JP2004129544A - 塩基多型検出プローブと塩基多型検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】プローブの設計が容易で、同一条件下で複数の塩基多型を精度よく検出できるプローブと、そのプローブを使った塩基多型検出方法を提供すること。
【解決手段】検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。
【選択図】 なし
【解決手段】検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基多型検出プローブとそれを用いた塩基多型検出方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノム解析が急速に進展し、その成果であるゲノム情報を医療の質的改善に結びつけようという試みが活発になってきている。一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism(s)、SNP(s))のデータが整備されれば、薬効の個人差を識別し、患者毎に至適薬物と投与量を決定する、いわゆるオーダーメード医療が可能になると期待されている。このようなSNPを利用したオーダーメード医療を実現するためには、迅速、正確、かつ安価なSNPタイピング技術の開発が不可欠である。ここでいうSNPタイピング技術とは、ゲノムの抽出・精製、核酸増幅、塩基配列の解析など検体の処理から検査結果のアウトプットに至るまでのすべての技術を意味する。一方、感染症の治療に際しては、感染ウィルスや感染起炎菌のゲノタイプ判定結果をもとに、治療法や薬剤を選択することが既に進められており、治療効果や医療費の軽減に寄与している。このようなヒトゲノム上の一塩基多型や、ウィルスや感染起炎菌のゲノタイプや変異を検出する方法が数多く報告されている。
【0003】
日本特許第2853864号(特許文献1)には、塩基多型に相当するヌクレオチドを3’末端に導入したプライマーにて伸長反応を行い、その伸長産物の有無で変異ヌクレオチドを検出する方法が述べられている。3’末端が非相補的な配列のプライマーにおいても伸長産物が生じる場合には、試料DNAとプライマーとの結合性を減少させるためプライマー中に故意に1つ又はそれ以上のミスマッチを導入したプライマーから伸長させることにより、この非特異的伸長を避けることができると記載されている。
【0004】
日本特許第2853864号に類似した方法として、欧州特許EP0332435号(特許文献2)が開示されている。この方法では、3’末端にSNPサイトを導入したDNAプローブをプライマーとして核酸伸張反応を行い、DNAプローブ中のSNPの塩基がターゲットDNAの塩基配列と相補的である場合は核酸伸張反応が起こり、SNPの塩基がターゲットDNAと相補的でない場合には核酸伸張反応が起こらず、この核酸伸張産物の有無からSNPサイトの塩基を決定する方法を示している。3’末端から1、2又は3塩基のところに人為的にミスマッチを導入した変異検出DNAプローブにて、プローブの3’末端のSNPを検出すると、良好な結果が得られたことが記載されている。また、これを応用した方法も考案されている。例えば、PCR反応時のプライマーの一方にこのプローブを使用すると、このプローブの塩基配列が検体の核酸配列と相補的である場合はPCRによる増幅が起こり、相補的でない場合は増幅は起こらないことから、PCR増幅産物の有無を判定することにより塩基多型を決定することができる。
【0005】
しかしながら、これら日本特許第2853864号と欧州特許EP0332435号に使用されているプライマーを使った一塩基変異の検出では、プライマーの3’末端付近の配列が標的核酸の配列と完全に一致しなくても非特異的な核酸伸長反応がしばしば起こることが確認されている。また、PCRにおけるプライマーとテンプレートDNAのアニーリング温度は、使用するプライマーの塩基配列に依存するため、複数の塩基多型の検出を同一のPCR条件下で行うことが困難である。つまり、プライマーとテンプレートDNAのアニーリング温度や変性温度のプライマー配列への依存度が低く、かつ、塩基多型検出の精度の高い塩基多型の検出法が求められている。
【0006】
【特許文献1】
日本特許第2853864号
【0007】
【特許文献2】
欧州特許EP0332435号
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、プローブの設計が容易で、同一条件下で複数の塩基多型を精度よく検出できるプローブと、そのプローブを使った塩基多型検出方法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、塩基多型を検出するプローブの設計と、そのプローブを使った塩基多型検出法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【0010】
(1) 検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。
【0011】
(2) 検出プローブ用オリゴヌクレオチドが3から9残基のオリゴヌクレオチドである、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(3) スペーサーがイノシンを含む、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(4) スペーサーがイノシンの重合体である、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(5) スペーサーが2から7残基のイノシンの重合体である、(4)に記載の塩基多型検出プローブ。
【0012】
(6) スペーサーが、少なくとも1種類以上の核酸誘導体およびその重合体を含む、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(7) スペーサーが2から7残基の核酸誘導体の重合体である、(6)に記載の塩基多型検出プローブ。
(8) 標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが15から100残基のオリゴヌクレオチドである、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(9) 配列番号32から91の何れかに記載の塩基配列を有する、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(10) ABO式血液型判定のために用いる、(9)に記載の塩基多型検出プローブ。
【0013】
(11) 検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する方法であって、(a)検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブを、検体核酸とハイブリダイズさせる工程;及び、
(b)検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出する工程;
を含む、上記の方法。
【0014】
(12) 検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する、(11)に記載の方法。
(13) 核酸合成酵素にて核酸伸長反応を行う、(12)に記載の方法。
(14) 核酸伸長反応時に標識ヌクレオチドを基質に加え、核酸伸張の有無を標識ヌクレオチドにて検出する、(12)に記載の方法。
【0015】
(15) 核酸伸長反応時に発生するピロリン酸を検出して核酸伸長の有無を検出する、(12)に記載の方法。
(16) 核酸伸長反応にて生じた二本鎖核酸をインターカレーターを用いて検出する、(12)に記載の方法。
(17) 検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をFRET法にて検出する、(11)に記載の方法。
(18) 配列番号32から91の何れかに記載の塩基配列を有する請求項1に記載の塩基多型検出プローブを用いる、ABO式血液型判定方法。
【0016】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)塩基多型検出プローブ
本発明の塩基多型検出プローブは、検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成されるものである。
【0017】
本発明において、核酸とは、プリン塩基またはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とし、このリン酸各ヌクレオチド間で糖の3’と5’位炭素の間にジエステル結合をつくって結ばれ重合した長い鎖状のポリヌクレオチドのことを指す。D−リボースを糖成分とするものをリボ核酸(RNA)、D−2−デオキシリボースを糖成分とするものをデオキシリボ核酸(DNA)という。
【0018】
本発明において塩基多型とは、核酸配列上に存在する核酸配列の変異や一塩基多型(Single nucleotide polymorphism(s)、SNP(s))を意味し、ヌクレオチドの置換や欠失や挿入がある。核酸は、DNAであってもRNAであっても良く、DNAを鋳型として転写されたRNAや、RNAを鋳型として逆転写されたDNAであってもよい。
【0019】
検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、標的とする塩基多型部位に特異的なオリゴヌクレオチドである。即ち、塩基多型の野生型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、野生型の核酸配列と二本鎖を形成するが、変異型の核酸配列とは二本鎖を形成しない、または、形成しても安定性が低い。同様に、塩基多型の変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、変異型の核酸配列と二本鎖を形成するが、野生型の核酸配列とは二本鎖を形成しない、または、形成しても安定性が低い。これにより、塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチドを有する本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸とハイブリダイズさせ、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出することができる。
【0020】
検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドは、本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸に結合させるためのものである。検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖を形成させる条件下で、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖を形成することができれば、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの長さは特に限定されない。標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドとして、通常の合成オリゴヌクレオチド以外に、例えばヌクレオチドをアミド結合にて重合させたPNAと呼ばれるオリゴヌクレオチド等核酸と二本鎖を形成するものであれば利用可能である。
【0021】
本発明の塩基多型検出プローブにおいては、上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間にスペーサーが存在する。
