限制于任何特定理论，这被认为是由于以下原因；(a)qSTAR条件要求链置换聚合酶与切口酶一起工作；没有酶的结合则扩增无法进行，因为产品转换无法进行；以及(b)PCR和其他循环方法依靠升高的温度(约95℃)以进行扩增进程的链分离的扩增；由于qSTAR方法不使用这种升高的温度，而是使用更中等的温度穿梭来控制酶活性(而不是用于链分离)，因此它可以帮助解释这些酶中的任何一种在qSTAR方案条件下均无法显示任何活性。
实例7：qSTAR相对于qPCR的结果
为了证明qSTAR的定量性质，相对于qPCR进行了比较。如果qSTAR是定量的，则期望此技术如与qPCR相比，具有高确定系数并且能够正确预测盲样品中的基因组DNA的量。
沙眼衣原体qPCR测定设计、主混合物和寡核苷酸：
设计用于沙眼衣原体qPCR测定(CtP)的合成寡核苷酸(1)，用于沙眼衣原体基因组DNA的扩增。所述测定涉及使用三种寡核苷酸；正向引物寡核苷酸、反向引用寡核苷酸和双标记探针。寡核苷酸由集成DNA技术公司(爱荷华州克拉尔维尔)合成。所用的PCR主混合物(PrimeTime基因表达主混合物(P/N 1055770)购自集成DNA技术公司(爱荷华州克拉尔维尔)。沙眼衣原体(菌株：UW-36/Cx)的基因组DNA(P/N VR-886D)是通过ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)购买的。
沙眼衣原体qPCR测定条件
基本的qPCR测定(CtP)混合物含有两种引物：聚合酶和基因组DNA。将反应以25μl的最终体积进行，所述体积包括0.3μM正向引物、0.3μM反向引物、0.1μM双标记探针、1X商业PCR主混合物和开始于100,000拷贝的各种浓度的基因组DNA模板。使用基因组DNA的10倍稀释液来生成标准曲线。如前所述，与以上标准曲线一起进行qSTAR。使用2个步骤程序进行qPCR反应；95℃持续15秒，然后60℃持续60秒，循环50次。
结果
图12示出了标准曲线和5个未知样品的qPCR实时数据。跨越5个对数范围，标准曲线的确定系数是0.9984。qPCR能够正确调用所有五个未知样品。图13示出了标准曲线和5个未知样品的qSTAR实时数据。跨越6个对数范围，标准曲线的确定系数是0.9981。qSTAR能够正确调用所有五个未知样品。表2示出了两种技术的总结比较，从总结清楚地看出，使用qSTAR技术用于定量时，qSTAR与qPCR相当。
表2
实例8：qSTAR升高的温度范围
qSTAR技术的另外的益处是能够跨越各种温度范围进行扩增。如美国专利号5,712,124、9,562,263、5,399,391和6,814,943中所述，大多数技术可以发生扩增的温度范围较窄，并且偏离这些范围会抑制反应。为了证明qSTAR的多能性，如下表3中所述进行了扩增。
表3
图14A、14B、14C和14D是荧光(任意单位)相对于时间(分钟)的图。图14A示出了从63℃开始的反应结果。图14B示出了从64℃开始的反应结果。图14C示出了从65℃开始的反应结果，并且图14D示出了从66℃开始的反应结果。在所有情况下，“无靶”阴性对照反应不产生任何荧光信号，而对于10、100和1,000拷贝具有良好扩增。尽管63℃反应的荧光信号稍高，但所有温度条件均在少于3分钟的时间内显示出强烈扩增。只要实现酶调节，则qSTAR方法就可以扩增良好。据信，高于62℃的任何温度都会显著降低切口酶活性(关于示例性切口酶，Nt.BstNBI)。
实例9：已知温度范围外的qSTAR
如美国专利6,814,943中所述的定量聚合酶链反应(qPCR)描述了热循环的温度范围。对于qPCR，典型地进行以下程序：约95℃变性，约55℃退火，约70℃延伸。如果一项技术可以在明显不同的温度区域中进行扩增，那将是令人惊讶和出乎意料的。此外，本领域技术人员不会期望一项技术工作于如此大的温度窗口。WO2011/030145A1描述了“波动”，其中测定温度在不超过15℃(但更优选地约5℃)的公布的等温温度设定点附近振荡。对于一些等温技术，此温度“振荡”考虑到改进的扩增动力学。如果qSTAR能够在显著不同的温度范围内工作并仍然实现扩增，那将是令人惊讶的。
扩增条件
低温qSTAR混合物含有两种引物(SEQ ID NO.11(5’-tGACTCCAcAcGGAGTCataaATCCTGCTGCmUA-3’)和SEQ ID NO.12(5’-TGACTCCAcAcGGAGTCAGAACCAACAAGAAGA-3’))、由ArticZymes(挪威特罗姆瑟(Tromso,Norway))提供的Isopol聚合酶、以及切口酶(先前所引用的)。将反应以25μl的最终体积进行，所述体积包括1.0μM的正向引物、0.5μM的反向引物、0.25μM分子导标(SEQ ID NO.13(5’-/56-FAM/tgaggTGCTGCTATGCCTCA/3IABkFQ/-3’))、10μl qSTAR主混合物和5μl DNA样品。qSTAR主混合物含有以下试剂；12.5mM MgSO4、90mMTris-HCl(pH 8.5)、300μM每种dNTP、20mM NH4OAc、30mM NaOAc、2mM DTT、0.02％ TritonX-100、12.5U切口核酸内切酶、75U聚合酶。在两个不连续的温度阶段之间控制反应温度，以利用固有的酶活性。指数阶段(主要由聚合酶和切口活性组成)在45℃的升高的温度下持续2秒。起始阶段(聚合酶具有高度活性并且切口酶具有大大降低的活性)在38℃下保持5秒。整个穿梭的总时间是15秒，由于设备在温度变化方面的限制，因此这在每次最高和最低温度下停留时间超过一倍。使用Agilent Mx3005 P qPCR设备(安捷伦公司)进行扩增和qSTAR产物检测。
