CN104919056A

CN104919056A - 多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法

Info

Publication number: CN104919056A
Application number: CN201380067456.3A
Authority: CN
Inventors: 约亨·金特; 迈克尔·赛恩瑞驰
Original assignee: Universitaetsspital Basel USB
Current assignee: Universitaetsspital Basel USB
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2015-09-16
Also published as: AU2013340839A1; WO2014068020A1; CA2888953A1; US20150267256A1; EP2728013A1; EP2914744A1; JP2015533281A

Abstract

本发明涉及使多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，其包括以下步骤：提供多个不同的核酸聚合物用作模板，每个模板包含特异性靶序列和位于所述靶序列下游的引物退火序列，以及利用包含与引物退火序列至少基本上互补的引物序列的引物寡核苷酸通过聚合酶依赖性扩增反应使所述模板进行扩增。该方法的特征在于，对于聚合酶依赖性扩增反应，使用一组引物寡核苷酸，所述组包含至少两个引物寡核苷酸，其能使相同模板的引物退火序列退火并且聚合酶依赖性扩增反应的效率彼此不同。

Description

多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法

技术领域

本发明涉及多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，以及一种用于实施所述方法的试剂盒和一种核酸聚合物文库，特别是DNA或RNA文库。本发明还涉及该方法在基因探针检测以及分子克隆中的用途。

背景技术

特异性核酸聚合物的检测是诊断医学和分子生物学研究的一个重要工具。基因探针检测目前例如在鉴别传染性有机体(Organism)例如细菌和病毒、在探测正常基因的表达以及在鉴别突变基因例如癌基因中、在组织移植前的组织分型兼容性中、在法医学中匹配组织或血液样品中、以及在研究来自不同物种的基因的同源性中发挥着作用。

理想情况下，基因探针检测应该是敏感的、特异性的并且易于自动化。对灵敏度(即低检测限)的要求已通过聚合酶链式反应(PCR)以及允许研究人员在分析之前对特异性靶序列进行指数扩增的其他扩增技术的发展而被大大提高。PCR技术为例如US-B-4,683,202中所描述的。

在过去几年中，通过开发新技术的而取得了进展，该新技术有望降低成本并加速新分子诊断的开发。DNA分析仪在序列分析能力上变得日益增强。DNA重测序微阵列(Chee等人，1996；Patil等人，2001)和高通量平行测序仪(Margulies等人，2005；Shendure等人，2005)目前用于低复杂度基因组的全基因组分析到低至单一核苷酸分离。然而，人类基因组仍然太大以至于如不通过特异性序列定向扩增来降低复杂度而无法实现。为了匹配这些仪器的通量，需要更有效的技术来解决扩增瓶颈。对于全基因组测序成本一小部分的人类外显子的全面重测序，靶序列的富集因此成为了关键。最近开发了几种序列捕获方法，例如分子倒置探针技术(Dahl等人，2007；Dahl等人，2005；Porreca等人，2007)；利用微阵列技术的方法(Okou等人，2007；Hodges等人，2007；Albert等人，2007)；利用RNA寡聚捕获探针在溶液中杂交的技术(Gnirke等人，2009)、或者利用小液滴的乳液PCR的微流体技术(Tewhey等人，2009年)。

理论上，目前最有力和最快速的扩增技术是PCR并已被广泛用于分子诊断。为了提高检测通量并能更有效地利用宝贵的DNA样本，通过将许多特异性引物对结合到个体PCR中以进行几个靶标的同时扩增(Chamberlain等人，1988；Shigemori等人，2005)。然而，这是一个与PCR相关的至关重要的问题是当大量的特异性引物对被加入到相同的反应物中时，正确和不正确的扩增子均产生。此外，即使当可避免引物二聚体并且实现特异性扩增时，由于扩增子长度和序列属性(GC含量)而使靶标具有不同的PCR效率。在后来的阶段，在许多扩增子丢失从而有利于高效扩增的扩增子和赝品的情况下，这影响了产品的均匀性。为了优化多重PCR，需要凭经验确定用于每组引物组合的引物、缓冲液dNTP、酶和氯化镁的浓度。这是个耗时的工艺，该工艺需要进行所生产的每个批次的检测。即使经过详尽的优化实验，也不能保证多重PCR成功。

即使在多重化情形下精心设计引物，PCR通常也仅限于10-20次同时反应，之后收率和均匀性由于不相关的扩增产物的累积而降低(2005；Broude等人，2001)。因此，每当需要分析许多基因组序列时，通常进行大量的单独的PCR。因此，多重PCR的主要挑战是要克服两个主要问题：导致非特异性扩增(例如引物二聚体)的引物不相容性以及不同靶标的扩增效率的差异性。

考虑到现有技术水平的方法的缺点，因此本发明待解决的问题是提供一种简单、快速和便宜的用于同时扩增多个不同的核酸靶序列的方法，特别是DNA和/或RNA靶序列。在此方面，所述方法应允许几乎所有靶序列以比传统方法特别是标准PCR更均匀的丰度扩增。本发明提供了一种新颖的多重化技术，解决这两个基本的问题，从而允许在一个单一反应中进行多个靶标的均匀扩增。

发明内容

方法论原则

效率标签PCR

该方法的原理基于这样的事实：在引物/模板杂合体的3引物末端(primeend)的单一错配显著地抑制了PCR扩增。虽然单一3引物错配(primemismatch)可能使引物退火，但是通过聚合酶进行的延伸步骤被抑制(图2a)。效率标签PCR(etPCR)利用调节每个单一靶标的PCR效率这一事实。代替使用一个单一引物对，etPCR利用两组引物，每一组由具有共有的核心序列(common core sequence)的相似引物组成，能使靶标退火，但其长度不同，从而导致在3引物末端差异(图2b)。在这样的etPCR反应中，其中模板与整个互补序列完全匹配，所有引物均可被用于通过聚合酶来合成新链。这样形成的扩增具有与正常PCR相符合的效率。在错配被引入到模板的引物位点的3引物部分的情况下，所有引物将仍能够结合，然而只有一些引物将允许通过聚合酶延伸。因此，参加扩增反应的引物的一部分将取决于靶标的3引物引物位点的错配的数量。这样PCR的效率可以通过模板中引入特定错配进行调节。在一组5引物的情形下，可能通过引入多达4个错配来调节5个不同等级的效率(图2C)。可使用的不同效率等级的数量是根据标签的规模来确定(等级＝标签的长度+1)。引入两个标签，在模板的每侧一个，乘以不同等级的可能性(等级＝[正向标签的长度+1]×[反向标签的长度+1])。使用模板两端4个碱基的效率标签将效率调整至25个不同的细微差别。这种效率标签PCR为多模板扩增带来了新的机遇。通过使用适当的标签来调整每个单一模板的PCR效率将导致所有模板均匀扩增。此外，利用用于所有模板的含有共有序列(Common Sequence)的通用引物对(uninversal pair of primer)消除了引物二聚体的问题。EtPCR只需要由模板组成的文库，侧翼为效率标签和共用引物序列(common priming sequence)。

序列捕获：由基因组DNA制备效率标签模板文库(优选实施方案)