【0022】
本発明の塩基多型検出プローブにおいて、検出プローブ用オリゴヌクレオチド、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、及びスペーサーの方向は特に限定されず、5’末端から3’末端の方向に、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び検出プローブ用オリゴヌクレオチドの順に配置されていてもよいし、5’末端から3’末端の方向に、検出プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが配置されていてもよい。検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する場合には、5’末端から3’末端の方向に、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び検出プローブ用オリゴヌクレオチドの順に配置されていることが好ましい。
【0023】
本発明においてスペーサーは、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドを連結させることができるものであれば特に限定されないが、イノシンを用いるスペーサーが特に好ましい。スペーサーの性質として、標的核酸と二本鎖を形成しない、または、形成しても通常の塩基対の結合より結合力が弱くて検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖形成を不安定化させるものが好ましい。また、分子の大きさや二本鎖核酸の立体構造(二重らせん構造)を考えた場合、核酸や核酸誘導体の重合体、D−リボースやD−2−リボースの重合体が好ましいことは容易に類推される。これら核酸や核酸誘導体は、既存の自動DNA合成機にて、通常のDNA合成と同じ方法で合成が可能であることも優れた点である。
【0024】
イノシンとは、塩基部分にプリン誘導体であるヒポキサンチンを含むヌクレオチドの一つである。Martinら(Nucleic Acids Research,13(24),8927−8938,1985)によると、イノシンとの塩基対の安定性はC、A、TまたはGの順で、イノシンは核酸中ではおよそグアニンのアナログとして働くが、Watson−Clickの塩基対グアニンとシトシン、アデニンとチミンよりも安定性が低いことが示されている。このイノシンの性質を利用して、複数種類のアレルを有する核酸配列を増幅する際のredundancyを下げるプライマーとしてイノシンを含むオリゴヌクレオチドが使用されている(J. Clinical Microbiology, 34,12,2990−2996,1996)。
【0025】
本発明の塩基多型検出プローブは、溶液の状態でもよく、基板、担体、多孔質体に固定化あるいは吸着された状態でもよい。固定化や吸着の方法は特に限定されるものではなく、例えば以下のような方法が挙げられる。アミノ修飾したオリゴヌクレオチドと基板上に導入したカルボキシル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミド結合させる方法(J.Org.,262525,1961)や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはアビジンを表面にコートした基板や担体にビオチン−アビジン結合させる方法(Biochemistry、11,2291,1972)、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲルに固定化する方法、シールされたガラス上にDNA合成試薬を接触させる合成方法(Nucleic Acids Research,22,1368,1994)等がある。
【0026】
上記した本発明の塩基多型検出プローブは、通常のDNA合成機を用いて常法により合成することができる。
【0027】
(2)塩基多型検出方法
本発明においては、上記(1)で説明した本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸とハイブリダイズさせ、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出することにより、検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出することができる。
【0028】
本発明において、検体核酸とは試料中の核酸を意味する。ここで言う試料とは、DNAやRNAを含むもので、その由来は、血液、尿、髄液、喀痰、体液、細胞浮遊液、細胞培養液、工場廃液などの細胞または核酸が含まれるものならどのようなものであってもよい。また、それらの試料に何らかの処理をほどこした処理液であっても良い。処理の方法としては、例えば、喀痰のような粘性の高い試料を喀痰処理剤により溶解するなどの方法が挙げられる。また、試料中の核酸は溶液の状態でも、多孔質フィルターや基板等に固定化された状態でもよい。ここで示す細胞とは、ヒト細胞、哺乳類細胞、酵母などの真核性単細胞生物、真菌、細菌、ウィルスなどを意味する。
【0029】
検体核酸は、反応液中の核酸の他に、基板、担体、又は多孔質体(例えば、多孔質からなるフィルター)に固定化あるいは吸着された核酸などその形態は問わない。固定化や吸着の方法は特に限定されるものではなく、例えば以下のような方法が挙げられる。アミノ修飾したオリゴヌクレオチドと基板上に導入したカルボキシル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミド結合させる方法(J.Org.,262525,1961)や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはアビジンを表面にコートした基板や担体にビオチン−アビジン結合させる方法(Biochemistry、11,2291,1972)、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲルに固定化する方法、シールされたガラス上にDNA合成試薬を接触させる合成方法(Nucleic Acids Research,22,1368,1994)等がある。
【0030】
本発明において多孔質体からなるフィルターとは、一方の面から他方の面に連通する多数の微細な孔を有し、核酸を選択的に分離除去できる平均孔径を有する通気性のフィルターを意味する。多孔質体からなるフィルターの孔の形状やその連通状態、フィルターの厚さ、材質、形状、寸法等は特に問わず、多孔質体からなるフィルターはフィルム、シート、膜、板塊状、繊維状、粒状等の任意の形態であることができる。多孔質体からなるフィルターは有機材料および無機材料のいずれからなっていてもよく、また天然材料、合成材料または半合成材料からなっていてもよい。多孔質体からなるフィルターの例としては天然、合成、半合成、再生の有機または無機繊維からなる多孔質体; 有機または無機発泡体(例えばスポンジ、フォームなど);孔成分の溶出、焼結、延伸、穿孔などにより孔形成された有機、無機多孔質体;有機または無機の微粒子や細片を充填または結合した多孔質体などを挙げることができる。例えば、繊維からなる多孔質体フィルターの場合は、繊維は有機または無機の短繊維、スライバー、長繊維のいずれからなっていてもよく、しかもフィルターの形態は、単なる繊維の塊でもよく、また不織布または織布よりなる繊維布層の1層または複数層でもよい。
【0031】
検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成は、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出することができ、この核酸伸長反応は、核酸合成酵素にて行うことができる。
【0032】
核酸伸長反応とは、DNAの伸長反応の場合、G、A、T、Cで表記される4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質として、鋳型核酸の配列に従い、DNA合成酵素にて触媒されるDNA鎖の重合反応を意味する。基質としては、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の他に、Cy3やCy5等の蛍光化合物で標識されたヌクレオチドやDigoxigenin(DIG)−11−dUTPやビオチンを付加した標識ヌクレオチドでもよい。核酸合成酵素としてはDNA合成酵素を使用することができ、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌ポリメラーゼIのクレノー断片、T4 DNAポリメラーゼ、耐熱性のTaqポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。またその由来も、バクテリア由来、ウィルス由来、脊椎動物由来、無脊椎動物由来、植物由来などいずれでもよい。鋳型核酸がRNAからなる場合は、逆転写酵素にて触媒される。またその由来も、バクテリア由来、ウィルス由来、脊椎動物由来、無脊椎動物由来、植物由来などいずれでもよい。
【0033】
ピロリン酸は、dNTPを基質としたDNA合成酵素によるDNA伸長反応の際に生じる副生成物である。LAMP法では、このピロリン酸と反応溶液中のマグネシウムイオンから生じる沈殿を検出し、核酸増幅の指標としている(Biochemical and Biophysical Research Communication,289,150−154,2001)。また、塩基配列決定法の一つである、いわゆるパイロシークエンス法においてもこのピロリン酸を検出している。本発明においても、これらの方法を用いて、ピロリン酸を指標として伸長反応の可否を判定することが出来る。
【0034】
核酸伸長の可否を検出する方法としてさまざまな方法があり、以下に例を示す。例えばPCR法が有用である。本プローブをPCRに用いるプライマーとしてPCRを行えば、検出プローブ用オリゴヌクレオチドの塩基配列と標的核酸の塩基配列が完全に相補的な時に両者が二本鎖を形成し、この検出プローブ用オリゴヌクレオチドの3’末端から核酸の伸長反応が起こり、核酸の増幅が起こる。一方、検出プローブ用オリゴヌクレオチドの塩基配列と標的核酸の塩基配列が相補的でない場合は、両者は二本鎖を形成しない、または、形成しても不安定であり、核酸伸長反応が起こらない、または、伸長反応が起こっても増幅効率が低下する。この差を、アガロースゲル電気泳動にて検出したり、エチジウムブロマイドやSYBR Green等のいわゆる核酸のインターカレーターを使って検出することが可能である。また、増幅産物の核酸配列と相補的な配列を持つ標識核酸をプローブとして、ハイブリダイズにて増幅産物を検出することができる。標識核酸プローブとして、放射標識やDIG標識、蛍光標識プローブ等があり、Taqmanプローブも有用である。Taqmanプローブとは、蛍光ドナーとアクセプターの働きを有する2種のDyeにてオリゴヌクレオチドの両端を標識したもので、標的核酸配列にハイブリダイズした際には蛍光を発し、DNA合成酵素によりプローブが分解された際には蛍光がクエンチされる性質を有するプローブである。
【0035】
また、伸長・増幅した核酸の荷電を検出することで、核酸伸長反応を検出することも可能である。また、核酸伸長反応液中にCy3−dUTPやCy5−dUTPなどの蛍光標識されたヌクレオチドやDIG標識ヌクレオチドを核酸伸長反応液中に添加して核酸伸長反応を行い、伸長核酸中の蛍光標識ヌクレオチドやDIG標識ヌクレオチドを検出することで、核酸伸長反応の可否を検定できる。標識ヌクレオチドとして、先に示したCy3−dUTPやCy5−dUTP等の蛍光標識ヌクレオチド、DIG標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド等の標識ヌクレオチドなどがある。
