CN116536435A - 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统及其构建方法，该检测系统包含基于淋病奈瑟菌PorA假基因的RPA引物对、Cas12a、crRNA、以及带有荧光基团和淬灭基团标记的荧光报告探针或带有荧光基团和生物素标记的生物素报告探针。该检测系统能够在不依赖特殊设备的情况下快速检测淋病奈瑟菌，对淋病诊断和控制具有重要临床意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统及其构建方法。
背景技术
淋病是由淋病奈瑟菌感染引起的性传播感染(STI)性疾病，以泌尿生殖道化脓性炎症为主要临床症状。淋病与不孕不育、不良妊娠和不良新生儿结局相关。此外，淋病还促进HIV的感染和传播。严重的淋病奈瑟菌感染可全身扩散，导致化脓性关节炎、皮炎和败血症等。因此，淋病是一项全球公共卫生挑战。根据世界卫生组织(WHO)的数据，2020年全球成人(15-49岁)的年新发淋病病例约为8240万,其中以低收入国家和地区的淋病发病率最高。传统的淋病奈瑟菌鉴定方法主要包括培养法和直接镜检法：培养法操作复杂，耗时长；直接镜检法对检验人员专业素养要求高，易漏诊。新兴的PCR分子诊断法需要专门的设备和训练有素的专业技术人员，而资源匮乏的基层医院可能不具备。因此，有必要开发一种敏感性高、特异性强、低成本的淋病奈瑟菌快速床旁检测方法。
成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/相关蛋白(Cas)系统的最新进展为分子诊断提供了一个有前景的新途径。基于CRISPR/Cas系统，科学家们成功开发了多种灵敏、特异、快速的检测平台，如可用于新冠病毒、HPV等各种病原体检测的SHERLOCK(Cas13a)、DETECTR(Cas12a)和Cas14-DETECTR等检测平台。Cas12a又名Cpf1，是一种RNA引导的核酸内切酶，具有顺式和反式DNA酶活性。在靶向识别与crRNA互补的双链DNA(dsDNA)序列后，Cas12a显示出顺式切割活性，切割dsDNA。随后，活化的Cas12a显示出反式切割活性，可对附近的非靶单链DNA(ssDNA)进行非特异性切割。其中，Cas12a对dsDNA靶基因的顺式切割是激活非特异性ssDNA反式切割活性的先决条件。Cas12a这种特异性靶基因顺式切割激活的非特异性ssDNA反式切割活性已被全面评估并开发应用于核酸诊断。通过引入某种待测病原体的特异性靶基因和非靶ssDNA探针，将CRISPR/Cas12a对特定病原体靶基因的顺式切割活性和对非靶ssDNA探针的反式切割活性联系起来，进行特定病原体的快速检测。将荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA或荧光基团和生物素标记的ssDNA引入反应体系，CRISPR/Cas12a切割结果就可以通过荧光读数或侧向层析试纸条进行可视化。
为了提高CRISPR/Cas12a检测系统的灵敏度，往往需要结合一些核酸扩增技术来提高靶基因丰度。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术的等温扩增特性降低了对设备的要求，为突破实验室边界开辟了新的途径。此外，RPA对背景DNA和某些PCR抑制剂，如血红蛋白、肝素、尿液等具有耐受性，从而有利于其临床应用。
PorA基因/假基因仅存在于人类致病奈瑟菌——脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌。在基因序列上，与脑膜炎奈瑟菌的PorA基因相比，淋病奈瑟菌的PorA假基因显示出足够的差异，将差异性基因片段作为靶基因，即可与脑膜炎奈瑟菌相区分。同时，因为没有正选择压力，淋病奈瑟菌的PorA假基因非常稳定，几乎不会随时间而改变。因此，具有较高稳定性和特异性的PorA假基因片段可被选作淋病奈瑟菌的分子检测靶点。