从DNA源例如基因组DNA或cDNA选择感兴趣的区域(即某些基因外显子)，我们开发了一种新的序列捕获方法。该方法导致感兴趣区域的单链复制，所述感兴趣区的侧翼为效率标签和共有引发序列(common primingsequence)，以利用etPCR进一步均匀扩增，如上文所述。特异性序列的靶向是通过感兴趣区域侧翼的寡核苷酸的杂交步骤来实现的。所述寡核苷酸由四个不同部分组成：靶标特异性序列、效率标签、共有引发序列和在它们外侧(outer end)的由硫代磷酸化组成的“核酸外切酶区块”(图1)。用侧翼寡核苷酸杂交后，由感兴趣区域组成的缺口将通过聚合酶反应来填补。合成链和寡核苷酸之间的缺口将通过一个连接反应被封闭。在随后的扩增之前，未结合的寡核苷酸将通过核酸外切酶消化而除去。靶向区域的新合成的DNA片段将受到保护而免受核酸外切酶消化，因为该区域两面中的每一面将以硫代磷酸化为侧翼，作为“核酸外切酶区块”。然而，个体寡核苷酸将被加入的核酸外切酶消化，因为在它们末端的一个上面仅包含一个核酸外切酶区块。这导致新合成的DNA单链由所需的基因组区域组成，其侧翼为效率标签和可用于etPCR的通用引发序列(universal priming sequences)。这种序列捕获与新颖的etPCR技术相结合可进行任何来源DNA的均匀多重扩增，消除了引物不相容性和非均匀扩增，即多重PCR的两个基本问题。

本发明涉及下述实施方案(1)至(15)。

(1)使多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，其包括以下步骤：

提供一组能使相同核苷酸序列退火的正向引物寡核苷酸，所述组包括具有5’-X-N¹-3’结构的第一正向引物寡核苷酸和具有5’-X-N¹-N²-3’结构的第二正向引物寡核苷酸，

其中X是能使第一引物退火序列X’退火的核苷酸序列，N¹为无或者由一个或多个核苷酸组成，并且N²由一个或多个核苷酸组成；

提供多个不同的核酸聚合物作为模板，每个模板包括：(i)正向引物退火序列X’，其与核苷酸序列X互补，和(ii)特异性靶序列；以及

利用所述组的正向引物寡核苷酸和一个或多个反向引物寡核苷酸，通过聚合酶依赖性扩增反应使模板扩增，其特征在于，第一正向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当使模板退火时，与至少两个不同的模板序列完全匹配；并且所述第二正向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当使模板退火时，与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个完全匹配。

(2)(1)的方法，其进一步包括提供一组能使相同核苷酸序列退火的反向引物寡核苷酸的步骤，其包括具有5’-Y-M¹-3’结构的第一反向引物寡核苷酸，和具有5’-Y-M¹-M²-3’结构的第二反向引物寡核苷酸，

其中Y是能使反向引物退火序列退火的核苷酸序列，M¹为无或者由一个或多个核苷酸组成，并且M²由一个或多个核苷酸组成；

其中每个模板进一步包括反向引物退火序列，其与核苷酸序列Y互补，靶序列位于正向引物退火序列和反向引物退火序列之间，并且所述聚合酶依赖性扩增反应是利用所述组的正向引物寡核苷酸和所述组的反向引物寡核苷酸进行的，

其特征在于，所述第一反向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当使模板退火时与至少两个不同的模板序列完全匹配，并且所述第二反向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当退火时至模板时与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个完全匹配。

(3)(2)的方法，其中模板的数量为v，并且每个模板包括5’-X-et^Xw-T^w-et^Y’w-Y’-3’结构

其中

v是大于1的整数，

w是1至v的整数，每个特定的模板分配一个单独的w值，

X如权利要求1所定义，

et^Xw是第一效率标签序列，

T^w是靶序列或其互补序列，

et^Y’w是第二效率标签序列的互补序列，

Y’是反向引物退火序列。

(4)(3)的方法，其特征在于每个效率标签序列包含1至10个核苷酸，优选2至7个核苷酸，最优选3至5个核苷酸。

(5)(3)或(4)的方法，其特征在于模板由随后的步骤提供：

提供一种单链原始核酸聚合物，其包含一个待扩增的原始靶序列(primal target sequence)；

与寡核苷酸探针上的原始靶序列的5’末端杂交，所述寡核苷酸探针序列包含与原始靶序列的5’末端互补的靶序列的一部分、引物退火序列和效率标签序列，并且与另一个寡核苷酸探针上的原始靶序列的3’末端杂交，另一个寡核苷酸探针序列包含与原始靶序列的3’末端互补的靶序列的一部分、引物退火互补序列和效率标签互补序列；

通过聚合酶和连接酶合成与原始靶序列互补的链以产生模板；以及

分离所产生的模板。

(6)(5)的方法，其特征在于所产生的模板的末端被保护以抗核酸外切酶。

(7)(5)或(6)的方法，其特征在于所产生的模板包含游离末端、两个末端区域中的一个或多个经修饰的核苷酸以形成核酸外切酶保护。

(8)(7)的方法，其特征在于所述一个或多个经修饰的核苷酸被硫代磷酸化。

(9)(5)至(8)中任一项所述的方法，其特征在于分离所产生的模板的步骤是利用核酸外切酶消化剩余的核酸组分而进行的。

(10)核酸聚合物文库，特别是DNA或RNA文库，包含(2)至(9)中任一项所定义的多个模板。

(11)一种试剂盒，用于实施(1)至(9)中任一项所述的方法，其包含：

第一组寡核苷酸探针，第一组的每种寡核苷酸探针的序列包含：

与待扩增的原始靶序列5’末端互补的靶序列的一部分，

效率标签序列，以及

引物退火序列，

第二组寡核苷酸探针，第二组的每种寡核苷酸探针的序列包含：

引物退火互补序列，

效率标签互补序列，以及

与原始靶序列的3’末端互补的靶序列的一部分，

第一组中不同的引物寡核苷酸包含一个引物序列，其与第一组中寡核苷酸的引物退火序列至少基本上互补，并且该引物序列的下游延伸长度彼此不同，以及

第二组中不同的引物寡核苷酸包含一个引物序列，所述引物序列与另一个引物退火序列至少基本上互补，所述引物退火序列可通过合成与含有引物退火互补序列的模板互补的链而获得，第二组的引物寡核苷酸在引物序列的下游延伸长度上彼此不同。

(12)(11)所述的试剂盒，还包含聚合酶和连接酶。

(13)(1)至(9)中任一项所述的方法在基因探针检测特别是用于鉴别传染性有机体或突变体基因中的用途。

(14)(1)至(9)中任一项所述的方法在分子克隆中的用途。

本发明的方法包括提供一组正向引物寡核苷酸的步骤。该组包含r个不同的正向引物寡核苷酸，其中r是大于1的整数，即r至少为2，优选至少为3，更优选至少为4，最优选至少为5。典型地，R的范围为2至20，优选2至10，更优选3至7，最优选r为4或5。

第一正向引物寡核苷酸具有5’-X-N¹-3’的结构，并且第二正向引物寡核苷酸具有5’-X-N¹-N²-3’的结构，其中X是能使第一引物退火序列X’退火的核苷酸序列，N¹序列为无或者由一个或多个核苷酸组成，并且N²由一个或多个核苷酸组成。该组的正向引物寡核苷酸中的每个正向引物能通过其X部分使相同核苷酸序列退火。序列N¹可以为无或由一个或多个核苷酸组成，例如1至20个核苷酸。序列N²可独立地由1至20个核苷酸组成。优选地，N²由1至10个，更优选1至5个，最优选1至3个核苷酸组成，例如1、2或3个核苷酸。优选地，N²是由1个核苷酸组成。