【0036】
さらに本発明では、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をFRET法にて検出することもできる。FRET法とは、Fluoerescent Resonance Energy Transfer法のことで、2種のDyeがおよそ10から75オングストロームの近接した距離に存在する場合に、そのドナー側のDyeから生じた蛍光にて励起されたアクセプター側のDyeの蛍光強度を測定する方法である。例えば、塩基多型検出プローブ中の検出プローブ用オリゴヌクレオチドの3’末端を一方のDyeにて標識し、この塩基多型検出プローブがハイブリダイズする標的核酸の近傍にハイブリダイズする5’末端をもう一方のDyeにて標識したオリゴヌクレオチドを用意し、この2者を標的核酸とハイブリダイズさせる。検出プローブ用オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした時は、アクセプターから生じる蛍光強度が強まることから、検出プローブ中の塩基多型を判別することができる。
【0037】
本発明の方法により検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する場合、検体核酸の一本鎖核酸への変性は必須でないが、一般的には変性を行う方が好ましい場合が多い。変性させる方法としては、例えば熱変性法やアルカリ変性法がある。熱変性として、95℃に2分間、または65℃にて10分間熱変性させる方法、アルカリ変性としては、核酸を0.5N NaOHを含む変性溶液中におく方法が挙げられる。一般的にプローブを標的核酸にハイブリダイズさせて二重鎖を形成させる場合には、上記の検体核酸の変性が必要である。PCRにおいてもプライマーを検体核酸とハイブリダイズさせるために熱変性のステップが通常は必要である。しかし、Bst Polymerase Large Fragment(New England BioLabs)のような鎖置換型のDNA合成酵素の場合、変性がなくてもプライマー検体核酸にハイブリダイズしDNAの伸長反応が起こることが知られている。
【0038】
(3)本発明の具体的態様
本発明にて、さまざまなデザインの塩基多型検出プローブをプライマーとしてPCRを行い、電気泳動、または、インターカレーターの一つSYBR Greenやハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムPCR法にて、標的核酸の増幅の有無を検出した。その結果、塩基多型検出プローブのスペーサーとしてイノシンデオキシリボヌクレオチドを使用した場合、その重合数は2残基から7残基がよく、2残基から6残基がより好ましく、3残基から5残基がさらに好ましく、また、塩基多型検出プローブの検出プローブ用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド残基数は、3残基から9残基がよく、3残基から7残基がより好ましく、3残基から5残基がさらに好ましいことを見出した。また、検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の塩基多型の挿入位置は、検出プローブ用オリゴヌクレオチドを5残基とした場合、いずれでも変異の検出が可能であるが、3’端より2残基目から5残基目が好ましく、より好ましくは3残基目から5残基目がより好ましく、3残基目がさらに好ましいことを見出した。これら塩基多型検出プローブと、日本国特許第2853864号や欧州特許EP0332435号に記載されているプライマーとを比較検討した結果、より効率よく塩基多型の検出ができることを見出し、本発明に至った。
【0039】
また本発明者は、この塩基多型検出プローブをABO式血液型判定に実践した。ヒトの血液型は、赤血球上に付加される2種の糖鎖によって判別される。A型は、Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)遺伝子(Genbank Accession No.NM_020469)にて、赤血球上にN−アセチルグルコサミンを含む糖鎖が合成される。一方、B型のUDP−GalNAc遺伝子上にはアミノ酸置換を引き起こす複数箇所のSNPsが存在してアミノ酸配列の異なるタンパクが翻訳され、N−アセチルグルコサミンではなくガラクトースを含む糖鎖が赤血球表面に合成される。また、O型は、UDP−GalNAc遺伝子上のSNPsにより途中でストップコドンが現れ、O型の赤血球表面にN−アセチルグルコサミンやガラクトースからなる糖鎖の合成が不可能となる。本発明者はこれらUDP−GalNAc遺伝子上のSNPsを検出する塩基多型検出プローブを設計した。ABO血液型判定に用いるUDP−GalNAc遺伝子上のSNPsとこれを検出するための塩基多型検出プローブの配列番号を表1に記載した。
【0040】
【表1】
【0041】
SNPsを検出する際には、遺伝子がコードされている正鎖と、この正鎖に対して相補的な負鎖の配列のいずれか一方が判ればよく、従って、表1に示した正鎖と負鎖の配列を有する塩基多型検出プローブが利用できる。塩基多型検出プローブをPCRプライマーの一方とした場合、この塩基多型検出プローブに対して相補鎖の配列のオリゴヌクレオチドをもう一方のプライマーとして設計し、PCRを行うことが出来る。この相補鎖のプライマーの配列は、両アレルに共通な配列であって、例えば塩基多型検出プローブから3’側に数十〜数百塩基の位置に、例えば10〜80塩基のヌクレオチドであればよい。
【0042】
本発明者は、表1に示した塩基多型検出プローブを使ったPCRにて、UDP−GalNAc遺伝子上のSNPsの塩基配列の検出に成功し、ABO式血液型判定方法を完成するに至った。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【0043】
【実施例】
実施例1:イノシンスペーサーの長さ
化学的に合成した配列番号1又は2に記載のオリゴヌクレオチドあるいは配列番号3〜10の塩基多型検出プローブを5’プライマーとし、配列番号11に記載のオリゴヌクレオチドを3’プライマーとし、Lambda DNA(GIBCO BRL)をテンプレートとしてPCRを行った。これらの配列は、Lambda DNA配列において、GC含量やPCR産物のサイズを考慮して設計した。PCRはExpand High−Fidelity PCR System(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)を使用した。3ngのLambdaDNAを入れたPCR用チューブに、5’プライマーと3’プライマーが、それぞれ最終濃度0.4μMとなるように添加し、2μlのExpand High−Fidelity PCR Systemの反応バッファーと、最終濃度が1.5mMとなるようMgCl2を添加し、0.3μlのHiFi Taq polymeraseを添加し、最終容量を20μlとした。これらPCR反応液をDNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)で、95℃で3分反応させた後、95℃で30秒、60℃で1分及び72℃で3分のサイクルを30回行い、そして最後に72℃で5分間反応させた。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この結果を図1に示す。LAM5I5wとLAM5I5m3にて、PCR産物量の差が顕著であり、一塩基の置換が検出されていることが示された。
【0044】
実施例2:検出プローブ用オリゴヌクレオチドの長さ
検出プローブ用オリゴヌクレオチド上の核酸残基数の異なる塩基多型検出プローブ設計し、PCRを行った。変異挿入個所は検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の中央とした。化学的に合成した配列番号5、6、13〜18記載の塩基多型検出プローブ、配列番号12のオリゴヌクレオチドのいずれかを5’プライマーとし、配列番号11記載のオリゴヌクレオチドを3’プライマーとして、Lambda DNAをテンプレートとしてPCRを行った。実験の詳細は実施例1に従った。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR反応物の有無を確認した。この結果を図2に示す。塩基多型検出プローブ中の検出プローブの長さ5または3merのときに、PCR産物量の差が顕著であることが示された。
【0045】
実施例3:検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の変異導入位置
検出プローブ用オリゴヌクレオチドの変異導入個所をかえた塩基多型検出プローブを設計し、PCRを行った。化学的に合成した配列番号5、6、19〜22記載の塩基多型検出プローブ、配列番号12のオリゴヌクレオチドのいずれかを5’側プライマー、配列番号11記載のオリゴヌクレオチドを3’側プライマーとし、Lambda DNAをテンプレートとしてPCRを行った。実験の詳細は実施例1に従った。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この結果を図3に示す。塩基多型検出プローブ中の検出プローブ用オリゴヌクレオチドが5merの時、3’端から3番目に変異個所を導入すると最もPCR産物量の差が顕著であることが示された。
【0046】
実施例4:HLAタイピング
ヒト培養細胞HL−60とU−937のHLA−A遺伝子のタイピングをSRL社に依頼した結果、それぞれHLA−A*0101とHLA−A*1101であることが判明した。ウェブサイト HYPERLINK ”http://www.anthonynolan.com/からHLA遺伝子の配列比較表” www.anthonynolan.com/からHLA遺伝子の配列比較表HLADB−1.12.0−OCT 2001をダウンロードし、ファイル中のA*0101とA*1101の2つの遺伝子配列を比較し、適当な一塩基置換としてHLA*0101のcDNA配列272位のアレルがHLA−A*0101がA,HLA−A−1101がGであることを見出し、この領域に塩基多型検出プローブを設定し、以下PCRのプライマーとして使用した。まず、5ngのヒトゲノムDNAを入れたPCR用チューブに、5’プライマーとして、配列番号23のHLA−A*0101を検出する塩基多型検出プローブ、または、配列番号24のHLA−A*1101を検出する塩基多型検出プローブのいずれかと、3’プライマーとして配列番号25のオリゴヌクレオチドが、それぞれ最終濃度0.4μMとなるように添加し、2μlのExpand High−Fidelity PCR Systemの反応バッファーと、適当な濃度のMgCl2を添加し、0.3μlのHiFi Taq polymeraseを添加し、最終容量を20μlとした。これらPCR反応液をDNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)で95℃ 3分、1cycle;95℃ 30秒、60℃ 1分、72℃ 3分、 30cycles;72℃ 5分間反応させた。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この結果を図4に示す。PCR産物の有無と各細胞のHLAタイプが一致していることが示された。
【0047】
実施例5:Realtime PCRによるHLAタイピング
