JP2014526257A - 複数の標的領域特異性および三部分的特性を有するプローブ - Google Patents

複数の標的領域特異性および三部分的特性を有するプローブ Download PDF

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Abstract

標的ヌクレオチド配列における多型（短い縦列反復を含む）を検出するためのプローブおよび方法が開示される。プローブは、リンカー配列により分け隔てられた第1および第2の領域を含み、第1および第2の領域は、対応する標的配列と共に別個の融解温度を有する。第1の実施態様では、第1および第2の領域は両方ともレポーター配列である。第2の実施態様では、1つの領域がアンカー配列である一方でもう1つの領域はレポーター配列である。

Description

本発明は、標的核酸配列を検出するための核酸プローブに関し、より具体的には、ゲノムDNAまたは増幅DNAからバリアント核酸配列を検出するためのプローブに関する。本発明のさらなる側面は、バリアント核酸配列を検出するため方法に関する。
核酸プローブは、ゲノムDNAまたは増幅DNA中の特定の標的配列の存在を同定するためにしばしば使用される。標的に対するプローブのアニーリング温度または融解温度は、プローブと標的とによって共有されている相補的領域の長さによって、および、相補的塩基対間にあるミスマッチの存在によって、影響される。これを利用して、例えばSNPまたは多重反復のようなバリアントの存在を検出することができる。プローブは、野生型配列に対する第1融解温度（Tm）を有するように設計することができ、そして例えばアニーリングの際の蛍光の発生を通して、標的へのプローブのアニーリングを監視することができる。もしTmが予測値と異なっていれば、その標的配列はバリアントを含んでいることになる。
しかしながら、このプロセスは、より長いプローブ領域では実施するのが困難であり得る。特に、長いプローブは、野生型とバリアント配列との間でTmの十分な差異を提供しないことがあり得る。
本発明は、従来型プローブのこれらおよびその他の不都合に対処することを意図する。
US2007/0065847は、タグとして作用する共通配列で標識された一群のヌクレオチドプローブを記述している。このプローブは、化合物のライブラリーを探索するために使用される。
WO2011/027966は、第1領域および第2領域を有するプローブであって、第1領域がレポーター分子を含み第2領域がクエンチャー分子を含むものを記述している。このプローブが標的にハイブリダイズすると、エキソヌクレアーゼがレポーターをクエンチャーから分断することができ、シグナル検出がもたらされる。ミスマッチが存在することによりレポーター部分がハイブリダイズしない場合には、レポーターが分断されず、シグナル検出が起こらない。
WO2007/058499は、分離部分によって隔てられた第1および第2のハイブリダイゼーション部分を有する、呼吸器ウイルス用のプローブを記述している。
US2007/0259347は、アレイをスクリーニングするためのプローブであって、リンカーによって隔てられた2つの部分を有し、そのリンカー部分はハイブリダイゼーションに関連する相同性ノイズを最小限化するよう選択されるものを記述している。
US2003/0170711は、ユニバーサル塩基（2-デオキシイノシンを含む）を含むオリゴヌクレオチドプローブを記述している。
WO2011/087928は、野生型配列のバックグラウンドの中からKRASおよびPIK3CAのSNPを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを記述しており、これはポリデオキシイノシンのリンカーを含むものである。
本発明の第1の側面によって、第1の標的核酸配列と相補的な第1の核酸配列；第2の標的核酸配列と相補的な第2の核酸配列；ならびに、前記第1および第2の核酸配列を連結するリンカー核酸配列を含む核酸プローブであって、前記リンカーは、前記第1の標的核酸配列にアニールした前記第1の配列の融解温度と前記第2の標的核酸配列にアニールした前記第2の配列の融解温度とが別個となるように、前記第1および第2の2つの配列を分け隔てる、核酸プローブが提供される。
リンカー領域の存在は、異なるハイブリダイゼーション特性を有する複数の機能的要素へとプローブを分離することを可能とする。これらのリンカーを含ませると「バブル」構造が創出され、これは熱力学的観点においてプローブの複数の要素を分離し、異なる結合特性を有する複数の領域を提供する。さらに、リンカー核酸配列の存在は、プローブ全体が、単一のポリヌクレオチド分子の特性を有しながら、より短い分離された核酸プローブから構成されているかのように振舞うことを可能とする。リンカー領域は、前記第1および第2の配列がそれぞれの標的配列にハイブリダイズしたときに折り畳まれて外部ループを形成し得る。
いくつかの実施態様では、プローブは、複数のリンカーによって分け隔たれたさらなる複数のハイブリダイゼーション領域を有するようにさらに延長され得る。