不同的正向引物寡核苷酸的区别通常仅在于它们的3’末端，也就是说，区别在于位于序列X的3’位的序列。

在本发明的一个方面，该组的正向引物包含r个不同的正向引物寡核苷酸，并且引物编号为q的结构为5’-X-(n)_(q-1)-3’，其中q的范围为1至r，r如上文所定义，并且每个n独立地是任何核苷酸。换句话说，第一正向引物寡核苷酸(即q＝1)具有5’-X-3’的结构；第二正向引物寡核苷酸(即q＝2)具有5’-X-n-3’的结构；第三正向引物寡核苷酸(即q＝3)具有5’-X-nn-3’的结构；第四正向引物寡核苷酸(即q＝4)具有5’-X-nnn-3’的结构；并且第五正向引物寡核苷酸(即q＝5)具有5’-X-nnnn-3’的结构。这个列表可以延长。优选地，每个n独立地选自核苷酸a、c、g和t所组成的组。

根据该方面的一个优选实施方案，该组的正向引物寡核苷酸包含4个不同的正向引物寡核苷酸(r＝4)，第一正向引物寡核苷酸具有5’-X-3’的结构；第二正向引物寡核苷酸具有5’-X-n-3’的结构；第三正向引物寡核苷酸具有5’-X-nn-3’的结构；并且第四正向引物寡核苷酸具有5’-X-nnn-3’的结构。

根据该方面的另一个优选实施方案，该组的正向引物寡核苷酸包含5个不同的正向引物寡核苷酸(r＝5)，第一正向引物寡核苷酸具有5’-X-3’的结构；第二正向引物寡核苷酸具有5’-X-n-3’的结构；第三正向引物寡核苷酸具有5’-X-nn-3’的结构；第四正向引物寡核苷酸具有5’-X-nnn-3’的结构；并且第五正向引物寡核苷酸具有5’-X-nnnn-3’的结构。

根据该方面的又一个优选实施方案，该组的正向引物寡核苷酸包含6个不同的正向引物寡核苷酸(r＝6)，第一正向引物寡核苷酸具有5’-X-3’的结构；第二正向引物寡核苷酸具有5’-X-n-3’的结构；第三正向引物寡核苷酸具有5’-X-nn-3’的结构；第四正向引物寡核苷酸具有5’-X-nnn-3’的结构；第五正向引物寡核苷酸具有5’-X-nnnn-3’的结构；并且第六正向引物寡核苷酸具有5’-X-nnnnn-3’的结构。

X是能使第一引物退火序列退火的核苷酸序列。X的长度为至少6个核苷酸，优选为至少8，更优选为至少10，最优选为至少12个核苷酸。通常情况下，X的长度范围为6至100，优选为8至75，更优选为10至50，更优选为12至30，最优选为15至25个核苷酸。

为了防止5’-X-(n)_(q-1)-3’结构的引物通过聚合酶核酸外切酶活性而被消化，其末端优选被保护以抗核酸外切酶。具体地，为了防止核苷酸通过某些聚合酶的核酸外切酶活性而被除去，对3’末端的一个或多个核苷酸进行修饰形成核酸外切酶保护。更具体地，一个或多个经修饰的核苷酸被硫代磷酸化。

本发明的方法进一步包括提供多个不同的核酸聚合物作为模板，每个模板包含特异性靶序列和正向引物退火序列，其与核苷酸序列X互补。不同核酸模板的数量为至少2，优选至少3，更优选至少5。典型地，所提供的不同模板的数量为2至100,000，优选为3至1000，更优选为4至500，更优选为5至200，最优选10至50的范围。优选地，所述正向引物退火序列位于特异性靶序列的上游，即靶序列的5’。优选的是，正向引物退火序列和靶序列被所谓的“效率标签序列”分开，如下文进一步阐述。

靶序列的长度范围可以为约10至约50,000个核苷酸，优选为约50至约10,000个核苷酸，更优选为约75至约5000个核苷酸，最优选为约100至约1500个核苷酸。这些模板通常有相同的引物退火序列和不同的靶序列。

本发明的方法进一步包括使用所述组的正向引物寡核苷酸和一个或多个反向引物寡核苷酸通过聚合酶依赖性扩增反应使模板扩增。在一个实施方案中，反向引物是能使基本上所有模板分子退火的单一寡核苷酸，优选位于靶序列下游。在另一个实施方案中，使用一组反向引物寡核苷酸。后一实施方案将在下文进一步阐述。

根据本发明，第一正向引物寡核苷酸的3’-末端核苷酸与至少两个不同的模板序列完全匹配，而第二正向引物寡核苷酸与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配。即，在它的最简单的变型中，第一正向引物寡核苷酸将扩增两个不同的模板，并且第二正向引物寡核苷酸将仅扩增这两个不同模板中的一个。

本发明的方法可以进一步包括提供一组能使模板序列内相同核苷酸序列退火的反向引物寡核苷酸的步骤。该组包括p个不同的反向引物寡核苷酸，其中p是大于1的整数。也就是说，p为至少2，优选至少3，更优选至少4，最优选至少5。通常情况下，p的范围为2至20，优选2至10，更优选3至7，最优选p为4或5。所述组的反向引物寡核苷酸中的每一个反向引物能够通过其Y部分使相同的核苷酸序列退火。反向引物寡核苷酸具有5’-Y-M¹-3’结构，并且第二反向引物寡核苷酸具有5’-Y-M¹-M²-3’结构，

其中Y是能使反向引物退火序列退火的核苷酸序列，M¹为无或者由一个或多个核苷酸组成，并且M²由一个或多个核苷酸组成。序列M¹可以为无或由一个或多个核苷酸组成，例如1至20个核苷酸。序列M²可独立地由1至20个核苷酸组成。优选地，M²由1至10个，更优选1至5个，最优选1至3个核苷酸组成，例如1、2或3个核苷酸。优选地，M²由1个核苷酸组成。

不同的反向引物寡核苷酸的区别通常仅在于它们的3’末端，也就是位于序列Y的3’的序列。

在本发明的一个方面，该组的反向引物包含p个不同的反向引物寡核苷酸，并且反向引物编号为S的结构为5'-Y-(n)_(S-1)-3'，其中s的范围为1至p，p如上文所定义，并且每个n独立地为任何核苷酸。换句话说，第一反向引物寡核苷酸(即S＝1)具有5’-Y-3’结构；第二反向引物寡核苷酸(即S＝2)具有5’-Y-n-3’结构；第三反向引物寡核苷酸(即S＝3)具有5’-Y-nn-3’结构；第四反向引物寡核苷酸(即S＝4)具有5’-Y-nnn-3’结构；并且第五反向引物寡核苷酸(即S＝5)具有5’-Y-nnnn-3’结构。这个列表可以延长。优选地，每个n独立地选自核苷酸a、c、g和t所组成的组。

根据该方面的一个优选实施方案，该组的反向引物寡核苷酸包含4个不同的反向引物寡核苷酸(p＝4)，第一反向引物寡核苷酸具有5’-Y-3’结构；第二反向引物寡核苷酸具有5’-Y-n-3’结构；第三反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nn-3’结构；并且第四反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nnn-3’结构。

根据该方面的另一个优选实施方案，该组的反向引物寡核苷酸包含5个不同的反向引物寡核苷酸(p＝5)，第一反向引物寡核苷酸具有5’-Y-3’结构；第二反向引物寡核苷酸具有5’-Y-n-3’结构；第三反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nn-3’；第四反向引物寡核苷酸的具有5’-Y-nnn-3’结构；并且第五反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nnnn-3’结构。

根据该方面的又一个优选实施方案，该组的反向引物寡核苷酸包含6个不同的反向引物寡核苷酸(p＝6)，第一反向引物寡核苷酸具有5’-Y-3’结构；第二反向引物寡核苷酸具有5’-Y-n-3’结构；第三反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nn-3’结构；第四反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nnn-3’结构；第五反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nnnn-3’结构；并且第六反向引物寡核苷酸具有5’-Y-nnnnn-3’结构。