Roche社製のRealtime PCRマシーンLightcyclerにて、塩基多型検出プローブを使ったPCR反応を行った。培養細胞から調製した5ngのヒトゲノムDNAを入れたLightcycler専用キャピラリーチューブに、5’プライマーとして配列番号26、27の塩基多型検出プローブのいずれかと、3’プライマーとして配列番号25のオリゴヌクレオチドを、それぞれ最終濃度0.5μMとなるように添加した。次に、3’端をFITCにて標識した配列番号92のプローブと、5’端をLC−Red640にて標識し、かつ、3’をリン酸化した配列番号93のプローブとを、それぞれ最終濃度が0.2μMと0.4μMになるように添加した。これにPCR Master Hybridization Probe(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)の反応液2μlと適量のMgCl2を添加して、全量を20μlとした。これをLightcyclerで、95℃で20秒、1cycle;95℃で10秒、60℃で20秒、72℃で20秒を100cycles;40℃で300秒、反応させた。PCR増幅反応中の蛍光強度の測定は、アニーリングのエンドポイントにて各サイクル1回測定した。その結果を図5に示す。HL−60細胞、U−937細胞共に、ゲノム配列とプローブ配列が一致する際にPCRの増幅の立ち上がりに要するPCRのサイクル数を見分けることで、HLA−A*0101かHLA−A*1101かのタイピングが可能であることが示された。
【0048】
実施例6:培養細胞のABO式血液型検出
Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)mRNA、complete cds(Genbank Accession No.NM_020469)の211位から310位までのDNAの部分配列をウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にてホモロジー検索を行い、Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)遺伝子のゲノム部分配列を含むGenomic sequence from Human 9q34,completesequence [Homo sapiens](Genbank Accession No.AC000397)を得た。NM_020469とAC000397の配列をもとに化学的に合成した配列番号28と29、30と31とを使用して、ヒト培養細胞HL−60(ATCC社)、U−937(ATCC社)、ASM(大日本製薬)、THP−1(ATCC社)から調製したゲノムDNAのHuman histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)ゲノムの部分配列の増幅をPCRにて行い、DNAシークエンスにてこの部分配列を決定した。Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)mRNA、completecds(Genbank Accession No.NM_020469)の261位と803位の配列を調べ、ABO式血液型の判定を行った。この結果を表2に示す。261位のヌクレオチドがGの場合、A型またはB型の血液型を示し、Gが欠失の場合、O型の血液型を示す。また、803位のヌクレオチドがGならAまたはO型の血液型を示し、CならB型の血液型を示す。
【0049】
【表2】
【0050】
一方、Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)遺伝子配列上で、ABOを規定する変異位置に塩基多型検出プローブを設定し、以下PCRのプライマーとして使用した。261位の変異検出は以下の様に行った。上記細胞から調製した5ngのゲノムDNAを含むPCR用チューブに、配列番号28記載のオリゴヌクレオチドを5’プライマー、配列番号42、43記載の塩基多型検出プローブのいずれかを3’プライマーとし、それぞれ最終濃度が0.4μMとなるように添加し、2μlのExpand High−Fidelity PCR Systemの反応バッファーと、適当な濃度のMgCl2と0.3μlのHiFi Taq polymeraseとを添加し、最終容量を20μlとした。これらPCR反応液をDNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)で95℃で3分、1cycle;95℃で30秒、66℃で30秒、72℃で2分、40cycles;72℃で5分間反応させた。PCR反応終了後、5μlの反応液を2%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この電気泳動の結果を図6に示す。803位の変異検出には、配列番号84、85記載の塩基多型検出プローブを5’プライマーとし、配列番号30記載のオリゴヌクレオチドを3’プライマーとして、261位の変異検出と同様の方法にて行った。その電気泳動の結果を図7に示す。図6及び図7から判定したABO血液型を表3に示す。表2と表3の結果が一致し、塩基多型検出プローブにてABO遺伝子の判定が可能であることが示された。
【0051】
【表3】
【0052】
【発明の効果】
本発明の塩基多型検出プローブは、容易にデザインすることが可能であり、また、従来のDNA合成機にて合成可能である。本発明にそってPCR法にて塩基多型を検出する際には、これを同一条件下で行うことが可能であり、精度良く塩基多型を検出することが可能である。
【0053】
【配列表】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
【0061】
【0062】
【0063】
【0064】
【0065】
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
【0073】
【0074】
【0075】
【0076】
【0077】
【0078】
【0079】
【0080】
【0081】
【0082】
【0083】
【0084】
【0085】
【0086】
【0087】
【0088】
【0089】
【0090】
【0091】
【0092】
【0093】
【0094】
【0095】
【0096】
【0097】
【0098】
【0099】
【0100】
【0101】
【0102】
【0103】
【0104】
【0105】
【0106】
【0107】
【0108】
【0109】
【0110】
【0111】
【0112】
【0113】
【0114】
【0115】
【0116】
【0117】
【0118】
【0119】
【0120】
【0121】
【0122】
【0123】
【0124】
【0125】
【0126】
【0127】
【0128】
【0129】
【0130】
【0131】
【0132】
【0133】
【0134】
【0135】
【0136】
【0137】
【0138】
【0139】
【0140】
【0141】
【0142】
【0143】
【0144】
【0145】
【0146】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、スペーサー長の異なる塩基多型検出プローブでのPCRの結果を示す。 プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2 LAM0I5w(配列番号1);Lane3 LAM0I5m3(配列番号2);Lane4 LAM3I5w(配列番号3);Lane5 LAM3I5m3(配列番号4);Lane6 LAM5I5w(配列番号5);Lane7 LAM5I5m3(配列番号6);Lane8 LAM7I5w(配列番号7);Lane9 LAM7I5m3(配列番号8);Lane10 LAM9I5w(配列番号9);Lane11 LAM9I5m3(配列番号10)
【図2】図2は、核酸残基数の異なる多型検出プローブでのPCRの結果を示す。プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2 LAM1(配列番号12);Lane3 LAM5I7w(配列番号13);Lane4 LAM5I7m4(配列番号14);Lane5 LAM5I5w(配列番号5);Lane6 LAM5I5m3(配列番号6);Lane7 LAM5I3w(配列番号15);Lane8 LAM5I3m2(配列番号16);Lane9 LAM5I1w(配列番号17);Lane10 LAM5I1m1(配列番号18);Lane11 100bpラダー(GIBCO BRL);
【図3】図3は、検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の変異位置が異なる塩基多型検出プローブでのPCRの結果を示す。プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2 LAM1(配列番号12);Lane3 LAM5I5w(配列番号5);Lane4LAM5I5m1(配列番号19);Lane5 LAM5I5m2(配列番号20);Lane6 LAM5I5m3(配列番号6);Lane7 LAM5I5m4(配列番号21);Lane8 LAM5I5m5(配列番号22)
【図4】図4は、塩基多型検出プローブを使ったPCRによる培養細胞のHLAタイピングの結果を示す。プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2、4,6,8、5’プライマー:HLAex2−1−3I5a3(配列番号23);Lane3、5、7、9 HLAex2−1−3I5g3(配列番号24)。
【図5】図5は、RelatimePCRによる多型検出の結果を示す。HLA−A*0101、HLA−A*1101に特異的な塩基多型検出プローブをプライマーとしたRealtimePCR。5’プライマーを塩基多型検出プローブHLAex2−1−5I5a3(配列番号26)、または、HLAex2−1−5I5g3(配列番号27)のいずれか、3’プライマーには、HLA−A*0101、HLA−A*1101に共通のプライマー(配列番号25)を用いた。横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度を示した。
【図6】図6は、塩基多型検出プローブを使ったPCRの結果を示す。Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)の261位のアレルを検出する塩基多型検出プローブを用いたPCRの産物の電気泳動。5’プライマーとしてABO11(配列番号28)、3’プライマーとして塩基多型検出プローブABO8(配列番号42)、または、塩基多型検出プローブABO10(配列番号43)を用いた。
【図7】図7は、塩基多型検出プローブを使ったPCRの結果を示す。Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)の803位のアレルを検出する塩基多型検出プローブを用いたPCRの産物の電気泳動。5’プライマーとして塩基多型検出プローブABO20(配列番号84)、または、塩基多型検出プローブABO22(配列番号85)、3’プライマーとしてABO13(配列番号30)を用いた。
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基多型検出プローブとそれを用いた塩基多型検出方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノム解析が急速に進展し、その成果であるゲノム情報を医療の質的改善に結びつけようという試みが活発になってきている。一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism(s)、SNP(s))のデータが整備されれば、薬効の個人差を識別し、患者毎に至適薬物と投与量を決定する、いわゆるオーダーメード医療が可能になると期待されている。このようなSNPを利用したオーダーメード医療を実現するためには、迅速、正確、かつ安価なSNPタイピング技術の開発が不可欠である。ここでいうSNPタイピング技術とは、ゲノムの抽出・精製、核酸増幅、塩基配列の解析など検体の処理から検査結果のアウトプットに至るまでのすべての技術を意味する。一方、感染症の治療に際しては、感染ウィルスや感染起炎菌のゲノタイプ判定結果をもとに、治療法や薬剤を選択することが既に進められており、治療効果や医療費の軽減に寄与している。このようなヒトゲノム上の一塩基多型や、ウィルスや感染起炎菌のゲノタイプや変異を検出する方法が数多く報告されている。