本研究选择具有较高稳定性的淋病奈瑟菌特异性PorA假基因片段作为淋病奈瑟菌分子检测用靶基因，并通过设计并筛选PorA假基因特异性的RPA引物，预扩增PorA靶基因，提高靶基因丰度。再设计PorA假基因特异性crRNA，与Cas12a形成Cas12a/crRNA二元复合物。若RPA扩增体系中存在PorA假基因，则Cas12a/crRNA二元复合物与PorA假基因结合形成三元复合物，Cas12a即可完成对PorA假基因的特异性顺式切割，继而激活Cas12a对系统中预先引入的非靶标ssDNA荧光报告基因的反式切割活性，裂解系统中ssDNA荧光报告探针，使得淬灭基团和荧光基团分离，从而发出荧光，通过荧光分析仪即可检测荧光信号。但考虑到荧光检测的最大缺点是需要荧光读数设备，大大限制了检测的便携性，为了进一步实现无仪器即时床旁检测，本研究在系统中引入了FAM基团和生物素标记的ssDNA报告探针，经Cas12a/crRNA二元复合物特异性识别并切割PorA假基因，并对ssDNA生物素报告探针进行非特异性反式切割后，即可通过商业侧向层析试纸条进行检测。在PorA假基因存在的情况下，CRISPR/Cas12a系统对PorA假基因进行顺式切割，继而激活Cas12a对系统中预先引入的FAM-生物素报告探针的反式切割，使得FAM和生物素基团被分离。试纸条的质控线(C)处富含链霉亲和素，吸附生物素而显色，试纸条的检测线(T)处富含抗FAM抗体-金纳米颗粒偶联物，吸附FAM基团而显色。
本发明基于DETECTER检测平台，通过将CRISPR/Cas12a反应与RPA相结合，建立了一种新的淋病奈瑟菌核酸诊断方法。RPA-CRISPR/Cas12a系统能够在不依赖特殊设备的情况下快速检测淋病奈瑟菌，对缺乏医疗设备的发展中国家的淋病诊断和控制具有重要意义。然而，RPA-CRISPR/Cas12a检测系统设计中存在几大难点，一是需要寻找和筛选出淋病奈瑟菌特异性(区别于其它病原菌，包括脑膜炎奈瑟菌)的保守基因序列，即各淋病奈瑟菌基因中具有同一性又区别于其它病原菌的序列作为特异性检测目标DNA序列；二是根据筛选出的特异性目标DNA序列设计特异性RPA引物对，以提高待测特异性目标基因的丰度，但目前没有专业的RPA引物对设计软件，要获得特异性高的RPA引物对，必须提取各类临床常见病原菌DNA，经RPA扩增实验结合琼脂糖凝胶电泳和CRISPR/Cas12a荧光检测才能确定，工作量大，且比较困难；三是设计特异性引导Cas12a至待测目标基因PAM序列位点，并与靶链互补配对的crRNA，即特异性的crRNA，所以RPA扩增子必须含有PAM序列。这些难点是在构建该检测系统过程中需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统及其构建方法。
为实现本发明的目的，提供了以下实施方案。
在一实施方案中，本发明的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统，包含基于淋病奈瑟菌PorA假基因的RPA引物对、Cas12a、crRNA、以及带有荧光基团和淬灭基团标记的荧光报告探针或带有荧光基团和生物素标记的生物素报告探针，所述目标基因PorA假基因为含有如SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列，所述crRNA为核苷酸序列为：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCGGCAGCAUUCAAUUUGUU-3’，
所述RPA引物对选自下列Primer pair No.3和Primer pair No.6的引物对：
优选的，上述本发明的检测系统，所述报告探针为带有荧光基团和生物素的生物素报告探针，其核苷酸序列为5’-/6-FAM/TTATTATT/Biotin/-3’。
在一具体实施方案中，上述本发明的检测系统，所述带有荧光基团和淬灭基团标记的荧光报告探针，其核苷酸序列为：
5’-/6-FAM/CCGGAAAAAAAAAAAACCGG/BHQ1/-3’。
上述本发明的检测系统，所述PorA假基因片段即为RPA扩增子或RPA扩增产物(简称RPA产物)。
优选的，上述本发明的检测系统，所述PorA假基因的RPA引物对为Primer pairNo.3的引物对。
在另一实施方案中，本发明还提供了一种上述本发明的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统的构建方法，包含：
1)从NCBI查选所有可获得的淋病奈瑟菌的PorA假基因的DNA序列；
2)采用Mega-X软件进行序列比对、筛选上步的DNA序列，获得淋病奈瑟菌保守序列；
3)采用Mega-X软件,将上步筛选获得的淋病奈瑟菌的PorA假基因的保守序列与228株脑膜炎奈瑟菌的PorA基因进行序列比对，筛查保守序列中的淋病奈瑟菌PorA假基因特异性区域，根据TwistDx说明书(www.twistdx.co.uk)设计特异性的RPA引物对；
4)使用IDT OligoAnalyze对引物二聚体和发卡结构进行分析后，采用NCBI的Primer-BLAST软件验证RPA引物对的特异性，初步获得理论上的特异性RPA引物对；