Y是能使反向引物退火序列退火的核苷酸序列。Y的长度为至少6个核苷酸，优选为至少8，更优选为至少10，最优选为至少12个核苷酸。通常情况下，Y的长度范围为6至100，优选为8至75，更优选为10至50，更优选为12至30，最优选为15至25个核苷酸。

根据本发明，第一反向引物寡核苷酸的3’-末端核苷酸与至少两个不同的模板序列完全匹配，而第二反向引物寡核苷酸与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配。即，在它的最简单的变型中，第一反向引物寡核苷酸将扩增两个不同的模板，并且第二反向引物寡核苷酸将仅扩增这两个不同模板中的一个。

在一个实施方案中，每个模板包含与核苷酸序列Y互补的反向引物退火序列，靶序列位于正向引物退火序列和反向引物退火序列之间，并且所述聚合酶依赖性扩增反应是利用所述组的正向引物寡核苷酸和所述组的反向引物寡核苷酸来实施的。

在本发明的一个方面，模板数量为v，并且每个模板包含结构

5’-X-et^Xw-T^w-et^Y’w-Y’-3’

其中

v是大于1的整数，

w是1至v的整数，每个特定的模板被分配一个单独的w值，

X如权利要求1所述，

et^Xw是第一效率标签序列，

T^w是靶序列或其互补序列，

et^Y’w是第二效率标签序列的互补序列，

Y’是反向引物退火序列。

将如下文所详述，本发明在扩增效率可特别适用于每个靶序列的意义上允许进行“逐级”扩增反应。特别是在多重PCR中，不同靶标的扩增效率因此可以是导致每个靶标或多或少均一数量的复制的水平。

根据一个非常直接并因此特别优选的实施方案，每个模板包含在引物退火序列和靶序列之间的特异性效率标签序列(ETS)。根据其特异性ETS，模板可因此被分成不同的模板组，因此具有延伸完全匹配ETS或完全匹配ETS的一部分的引物寡核苷酸的数量从模板组到模板组是不同的。ETS因此一方面对于具有延伸完全匹配ETS或完全匹配ETS的一部分的引物寡核苷酸允许进行选择性聚合酶介导的延伸。另一方面，对于具有延伸不匹配或仅部分地匹配ETS或其一部分的引物寡核苷酸将仅发生无效率的聚合酶介导的延伸。

通过适当地将不同ETS归因于不同的靶标，对于高丰度的扩增子可实现较低效率的扩增。

更具体地说，在“逐级”扩增反应中，对于显示出与任何引物寡核苷酸的延伸无互补性的ETS实现了最低等级的效率，因为对于这一点，该组的可通过聚合酶延伸的唯一引物寡核苷酸是根本没有延伸的一个。对于显示出与寡核苷酸延伸的第一个核苷酸互补的ETS实现了更高的等级，因为对于这一点，根本不延伸的原始寡核苷酸和通过1个单核苷酸延伸的引物寡核苷酸将退火并且可通过聚合酶延伸。对于显示出与延伸的最初的两个核苷酸互补的ETS实现了甚至更高的效率，依次类推。

ETS优选包含1至10个核苷酸，更优选2至7个核苷酸，最优选3至5个核苷酸。例如，如果利用具有4个核苷酸的ETS，则可建立5个不同的效率等级，一个用于充分对应于所述引物寡核苷酸的延伸的所有核苷酸的ETS，一个用于仅与延伸的最初的三个核苷酸互补的ETS，一个用于仅与延伸的最初的两个核苷酸互补的ETS，一个用于仅与延伸的第一个核苷酸互补的ETS，以及一个用于根本与延伸没有互补的ETS。

根据一个特别优选的实施方案，所有模板的引物退火序列均相同。因此，包含一个通用引物序列的引物寡核苷酸可用于该实施方案中，即允许靶标扩增，又允许其随后测序。

如上文所述的引物寡核苷酸，所有模板的另一个引物退火序列优选相同。因此，包含通用引物序列的引物寡核苷酸也可用于该实施方案中所用的其他组。

在这方面，还优选另外组的引物寡核苷酸之间的唯一差别是它们延伸的长度，如上文所述组的引物寡核苷酸的情况。这允许模板互补链被分为不同的“互补链基团”，由此，具有延伸完全匹配另外ETS或其一部分的另外组的引物寡核苷酸的数量从“互补链基团”到“互补链基团”是不同的。ETS因此允许选择性聚合酶介导延伸用于具有延伸完全匹配另外ETS或完全匹配一部分ETS的延伸引物寡核苷酸，其一方面允许低效率扩增的靶标进行选择性并因此高效率的扩增，以及所有其他引物寡核苷酸的不充分退火；另一方面允许高丰度的靶标进行效率较低的扩增，如与模板的ETS相关的上文所述。

根据进一步优选的实施方案，对所述模板和/或引物寡核苷酸的至少一部分的一个或多个区域编码成条形码，因此这允许以容易方式将复制模板归属于其来源。特别是平行测定来自不同患者的DNA时，例如在多重PCR中，条形码允许将复制DNA序列归属于每个个体患者(Binladen等人，(2007)PLoS ONE 2(2):e197，通过引用并入本文作为参考)。

为了提供还包含ETS和引物退火序列(除了特异性靶序列之外)的模板，优选使用包括以下后续步骤的方法：

提供一种单链原始核酸聚合物，其包含待扩增的原始靶序列；

杂交到寡核苷酸探针上的原始靶序列的5’末端，所述寡核苷酸探针序列包含与原始靶序列5’末端互补的靶序列的一部分、ETS和引物退火序列；并杂交到另外的寡核苷酸探针的原始靶序列的3’末端，另外的寡核苷酸探针的序列包含与原始靶序列的3’末端互补的靶序列的一部分、效率标签互补序列和引物退火互补序列；

分离所产生的模板。

为了使连接酶封闭所产生的链和3’-末端(包括所述原始靶序列的5’末端互补的靶标的一部分)的寡核苷酸探针之间的缺口，所述寡核苷酸探针通常是5’末端磷酸化的。

因此，可以得到一个新合成的包含靶序列和引物退火序列的单一核酸链，然后其可在通用PCR中用于扩增。

另外，“定制”ETS可以通过这种方法引入到每个模板中，最终允许调节每个模板的扩增效率，如上文详细描述的。

由于本发明优分离选用于基因探针检测，特别是用于鉴别传染性有机体或突变体基因，或者用于分子克隆，原始核酸聚合物是至少一种选自基因组DNA、线粒体DNA、mRNA、病毒DNA、细菌DNA、病毒RNA和cDNA所组成的组。

为了使所产生的模板的容易分离，其末端优选被保护以抗核酸外切酶。特别是，所产生的模板包含游离末端、经修饰形成核酸外切酶保护的两个末端区域中的一个或多个核苷酸。更特别地，一个或多个经修饰的核苷酸是被硫代磷酸化的。

因此，分离所产生的模板的步骤可以很容易地进行，通过使用核酸外切酶消化剩余的核酸成分而仅仅使被保护的模板保持完整。用于提供模板的方法在本发明的上下文中也称为“富集步骤”。

根据进一步优选的实施方案，寡核苷酸探针是在微芯片上合成的。

作为使用ETS的方法的替代，也可以想象使用一组引物寡核苷酸，其中至少一些被封闭从而不能通过聚合酶延伸。取决于待扩增的每个模板的所需效率等级，可调整封闭部分与未封闭部分的比例以适用于每种引物寡核苷酸。基于实现更均匀的扩增，封闭的引物寡核苷酸在丰度高的靶序列中的比例更高，而在丰度低的靶序列中的比例更低。