【0003】
日本特許第2853864号(特許文献1)には、塩基多型に相当するヌクレオチドを3’末端に導入したプライマーにて伸長反応を行い、その伸長産物の有無で変異ヌクレオチドを検出する方法が述べられている。3’末端が非相補的な配列のプライマーにおいても伸長産物が生じる場合には、試料DNAとプライマーとの結合性を減少させるためプライマー中に故意に1つ又はそれ以上のミスマッチを導入したプライマーから伸長させることにより、この非特異的伸長を避けることができると記載されている。
【0004】
日本特許第2853864号に類似した方法として、欧州特許EP0332435号(特許文献2)が開示されている。この方法では、3’末端にSNPサイトを導入したDNAプローブをプライマーとして核酸伸張反応を行い、DNAプローブ中のSNPの塩基がターゲットDNAの塩基配列と相補的である場合は核酸伸張反応が起こり、SNPの塩基がターゲットDNAと相補的でない場合には核酸伸張反応が起こらず、この核酸伸張産物の有無からSNPサイトの塩基を決定する方法を示している。3’末端から1、2又は3塩基のところに人為的にミスマッチを導入した変異検出DNAプローブにて、プローブの3’末端のSNPを検出すると、良好な結果が得られたことが記載されている。また、これを応用した方法も考案されている。例えば、PCR反応時のプライマーの一方にこのプローブを使用すると、このプローブの塩基配列が検体の核酸配列と相補的である場合はPCRによる増幅が起こり、相補的でない場合は増幅は起こらないことから、PCR増幅産物の有無を判定することにより塩基多型を決定することができる。
【0005】
しかしながら、これら日本特許第2853864号と欧州特許EP0332435号に使用されているプライマーを使った一塩基変異の検出では、プライマーの3’末端付近の配列が標的核酸の配列と完全に一致しなくても非特異的な核酸伸長反応がしばしば起こることが確認されている。また、PCRにおけるプライマーとテンプレートDNAのアニーリング温度は、使用するプライマーの塩基配列に依存するため、複数の塩基多型の検出を同一のPCR条件下で行うことが困難である。つまり、プライマーとテンプレートDNAのアニーリング温度や変性温度のプライマー配列への依存度が低く、かつ、塩基多型検出の精度の高い塩基多型の検出法が求められている。
【0006】
【特許文献1】
日本特許第2853864号
【0007】
【特許文献2】
欧州特許EP0332435号
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、プローブの設計が容易で、同一条件下で複数の塩基多型を精度よく検出できるプローブと、そのプローブを使った塩基多型検出方法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、塩基多型を検出するプローブの設計と、そのプローブを使った塩基多型検出法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【0010】
(1) 検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。
【0011】
(2) 検出プローブ用オリゴヌクレオチドが3から9残基のオリゴヌクレオチドである、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(3) スペーサーがイノシンを含む、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(4) スペーサーがイノシンの重合体である、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(5) スペーサーが2から7残基のイノシンの重合体である、(4)に記載の塩基多型検出プローブ。
【0012】
(6) スペーサーが、少なくとも1種類以上の核酸誘導体およびその重合体を含む、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(7) スペーサーが2から7残基の核酸誘導体の重合体である、(6)に記載の塩基多型検出プローブ。
(8) 標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが15から100残基のオリゴヌクレオチドである、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(9) 配列番号32から91の何れかに記載の塩基配列を有する、(1)に記載の塩基多型検出プローブ。
(10) ABO式血液型判定のために用いる、(9)に記載の塩基多型検出プローブ。
【0013】
(11) 検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する方法であって、(a)検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブを、検体核酸とハイブリダイズさせる工程;及び、
(b)検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出する工程;
を含む、上記の方法。
【0014】
(12) 検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する、(11)に記載の方法。
(13) 核酸合成酵素にて核酸伸長反応を行う、(12)に記載の方法。
(14) 核酸伸長反応時に標識ヌクレオチドを基質に加え、核酸伸張の有無を標識ヌクレオチドにて検出する、(12)に記載の方法。
【0015】
(15) 核酸伸長反応時に発生するピロリン酸を検出して核酸伸長の有無を検出する、(12)に記載の方法。
(16) 核酸伸長反応にて生じた二本鎖核酸をインターカレーターを用いて検出する、(12)に記載の方法。
(17) 検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をFRET法にて検出する、(11)に記載の方法。
(18) 配列番号32から91の何れかに記載の塩基配列を有する請求項1に記載の塩基多型検出プローブを用いる、ABO式血液型判定方法。
【0016】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)塩基多型検出プローブ
本発明の塩基多型検出プローブは、検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成されるものである。
【0017】
本発明において、核酸とは、プリン塩基またはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とし、このリン酸各ヌクレオチド間で糖の3’と5’位炭素の間にジエステル結合をつくって結ばれ重合した長い鎖状のポリヌクレオチドのことを指す。D−リボースを糖成分とするものをリボ核酸(RNA)、D−2−デオキシリボースを糖成分とするものをデオキシリボ核酸(DNA)という。
【0018】
本発明において塩基多型とは、核酸配列上に存在する核酸配列の変異や一塩基多型(Single nucleotide polymorphism(s)、SNP(s))を意味し、ヌクレオチドの置換や欠失や挿入がある。核酸は、DNAであってもRNAであっても良く、DNAを鋳型として転写されたRNAや、RNAを鋳型として逆転写されたDNAであってもよい。
【0019】
検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、標的とする塩基多型部位に特異的なオリゴヌクレオチドである。即ち、塩基多型の野生型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、野生型の核酸配列と二本鎖を形成するが、変異型の核酸配列とは二本鎖を形成しない、または、形成しても安定性が低い。同様に、塩基多型の変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、変異型の核酸配列と二本鎖を形成するが、野生型の核酸配列とは二本鎖を形成しない、または、形成しても安定性が低い。これにより、塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチドを有する本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸とハイブリダイズさせ、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出することができる。
【0020】
検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドは、本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸に結合させるためのものである。検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖を形成させる条件下で、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖を形成することができれば、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの長さは特に限定されない。標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドとして、通常の合成オリゴヌクレオチド以外に、例えばヌクレオチドをアミド結合にて重合させたPNAと呼ばれるオリゴヌクレオチド等核酸と二本鎖を形成するものであれば利用可能である。
【0021】
本発明の塩基多型検出プローブにおいては、上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間にスペーサーが存在する。
【0022】
本発明の塩基多型検出プローブにおいて、検出プローブ用オリゴヌクレオチド、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、及びスペーサーの方向は特に限定されず、5’末端から3’末端の方向に、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び検出プローブ用オリゴヌクレオチドの順に配置されていてもよいし、5’末端から3’末端の方向に、検出プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが配置されていてもよい。検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する場合には、5’末端から3’末端の方向に、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び検出プローブ用オリゴヌクレオチドの順に配置されていることが好ましい。
【0023】