これは数多くの異なる方法で使用することができる。例えば、このプローブ構造は、より長いプローブ（例えば、第1および第2の標的領域の両方に渡る単一プローブ）ではTm分析を通じて異なるバリアントに関する十分なレポートが提供されないであろう連続的領域をプローブすることを可能とする。
好ましくは、リンカーは、ヌクレオシドリンカーである。より好ましくは、リンカーは、ポリデオキシリボヌクレオチドを含む。最も好ましくは、リンカーは、ポリデオキシイノシンを含むか、またはポリデオキシイノシンからなる。デオキシイノシンは、より弱い水素結合のために、天然塩基に比べて相対的に低い融解温度を有する。他のヌクレオシドも使用し得る。
好ましくは、リンカーは、5、10、15、20、30、40、50ヌクレオチドまでの長さである。
第1および第2の核酸配列のうちの少なくとも1つは、レポーター領域である。レポーター領域は、標識部分、好ましくは蛍光標識を含む。これは、標的配列に結合した際にプローブを検出すること、および、バリアント標的配列の存在を決定するために一定の温度範囲に渡ってアニーリングを監視することを可能とする。プローブは好ましくはクエンチャー部分を含まず、標識もクエンチャーと共に使用されることが意図されない。適切な標識としては、FAM、TET、HEX、ROX、TAMRA、Cy3、およびCy5が含まれる。他の適切な標識が当業者に知られる。好ましくは標識はTヌクレオチド上に組み入れられるが、ただしあらゆる適切なヌクレオチドが使用され得る。
レポーター領域は、好ましくは15〜200ヌクレオチド（nt）の長さであり、より好ましくは15〜150、さらにより好ましくは15〜100、あるいは20〜100、30〜80、40〜60、もしくは約50 ntの長さである。
レポーター領域は、完全に相補的な標的配列に対して第1のTmを有し、バリアント標的配列に対しては（好ましくはより低く）改変されたTmを有するように設計される。例えば、バリアントは、SNP（一塩基多型）、挿入、欠失、逆位、または反復配列を表し得る。
この実施態様において、第1の標的核酸配列にアニールした第1配列の融解温度は、第2の標的核酸配列にアニールした第2配列のものと異なり得る。しかしながら、好ましくは、第1および第2の核酸配列の両方が、対応する標的配列に対して同様のTmを有するように選択される。
レポーター領域は、ブロッキング領域をさらに含み得る。ブロッキング領域とは、DNAポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を阻止（ブロック）することに供され、従って例えばPCRの途中で鎖伸長を妨げる部分である。ポリメラーゼ酵素ブロッキング基とは、ポリマーのさらなる延長を阻止する機能特性を有すべきものである。ブロッキング基は、ヌクレオチドに結合させることが可能なあらゆる化学基であって、DNA鎖中でその修飾ヌクレオチドの5’末端を別のヌクレオチドの3’末端に結合させることを許容するが、その修飾ヌクレオチドの3’ヒドロキシル基にヌクレオチドが結合することは許容しないものであり得る。適切なものとして、3’位におけるOH基の欠如は、ポリメラーゼ活性によるさらなる伸長を妨げる。特に好ましい一実施態様において、ブロッキング基は、アセチル基、CH3基、グリシル基、ロイシル基、およびアラニル基から選択される。別の実施態様では、ブロッキング基は、ジペプチドまたはトリペプチドの形態であり得る。
本発明の一実施態様では、第1および第2の核酸配列の両方がレポーター領域である。これらは異なる標識を含み得る。そのようなプローブは、マルチプレックスレポーターとして使用することができ、単一プローブによって、広い範囲に渡る標的配列の検出を可能とする。
この実施態様では、プローブは、複数別個のレポーター領域に分割される。各レポーター領域は異なるアニーリング温度を有し、1つ以上の蛍光ヌクレオチド（好ましくはFAM-T）、または異なる／複数の色を有する。レポーターは、特定の配列または配列バリアント、SNP、挿入、欠失等の存在を報告するために使用され得る。これは、単一プローブによって、広い範囲に渡る複数配列の検出を可能とする。各領域は、野生型標的配列の場合には同様のTmを有するが、突然変異の場合にはシフトしたTmを有するように調節される。これは、シフトしたTmを検出するだけでユーザーはバリアントの存在を知ることを意味する。
複数の標的配列を検出することに替わるものとして、例えば対照結合領域と試験結合領域とを提供するようにプローブを構成して、アッセイの信頼性を高めることができる。
本発明の別の一実施態様では、第2の核酸配列がレポーター領域であり得、そして第1の核酸配列はアンカー領域である。この実施態様では、第1の標的核酸配列にアニールした第1の配列の融解温度は、第2の標的核酸配列にアニールした第2の配列のものよりも高い。リンカー配列は外部ループ領域を形成してもよいし、またはいずれかのプローブ間核酸配列にハイブリダイズしてもよい。標的配列に対するアンカー領域のTmは、標的配列に対するレポーター領域のTmよりも有意に高い（少なくとも0.5、1、1.5℃高いが、より一般的には5℃〜20℃高い）。