根据进一步的方面，本发明还涉及一种包含上文所述的模板的DNA或RNA文库。例如，用于杂交程序的多个多重DNA探针可在微芯片上被合成并被释放作为溶液中的DNA探针池。这种DNA探针池可使用PCR来扩增。使用合成的DNA探针上的通用引物退火序列，可以使用一个引物对扩增DNA探针池。单一DNA探针的效率和最后的量主要取决于靶序列比如长度和序列成分。“逐级”PCR可用于获得更均匀的扩增并因此每个DNA探针的量几乎相等。在某些情况下，期望产生较大量的某些DNA探针和/或较少量的某些DNA探针。利用逐级PCR，每个DNA探针的扩增效率可根据所期望的最终探针量来调整。

根据再一个方面，本发明进一步涉及用于实施上述方法的试剂盒。

所述试剂盒包含：

第一组寡核苷酸探针，第一组的每种寡核苷酸探针的序列包含

-与待扩增的原始靶序列的5’末端互补的靶序列的一部分；

-效率标签序列，以及

-引物退火序列，

第二组寡核苷酸探针，第二组的每种寡核苷酸探针的序列包含

-引物退火互补序列；

-效率标签互补序列，以及

-与原始靶序列的3’末端互补的靶序列的一部分，

第一组中不同的引物寡核苷酸包含一个引物序列，其与第一组中寡核苷酸的引物退火序列至少基本上互补并且其在引物序列下游延伸的长度上彼此不同，以及

第二组中不同的引物寡核苷酸包含引物序列，其与通过合成与包含引物退火互补序列的模板互补的链而获得的另外的引物退火序列至少基本上互补，第二组的引物寡核苷酸在引物序列下游延伸的长度上彼此不同。

优选地，所述试剂盒还包含聚合酶和连接酶。如上文所述，第一组中每个寡核苷酸探针通常是5’末端被磷酸化，以允许所述连接酶封闭所述寡核苷酸探针和所产生的链之间的缺口。此外，第一组寡核苷酸探针的3’末端上的最初1至6个核苷酸被修饰以抗核酸外切酶切割。第二组寡核苷酸探针的5’末端上的最后1至6个核苷酸被修饰以抗核酸外切酶切割。更具体地，一个或多个经修饰的核苷酸被硫代磷酸化(phosphorothioated)。

由于本发明特别适用于基因探针检测，特别是用于鉴别传染性有机体(organism)或突变体基因，本发明还涉及上文所述用于该目的的方法的应用。

或者，本发明还涉及所述方法在分子克隆中的应用。

附图说明

通过附图进一步举例说明本发明的方法。

图1A-C示意性地示出了用于提供根据本发明的方法的一个优选实施方案中所用模板的方法的不同步骤。根据图1中所示的方法(即“富集步骤”)，寡核苷酸探针被加入到基因组DNA中作为包含一个或多个原始靶序列的初始核酸聚合物。

在图1中所示的实施方案中，原始核酸聚合物(PNAP)2包含两个原始靶序列2a、2b(参见图1A)。

寡核苷酸探针(OP)4可分为两部分：

第一部分4a、4b的每个寡核苷酸分别包含靶序列的3a、3b部分，分别与原始靶序列2a、2b之一的5’末端互补，引物退火序列6和ETS 8位于靶序列的一部分与引物退火序列之间。

第二部分4a’、4b’的每个寡核苷酸探针分别包含靶序列的3a’、3b’部分，分别与原始靶序列2a、2b之一的3’末端互补，引物退火序列6’和效率标签互补序列8’位于靶序列的一部分与引物退火互补序列之间。

另外，第一部分的寡核苷酸探针在它们的3’末端包含一个核酸外切酶区块12，而第二部分的寡核苷酸探针在它们的5’末端包含一个核酸外切酶区块12’。该核酸外切酶区块可以以多种方式来实现。根据一个优选的实施方案，被硫代磷酸化、核酸酶抗性核苷酸被加入到侧翼靶序列的两个末端。

然后，将第一部分的寡核苷酸探针4a、4b与各自的原始靶序列2a、2b的5’末端杂交，并且将第二部分的寡核苷酸探针4a’、4b’与各自的原始靶序列2a、2b的3’末端杂交。杂交包括基因组DNA变性，通常在95℃进行10分钟，以及寡核苷酸探针的退火，通常在约60℃下进行14小时。

杂交后，侧翼寡核苷酸探针之间的间隙通过聚合酶14合成的与靶序列互补的链而填充，其通过添加核苷酸来填充间隙。通过连接酶16，所产生的链和探针之间在3’末端的缺口最终封闭，如图1B所示。为了填充间隙和封闭缺口而进行的孵育通常在60℃下进行约24小时。

通过合成步骤，模板18a、18b得以实现，其3’末端包含引物退火序列6，后跟ETS 8，并且其5’末端包含引物退火互补序列6’，在3’末端方向上后跟效率标签互补序列8’。靶序列20a、20b分别与原始靶序列2a、2b互补，被安排在ETS 8和效率标签互补序列8’之间。模板的3’末端和5’末端两者分别被核酸外切酶区块12、12’保护。

在进一步的步骤中，加入核酸外切酶或多个核酸外切酶22的混合物，其消化两个末端中未被核酸外切酶封闭的所有核酸聚合物，即除了模板18a、18b之外产生的所有核酸聚合物，如图1C。

基于所产生的模板，然后利用一组引物寡核苷酸24进行PCR。图2D中示出了3个引物寡核苷酸24a、24b、24c。所述引物寡核苷酸24a、24b、24c包含引物序列26，其在所示的实施方案中对所述组的引物寡核苷酸通用。所示3个引物寡核苷酸中的2个进一步包含引物序列26下游的延伸28b、28c(见下文)。

缩写：E＝核酸外切酶；L＝连接酶；Poly＝聚合酶；PNAP＝核酸聚合物；OP＝寡核苷酸探针。图2A-C描述了新的序列捕获技术的原理。(a)为靶向特异性的基因组区域，利用对引物的3引物末端(prime end)错配敏感的DNA聚合酶对每个靶标延伸设计左侧靶寡核苷酸(LTO)和右侧靶寡核苷酸(RTO)。引物模板杂交体的3引物末端存在的单一错配能大大降低或完全抑制PCR扩增。因此，扩增过程可以通过向模板的引物结合位点引入错配来抑制。(b)新的PCR扩增方法能够特异性调节具有共有用引物结合位点(common primer binding sites)的模板池的每一个单一模板的扩增效率。使用一组类似的引物代替每个位点上的单一共有引物(common primer)。引物覆盖了相同的序列并且只是长度不同，导致不同程度的3引物延伸。模板池被设计成由共有核心序列(common core sequence)组成的最短的引物与所有模板匹配。与所述组所有引物完全匹配的模板的扩增效率没有任何降低(T1)。在模板的效率标签内引入错配导致了扩增效率降低(T2)。(c)通过控制模板效率标签(ET)内的错配程度可调节每一个单一模板的扩增效率。缩写：CCS＝共有核心序列；PS＝引物组；T1＝与所有引物完全匹配的靶标1；T1＝与某个引物错配的靶标2；ET＝效率标签；EF＝PCR效率。

图2D示意性地示出了一组三个不同的引物寡核苷酸使一个给定模板退火。在图2D所示的实施方案中，该组的引物寡核苷酸24a、24b、24c之间的唯一差别是它们的延伸长度。取决于归属于给定靶序列的特异性ETS，在扩增步骤中不同数量的引物寡核苷酸将进行聚合酶依赖性延伸。