5)采用重组酶聚合酶扩增反应(RPA)联合琼脂糖凝胶电泳，筛选上步获得的理论上的特异性RPA引物对，获得特异性引物对Primer pair No.3和Primer pair No.6，再联合CRISPR-Cas12a反应和荧光检测，优选为Primer pair No.3；
6)利用引物对Primer pair No.3进行RPA扩增反应获得RPA扩增子，即目标基因PorA假基因的特异性保守序列；
7)设计crRNA，所述crRNA识别PAM位点(TTTN)附近21bp的目标序列；
8)使用BLAST程序检查crRNA序列的特异性，获得具有特异性的crRNA序列。
上述本发明的构建方法，步骤5)中所述RPA扩增反应筛选，通过联合琼脂糖凝胶核酸电泳和CRISPR/Cas12a荧光检测，筛选出RPA引物对，筛选出的最佳RPA引物对为Primerpair No.3，即SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
上述本发明的构建方法，步骤6)中的目标基因PorA假基因片段序列为RPA扩增子，其核苷酸序列为(SEQ ID NO 13):
GCTCGCCGGTCGCGTTGCGAATCCGTTTGGCGATGCCAGCAAAGCCATTGATCCTTGGGACAGCAATAATAATGTGGCTTCGCAATTGGGTATTTTCAAACGCCACGACGGTATGCCGGTTTCCGTGCGTTACGATTCCCCCGGATTTTCCGGTTTCAGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCGAGTCAAAACAGCAAGTCCGCCTATACGCCTGCTACTTTCACGCTGGAAAGTAATCAGATGAAACCAGTTC。
上述本发明的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统的构建方法，所述从NCBI基因库中筛查淋病奈瑟菌的PorA假基因的DNA序列，获得多条核苷酸序列，如编码号为AJ010732.1,AJ010733.1,AJ223449.1,AJ223448.1,AJ223447.1,AJ223446.1的基因序列。
另一方面，本发明还提供了上述本发明的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统用于制备检测淋病奈瑟菌的检测试剂盒的用途。
本发明的一种检测淋病奈瑟菌的检测试剂盒，含有上述本发明的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统。
本发明的淋病奈瑟菌的检测系统可用于淋病奈瑟菌的检测，检测方法包括：
从患者的临床标本中提取DNA，利用该DNA和特异性RPA引物对对淋病奈瑟菌特异性PorA假基因进行RPA扩增，提高靶基因丰度。再利用Cas12a/crRNA二元复合物对PorA靶基因的特异性顺式切割，激活Cas12系统的反式切割活性，切断FAM-BHQ标记的ssDNA探针或FAM-Biotin标记的ssDNA探针，分别可经荧光分析仪或侧向流层析检测试纸条判读结果。整个过程无需复杂仪器，可在1小时内完成检测。
本发明的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统的优势在于：
该系统无需特殊设备，与其它常见病原体无交叉反应，具有非常高的特异性(100％)，可在1h内快速、准确检测淋病奈瑟菌。在包括24份临床样本的评估实验中，该检测系统与传统培养法的符合率高达100％。具有快速、便携、低成本、无需特殊设备、可操作性强等优点，具有作为自我检测和即时诊断的巨大应用潜力，对缺乏医疗设备的发展中国家的淋病临床管理将发挥重要意义。
附图说明
图1为PorA-RPA最佳引物对筛选和CRISPR/Cas12a切割时间优化结果图，图中，
a.通过核酸电泳评价3号RPA引物对的特异性，1代表淋病奈瑟菌ATCC43069，2代表屎肠球菌，3代表干燥奈瑟菌，4代表干燥奈瑟菌，5代表脑膜炎奈瑟菌，6代表脑膜炎奈瑟菌，7代表铜绿假单胞菌，8代表抗辐射不动杆菌，9代表阴沟肠杆菌，10代表肺炎克雷伯菌；
b.通过核酸电泳评价6号RPA引物对的特异性，1-7为淋病奈瑟菌临床分离株，8为抗辐射不动杆菌；9为肺炎克雷伯菌，10为脑膜炎奈瑟菌，11为脑膜炎奈瑟菌，BP为碱基对，M为marker；
c.通过CRISPR/Cas12a检测系统评价RPA引物对的特异性，采用6对候选引物进行RPA反应；
d.CRISPR/Cas12a切割时间优化，Ng为淋病奈瑟菌ATCC43069(1ng/μL)，Nm为脑膜炎奈瑟菌。