アンカー領域は、好ましくは少なくとも50 ntの長さであり、より好ましくは少なくとも60、70、80、90、100、125、150 ntである。アンカー領域は、好ましくは、200 nt以下の長さであり、20 nt以上の長さである。
使用の際には、アンカー領域は、実質的により高いアニーリング温度を有するので、プローブを正しい領域に繋ぎ留める作用をする。レポーター領域はアンカー領域より低いアニーリング温度を有し、1つ以上の蛍光ヌクレオチド（好ましくはFAM-T）を有する。レポーターは、特定の配列または配列バリアント、SNP、挿入、欠失等の存在を報告するために使用される。
好ましい実施態様において、プローブは、例えばSTRプロファイリング、脆弱X染色体等のようなサイズ／長さの多型を検出することに使用される。アンカー領域は、反復領域の下流にアニールするように用いられ、一方でレポーター領域は、反復に係る短い配列に相同的である。レポーターは主要なアンカー領域から分離されているので、そしてフルオロフォアはレポーター領域のみにあるので、レポーターがアンプリコン中で異なる部位に結合して外部ループ形成を引き起こしても支障はない（普通ならばこれは産物のTmを変化させて測定を困難にするであろう）。いくつかの実施態様において、アンカー領域は、反復領域の短い配列だけでなく隣接領域にも相同的であるように設計され得る。例えば、アンカー領域は、50 ntまでの反復配列と、より長い（例えば150 ntの）隣接配列とを含み得る。
本発明のさらなる一側面は、第1の標的核酸配列と相補的な第1のアンカー核酸配列；第2の標的核酸配列と相補的な第2のレポーター核酸配列；ならびに、前記第1および第2の核酸配列を連結するリンカー核酸配列を含む核酸プローブを提供し、ここで、前記リンカーは、それぞれの対応する標的配列にハイブリダイズした前記第1の配列の融解温度と第2の配列の融解温度とが別個となるように、前記第1および第2の配列を分け隔て、前記第1の標的核酸配列にアニールしたアンカー配列の融解温度は、前記第2の標的核酸配列にアニールしたレポーター配列のものより高く、各レポーター配列は少なくとも1つの検出可能標識を含む。
レポーターは、好ましくは、複数の反復配列単位を含む。好ましくは少なくとも3つ、4つ、または5つの反復単位を含む。
リンカーは、好ましくは、ポリデオキシイノシンを含む。
アンカーは、1つ以上の反復配列単位を含み得るが、好ましくは非反復配列を含む。アンカーは、好ましくは、50〜200 ntの長さである。
プローブは、好ましくは、PCR中の鎖伸長を妨げるブロッキング配列をさらに含む。
プローブは、1つ以上の追加のリンカー配列およびレポーター配列をさらに含み得る。
本発明のさらに別の一側面は、第1の標的核酸配列と相補的な第1のレポーター核酸配列；第2の標的核酸配列と相補的な第2のレポーター核酸配列；ならびに、前記第1および第2の核酸配列を連結するリンカー核酸配列を含む核酸プローブを提供し、ここで、前記第1の標的核酸配列にアニールした第1のレポーター配列の融解温度は、前記第2の標的核酸配列にアニールした第2のレポーター配列のものと同様または同等であり、各レポーター配列は少なくとも1つの検出可能標識を含む。
プローブは、好ましくは、PCR中の鎖伸長を妨げるブロッキング配列をさらに含む。
本発明のさらなる一側面は、標的核酸配列における1つ以上の多型を検出するための方法であって、
本発明の一側面によるプローブを提供すること；
前記プローブを、第1の標的核酸配列および第2の標的核酸配列を有する試験核酸配列に接触させること；
前記プローブの第1の核酸配列を、前記第1の標的核酸配列にハイブリダイズさせ、前記プローブの第2の核酸配列を、前記第2の標的核酸配列にハイブリダイズさせること；ならびに、
前記第1の標的配列にハイブリダイズした第1のプローブ配列のTmを決定し、前記第2の標的配列にハイブリダイズした第2のプローブ配列のTmを決定すること；
を含み、前記Tmが、野生型配列またはバリアント配列の存在を示す方法を提供する。
この方法は、第1レポート領域のTmが、バリアント配列領域のTmを測定する基準として作用するように、融解温度の有用性を向上させることにも使用され得る。一般的に、プローブ下にある配列を決定することに有用な、記録される融解温度の位置は、反応混合物中の塩の濃度によって影響され得る。既知配列としての第1レポーター領域の融解位置を比較することによって、第2レポーター配列下にある配列をより正確に決定することが可能となるが、これは、両方の領域が、外部塩のような干渉性物質によって等しく影響されるからである。
従って、本発明のさらなる一側面は、標的核酸配列における1つ以上の多型を検出するための方法であって、
本発明の一側面によるプローブを提供すること；
前記プローブを、第1の標的核酸配列および第2の標的核酸配列を有する試験核酸配列に接触させること；
前記プローブの第1の核酸配列を、前記第1の標的核酸配列にハイブリダイズさせ、前記プローブの第2の核酸配列を、前記第2の標的核酸配列にハイブリダイズさせること；ならびに、