本発明においてスペーサーは、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドを連結させることができるものであれば特に限定されないが、イノシンを用いるスペーサーが特に好ましい。スペーサーの性質として、標的核酸と二本鎖を形成しない、または、形成しても通常の塩基対の結合より結合力が弱くて検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖形成を不安定化させるものが好ましい。また、分子の大きさや二本鎖核酸の立体構造(二重らせん構造)を考えた場合、核酸や核酸誘導体の重合体、D−リボースやD−2−リボースの重合体が好ましいことは容易に類推される。これら核酸や核酸誘導体は、既存の自動DNA合成機にて、通常のDNA合成と同じ方法で合成が可能であることも優れた点である。
【0024】
イノシンとは、塩基部分にプリン誘導体であるヒポキサンチンを含むヌクレオチドの一つである。Martinら(Nucleic Acids Research,13(24),8927−8938,1985)によると、イノシンとの塩基対の安定性はC、A、TまたはGの順で、イノシンは核酸中ではおよそグアニンのアナログとして働くが、Watson−Clickの塩基対グアニンとシトシン、アデニンとチミンよりも安定性が低いことが示されている。このイノシンの性質を利用して、複数種類のアレルを有する核酸配列を増幅する際のredundancyを下げるプライマーとしてイノシンを含むオリゴヌクレオチドが使用されている(J. Clinical Microbiology, 34,12,2990−2996,1996)。
【0025】
本発明の塩基多型検出プローブは、溶液の状態でもよく、基板、担体、多孔質体に固定化あるいは吸着された状態でもよい。固定化や吸着の方法は特に限定されるものではなく、例えば以下のような方法が挙げられる。アミノ修飾したオリゴヌクレオチドと基板上に導入したカルボキシル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミド結合させる方法(J.Org.,262525,1961)や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはアビジンを表面にコートした基板や担体にビオチン−アビジン結合させる方法(Biochemistry、11,2291,1972)、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲルに固定化する方法、シールされたガラス上にDNA合成試薬を接触させる合成方法(Nucleic Acids Research,22,1368,1994)等がある。
【0026】
上記した本発明の塩基多型検出プローブは、通常のDNA合成機を用いて常法により合成することができる。
【0027】
(2)塩基多型検出方法
本発明においては、上記(1)で説明した本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸とハイブリダイズさせ、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出することにより、検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出することができる。
【0028】
本発明において、検体核酸とは試料中の核酸を意味する。ここで言う試料とは、DNAやRNAを含むもので、その由来は、血液、尿、髄液、喀痰、体液、細胞浮遊液、細胞培養液、工場廃液などの細胞または核酸が含まれるものならどのようなものであってもよい。また、それらの試料に何らかの処理をほどこした処理液であっても良い。処理の方法としては、例えば、喀痰のような粘性の高い試料を喀痰処理剤により溶解するなどの方法が挙げられる。また、試料中の核酸は溶液の状態でも、多孔質フィルターや基板等に固定化された状態でもよい。ここで示す細胞とは、ヒト細胞、哺乳類細胞、酵母などの真核性単細胞生物、真菌、細菌、ウィルスなどを意味する。
【0029】
検体核酸は、反応液中の核酸の他に、基板、担体、又は多孔質体(例えば、多孔質からなるフィルター)に固定化あるいは吸着された核酸などその形態は問わない。固定化や吸着の方法は特に限定されるものではなく、例えば以下のような方法が挙げられる。アミノ修飾したオリゴヌクレオチドと基板上に導入したカルボキシル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミド結合させる方法(J.Org.,262525,1961)や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはアビジンを表面にコートした基板や担体にビオチン−アビジン結合させる方法(Biochemistry、11,2291,1972)、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲルに固定化する方法、シールされたガラス上にDNA合成試薬を接触させる合成方法(Nucleic Acids Research,22,1368,1994)等がある。
【0030】
本発明において多孔質体からなるフィルターとは、一方の面から他方の面に連通する多数の微細な孔を有し、核酸を選択的に分離除去できる平均孔径を有する通気性のフィルターを意味する。多孔質体からなるフィルターの孔の形状やその連通状態、フィルターの厚さ、材質、形状、寸法等は特に問わず、多孔質体からなるフィルターはフィルム、シート、膜、板塊状、繊維状、粒状等の任意の形態であることができる。多孔質体からなるフィルターは有機材料および無機材料のいずれからなっていてもよく、また天然材料、合成材料または半合成材料からなっていてもよい。多孔質体からなるフィルターの例としては天然、合成、半合成、再生の有機または無機繊維からなる多孔質体; 有機または無機発泡体(例えばスポンジ、フォームなど);孔成分の溶出、焼結、延伸、穿孔などにより孔形成された有機、無機多孔質体;有機または無機の微粒子や細片を充填または結合した多孔質体などを挙げることができる。例えば、繊維からなる多孔質体フィルターの場合は、繊維は有機または無機の短繊維、スライバー、長繊維のいずれからなっていてもよく、しかもフィルターの形態は、単なる繊維の塊でもよく、また不織布または織布よりなる繊維布層の1層または複数層でもよい。
【0031】
検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成は、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出することができ、この核酸伸長反応は、核酸合成酵素にて行うことができる。
【0032】
核酸伸長反応とは、DNAの伸長反応の場合、G、A、T、Cで表記される4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質として、鋳型核酸の配列に従い、DNA合成酵素にて触媒されるDNA鎖の重合反応を意味する。基質としては、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の他に、Cy3やCy5等の蛍光化合物で標識されたヌクレオチドやDigoxigenin(DIG)−11−dUTPやビオチンを付加した標識ヌクレオチドでもよい。核酸合成酵素としてはDNA合成酵素を使用することができ、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌ポリメラーゼIのクレノー断片、T4 DNAポリメラーゼ、耐熱性のTaqポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。またその由来も、バクテリア由来、ウィルス由来、脊椎動物由来、無脊椎動物由来、植物由来などいずれでもよい。鋳型核酸がRNAからなる場合は、逆転写酵素にて触媒される。またその由来も、バクテリア由来、ウィルス由来、脊椎動物由来、無脊椎動物由来、植物由来などいずれでもよい。
【0033】
ピロリン酸は、dNTPを基質としたDNA合成酵素によるDNA伸長反応の際に生じる副生成物である。LAMP法では、このピロリン酸と反応溶液中のマグネシウムイオンから生じる沈殿を検出し、核酸増幅の指標としている(Biochemical and Biophysical Research Communication,289,150−154,2001)。また、塩基配列決定法の一つである、いわゆるパイロシークエンス法においてもこのピロリン酸を検出している。本発明においても、これらの方法を用いて、ピロリン酸を指標として伸長反応の可否を判定することが出来る。
【0034】
核酸伸長の可否を検出する方法としてさまざまな方法があり、以下に例を示す。例えばPCR法が有用である。本プローブをPCRに用いるプライマーとしてPCRを行えば、検出プローブ用オリゴヌクレオチドの塩基配列と標的核酸の塩基配列が完全に相補的な時に両者が二本鎖を形成し、この検出プローブ用オリゴヌクレオチドの3’末端から核酸の伸長反応が起こり、核酸の増幅が起こる。一方、検出プローブ用オリゴヌクレオチドの塩基配列と標的核酸の塩基配列が相補的でない場合は、両者は二本鎖を形成しない、または、形成しても不安定であり、核酸伸長反応が起こらない、または、伸長反応が起こっても増幅効率が低下する。この差を、アガロースゲル電気泳動にて検出したり、エチジウムブロマイドやSYBR Green等のいわゆる核酸のインターカレーターを使って検出することが可能である。また、増幅産物の核酸配列と相補的な配列を持つ標識核酸をプローブとして、ハイブリダイズにて増幅産物を検出することができる。標識核酸プローブとして、放射標識やDIG標識、蛍光標識プローブ等があり、Taqmanプローブも有用である。Taqmanプローブとは、蛍光ドナーとアクセプターの働きを有する2種のDyeにてオリゴヌクレオチドの両端を標識したもので、標的核酸配列にハイブリダイズした際には蛍光を発し、DNA合成酵素によりプローブが分解された際には蛍光がクエンチされる性質を有するプローブである。
【0035】
また、伸長・増幅した核酸の荷電を検出することで、核酸伸長反応を検出することも可能である。また、核酸伸長反応液中にCy3−dUTPやCy5−dUTPなどの蛍光標識されたヌクレオチドやDIG標識ヌクレオチドを核酸伸長反応液中に添加して核酸伸長反応を行い、伸長核酸中の蛍光標識ヌクレオチドやDIG標識ヌクレオチドを検出することで、核酸伸長反応の可否を検定できる。標識ヌクレオチドとして、先に示したCy3−dUTPやCy5−dUTP等の蛍光標識ヌクレオチド、DIG標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド等の標識ヌクレオチドなどがある。
【0036】
さらに本発明では、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をFRET法にて検出することもできる。FRET法とは、Fluoerescent Resonance Energy Transfer法のことで、2種のDyeがおよそ10から75オングストロームの近接した距離に存在する場合に、そのドナー側のDyeから生じた蛍光にて励起されたアクセプター側のDyeの蛍光強度を測定する方法である。例えば、塩基多型検出プローブ中の検出プローブ用オリゴヌクレオチドの3’末端を一方のDyeにて標識し、この塩基多型検出プローブがハイブリダイズする標的核酸の近傍にハイブリダイズする5’末端をもう一方のDyeにて標識したオリゴヌクレオチドを用意し、この2者を標的核酸とハイブリダイズさせる。検出プローブ用オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした時は、アクセプターから生じる蛍光強度が強まることから、検出プローブ中の塩基多型を判別することができる。
【0037】