结果
图15示出了在上述参考范围内进行qSTAR扩增的实时定量数据。首先要注意的事是，在此实例中，与先前的实例相比，已经切换了温度阶段：上限温度阶段用于指数扩增，其中两种酶均具有活性，而下限温度阶段用于起始，其中聚合酶具有高活性，并且切口酶相对被抑制。qSTAR与这种“低温”qSTAR之间的温差是24℃。令人惊讶和出乎意料的是，技术可以在如此大的温度范围内起作用，并且进一步证明此扩增方法不同于先前已知的任何扩增方法(就本发明人的知识所及)。
不将发明人限制于任何特定理论，据信qSTAR仍能够在这些低温下实现扩增，因为切口酶活性在下限温度下大大降低。酶的这种门控允许模板的可控和精确扩增，并且发明人可以设想许多方式(其中可以在单一反应中使用多种酶、引物和温度方案)以实现新型、快速和定量的结果。
实例10：使用核糖核酸的结果
qSTAR可以使用DNA(cDNA和gDNA)、RNA(mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、微RNA)、RNA/DNA类似物、糖类似物、杂交体、聚酰胺核酸和其他已知类似物的任何组合从任何核酸扩增。如下所述进行核糖体RNA的扩增。
酶、寡核苷酸和靶：
将单核细胞增多性李斯特菌用作开发qSTAR RNA测定的靶。单核细胞增多性李斯特菌(ATCC VR-886)基因组DNA获自美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)。对gDNA进行初步筛选，并且发现核糖体RNA的23S区将用引物LMONF72 ACAC5-OM(SEQ ID NO:14,5’-GGACTCGACACCGAGTCCAGTTACGATTmTmGmTmTmG-3’)和LMONR86 ATAT(SEQ ID NO:15,5’-gGACTCCATATGGAGTCCTACGGCTCCGCTTTT-3’)扩增。如EPNo.0728218中所述，使用分子导标LMONMB1(SEQ ID NO:16,5’-FAM/gctgcGTTCCAATTCGCCTTTTTCGCagc/BHQ1-3’)检测所得的DNA模板。
使用RNeasy Plus小量提取试剂盒(德国希尔登(Hilden，Germany)的凯杰公司)与在Mini Bead Mill 4(VWR)上的快速机械裂解相结合来分离总RNA。单核细胞增多性李斯特菌(ATCC BAA-2660)获自美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)，并通过在脑心浸液琼脂平板(BHI)上铺板而复苏。使用单个菌落接种25mL BHI培养基，在37℃下生长18小时以达到稳定期。然后将培养液在250mL烧瓶中反稀释成两份50mL的BHI，并在收获前再生长四小时。从两个30mL等分式样的反稀释培养液中以5,000xg收获细菌15min。将团块重悬并合并到5mL的RNAlater RNA稳定试剂(凯杰公司)中，并允许其在室温下孵育10min。收获细菌并将其重悬于5mL RLT裂解缓冲液细菌中，并在Mini Bead Mill(VWR)上于设置5(3x30秒，脉冲之间在冰上一分钟)下均质化。
根据制造商的说明(凯杰公司)纯化总RNA。通过使裂解物通过RNeasy Plus纯化试剂盒中提供的DNA结合柱除去基因组DNA。通过使用RNeasy RNA结合柱上的柱上无RNA酶的DNA酶I(凯杰公司)消化样品，进一步减少基因组DNA污染。Bst X DNA聚合酶购自马萨诸塞州贝弗利的贝弗利凯杰公司。Omniscript是逆转录酶，购自德国希尔登的凯杰公司。Nt.BstNBI切口核酸内切酶购自新英格兰生物学实验室公司(马萨诸塞州伊普斯威奇)，如美国专利号6,191,267中所述。寡核苷酸和分子导标由集成DNA技术公司(爱荷华州克拉尔维尔)合成。
扩增条件：
基本的qSTAR混合物含有如以上实例1中所述的所有物质，另外还包含以下物质：4U逆转录酶(上文提及的)。
结果
结果示出于图16中，所述图是荧光(任意单位)相对于时间(分钟)的图。阴性对照反应未产生任何荧光信号，而100、1,000、10,000、100,000、1,000,000拷贝数的靶反应产生的荧光信号超过阈值。结果表明，qSTAR可以有效地从逆转录的RNA靶扩增。此外，所述数据表明它可用于定量未知的RNA样品输入。