前記第1の標的配列にハイブリダイズした第1のプローブ配列のTmを決定し、前記第2の標的配列にハイブリダイズした第2のプローブ配列のTmを決定すること；
前記第1のプローブ配列の決定されたTmを、前記第1のプローブ配列の予測Tmと比較すること；
前記第1のプローブ配列の決定されたTmと予測Tmとの差に基づいて、前記第2のプローブ配列の決定されたTmを正規化すること；
を含み、前記第2のプローブ配列の正規化されたTmが、野生型配列またはバリアント配列の存在を示す方法を提供する。
本発明のさらに別の一側面は、標的核酸配列における縦列反復を検出するための方法であって、
本発明の一側面によるプローブであって、レポーター配列がいくつかの縦列反復単位を含むものを提供する工程；
前記プローブを、第1の標的核酸配列および第2の標的核酸配列を有する試験核酸配列に接触させる工程であって、前記第1の標的配列はプローブのアンカー配列と相補的であり、前記第2の標的配列は、前記レポーター配列の縦列反復単位と相補的ないくつかの縦列反復を含む工程；
前記プローブのアンカー核酸配列を、前記第1の標的核酸配列にハイブリダイズさせ、前記プローブの第2の核酸配列を、前記第2の標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程；ならびに、
前記試験核酸配列に対する前記レポーター配列の結合の有無を検出する工程
を含む方法を提供する。
結合は、試験核酸配列に対するレポーター配列のTmを決定することによって、および／または、レポーター配列からの標識（例えば蛍光）を検出することによって、検出することができる。結合は、標的配列中の反復の数が、レポーター配列中の反復の数と同等以上であることを示す。もしレポーター配列中により多くの反復がある場合には、結合が生じないかまたは結合が減少する。いくつかの実施態様では、Tmは、標的配列中の反復の数に概して比例すると考えられ、反復の数を決定するためにTmを決定することができる。それに代えて、またはそれに加えて、プローブのレポーター配列は、各反復単位に1つ以上の標識化部分を含み得る。このようにして、検出される標識が、標的配列中の反復の数に比例するものとして解され得る。
本発明のこれらおよびその他の側面を、単に例示として、添付の図面を参照しながら、以下に記述する。図面の説明は次の通りである。
図1は、本発明の一実施態様による第1のプローブ構成を示す。 図2〜図5は、図1のプローブの標的配列への結合を介して形成される異なる二重鎖構造を示す。 図2〜図5は、図1のプローブの標的配列への結合を介して形成される異なる二重鎖構造を示す。 図2〜図5は、図1のプローブの標的配列への結合を介して形成される異なる二重鎖構造を示す。 図2〜図5は、図1のプローブの標的配列への結合を介して形成される異なる二重鎖構造を示す。 図6は、本発明の別の実施態様による第2のプローブ構成を示す。 図7は、M. tuberculosisのrpoB遺伝子においてよく見られる突然変異（Mut）コドンを示す 図8は、M. tuberculosのrpoB遺伝子の一部分の配列を、一定の突然変異遺伝子の配列、およびそのような突然変異の存在を検出するための本発明によるプローブの配列と共に示す。 図9は、図8のプローブの標的配列に対する結合を介して形成される、異なる二重鎖構造を示す。 図10は、図9の二重鎖から得られる融解曲線の例を示す。 図11は、ワクシニアのゲノムの一部分と、他のポックスウイルスのものとの配列アラインメントを示す。 図12は、ポックスウイルスの検出のためのプローブを示す。 図13は、図12のリンカープローブの感度を、従来型のワクシニアプローブのものと比較する。 図14は、様々なポックスウイルスの増幅ゲノム配列を用いた、図12のリンカープローブおよび従来型プローブの融解曲線分析を示す。 図15は、図14において使用されたポックスウイルス断片を増幅するためのプライマー配列および増幅条件を示す。 図16は、ヒトのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子における短い縦列反復についての、プライマーおよびプローブの配列ならびに融解曲線分析を示す。
本発明は、核酸リンカーによって隔てられて2つ以上の機能的要素に分割された、核酸プローブに関する。リンカーは好ましくはデオキシイノシンであり、これは天然DNA塩基と比べて低いTmを有する。その他の適切なリンカーも使用し得る。
図1は、本発明によるプローブの第1の実施態様を模式的に示す。このプローブは、およそ100〜200 ntの長さのアンカー領域を含み、アンカー領域は、5 ntの長さのデオキシイノシンリンカーによって、15〜200 ntの長さのレポーター領域から分け隔てられている。アンカー領域は、標的核酸において反復配列領域の下流に位置する第1の標的領域と相補的であるように設計される。レポーター領域は反復配列領域と相補的であり、既知数の反復単位を含む。レポーター領域はまた、1つ以上の標識ヌクレオチドも含み、これは好ましくはFAM-Tである。いくつかの実施態様では、各反復単位が標識ヌクレオチドを含む。