在图2D中所示的具体实例中，其中ETS 8包含4个核苷酸，ETS的最后两个核苷酸与全长引物寡核苷酸延伸的最后两个核苷酸不互补。因此，只有含有2个核苷酸延伸(即引物寡核苷酸24b)、一个单核苷酸延伸(未示出)或根本没有延伸(即引物寡核苷酸24a)的引物寡核苷酸进行了有效的聚合酶依赖性延伸，然而含有三个核苷酸延伸(未示出)或四个核苷酸延伸(即引物寡核苷酸24c)的引物寡核苷酸却没有。

取决于归属于给定靶序列的特异性ETS，模板可归属于不同的模板组，延伸完全匹配ETS或完全匹配ETS一部分的引物寡核苷酸的数量从模板组到模板组是不同的。

缩写：PS＝引物寡核苷酸组；T＝靶标；ts＝靶标序列。图3示意性地示出了下文讨论的本发明实施例1中所靶向的钙蛋白酶3基因的不同外显子的位置。

缩写：Ex17＝外显子17；Ex18、19＝外显子18和外显子19；Ex22＝外显子22。图4是用于分离实施例1所述扩增的核酸靶序列的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶的照片。

缩写：P1＝标准PCR；P2＝效率标签PCR；Ex17＝外显子17；Ex18_19＝外显子18和外显子19；Ex22＝外显子22。

图5描述了带有效率标签和通用引物序列的不同模板。a)生成具有不同基因组靶序列的模板，用于执行其两个末端具有通用引物序列和效率标签etPCR。b)该表示出了不同性质的靶序列以及整个扩增子的性质。引入不同的效率标签来分析其在etPCR中的性能。C)在etPCR分析之前，不同模板通过凝胶电泳验证冰纯化。

缩写：AMP＝扩增子；GT＝基因组靶标；ETS_A＝效率标签序列A；ETS_B＝效率标签序列B；UPS_A＝通用引物位点A；UPS_B＝通用引物位点B。

图6描述由于固有性质引起的PCR效率变化。A)具有共有引物位点(common primer site)的不同模板被用于标准qPCR，使用相同的引物对。利用LinReg软件分析指数期来测量PCR效率。B)可检测几个模板之间PCR效率的显着差异。C)在我们的一组模板中，固有PCR效率与扩增子长度强相关，并显示与GC含量(d)无相关性。缩写：nFU＝标准荧光单位；Cy＝循环数；S＝扩增子大小，以碱基对表示；GC＝GC百分比含量。

图7表明etPCR可特异性调节PCR效率。效率标签PCR用12个模板进行，并与标准PCR相比较。a)和具有效率标签(标签5)内无错配的模板未观察到差异。b)将错配引入到标签较少的引物中可以参与PCR反应，以导致PCR效率降低。c)所有庇护错配的标签显示效率显著降低，并因此进行扩增的特异性操控。降低程度以表中所示的校正因子来定义。d)具有相同效率标签的不同模板显示出类似的校正因子。这可以通过选择某些标签进行限定特异性模板的调节。缩写：nFU＝标准荧光单位；Cy＝循环数；P1＝标准PCR；P2＝效率标签PCR；CF＝校正因子；ET＝效率标签。

图8表明etPCR可调节多重反应中的PCR效率以产生均匀的扩增。序列捕获反应后，使用100ng基因组DNA，如材料和方法中所描述，进行标准PCR或etPCR。利用标准PCR，小模板扩增是最有效的，然而较大的扩增子难以在凝胶电泳上检测。当利用etPCR时，大扩增子易于被检测并且观察到的图案类似更均匀的扩增。需要注意的是，更大的片段由于其具有更高的与DNA染料结合的特性，在染色过程中给出更亮的信号。利用生物分析仪对DNA芯片(b)进行扩增子的定量。这表明，与标准PCR相比，当使用etPCR时，扩增产物的均匀性显著提高。缩写：M＝大小标记物；P1＝标准PCR；P2＝效率标签PCR；C＝扩增后扩增子的浓度，以pmol/l表示；R＝丰度最小的靶标的比率。

具体实施方式

通过下述工作实施例进一步举例说明本发明：

实施例1

寡核苷酸探针被设计为靶向钙蛋白酶-3基因的三个基因组位置，即外显子17、外显子18和19以及外显子22，如图3所示。对于每个靶标区域，均合成第一寡核苷酸探针(“反向寡核苷酸”)和第二寡核苷酸探针(“正向寡核苷酸”)。寡核苷酸探针见下文表1中。

反向寡核苷酸探针(对于各外显子而言，CAPN3_外显子17_反向_ET1、CAPN3_外显子18-19_反向_ET5和CAPN3_外显子22_反向_ET1)的5’末端被磷酸化，并且包含与原始靶序列互补的靶序列的一部分、效率标签序列(下划线)、通用反向引物退火序列和其3’末端的6个硫代磷酸化的核苷酸类似物(由星号表示)。

正向寡核苷酸探针(CAPN3_外显子17_正向_ET1、CAPN3_外显子18-19_正向_ET5和CAPN3_外显子22_正向_ET1)包含其5’末端的6个硫代磷酸化的核苷酸类似物、通用正向引物退火互补序列、效率标签互补序列(下划线)和与原始靶序列互补的靶序列的一部分。

表1

为了使寡核苷酸探针杂交到基因组DNA，将含有200pM寡核苷酸探针的10μl反应液和在1倍扩增缓冲液中的1μg基因组DNA(Epicentre)一起在95℃下孵育5分钟，在PCR循环仪中以每分钟1℃的斜率冷却至60℃。在60℃下杂交14小时后，加入2单位的Stoffel聚合酶(Applied Biosystems)、10单位的Ampligase(Epicentre)和最终浓度为12μM的dNTP，并在60℃下孵育2小时以上。间隙填充反应之后，将样品用核酸外切酶混合物(核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶λ)在37℃下消化2小时。核酸外切酶在80℃下热失活20分钟后，利用etPCR使1μl所得样品进行均匀扩增。

对于利用etPCR进行均匀扩增，使用了一组包含通用引物序列的引物寡核苷酸，如表2所示。

表2

名称	序列	序列号
			(UFP1):	CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC	7
(UFP2):	CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC G	8
			(UFP3):	CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC GC	9
(UFP4):	CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC GCT	10
			(UFP5):	CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC GCT C	11
(URP1):	CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA	12

作为引物寡核苷酸，使用了正向引物寡核苷酸UFP1(7份)、UFP2(1份)、UFP3(1份)、UFP4(1份)、UFP5(1份)的7:1:1:1:1混合物，总浓度为200nM正向引物寡核苷酸和200nM通用反向引物寡核苷酸1(URP1)。PCR扩增是使用Power SYBR Green混合液(Applied Biosystems)和StepOnePlus热循环仪进行的，PCR程序如下：开始在95℃下变性15分钟，然后40个扩增循环(95℃下10秒，60℃下15秒，72℃下30秒)。扩增的靶标在1％琼脂糖凝胶上分析。

如图4所示，琼脂糖凝胶表明本发明的方法相比于标准PCR实现了更均匀丰度的复制，其几乎未显示外显子18和19的任何扩增。

虽然具体的工作实施例是指仅一个末端上ETS被提供用于五个不同的引物寡核苷酸用于聚合酶介导的延伸的方法，但是应当理解的是，ETS和一组不同的寡核苷酸可另外用于相对的末端。如果在相对的末端同样使用了4个核苷酸的ETS和相应的包含五个不同引物寡核苷酸的一组，可实现25个不同效率等级的扩增。