图2为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统的构建，图中，
a和b为侧向层析法ssDNA报告基因浓度的优化，
c为CRISPR/Cas12a反应液与Hybri检测缓冲液比例的优化。
图3为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a系统的特异性和检测限结果图，图中，
a和b为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统的特异性，反应时间30分钟，
c为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统的检测限，反应时间30分钟，
d为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统的特异性，反应时间30分钟，
e为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统的检测限，反应时间30分钟，数据点代表至少四次生物学独立试验，误差棒指示平均值±SD，AU，任意单位，星号表示通过单因素方差分析，与空白对照相比有显著差异(*P<0.05,****P<0.0001)，ns,没有统计学意义，Ng为淋病奈瑟菌ATCC43069，Nm为脑膜炎奈瑟菌，Ns为干燥奈瑟菌，Pae为铜绿假单胞菌。
图4为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的临床验证结果图，图中，
图a为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统的临床验证，
图b为PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统的临床验证。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明和帮助理解本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例采用的材料和试剂：
仪器与耗材
试剂
实施例1基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统的构建方法
1.1菌株、临床样本
淋病奈瑟菌参考菌株(ATCC 43069)由捐赠获得。淋病奈瑟菌临床分离株(n＝8)经过革兰染色和VITEK MS质谱鉴定。以10株非淋病奈瑟菌临床分离株(干燥奈瑟菌2株、脑膜炎奈瑟菌2株、解脲脲原体1株、铜绿假单胞菌1株、阴沟肠杆菌1株、肺炎克雷伯菌1株、屎肠球菌1株、抗辐射不动杆菌1株)作为阴性对照。此外，还收集了24份疑似淋病患者的临床样本，包括女性宫颈或阴道分泌物标本，以及男性的尿道分泌物标本。将一份足量的临床样本分为两等份，一份用于淋病奈瑟菌传统培养(金标准)，另一份用于提取DNA并使用PorA-RPA-CRISPR/Cas12a系统进行分子诊断。上述临床分离株和临床样本均收集自重庆医科大学附属第一医院。
1.2 RPA引物的设计、合成、筛选
第一步、目标保守序列的选择
从NCBI数据库中下载所有可获得的淋病奈瑟菌的PorA假基因序列(AJ010732.1,AJ010733.1,AJ223449.1,AJ223448.1,AJ223447.1,AJ223446.1)，使用Mega-X软件进行筛选、反复序列比对，获得保守区域。
第二步、RPA引物对设计
为了与脑膜炎奈瑟菌相区分，将上步筛选出的淋病奈瑟菌的PorA假基因的保守序列与228株脑膜炎奈瑟菌的PorA基因进行序列比对，选择特异性区域(两者差异较大的区域)，作为后续RPA扩增子序列。根据TwistDx公司的重组酶聚合酶扩增试剂盒中的说明书(www.twistdx.co.uk)的要求，初步设计特异性RPA引物对。使用IDT OligoAnalyzer(www.idtdna.com)对引物二聚体和发卡结构进行分析，排除可能具有发卡结构和二聚体的序列。
第三步、使用NCBI的Primer-BLAST软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)验证上述初步设计的RPA引物的特异性。经验证后的特异性RPA引物序列见表1。RPA引物送擎科生物公司合成。
表1扩增PorA假基因的RPA引物对序列
第四步、核酸制备