Claims (45)

1.一种进行非等温核酸扩增反应的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许杂交事件的条件下将靶序列与一种或多种互补单链引物混合，其中所述引物与靶杂交，所述杂交事件直接或间接导致形成包含两个切口位点的双链体结构，这两个切口位点位于双链体的相反两端处或附近；并通过以下步骤执行扩增过程；
(b)使用切口酶在所述双链体的链中的每个所述切口位点处产生切口；
(c)使用聚合酶延伸带切口的链以便形成新合成的核酸，所述用聚合酶进行的延伸重新产生切口位点；
(d)根据需要重复步骤(b)和(c)，以产生所述新合成的核酸的多个拷贝；
其特征在于：进行此方法的温度是非等温的，并且在步骤(b)-(d)的扩增过程期间，在上限温度和下限温度之间经历多次穿梭，其中在所述上限温度下，所述聚合酶或切口酶中的一种比所述酶中的另一种更具活性，从而使得所述酶在活性方面存在差异，并且在所述下限温度下，所述酶在活性方面的差异变小或逆转。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)，所述靶包含两条互补的核酸链，并且所述引物包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物各自与靶的相应链互补，使得所述正向引物和反向引物的3’端朝向彼此取向。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)-(d)基本上在步骤(a)之后立即进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(a)-(d)在相同的反应容器中或在相同的固体支持物上进行。
5.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法进一步包括直接或间接检测所述新合成的核酸的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述检测步骤包括使用分子导标或荧光染料、横向流标记的探针或催化电化学反应的酶。
7.根据权利要求1-2和6中任一项所述的方法，其中所述新合成的核酸的量在进行扩增反应期间进行定量或测量。
8.根据权利要求7所述的方法，其中使用所述新合成的核酸的量以定量方式来确定所述靶序列的量和/或浓度。
9.根据权利要求1-2、6和8中任一项所述的方法，其中所述上限温度相对有利于所述聚合酶的活性。
10.根据权利要求1-2、6和8中任一项所述的方法，其中所述上限温度相对有利于所述切口酶的活性。
11.根据权利要求1-2、6和8中任一项所述的方法，其中所述聚合酶的最适温度与所述切口酶的最适温度相差10℃-30℃范围内的量。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚合酶的最适温度与所述切口酶的最适温度相差10℃-25℃范围内的量。
13.根据权利要求1-2、6、8和12中任一项所述的方法，其中所述上限温度在50℃-64℃范围内。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述上限温度在55℃-63℃范围内。
15.根据权利要求1-2、6、8、12和14中任一项所述的方法，其中所述下限温度在20.0℃-58.5℃范围内。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述下限温度在35.0℃-57.9℃范围内。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述下限温度在36.0℃-57.9℃范围内。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述下限温度在37.0℃-57.9℃范围内。
19.根据权利要求1-2、6、8、12、14和16-18中任一项所述的方法，其中温度穿梭是连续地进行多次穿梭。
20.根据权利要求19所述的方法，其中温度穿梭在至少两分钟的时间段内进行。
21.根据权利要求19所述的方法，其中温度穿梭在至少三分钟的时间段内进行。
22.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18和20-21中任一项所述的方法，其中所述多次穿梭的每一次基本上是相同的。
23.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18和20-21中任一项所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次的持续时间在5-60秒范围内。
24.根据权利要求23所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次的持续时间在5-45秒范围内。