实施例2

结果

作为模型，我们选择了人类抗肌萎缩蛋白基因，这是最大的(不是外显子比较(exon wise)，而是覆盖率比较(coverage wise))已知的由79个外显子组成的人类基因。自从Chamberlain首次报道了多重PCR以来，抗肌萎缩蛋白基因也已被其他研究者用作多重PCR模型。为了建立我们的新技术，我们利用ExonPrimer设计了78个不同的靶标，涵盖了所有79个外显子。为了能通过凝胶电泳进行快速分析，当在凝胶上解析时，我们选择了易于辨别的12个不同大小的靶标(图5)。所选择靶标的大小在范围为153bp至725bp之间(图5)。

为了证明etPCR控制PCR效率的能力，我们首先通过PCR为12个靶标中每一个生成了包含效率标签和共同引发序列(common primingsequence)的单一模板(图5)。将凝胶纯化的模板进行定量PCR以分析PCR效率(图6a)。我们首先利用通用引物(universe primer pair)对进行标准qPCR。因为所有模板均具有相同的引物结合位点并且在相同条件进行qPCR，预计PCR效率的差别是由于固有模板属性例如长度、GC含量和二级结构引起的。12个靶标的固有PCR效率范围为76％至87％(100％对应一个PCR循环中的复制)(图6b)。我们分析了扩增长度和GC含量对PCR扩增效率的影响。正如预期的那样，我们发现大小和PCR效率之间的相关性(图6c)。与此相反，我们发现效率和分析样本中GC含量之间没有强相关性(图6d)。低于20％或高于80％的GC含量据报道显著影响PCR效率。在我们的研究中，12个模板的GC含量范围为34％至51％，说明在我们的研究中PCR性能只受轻微的影响。

然后我们研究了etPCR是否能通过使用一组仅长度不同的五个通用正向引物而影响相同模板的PCR效率。所述靶标具有不同的效率标签，如所预期的那样，与通用引物整个组匹配的标签(TAG 5)当进行etPCR时对效率没有影响(图7a)。然而，含有效率标签和错配子的靶标的扩增与etPCR以及正常PCR显著不同(图7b、c)。为了调查不同标签在采用相同的定量方式时是否会影响不同靶标的PCR效率，我们计算出一个校正因子。校正因子是相同模板的etPCR和正常PCR的效率的比值。该校正因子与标签的类型显著相关并且与模板的内在性质无关(图7d)。因此，这允许根据具体情况调整每一个单一靶标的PCR效率。

我们想知道这些效率标签是否可用于调节多重反应中的扩增效率以获得均匀扩增。设计靶向寡核苷酸并且如材料和方法中所述进行捕获反应。根据扩增子的大小选择效率标签以校正大小依赖性扩增偏向性。使用我们的新的捕获技术，我们能从少量的基因组DNA(200ng)中捕获靶标，并成功地通过PCR将其扩增(图8a)。利用常规PCR进行扩增，观察到强的偏向性，正如我们之前单一模板的PCR效率测量法所预期的。小的扩增子出现次数过高而最大的扩增子通过常规的凝胶电泳几乎检测不到。当使用etPCR时，每个特异性靶标的这种偏向性被显著校正。扩增产物用生物分析仪2100的DNA芯片技术来定量(图8b)。量化数据显示显著校正了扩增偏向性，并形成了类似的均匀扩增(图8d)。这表明新的etPCR技术以均匀方式扩增多个模板的能力是基于允许以非常经济有效的方式进行序列分析。

讨论

我们已经开发了效率标签PCR(etPCR)，是一种新的用于多重PCR的方法，该方法能够由基因组DNA同时均匀地扩增多个靶标。靶标选择策略仅仅是加成反应(addition-only reaction)，并且每个样品可以在单一管中进行，使它易于自动化。etPCR的应用是多种多样的：基因检测的分子诊断、产前检查、癌症表征以及传染病有机体和它们的电阻(resistances)的诊断。此外，它可应用于法医学应用，食品和饲料、环境和水的检测中遗传修饰生物(GMO)或合成生物学的检测。

在这项研究中，我们着重于etPCR在遗传紊乱例如Duchene型肌营养不良的分子诊断中的应用。所述etPCR可在多个样品中平行进行，然后可用样品特异性DNA条形码进行标记并且以池的形式来测序。对靶标和靶标的边界的选择是灵活的，并且大量的靶序列可同时扩增(在此，154bp至724bp)。根据所获得的结果，可对效率标签进行进一步的调整，从而改善均匀性。必须评估为了获得最佳均匀性而应进行调整的循环次数。

近来，已经开发了几种新的方法用于基因组亚组的多重选择、扩增和测序(Fredriksson等人，2007；Bashiardes等人，2005；Dahl等人，2005；Dahl等人，2007；Albert等人，2007；Hodges等人，2007；Meuzelaar等人，2007；Okou等人，2007；Porreca等人，2007)。这些方法中的几种在不同方面具有几个性能缺点，例如靶标边界的精确定义(Albert等人，2007年；Dahl等人，2007；Dahl等人2005；Okou等2007人)、靶标区域的可重现捕获(Porreca等人，2007)、或者匹配靶序列的读段(reads)的片段(Albert等人，2007年；Hodges等人，2007；Okou等人，2007)。在该原理论证型研究中，我们不确定可以通过etPCR扩增的靶序列的数量的上限，使得难以直接将我们的方法和这些技术进行比较，尤其是用于需要高度重复的应用中。然而，etPCR应当证明可用于大量样品的候选区域的中间数(10-1000)的扩增。它特别适合于这些应用，因为它可以引入样品特异性DNA条形码，允许对靶序列的边界进行准确定义，可重复性地、高度特异性地并且均匀地对所述靶序列进行扩增。

我们设想etPCR将能用于多种应用。因为该方法基于PCR，它可能具有与PCR相同的灵敏度，以检测宿主DNA高背景情形下的病原体DNA(Elnifro等人2000；Akhras等人2007a、b)或检测样品中罕见DNA生物标志物(Fackler等人，2006)。此外，它可能具有扩增标靶灵敏性，所述标靶来自降解的样品，没有稳健方法以进行多重或者全基因组扩增的区域。严重依赖PCR的其他应用可从更高级别的多重性中受益，例如许多DNA片段在合成生物学实验中同时装配组件(Reisinger等人2006；Forster和Church，2007)。通过对不同的样品进行条形编码，此方法将用于对大批患者的候选区域进行选择性测序，以识别与疾病相关的变体。EtPCR有望改善依赖于PCR灵敏度的许多其他方法并且可受益于更高的多重性和均匀性，例如体液中病原体检测、生物标记物检测以及用于合成DNA组件。

材料和方法

寡核苷酸设计

为了设计靶向抗肌萎缩蛋白基因的79个外显子的引物，我们利用UCSC基因组浏览器提取了GRCh37/hg19构建体的基因组序列信息。利用ExonPrimer软件选择包含靶寡核苷酸的靶特异性序列的模板，这基于Primer3算法。为了便于通过凝胶电泳进行快速分析，我们选择了12个与靶标大小最多样性相关的模板。针对靶标特异性基因组区域，为每个选定的靶标设计左靶寡核苷酸(LTO)和右靶寡核苷酸(RTO)。LTO的5引物末端(5prime end)加帽硫代磷酸化的核苷酸作为核酸外切酶区块。所述区块之后是允许PCR扩增的所有靶标共有的通用序列以及控制均匀扩增所需的效率标签。最后，3引物末端由靶标特异性序列组成。反之，RTO由5引物末端的靶标特异性序列开始并且由3引物末端的核酸外切酶区块结束而组成。此外，RTO是5引物被磷酸化。利用Microsynth(瑞士)合成寡核苷酸，长度相似的汇集成组并进行凝胶纯化。