使用TIANamp细菌DNA提取试剂盒，按照试剂厂商的说明提取上述1.1的菌株，获得淋病奈瑟菌细菌基因组DNA和非淋病奈瑟菌细菌基因组DNA，并使用微量分光光度仪NanoDrop 2000(Thermo,United States)测量DNA浓度。提取的DNA在使用前储存在-20℃冰箱保存。
第五步、RPA引物对筛选
为构建特异且稳定的重组酶聚合酶扩增(RPA)反应，对候选引物进行了筛选。使用第四步提取的DNA，采用TwistDx公司的重组酶聚合酶扩增技术，分别使用表1的6对候选引物对扩增淋病奈瑟菌和非淋病奈瑟菌DNA，然后通过琼脂糖凝胶核酸电泳和CRISPR/Cas12a荧光检测筛选出最佳引物对。
a.琼脂糖凝胶电泳：电泳胶配制的终浓度为2％，加5μL RPA扩增产物，100V恒压电泳30min，结束后显影。
b.CRISPR/Cas12a荧光检测:参见实施例2的RPA-Cas12a荧光检测部分。
(2)RPA反应体系
使用TwistDx商业重组酶聚合酶扩增试剂盒，按照说明书进行RPA反应，反应在39℃下进行15-20分钟(表2)。
表2RPA反应体系
核酸电泳测试结果提示，3号(即Primer pair No.3)和6号(即Primer pair No.6)RPA引物对具有PorA假基因扩增特异性(参见图1中的a,b)。然而，当我们结合CRISPR/Cas12a荧光检测系统对6号引物对的扩增产物进行检测时，发现特异性并不好。因此，我们放弃了直接通过核酸电泳结果筛选特异RPA引物的方法，而是结合CRISPR/Cas12a荧光检测系统观察RPA引物对的扩增特异性，以选择最适合CRISPR/Cas12a检测系统的RPA引物对。如图2c所示，CRISPR/Cas12a系统在检测由3号引物对和4号引物对扩增得到的RPA产物时表现出显著的特异性，相对于4号引物对RPA扩增产物来说，3号引物对RPA扩增产物用于后续CRISPR/Cas12a裂解和荧光检测时，淋病奈瑟菌的荧光值更高，而阴性对照脑膜炎奈瑟菌的荧光值更低。因此，3号引物对更有利于特异的CRISPR/Cas12a检测系统的构建，所以选择3号引物对，即Primer pair No.3，为最佳RPA引物对。
最后采用3号引物对，参照前述聚合酶反应方法，使用TwistDx商业重组酶聚合酶扩增试剂盒，按表2的反应条件，制备了RPA扩增子(也称RPA产物)，经测序，其核苷酸序列如下(5’-3’)：
GCTCGCCGGTCGCGTTGCGAATCCGTTTGGCGATGCCAGCAAAGCCATTGATCCTTGGGACAGCAATAATAATGTGGCTTCGCAATTGGGTATTTTCAAACGCCACGACGGTATGCCGGTTTCCGTGCGTTACGATTCCCCCGGATTTTCCGGTTTCAGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCGAGTCAAAACAGCAAGTCCGCCTATACGCCTGCTACTTTCACGCTGGAAAGTAATCAGATGAAACCAGTTC。
该核苷酸序列作为本发明的检测系统的目标靶序列,记为SEQ ID NO 13。
1.3 crRNA、ssDNA报告基因设计
依据1.2获得的RPA扩增子，设计了特异性的crRNA以识别PAM位点(TTTN)附近21bp的目标序列，并使用BLAST程序检查和验证crRNA序列的特异性。crRNA送Takara宝生物技术有限公司合成，具体序列见表3。同时设计了ssDNA报告基因，送上海生工生物工程有限公司合成，具体序列见表4。
表3crRNA序列(5’-3’)
表4ssDNA报告基因序列
以上完成了本发明的RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的构建，获得了检测目标基因序列(RPA产物)、RPA引物对、crRNA序列和报告探针等RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的主要组成要素。
实施例2RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统
将1.2RPA扩增反应获得的RPA产物作为底物添加到RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统中(参见表5)。RPA-CRISPR/Cas12a荧光反应在37℃下进行，最终体积为20μL，并通过酶标仪TECAN检测荧光信号。为获得满意的CRISPR/Cas12a检测系统性能，将CRISPR/Cas12a切割时间在5至55分钟间进行优化。
表5RPA-CRISPR/Cas12a荧光/侧向层析检测系统