プローブ配列は、標的に対するアンカー領域のTmが、標的に対するレポーターのTmよりも有意に高く、そして標的に対するレポーターのTmが、標的核酸中のあらゆる配列に対するリンカーのTmよりも有意に高いように設計される。
図2〜5は、標的に対するプローブの結合についての様々な異なるシナリオを示している。これらのシナリオにおいて、プローブは、サイズ／長さの多型（例えばSTRプロファイリング、脆弱X染色体等）を決定することに使用されている。アンカー領域は、プローブを反復領域の下流にアニールさせることに使用されるのに対し、レポーター領域は、反復の短い配列に対して相同的である。レポーターは主要なアンカー領域から分離されているので、そしてフルオロフォアはレポーター領域のみにあるので、レポーターがアンプリコン中で異なる部位に結合して外部ループ形成を引き起こしても支障はない（普通ならば、これは産物のTmを変化させて測定を困難にするであろう）。
標的反復配列領域の長さがレポーター領域のものより短い場合には（図2）、レポーター領域は標的に結合せず、標識からの蛍光はなく、レポーターのTmを測定することによる融解曲線は得られない。しかしながら、アンカー領域は標的に結合しているので、これを測定（例えばTmを決定することによって）して、プローブが事実結合していることおよび反復配列領域が欠如していることを確認することができる。
標的反復配列領域の長さがレポーター領域の長さと同等以上である場合には、図3〜5のいずれかのシナリオが起こり得る。図3において、レポーターは、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの反復の長さという小ささにとどめられ、これによって、レポーター：アンプリコン二重鎖のTmに対する外部ループ効果の影響が制限される。使用の例として、大きな反復構造についてのものがあり、例えば、反復の数（例えば＜50、＞100、＞200）を「バンド決定」することが重要である脆弱X染色体が挙げられる。あるいは、小さな外部ループ形成が起こり得る（図4）。この場合でもやはり、レポーターが小さいので、レポーター：アンプリコン二重鎖のTmに対する影響は最小限であり、少なくともプローブ上にある反復数が存在することを決定することができる。
複数の反復を収容するようにレポーターの長さを増加させた場合には（図5）、レポーター：アンプリコン二重鎖のTmは、反復の数に比例することとなる。レポーターの未結合部分は、標識の自己消光により蛍光を発しない。レポーター中の各反復の1つか2つのヌクレオチドが標識される。この方法は、3、4、あるいは5bpの反復の、15xあるいは20xまでの反復数が問題となるようなSTR分析において重要となり得る。
別のプローブ構成が図6に示されている。このプローブは、マルチプレックス化レポーターであり、リンカーにより繋げられた2つの別々のレポーター領域を含む。各レポーター領域は異なるアニーリング温度を有し、1つ以上の蛍光ヌクレオチド（好ましくはFAM-T）または異なる／複数の色を有する。このレポーターは、特定の配列または配列バリアント（例えばSNP、挿入、欠失等）の存在を検出報告することに使用される。これは、単一プローブによって、広い範囲に渡る複数の配列を検出することを可能とする。各領域は、野生型配列の場合には、同一ではないものの同様のTmを有するが、突然変異の場合にはシフトしたTmを有するように調節され、従ってユーザーは、シフトしたTmを検出するだけで、バリアントが存在することを知る。「同様」とは、Tmが最大で2、1.5、1、0.5℃異なることを意味する。
プローブは、例えば対照結合領域と試験結合領域とを提供するような構造にすることもできる。
ここで、Mycobacterium tuberculosis（結核菌）のrpoB遺伝子におけるバリアントを検出するためのマルチプレックスレポータープローブの使用の例を記述する。M. tuberculosisにおける多剤耐性は複雑である。リファンピンはM. tuberculosisに対する第一選択薬であり、本分野において、治療前に同定する主たる標的である。リファンピン耐性M. tuberculosisは、RNAポリメラーゼのβサブユニットをコードするrpoB遺伝子の81-bpコア領域に突然変異を有する。M. tuberculosisのリファンピン耐性臨床分離株の96%はこの遺伝子に突然変異を有する。第516、第526、または第531コドンにおける突然変異は、高レベルのリファンピン耐性をもたらす。しかしながら、81-bpの遺伝子領域に渡って突然変異を検出することは、通常は、複数の従来型プローブが必要とされ、それらのうちの数個は互いにオーバーラップする必要があり、従って複数の検出工程が要求される。
図7は、rpoB遺伝子の一区域における野生型およびバリアントのコドンを示す。21コドン（63 nt）領域からの9つのコドンが示されていることに注意すべきである。本発明者らは、主要な耐性コドン516、526、または531に突然変異を有する潜在的なM. tuberculosis遺伝子型の存在を検出し報告するプローブ（図8に示されており、PROBEと標識されている）を設計した。