本発明の方法により検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する場合、検体核酸の一本鎖核酸への変性は必須でないが、一般的には変性を行う方が好ましい場合が多い。変性させる方法としては、例えば熱変性法やアルカリ変性法がある。熱変性として、95℃に2分間、または65℃にて10分間熱変性させる方法、アルカリ変性としては、核酸を0.5N NaOHを含む変性溶液中におく方法が挙げられる。一般的にプローブを標的核酸にハイブリダイズさせて二重鎖を形成させる場合には、上記の検体核酸の変性が必要である。PCRにおいてもプライマーを検体核酸とハイブリダイズさせるために熱変性のステップが通常は必要である。しかし、Bst Polymerase Large Fragment(New England BioLabs)のような鎖置換型のDNA合成酵素の場合、変性がなくてもプライマー検体核酸にハイブリダイズしDNAの伸長反応が起こることが知られている。
【0038】
(3)本発明の具体的態様
本発明にて、さまざまなデザインの塩基多型検出プローブをプライマーとしてPCRを行い、電気泳動、または、インターカレーターの一つSYBR Greenやハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムPCR法にて、標的核酸の増幅の有無を検出した。その結果、塩基多型検出プローブのスペーサーとしてイノシンデオキシリボヌクレオチドを使用した場合、その重合数は2残基から7残基がよく、2残基から6残基がより好ましく、3残基から5残基がさらに好ましく、また、塩基多型検出プローブの検出プローブ用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド残基数は、3残基から9残基がよく、3残基から7残基がより好ましく、3残基から5残基がさらに好ましいことを見出した。また、検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の塩基多型の挿入位置は、検出プローブ用オリゴヌクレオチドを5残基とした場合、いずれでも変異の検出が可能であるが、3’端より2残基目から5残基目が好ましく、より好ましくは3残基目から5残基目がより好ましく、3残基目がさらに好ましいことを見出した。これら塩基多型検出プローブと、日本国特許第2853864号や欧州特許EP0332435号に記載されているプライマーとを比較検討した結果、より効率よく塩基多型の検出ができることを見出し、本発明に至った。
【0039】
また本発明者は、この塩基多型検出プローブをABO式血液型判定に実践した。ヒトの血液型は、赤血球上に付加される2種の糖鎖によって判別される。A型は、Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)遺伝子(Genbank Accession No.NM_020469)にて、赤血球上にN−アセチルグルコサミンを含む糖鎖が合成される。一方、B型のUDP−GalNAc遺伝子上にはアミノ酸置換を引き起こす複数箇所のSNPsが存在してアミノ酸配列の異なるタンパクが翻訳され、N−アセチルグルコサミンではなくガラクトースを含む糖鎖が赤血球表面に合成される。また、O型は、UDP−GalNAc遺伝子上のSNPsにより途中でストップコドンが現れ、O型の赤血球表面にN−アセチルグルコサミンやガラクトースからなる糖鎖の合成が不可能となる。本発明者はこれらUDP−GalNAc遺伝子上のSNPsを検出する塩基多型検出プローブを設計した。ABO血液型判定に用いるUDP−GalNAc遺伝子上のSNPsとこれを検出するための塩基多型検出プローブの配列番号を表1に記載した。
【0040】
【表1】
【0041】
SNPsを検出する際には、遺伝子がコードされている正鎖と、この正鎖に対して相補的な負鎖の配列のいずれか一方が判ればよく、従って、表1に示した正鎖と負鎖の配列を有する塩基多型検出プローブが利用できる。塩基多型検出プローブをPCRプライマーの一方とした場合、この塩基多型検出プローブに対して相補鎖の配列のオリゴヌクレオチドをもう一方のプライマーとして設計し、PCRを行うことが出来る。この相補鎖のプライマーの配列は、両アレルに共通な配列であって、例えば塩基多型検出プローブから3’側に数十〜数百塩基の位置に、例えば10〜80塩基のヌクレオチドであればよい。
【0042】
本発明者は、表1に示した塩基多型検出プローブを使ったPCRにて、UDP−GalNAc遺伝子上のSNPsの塩基配列の検出に成功し、ABO式血液型判定方法を完成するに至った。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【0043】
【実施例】
実施例1:イノシンスペーサーの長さ
化学的に合成した配列番号1又は2に記載のオリゴヌクレオチドあるいは配列番号3〜10の塩基多型検出プローブを5’プライマーとし、配列番号11に記載のオリゴヌクレオチドを3’プライマーとし、Lambda DNA(GIBCO BRL)をテンプレートとしてPCRを行った。これらの配列は、Lambda DNA配列において、GC含量やPCR産物のサイズを考慮して設計した。PCRはExpand High−Fidelity PCR System(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)を使用した。3ngのLambdaDNAを入れたPCR用チューブに、5’プライマーと3’プライマーが、それぞれ最終濃度0.4μMとなるように添加し、2μlのExpand High−Fidelity PCR Systemの反応バッファーと、最終濃度が1.5mMとなるようMgCl2を添加し、0.3μlのHiFi Taq polymeraseを添加し、最終容量を20μlとした。これらPCR反応液をDNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)で、95℃で3分反応させた後、95℃で30秒、60℃で1分及び72℃で3分のサイクルを30回行い、そして最後に72℃で5分間反応させた。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この結果を図1に示す。LAM5I5wとLAM5I5m3にて、PCR産物量の差が顕著であり、一塩基の置換が検出されていることが示された。
【0044】
実施例2:検出プローブ用オリゴヌクレオチドの長さ
検出プローブ用オリゴヌクレオチド上の核酸残基数の異なる塩基多型検出プローブ設計し、PCRを行った。変異挿入個所は検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の中央とした。化学的に合成した配列番号5、6、13〜18記載の塩基多型検出プローブ、配列番号12のオリゴヌクレオチドのいずれかを5’プライマーとし、配列番号11記載のオリゴヌクレオチドを3’プライマーとして、Lambda DNAをテンプレートとしてPCRを行った。実験の詳細は実施例1に従った。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR反応物の有無を確認した。この結果を図2に示す。塩基多型検出プローブ中の検出プローブの長さ5または3merのときに、PCR産物量の差が顕著であることが示された。
【0045】
実施例3:検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の変異導入位置
検出プローブ用オリゴヌクレオチドの変異導入個所をかえた塩基多型検出プローブを設計し、PCRを行った。化学的に合成した配列番号5、6、19〜22記載の塩基多型検出プローブ、配列番号12のオリゴヌクレオチドのいずれかを5’側プライマー、配列番号11記載のオリゴヌクレオチドを3’側プライマーとし、Lambda DNAをテンプレートとしてPCRを行った。実験の詳細は実施例1に従った。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この結果を図3に示す。塩基多型検出プローブ中の検出プローブ用オリゴヌクレオチドが5merの時、3’端から3番目に変異個所を導入すると最もPCR産物量の差が顕著であることが示された。
【0046】
実施例4:HLAタイピング
ヒト培養細胞HL−60とU−937のHLA−A遺伝子のタイピングをSRL社に依頼した結果、それぞれHLA−A*0101とHLA−A*1101であることが判明した。ウェブサイト HYPERLINK ”http://www.anthonynolan.com/からHLA遺伝子の配列比較表” www.anthonynolan.com/からHLA遺伝子の配列比較表HLADB−1.12.0−OCT 2001をダウンロードし、ファイル中のA*0101とA*1101の2つの遺伝子配列を比較し、適当な一塩基置換としてHLA*0101のcDNA配列272位のアレルがHLA−A*0101がA,HLA−A−1101がGであることを見出し、この領域に塩基多型検出プローブを設定し、以下PCRのプライマーとして使用した。まず、5ngのヒトゲノムDNAを入れたPCR用チューブに、5’プライマーとして、配列番号23のHLA−A*0101を検出する塩基多型検出プローブ、または、配列番号24のHLA−A*1101を検出する塩基多型検出プローブのいずれかと、3’プライマーとして配列番号25のオリゴヌクレオチドが、それぞれ最終濃度0.4μMとなるように添加し、2μlのExpand High−Fidelity PCR Systemの反応バッファーと、適当な濃度のMgCl2を添加し、0.3μlのHiFi Taq polymeraseを添加し、最終容量を20μlとした。これらPCR反応液をDNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)で95℃ 3分、1cycle;95℃ 30秒、60℃ 1分、72℃ 3分、 30cycles;72℃ 5分間反応させた。PCR反応終了後、5μlの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この結果を図4に示す。PCR産物の有無と各細胞のHLAタイプが一致していることが示された。
【0047】
実施例5:Realtime PCRによるHLAタイピング
Roche社製のRealtime PCRマシーンLightcyclerにて、塩基多型検出プローブを使ったPCR反応を行った。培養細胞から調製した5ngのヒトゲノムDNAを入れたLightcycler専用キャピラリーチューブに、5’プライマーとして配列番号26、27の塩基多型検出プローブのいずれかと、3’プライマーとして配列番号25のオリゴヌクレオチドを、それぞれ最終濃度0.5μMとなるように添加した。次に、3’端をFITCにて標識した配列番号92のプローブと、5’端をLC−Red640にて標識し、かつ、3’をリン酸化した配列番号93のプローブとを、それぞれ最終濃度が0.2μMと0.4μMになるように添加した。これにPCR Master Hybridization Probe(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)の反応液2μlと適量のMgCl2を添加して、全量を20μlとした。これをLightcyclerで、95℃で20秒、1cycle;95℃で10秒、60℃で20秒、72℃で20秒を100cycles;40℃で300秒、反応させた。PCR増幅反応中の蛍光強度の測定は、アニーリングのエンドポイントにて各サイクル1回測定した。その結果を図5に示す。HL−60細胞、U−937細胞共に、ゲノム配列とプローブ配列が一致する際にPCRの増幅の立ち上がりに要するPCRのサイクル数を見分けることで、HLA−A*0101かHLA−A*1101かのタイピングが可能であることが示された。
【0048】
実施例6:培養細胞のABO式血液型検出
Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)mRNA、complete cds(Genbank Accession No.NM_020469)の211位から310位までのDNAの部分配列をウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にてホモロジー検索を行い、Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)遺伝子のゲノム部分配列を含むGenomic sequence from Human 9q34,completesequence [Homo sapiens](Genbank Accession No.AC000397)を得た。NM_020469とAC000397の配列をもとに化学的に合成した配列番号28と29、30と31とを使用して、ヒト培養細胞HL−60(ATCC社)、U−937(ATCC社)、ASM(大日本製薬)、THP−1(ATCC社)から調製したゲノムDNAのHuman histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)ゲノムの部分配列の増幅をPCRにて行い、DNAシークエンスにてこの部分配列を決定した。Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)mRNA、completecds(Genbank Accession No.NM_020469)の261位と803位の配列を調べ、ABO式血液型の判定を行った。この結果を表2に示す。261位のヌクレオチドがGの場合、A型またはB型の血液型を示し、Gが欠失の場合、O型の血液型を示す。また、803位のヌクレオチドがGならAまたはO型の血液型を示し、CならB型の血液型を示す。
【0049】
【表2】
【0050】
一方、Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)遺伝子配列上で、ABOを規定する変異位置に塩基多型検出プローブを設定し、以下PCRのプライマーとして使用した。261位の変異検出は以下の様に行った。上記細胞から調製した5ngのゲノムDNAを含むPCR用チューブに、配列番号28記載のオリゴヌクレオチドを5’プライマー、配列番号42、43記載の塩基多型検出プローブのいずれかを3’プライマーとし、それぞれ最終濃度が0.4μMとなるように添加し、2μlのExpand High−Fidelity PCR Systemの反応バッファーと、適当な濃度のMgCl2と0.3μlのHiFi Taq polymeraseとを添加し、最終容量を20μlとした。これらPCR反応液をDNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)で95℃で3分、1cycle;95℃で30秒、66℃で30秒、72℃で2分、40cycles;72℃で5分間反応させた。PCR反応終了後、5μlの反応液を2%アガロースゲルにて電気泳動を行い、PCR産物の有無を確認した。この電気泳動の結果を図6に示す。803位の変異検出には、配列番号84、85記載の塩基多型検出プローブを5’プライマーとし、配列番号30記載のオリゴヌクレオチドを3’プライマーとして、261位の変異検出と同様の方法にて行った。その電気泳動の結果を図7に示す。図6及び図7から判定したABO血液型を表3に示す。表2と表3の結果が一致し、塩基多型検出プローブにてABO遺伝子の判定が可能であることが示された。
【0051】
【表3】
【0052】
【発明の効果】
本発明の塩基多型検出プローブは、容易にデザインすることが可能であり、また、従来のDNA合成機にて合成可能である。本発明にそってPCR法にて塩基多型を検出する際には、これを同一条件下で行うことが可能であり、精度良く塩基多型を検出することが可能である。
【0053】
【配列表】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
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【0100】
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【0140】
【0141】
【0142】
【0143】
【0144】
【0145】
【0146】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、スペーサー長の異なる塩基多型検出プローブでのPCRの結果を示す。 プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2 LAM0I5w(配列番号1);Lane3 LAM0I5m3(配列番号2);Lane4 LAM3I5w(配列番号3);Lane5 LAM3I5m3(配列番号4);Lane6 LAM5I5w(配列番号5);Lane7 LAM5I5m3(配列番号6);Lane8 LAM7I5w(配列番号7);Lane9 LAM7I5m3(配列番号8);Lane10 LAM9I5w(配列番号9);Lane11 LAM9I5m3(配列番号10)
【図2】図2は、核酸残基数の異なる多型検出プローブでのPCRの結果を示す。プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2 LAM1(配列番号12);Lane3 LAM5I7w(配列番号13);Lane4 LAM5I7m4(配列番号14);Lane5 LAM5I5w(配列番号5);Lane6 LAM5I5m3(配列番号6);Lane7 LAM5I3w(配列番号15);Lane8 LAM5I3m2(配列番号16);Lane9 LAM5I1w(配列番号17);Lane10 LAM5I1m1(配列番号18);Lane11 100bpラダー(GIBCO BRL);
【図3】図3は、検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の変異位置が異なる塩基多型検出プローブでのPCRの結果を示す。プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2 LAM1(配列番号12);Lane3 LAM5I5w(配列番号5);Lane4LAM5I5m1(配列番号19);Lane5 LAM5I5m2(配列番号20);Lane6 LAM5I5m3(配列番号6);Lane7 LAM5I5m4(配列番号21);Lane8 LAM5I5m5(配列番号22)
【図4】図4は、塩基多型検出プローブを使ったPCRによる培養細胞のHLAタイピングの結果を示す。プライマーは、使用した5’プライマーを示す。
Lane1 100bpラダー(GIBCO BRL);Lane2、4,6,8、5’プライマー:HLAex2−1−3I5a3(配列番号23);Lane3、5、7、9 HLAex2−1−3I5g3(配列番号24)。
【図5】図5は、RelatimePCRによる多型検出の結果を示す。HLA−A*0101、HLA−A*1101に特異的な塩基多型検出プローブをプライマーとしたRealtimePCR。5’プライマーを塩基多型検出プローブHLAex2−1−5I5a3(配列番号26)、または、HLAex2−1−5I5g3(配列番号27)のいずれか、3’プライマーには、HLA−A*0101、HLA−A*1101に共通のプライマー(配列番号25)を用いた。横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度を示した。
【図6】図6は、塩基多型検出プローブを使ったPCRの結果を示す。Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)の261位のアレルを検出する塩基多型検出プローブを用いたPCRの産物の電気泳動。5’プライマーとしてABO11(配列番号28)、3’プライマーとして塩基多型検出プローブABO8(配列番号42)、または、塩基多型検出プローブABO10(配列番号43)を用いた。
【図7】図7は、塩基多型検出プローブを使ったPCRの結果を示す。Human histo−blood A transferase(UDP−GalNAc)の803位のアレルを検出する塩基多型検出プローブを用いたPCRの産物の電気泳動。5’プライマーとして塩基多型検出プローブABO20(配列番号84)、または、塩基多型検出プローブABO22(配列番号85)、3’プライマーとしてABO13(配列番号30)を用いた。
Claims (18)
- 検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。
- 検出プローブ用オリゴヌクレオチドが3から9残基のオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の塩基多型検出プローブ。
- スペーサーがイノシンを含む、請求項1に記載の塩基多型検出プローブ。
- スペーサーがイノシンの重合体である、請求項1に記載の塩基多型検出プローブ。
- スペーサーが2から7残基のイノシンの重合体である、請求項4に記載の塩基多型検出プローブ。
- スペーサーが、少なくとも1種類以上の核酸誘導体およびその重合体を含む、請求項1に記載の塩基多型検出プローブ。
- スペーサーが2から7残基の核酸誘導体の重合体である、請求項6に記載の塩基多型検出プローブ。
- 標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが15から100残基のオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の塩基多型検出プローブ。
- 配列番号32から91の何れかに記載の塩基配列を有する、請求項1に記載の塩基多型検出プローブ。
- ABO式血液型判定のために用いる、請求項9に記載の塩基多型検出プローブ。
- 検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する方法であって、(a)検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも1つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から5’側または3’側に3核酸残基から100核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも1つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブを、検体核酸とハイブリダイズさせる工程;及び、
(b)検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出する工程;
を含む、上記の方法。 - 検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する、請求項11に記載の方法。
- 核酸合成酵素にて核酸伸長反応を行う、請求項12に記載の方法。
- 核酸伸長反応時に標識ヌクレオチドを基質に加え、核酸伸張の有無を標識ヌクレオチドにて検出する、請求項12に記載の方法。
- 核酸伸長反応時に発生するピロリン酸を検出して核酸伸長の有無を検出する、請求項12に記載の方法。
- 核酸伸長反応にて生じた二本鎖核酸をインターカレーターを用いて検出する、請求項12に記載の方法。
- 検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をFRET法にて検出する、請求項11に記載の方法。
- 配列番号32から91の何れかに記載の塩基配列を有する請求項1に記載の塩基多型検出プローブを用いる、ABO式血液型判定方法。
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