上述RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统，是带有荧光基团和淬灭基团标记的荧光报告探针(ssDNA)的基于CRISPR-CAS12a的淋病奈瑟菌的检测系统，荧光报告探针的核苷酸序列为5’-/6-FAM/CCGGAAAAAAAAAAAACCGG/BHQ1/-3’。
在确保产生可分辨荧光强度的条件下，CRISPR/Cas12a裂解时间越短，RPA-Cas12a荧光检测总时间就越短。通过观察不同裂解时间点的荧光读数，对裂解时间在5-55分钟范围内进行优化。发现CRISPR/Cas12a裂解30分钟时荧光强度达到平台期，因此，选定30分钟为最佳裂解时间。然而事实上，在荧光强度达到平台期之前，淋病奈瑟菌组产生的荧光强度即可与阴性对照脑膜炎奈瑟菌组产生的荧光强度进行明显区分。因此，裂解时间可适当缩短至15-30分钟(参见图1中的d)。
实施例3 RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统
RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统，为带有荧光基团和生物素标记的生物素报告探针(ssDNA)的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌的检测系统，生物素报告探针的核苷酸序列为5’-/6-FAM/TTATTATT/Biotin/-3’。
除ssDNA报告基因不同外，RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统的反应组成与实施例2的RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统相同(表5)。另外，侧向层析检测法在37℃下进行CRISPR/Cas12a裂解反应后，需在CRISPR/Cas12a反应液中加入Hybri检测缓冲液并按比例稀释，以满足侧向层析检测的溶液体积要求，然后将试纸条插入，室温下孵育2min后取出并拍照，通过ImageJ量化和GraphPad可视化分析条带强度。对RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统中的几个参数进行优化，包括ssDNA浓度(3.125nmol/L,6.25nmol/L,12.5nmol/L,25nmol/L,62.5nmol/L,125nmol/L,250nmol/L)，CRISPR/Cas12a反应液与Hybri检测缓冲液的比例(1：1，1：3)。使用商业条带进行侧向层析检测。
为了最大限度降低RPA-Cas12a侧向层析检测法的假阳性率，将ssDNA报告基因稀释成不同浓度进行实验。ImageJ定量和GraphPad可视化侧流条带强度分析结果显示：125nmol/L ssDNA使阴性样品测试线的条带强度最低(参见图2中的a,b)。此外，还优化了CRISPR/Cas12a反应液与Hybri检测缓冲液的比例。将CRISPR/Cas12a反应液在Hybri检测缓冲液中以不同的比例(1:1、1:3)进行稀释，检测结果显示，1:1的比例可以使阳性样品测试线的条带最明显(参见图2的c)。
RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法操作简单，依赖于特殊的荧光读数仪，而本发明的RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测法具有便携、低成本、无需特殊设备(如荧光读数仪)等优点，可实现淋病奈瑟菌的现场即时诊断。
实施例4 PorA-RPA-CRISPR/Cas12a系统的特异性和检测限
术语：PorA-RPA-CRISPR/Cas12a系统即为本发明的RPA-CRISPR/Cas12a检测系统，以下同义。
为评价PorA-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的特异性，以淋病奈瑟菌参考菌株、淋病奈瑟菌临床分离株和非淋病奈瑟菌临床分离株(干燥奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、解脲脲原体、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、抗辐射不动杆菌)的基因组DNA作为模板进行检测。结果表明，PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统和PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统均与非淋病奈瑟菌无交叉反应，能准确鉴定淋病奈瑟菌，证实PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测和侧向层析检测系统均具有高特异性(参见图3的a,b,d)。