図8も、rpoB遺伝子の野生型（WT）配列と共に3つの突然変異型配列（MUT516、MUT526、およびMUT531）を示している。WT配列の四角で囲った領域は、そこにプローブがハイブリダイズするように設計された領域である。プローブ自体は、第531〜第525コドン（潜在的な突然変異型コドン526および531を包含する）に渡る第1のレポーター配列、5つのポリデオキシイノシン残基（「I」として示す）を含むリンカー、および、第518〜第510コドン（潜在的な突然変異型コドン516を包含する）に渡る第2のレポーター配列を含む。各々のレポーター配列は、標識された2つのT残基を含んでいる（網掛けで示す）。第2のレポーター配列は、PCRブロッカー部分（BLOCK）にも隣接している。
両方の部位においてWT配列に結合したプローブは、各レポーター配列について同じ60℃のTmを有する。突然変異型配列の存在はこれを52℃〜56℃にシフトさせる。
図9は、標的配列に対するプローブの可能な結合パターンを示す。両方のレポーター配列が野生型に結合する場合（WT:WT）には、第1レポーターのTm（Tm1）は第2レポーターのTm（Tm2）と等しくなる。第1レポーターにおける単一の突然変異（MUT:WT）は、第1レポーターのTmをTm3に下げ、このTm3はTm2よりも低い。第2レポーターにおける単一の突然変異（WT:MUT）は、第2レポーターのTmをTm4に下げ、このTm4はTm1よりも低い。各レポーターのそれぞれにおける単一の突然変異（MUT:MUT）は、対応するTmをTm3およびTm4にシフトさせる。最後に、第1レポーター標的における第2の突然変異の存在（MUT:WT）は、TmをTm5に下げ、このTm5はTm3よりも低い。
これらTmの各々は、互いから区別可能なものであり、従って、単一のプローブを使用してrpoB遺伝子中の3つの別個の突然変異の存在を決定することができる。図10は、そのような実験からの典型的な融解曲線を示す。野生型および突然変異型の配列の存在を明確に識別することができる。従って、このプローブ構成は、ゲノムの比較的長い区域に渡る複数の突然変異の、シンプルなマルチプレックス検出を可能とする。
そのようなプローブのさらなる例示的使用が図11〜15に示されており、これは、ワクシニアウイルスを検出するためのプローブの使用、およびこのウイルスを関連ポックスウイルスから見分けることを例証している。
図11は、ワクシニアのゲノム配列の30ヌクレオチドの部分を、サル痘、牛痘、エクトロメリア、およびラクダ痘のウイルスのものと比較している。この配列の中で、異なり得る8つの塩基があることが見て取れるであろう。
図12は、ウイルスゲノムのこの領域を検出して、様々なウイルスを互いに見分けるためのプローブを示している。このプローブは、第1のレポーター領域が、5つのイノシン残基の配列によって第2のレポーター領域から隔てられているものを含む。第1のレポーター領域はトリメトキシスチルベンキャップを含む。各レポーター領域は、蛍光標識された2つのT残基を含む。
プローブ配列は以下の通りである。
5’-GAG T*AT TTG T*CA TTT IIIII TAT ATT T*GT TGG CT*G-3’：配列番号1
5’トリメトキシスチルベンおよび3’リン酸によりキャップされている。I＝イノシン。T*＝フルオレセイン標識されたT。
2つのレポーター領域は、図11に示された30ヌクレオチド配列に渡り、どちらも、複数の潜在的な変異部位を包含する。
図13は、このプローブの感度を、同じ30 nt配列に渡る標準的ワクシニアプローブのものと比較している。本リンカープローブは、同じコピー数において著しく感度が上回っている。感度を比較するために、図15に示すプライマーおよび条件を使用してゲノムの一部分が増幅され、それからアンプリコンに対して関連プローブを使用して融解曲線アッセイが実施されている。
図14は、異なるポックスウイルス標的配列にハイブリダイズした際の、本ワクシニアプローブ（「リンカープローブ」）および従来型ワクシニアプローブ（「標準的プローブ」）の融解曲線を示す。リンカープローブによって網羅されるTmの範囲はずっと小さいが、リンカープローブは様々なポックスウイルス間でより改善された判別力を提供しており、単一プローブを使用して5つのウイルスを明確に同定し区別することを可能にしている。リンカープローブの使用は、従来型プローブと比較して、産物のTmを低下させ、そしてTm範囲を低下させ、その範囲のより高域におけるマルチプレックス化を可能とする。本発明のプローブは、30塩基という短い領域の中で5つに及ぶ塩基ミスマッチを同定することを可能とし、従ってこれらポックスウイルスの同定を可能とする。
図16は、ヒトのチロシンヒドロキシラーゼ（tyrosine hydroxylase）遺伝子における短い縦列反復（STR）を分析するためのプライマーおよびプローブの配列を示す。