25.根据权利要求23所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次的持续时间在5-30秒范围内。
26.根据权利要求23所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次的持续时间在5-20秒范围内。
27.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18、20-21和24-26中任一项所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次在上限温度下的停留时间在1-10秒范围内。
28.根据权利要求27所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次在上限温度下的停留时间在1-5秒范围内。
29.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18、20-21、24-26和28中任一项所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次在下限温度下的停留时间在2-40秒范围内。
30.根据权利要求29所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次在下限温度下的停留时间在2-30秒范围内。
31.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18、20-21、24-26、28和30中任一项所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次在下限温度和上限温度之间的转换时间在0.5-10秒范围内。
32.根据权利要求31所述的方法，其中多次温度穿梭的每一次在下限温度和上限温度之间的转换时间在1-5秒范围内。
33.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18、20-21、24-26、28、30和32中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前进行逆转录步骤，包括使目标RNA分析物与逆转录酶接触，以便形成所述目标RNA分析物的DNA转录物。
34.根据权利要求33所述的方法，所述方法进一步包括从所述DNA转录物制备双链DNA的步骤。
35.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18、20-21、24-26、28、30、32和34中任一项所述的方法，所述方法进一步包括预扩增或富集步骤。
36.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18、20-21、24-26、28、30、32和34中任一项所述的方法，其中所述引物中的一种或多种包含经修饰的核苷酸。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸位于所述引物的靶互补部分中。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种引物包含2'-修饰的核苷酸。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种引物包含2’O-甲基修饰的核苷酸。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述一种或多种引物包含多个2'O-甲基修饰的核苷酸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种引物包含多达七个2'O-甲基修饰的核苷酸。
42.根据权利要求1-2、6、8、12、14、16-18、20-21、24-26、28、30、32、34和37-41中任一项所述的方法，其中所述引物中的一种或多种包含自身互补部分。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述自身互补部分形成发夹结构。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述发夹包含5至10个碱基对。
45.一种确定样品中的靶多核苷酸的量和/或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：根据权利要求1-44中任一项所述的方法进行非等温核酸扩增反应以扩增所述样品中的靶多核苷酸；并且以定量方式检测所述扩增反应的一种或多种直接或间接产物，以便允许确定所述样品中的靶多核苷酸的量和/或浓度。
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