以系列稀释的淋病奈瑟菌参考菌株(ATCC43069)基因组DNA为模板，对PorA-RPA-CRISPR/Cas12a系统的检测限进行评价。结果表明，PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统和PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统的检测限均低至5pg/μL，均具有较高的灵敏度(参见图3的c,e)。
实施例5PorA-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的临床验证
PorA-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的临床验证方法
收集24个疑似淋病患者的临床样本，以传统培养法为参考方法，对PorA-RPA-CRISPR/Cas12a系统的可行性进行评价。将一份足量的临床样本分为两等份，一份用于传统培养(作为金标准)，另一份用于提取DNA，并使用PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统和RPA-Cas12a侧向层析检测系统进行分子诊断。即所有的临床样本均使用上述三种方法分别进行检测，并将检测结果与培养法检测结果进行比较。培养法：血平板、巧克力平板、TM选择培养基，35-37℃，5％CO2，培养24-72小时。
利用24份疑似淋病患者的临床样本对PorA-RPA-CRISPR/Cas12a系统的检测能力进行了评估。以传统培养为参考方法，PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法和PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测法与传统培养法检测结果的符合率均为100％(参见图4的a,b和表6)。表明PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测和侧向层析检测系统均具有良好的可行性，可应用于淋病奈瑟菌的临床检测。
表6PorA-RPA-Cas12a系统的临床验证
-：检测阴性；+：检测阳性
目前临床检测淋病奈瑟菌的方法，无论是传统的培养法、直接镜检法，还是新兴的PCR法，都依赖于专门的设备和训练有素的技术人员，限制了检测的便利性和灵活性。本发明开发的基于PorA-RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌检测系统，可以在不依赖特殊设备的情况下快速完成检测，具有床旁检测的巨大应用潜力，尤其是PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统。
值得一提的是，淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌具有较高的同源性，以至于在临床检测时常常难以区分。本发明构建的靶向淋病奈瑟菌PorA假基因的PorA-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统与其他病原体无交叉反应，可准确区分淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌，这对临床检测具有重要意义。除了具有非常高的特异性外，实验结果还表明，PorA-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统具有较高的灵敏度，检测限为5pg/uL。此外，还利用24份临床样本，对PorA-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统直接用于临床标本检测的可行性进行了评估。研究结果证实，PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统和侧向层析检测系统对临床标本的检测结果与传统培养法检测结果的符合率均高达100％。因此，PorA-RPA-CRISPR/Cas12a(即本发明的RPA-CRISPR/Cas12a)检测系统具有良好的临床应用可行性，可以应用于淋病奈瑟菌的临床检测。