フォワードおよびリバースのプライマーは以下の通りである。
TH01-FWD
ATT CAA AGG GTA TCT GGG CTC TGG : 配列番号2

TH01-REV
GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT：配列番号3
TH遺伝子は、(AATG)nという短い縦列反復配列を含有し、これには多型があることが知られている。本発明は異なる長さのSTR間を見分ける能力を有することを確認するために、2つのプローブを感度および精度について比較した。どちらのプローブも同じ配列のものであり、プローブ1はリンカー無しで調製されたのに対して、プローブ2は、プローブの2つの部分の間でリンカーとして作用する5つのイノシン塩基の配列を含む。プローブ配列を以下の通りであった。

TH01-プローブ1
Figure 2014526257

TH01-プローブ2
Figure 2014526257

（M＝トリメトキシスチルベン；P＝リン酸；*＝イノシン；F＝フルオレセイン標識されたT）
プライマーを用いて標的配列を増幅した後、そのアンプリコンおよびプローブ1またはプローブ2のいずれかを用いて融解曲線分析を実施した。図16にその曲線を示す。どちらのプローブも3、6、9、および12コピーの反復を見分ける能力を有するが、リンカーを有するプローブ2は、異なる数の反復の判別を、はるかに狭い温度範囲において提供している。

Claims (27)

  1. 第1の標的核酸配列と相補的な第1の核酸配列；第2の標的核酸配列と相補的な第2の核酸配列；ならびに、前記第1および第2の核酸配列を連結するリンカー核酸配列を含む核酸プローブであって、前記リンカーは、前記第1の標的核酸配列にアニールした前記第1の配列の融解温度と前記第2の標的核酸配列にアニールした前記第2の配列の融解温度とが別個となるように、前記第1および第2の2つの配列を分け隔てる、核酸プローブ。
  2. 前記リンカーがポリデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載のプローブ。
  3. 前記リンカーは、ポリデオキシイノシンを含むか、またはポリデオキシイノシンからなる、請求項1または2に記載のプローブ。
  4. 前記リンカーは、5、10、15、20、30、40、または50ヌクレオチドまでの長さである、請求項1〜3のいずれかに記載のプローブ。
  5. 前記第1および第2の核酸配列のうちの少なくとも1つが、標識部分を含むレポーター領域であり、前記標識は好ましくは蛍光標識である、請求項1〜4のいずれかに記載のプローブ。
  6. クエンチャー部分を含まない、請求項1〜5のいずれかに記載のプローブ。
  7. 前記レポーター領域は、好ましくは15〜200 ntの長さであり、より好ましくは15〜150 nt、さらに好ましくは15〜100 nt、もしくは20〜100 nt、30〜80 nt、40〜60 nt、または約50 ntの長さである、請求項5に記載のプローブ。
  8. 前記レポーター領域は、完全に相補的な標的配列に対する第1のTm、および、バリアント標的配列に対する（好ましくはより低く）改変されたTmを有するように設計される、請求項5または7に記載のプローブ。
  9. DNAポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を阻止する作用をするブロッキング領域をさらに含む、請求項1〜8のいずれかに記載のプローブ。
  10. 前記第1および第2の核酸配列の両方がレポーター領域である、請求項1〜9のいずれかに記載のプローブ。
  11. 両方のレポーター領域は、野生型標的配列に結合する場合には同様のTmを有し、突然変異型標的配列に結合する場合には低下されたTmを有するように選択され、前記第1のレポーター領域についての低下されたTmは好ましくは前記第2のレポーター領域についてのものと異なる、請求項10に記載のプローブ。
  12. 前記第2の核酸配列はレポーター領域であって、前記第1の核酸配列はアンカー領域であり、前記第1の標的核酸配列にアニールした前記アンカー領域の融解温度は、前記第2の標的核酸配列にアニールした前記第2の配列の融解温度よりも高い、請求項1〜9のいずれかに記載のプローブ。
  13. 前記アンカー領域と標的配列との二重鎖のTmが、前記レポーター領域の標的配列に対するTmよりも有意に高い（少なくとも0.5、1、または1.5℃、より一般的には5〜20℃高い）、請求項12に記載のプローブ。
  14. 前記アンカー領域は少なくとも50 ntの長さであり、より好ましくは少なくとも60、70、80、90、100、125、または150 ntの長さである、請求項12または13に記載のプローブ。
  15. 前記アンカー領域は200 nt以下の長さである、請求項12〜14のいずれかに記載のプローブ。
  16. 前記レポーター領域が縦列反復配列を含む、請求項12〜15のいずれかに記載のプローブ。
  17. 前記アンカー領域が、縦列反復配列および非反復配列を含む、請求項12〜16のいずれかに記載のプローブ。