靶标寡核苷酸序列

表3

单一模板的PCR扩增

为了分析效率标签对单一靶标的影响，通过标准PCR由上文所述的LTO和“右”PCR引物制备模板，其与右靶标寡核苷酸互补而未被磷酸化。扩增是利用100ng基因组DNA、200nM各引物和含有热启动Taq聚合酶的市售Mastermix(SolisBiodyne)和2.5mM的MgCl完成的。PCR按下述循环方案进行：95℃下12分钟；95℃下35个循环，20秒；60℃下20秒；72℃下1分钟，以及72℃下5分钟的最终延伸步骤。PCR产物进行凝胶纯化并定量。

表4

表五

F1	CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG	49
			F2	CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG*G	50
F3	CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGGC	51
			F4	CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGGC*T	52

F5	CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTC	53
			R1	CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG	54
R2	CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGC	55
			R3	CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCC	56
R4	CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCA	57
			R5	CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCAG	58

定量PCR

利用StepOnePlus循环仪(Applied Biosystems)和Power SYBR GreenPCR预混液(Invitrogen)进行定量PCR(qPCR)。所有实验中的引物浓度均为200nM，并且模板的浓度为10阿托摩尔和3.3阿托摩尔。通过下述步骤进行40个循环：95℃下变性20”，60℃下退火20”，72℃下延伸60”。单个PCR效率利用软件包LinReg通过线性回归分析来计算。

序列捕获反应

为了富集所选靶标，利用以下组分构建10μl捕获反应液：1fmol各靶标寡核苷酸探针、200ng基因组DNA、0.5U的Phusion热启动聚合酶、5U的Ampligase、在1倍Ampligase缓冲液(Epicentre)中的0.1mM的dNTP。在PCR循环仪中按以下步骤进行反应：1)95℃下5分钟，56℃下2小时，并且最后维持在4℃。最初的间隙填充反应之后，加入5μl核酸外切酶混合物(核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶λ)。未掺入的寡核苷酸探针以及基因组DNA在37℃下消化1小时后，将核酸外切酶在80℃下热灭活10分钟，并将样品在4℃下储存。EtPCR扩增之前，加入2μl 50mM的EDTA。对于etPCR扩增，加入5μl这种俘获反应液。

多重效率标签PCR

为了etPCR，使用下述组的通用引物寡核苷酸：由F1(1份)、F2(2份)、F3(3份)、F4(4份)、F5(5份)组成的一组正向引物寡核苷酸以及用作反向引物寡核苷酸的R1。引物的3’末端被封闭以防止通过校读型聚合酶(例如Phusion聚合酶)的3’核酸外切酶活性而被消化。PCR扩增是在30μl中利用0.2mM的dNTP、200nM总的正向引物寡核苷酸和200nM反向引物寡核苷酸、5μl捕获反应液、1倍的GC Phusion缓冲液、0.3μl Phusion热启动聚合酶、2.5mM MgCl₂完成的。扩增反应是在热循环仪中采用下述循环程序而进行的：95℃下预变性15分钟，随后40个扩增循环(95℃下10秒，60℃下20秒，72℃下45秒)。利用安捷伦(Agilent)的生物分析仪2100系统在1.8％的琼脂糖凝胶上分析扩增靶标。

参考文献

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Claims

1.一种使多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，其包括以下步骤：

提供一组能使相同核苷酸序列退火的正向引物寡核苷酸，所述组包括具有5’-X-N’-3’结构的第一正向引物寡核苷酸和具有5’-X-N¹-N²-3’结构的第二正向引物寡核苷酸，

其中X是能使第一引物退火序列退火的核苷酸序列，N¹为无或者由一个或多个核苷酸组成，并且N²由一个或多个核苷酸组成；

提供多个不同的核酸聚合物用作模板，每个模板包括：(i)与核苷酸序列X互补的正向引物退火序列X’，和(ii)特异性靶序列；以及

利用所述组的正向引物寡核苷酸和一个或多个反向引物寡核苷酸，通过聚合酶依赖性扩增反应使模板扩增，其特征在于，第一正向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当使模板退火时与至少两个不同的模板序列完全匹配，并且所述第二正向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当使模板退火时与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个完全匹配。

2.权利要求1所述的方法，其进一步包括提供一组能使相同核苷酸序列退火的反向引物寡核苷酸的步骤，包括具有5’-Y-M¹-3’结构的第一反向引物寡核苷酸和具有5’-Y-M¹-M²-3’结构的第二反向引物寡核苷酸，

其中每个模板进一步包括与核苷酸序列Y互补的反向引物退火序列，靶序列位于正向引物退火序列和反向引物退火序列之间，并且所述聚合酶依赖性扩增反应是利用所述组的正向引物寡核苷酸和所述组的反向引物寡核苷酸进行的，

其特征在于，所述第一反向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当使模板退火时与至少两个不同的模板序列完全匹配，并且所述第二反向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸当使模板退火时与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个错配并且与所述至少两个不同的模板序列中的至少一个完全匹配。

3.权利要求2所述的方法，其中模板的数量为v，并且每个模板包括5’-X-et^Xw-T^w-et^Y’w-Y’-3’结构

其中

v是大于1的整数，

w是1至v的整数，每个特定的模板分配一个单独的w值，

X如权利要求1所定义，

et^Xw是第一效率标签序列，

T^w是靶序列或其互补，

et^Y’w是第二效率标签序列的互补序列，

Y’是反向引物退火序列。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于每个效率标签序列包含2至10个核苷酸，优选2至7个核苷酸，更优选3至5个核苷酸。

5.权利要求3或4所述的方法，其特征在于每个模板均由下述步骤提供：

提供一种单链原始核酸聚合物，其包含一个待扩增的原始靶序列；

杂交到寡核苷酸探针上的原始靶序列的5’末端，所述寡核苷酸探针序列包含与原始靶序列5’末端互补的靶序列的一部分、引物退火序列和效率标签序列，并且与另一个寡核苷酸探针上的原始靶序列的3’末端杂交，另一个寡核苷酸探针序列包含与原始靶序列的3’末端互补的靶序列的一部分、引物退火互补序列和效率标签互补序列；

分离所产生的模板。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于所产生的模板的末端被保护抗核酸外切酶。

7.权利要求5或6所述的方法，其特征在于所产生的模板包含游离末端、双末端区域中的一个或多个核苷酸被修饰以形成核酸外切酶保护。

8.权利要求7所述的方法，其特征在于所述一个或多个经修饰的核苷酸是被硫代磷酸化。

9.权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于分离所产生的模板的步骤是利用核酸外切酶消化剩余的核酸组分而进行的。

10.核酸聚合物文库，特别是DNA或RNA文库，包含2至9中任一项所定义的多个模板。

11.一种试剂盒，用于实施权利要求1至9中任一项所述的方法，其包含

第一组寡核苷酸探针，第一组中每种寡核苷酸探针的序列包含

-与待扩增的原始靶序列5’末端互补的靶序列的一部分，

-效率标签序列，以及

-引物退火序列，

第二组寡核苷酸探针，第二组中每种寡核苷酸探针的序列包含

-引物退火互补序列，

-效率标签互补序列，以及

-与原始靶序列的3’末端互补的靶序列的一部分，

第二组中不同的引物寡核苷酸包含一个引物序列，其与通过合成与包含引物退火互补序列的模板互补的链而获得的另一个引物退火序列至少基本上互补，第二组中引物寡核苷酸在引物序列下游延伸的长度上彼此不同。

12.权利要求11所述的试剂盒，还包含聚合酶和连接酶。

13.权利要求1至9中任一项所述的方法在基因探针检测特别是用于鉴别传染性有机体或突变体基因中的用途。

14.权利要求1至9中任一项所述的方法在分子克隆中的用途。