综上所述，本发明开发并验证了两种基于RPA-CRISPR/Cas12a的特异且敏感的淋病奈瑟菌快速检测方法—PorA-RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法和PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测法，在即时诊断和自我检测中具有巨大的应用前景。其中PorA-RPA-CRISPR/Cas12a侧向层析检测系统非常容易获得，这可能为医疗设施有限的地区控制淋病作出重要贡献。
Claims (10)
1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统，包含基于淋病奈瑟菌PorA假基因的RPA引物对、Cas12a、crRNA、以及带有荧光基团和淬灭基团标记的荧光报告探针或带有荧光基团和生物素标记的生物素报告探针，所述目标基因PorA假基因为含有如SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列，所述crRNA核苷酸序列为5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCGGCAGCAUUCAAUUUGUU-3’，
所述RPA引物选自下列Primer pair No.3和Primer pair No.6的引物对：
。
2.如权利要求1所述的检测系统，所述报告探针为带有荧光基团和生物素的生物素报告探针。
3.如权利要求1所述的检测系统，所述带有荧光基团和淬灭基团标记的荧光报告探针，其核苷酸序列为：5’-/6-FAM/CCGGAAAAAAAAAAAACCGG/BHQ1/-3’。
4.如权利要求1或2所述的检测系统，所述带有荧光基团和生物素标记的生物素报告探针，其核苷酸序列为5’-/6-FAM/TTATTATT/Biotin/-3’。
5.如权利要求1所述的检测系统，所述目标基因PorA假基因为RPA扩增子。
6.如权利要求1所述的检测系统，所述RPA引物对为Primer pair No.3的引物对。
7.一种权利要求1-6任一所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统的构建方法，包含：
1)从NCBI查选所有可获得的淋病奈瑟菌的PorA假基因的DNA序列；
2)采用Mega-X软件进行序列比对、筛选上步的DNA序列，获得淋病奈瑟菌保守序列；
3)采用Mega-X软件,将上步筛选获得的淋病奈瑟菌的PorA假基因的保守序列与228株脑膜炎奈瑟菌的PorA基因进行序列比对，筛查出保守序列中的淋病奈瑟菌PorA假基因特异性区域，设计特异性的RPA引物对；
4)采用NCBI的Primer-BLAST软件验证RPA引物对的特异性，初步获得理论上的特异性RPA引物对；
5)采用重组酶聚合酶扩增(RPA)反应，筛选上步获得的理论上的特异性RPA引物对，获得特异性引物对Primer pair No.3和Primer pair No.6；
6)利用引物对Primer pair No.3进行RPA扩增反应获得RPA扩增子，获得目标基因PorA假基因序列，即RPA扩增子；
7)设计crRNA，所述crRNA识别RPA扩增子PAM位点(TTTN)附近21bp的目标序列；
8)使用BLAST程序检查crRNA序列的特异性，获得具有特异性的crRNA序列。
8.如权利要求7所述的构建方法，步骤5)中所述重组酶聚合酶扩增(RPA)反应筛选，通过联合琼脂糖凝胶核酸电泳和CRISPR/Cas12a荧光检测，筛选出最佳RPA引物对Primerpair No.3。
9.一种权利要求1-6任一的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统用于制备检测淋病奈瑟菌的试剂盒的用途。
10.一种检测淋病奈瑟菌的检测试剂盒，含有权利要求1-6任一的基于RPA-CRISPR/Cas12a的淋病奈瑟菌快速检测系统。
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2023
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| CN116978457B (zh) * | 2023-09-22 | 2023-12-22 | 成都斯马特科技有限公司 | 避免rna检测过程中假基因干扰的引物和探针组合及其设计方法 |
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