  18. 前記第1および第2の標的核酸配列は、M. tuberculosisのゲノムに見出される、請求項1〜11のいずれかに記載のプローブ。
  19. 前記第1および第2の標的核酸配列は、ワクシニアポックスウイルスのゲノムに見出される、請求項1〜11のいずれかに記載のプローブ。
  20. 前記第1および第2の標的配列は、ゲノム配列中において互いから200、150、100、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2、または1ヌクレオチド以内にある、請求項1〜19のいずれかに記載のプローブ。
  21. 第1の標的核酸配列と相補的な第1のアンカー核酸配列；第2の標的核酸配列と相補的な第2のレポーター核酸配列；ならびに、前記第1および第2の核酸配列を連結するリンカー核酸配列を含む核酸プローブであって、前記リンカーは、それぞれの対応する標的配列にハイブリダイズした前記第1の配列の融解温度と第2の配列の融解温度とが別個となるように、前記第1および第2の配列を分け隔て、前記第1の標的核酸配列にアニールしたアンカー配列の融解温度は、前記第2の標的核酸配列にアニールしたレポーター配列の融解温度より高く、各レポーター配列は少なくとも1つの検出可能標識を含む、核酸プローブ。
  22. 第1の標的核酸配列と相補的な第1のレポーター核酸配列；第2の標的核酸配列と相補的な第2のレポーター核酸配列；ならびに、前記第1および第2の核酸配列を連結するリンカー核酸配列を含む核酸プローブであって、前記第1の標的核酸配列にアニールした第1のレポーター配列の融解温度は、前記第2の標的核酸配列にアニールした第2のレポーター配列の融解温度と同様または同等であり、各レポーター配列は少なくとも1つの検出可能標識を含む、核酸プローブ。
  23. 1つ以上のさらなるリンカー配列、および、1つ以上のさらなる標的配列にハイブリダイズするための1つ以上のさらなる核酸配列をさらに含む、請求項1〜22のいずれかに記載の核酸プローブ。
  24. 標的核酸配列における1つ以上の多型を検出するための方法であって、
    請求項1〜23のいずれかに記載のプローブを提供すること；
    前記プローブを、第1の標的核酸配列および第2の標的核酸配列を有する試験核酸配列に接触させること；
    前記プローブの第1の核酸配列を、前記第1の標的核酸配列にハイブリダイズさせ、前記プローブの第2の核酸配列を、前記第2の標的核酸配列にハイブリダイズさせること；ならびに、
    前記第1の標的配列にハイブリダイズした前記第1のプローブ配列のTmを決定し、前記第2の標的配列にハイブリダイズした前記第2のプローブ配列のTmを決定すること；
    を含み、前記Tmが、野生型配列またはバリアント配列の存在を示す、方法。
  25. 標的核酸配列における縦列反復を検出するための方法であって、
    請求項12〜17のいずれかに記載のプローブであって、いくつかの縦列反復単位を有するレポーター配列を含むものを提供する工程；
    前記プローブを、第1の標的核酸配列および第2の標的核酸配列を有する試験核酸配列に接触させる工程であって、前記第1の標的配列はプローブのアンカー配列と相補的であり、前記第2の標的配列は、前記レポーター配列の縦列反復単位と相補的ないくつかの縦列反復を含む工程；
    前記プローブのアンカー核酸配列を、前記第1の標的核酸配列にハイブリダイズさせ、前記プローブの第2の核酸配列を、前記第2の標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程；ならびに、
    前記試験核酸配列に対する前記レポーター配列の結合の有無を検出する工程
    を含む、方法。
  26. 標的核酸配列における1つ以上の多型を検出するための方法であって、
    請求項1〜23のいずれかに記載のプローブを提供すること；
    前記プローブを、第1の標的核酸配列および第2の標的核酸配列を有する試験核酸配列に接触させること；
    前記プローブの第1の核酸配列を、前記第1の標的核酸配列にハイブリダイズさせ、前記プローブの第2の核酸配列を、前記第2の標的核酸配列にハイブリダイズさせること；ならびに、
    前記第1の標的配列にハイブリダイズした第1のプローブ配列のTmを決定し、前記第2の標的配列にハイブリダイズした第2のプローブ配列のTmを決定すること；
    前記第1のプローブ配列の決定されたTmを、前記第1のプローブ配列の予測Tmと比較すること；
    前記第1のプローブ配列の決定されたTmと予測Tmとの差に基づいて、前記第2のプローブ配列の決定されたTmを正規化すること；
    を含み、前記第2のプローブ配列の正規化されたTmが、野生型配列またはバリアント配列の存在を示す、方法。
  27. 前記バリアント配列は、欠失、反復、SNP、または挿入である、請求項24または26に記載の方法。
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