JPWO2016098595A1 - 一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ及び一塩基多型検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態のプローブは、一塩基多型を検出するレポーター領域と、アンカー領域と、リンカー領域と、を含む。本実施形態のプローブにおいて、レポーター領域及びアンカー領域の位置関係は、標的核酸において設定した第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列の位置関係に応じて、適宜設定することができる。例えば、第二の標的塩基配列が第一の標的塩基配列の3’側に位置するときは、アンカー領域はレポーター領域の5’側に配置される。
レポーター領域は、SNPを検出するための領域である。レポーター領域は、第一の標的塩基配列に対して、一塩基多型のヌクレオチドが第一のヌクレオチドのときには完全マッチし、第一のヌクレオチド以外のときにはミスマッチとなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。本明細書において、「第一のヌクレオチド」とは、標的核酸において、検出したいSNPが入りうる塩基のことである。例えば、第一のヌクレオチドが、SNPがないときの標的核酸のヌクレオチドである場合、レポーター領域は第一の標的塩基配列に対して、SNPが存在しないときには完全マッチとなりハイブリダイズし、SNPが存在するときにはミスマッチとなりハイブリダイズしない。
アンカー領域は、標的核酸においてSNPの有無に係らず、プローブが標的核酸に結合するための領域である。アンカー領域は、第二の標的塩基配列に対して、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する。第二の標的塩基配列に対して良好な結合性を得る観点から、アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さは、10〜20個のヌクレオチドが好ましく、12〜18個のヌクレオチドがより好ましく、15個のヌクレオチドが更に好ましい。
リンカー領域は、プローブの自由度を増加させるための領域である。リンカー領域は、レポーター領域及びアンカー領域を連結している。リンカー領域は、標的核酸における第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する。
本実施形態のプローブは、SNPを検出するレポーター領域に蛍光色素を有するため、その蛍光強度に基づいて、標的核酸におけるSNPの有無を検出することができる。
レポーター領域及びアンカー領域をリンカー領域で介することで得られる効果について、検証を行った。検出系には、Mycobacterium TuberculosisのrpoB遺伝子中の516番目のAsp(GAC)がVal(GTC)に置換するミスセンス変異を検出する系を用いた。長さを段階的に変えたSNP−オリゴDNA又はリンカー型SNP−オリゴDNAと、QProbe結合DNAとのハイブリダイズによる蛍光値の変化について解析した。QProbe結合DNAはSNPを有しているため、SNP−オリゴDNA又はリンカー型SNP−オリゴDNAは、完全マッチとなるときにSNPを検出でき、ミスマッチとなるときにSNPを検出できない系を用いた。
QProbe結合DNA:配列番号1の塩基配列を有するDNAにQProbe−3G(日鉄住金環境社製)を結合させたもの。
SNP−オリゴDNA:配列番号2〜11のいずれかの塩基配列を有するDNA。
リンカー型SNP−オリゴDNA:配列番号12〜21のいずれかの塩基配列を有するDNA。リンカーはアデニンを用いた。
ハイブリダイズ用バッファー:50mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl2、0.1% Tween−20。
10μM QProbe結合DNA0.1μL、10μM SNP−オリゴDNA又は10μM リンカー型SNP−オリゴDNA3.2μL、及びバイブリダイズ用バッファー16.7μLを混合し、8連チューブに20μLずつ分注し、サンプルを調製した。サンプルを、Mx3005P Real−Time PCR System(アジレントテクノロジー社製)を用いてTm解析を行い、99℃から25℃までの降温時の蛍光強度を測定した。降温速度は−2℃/30秒で行った。
SNP−オリゴDNAを用いたときの結果を図2に示す。6塩基の長さを持つ配列番号2及び3のSNP−オリゴDNAは、完全マッチ/ミスマッチのいずれの配列についてもQProbeの消光がみられなかった(図2(a))。これはSNP−オリゴDNAのTm値が低くすぎたため、この測定条件ではSNP−オリゴDNAとQProbe結合DNAとのハイブリダイズを検出できなかったと考えられる。一方、9〜10塩基の長さを持つ配列番号8〜11のSNP−オリゴDNAの場合は、完全マッチ/ミスマッチのいずれの配列についてもQProbeの消光がみられた(図2(d)、(e))。これは、逆にSNP−オリゴDNAのTm値が高く、一塩基置換の差ではQProbe結合DNAとSNP−オリゴDNAとのハイブリダイズの起こりやすさに影響を与えなかったためであると考えられる。7又は8塩基の長さを持つ配列番号4〜7のSNP−オリゴDNAを用いたときには、完全マッチの配列を有するSNP−オリゴDNAに対してのみQProbeの消光がみられた(図2(b)、(c))。このようなプローブであれば、一塩基の違いを認識できることになる。しかしながら、このプローブは完全マッチのときに消光し始める温度が40℃と低く、実験環境によっては消光が観察されない可能性も考えられた。
QProbe結合プローブを設計するに当たり、プローブと標的核酸とをハイブリダイズするためのアンカー領域の配列、及びリンカー領域の長さを検討した。
QProbe結合DNA:配列番号22の塩基配列を有するDNAにQProbeを結合させたもの。
リンカー型SNP−オリゴDNA:4塩基からなるレポーター領域と、20塩基からなるアンカー領域とを含むオリゴDNAであり、配列番号23又は24の塩基配列を有するDNAをベースとして、様々な長さのインターバル及びリンカーを有する。レポーター領域は、配列番号23又は24における37〜40番の塩基配列であり、アンカー領域は、レポーター領域からインターバルの塩基数の分だけ、5’側にある20塩基である。ここでいうインターバルとは、配列番号23又は24の塩基配列を有するDNAにおいて、レポーター領域及びアンカー領域を設定する際のレポーター領域の5’末端からアンカー領域の3’末端までの塩基数をいう。リンカーはアデニンを用いた。
ハイブリダイズ用バッファー:50mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl2、0.1% Tween−20。
各種合成DNA及びリンカー型QProbe結合プローブを用いたこと以外は、実施例1に記載の方法と同様に行った。
QProbe結合DNA及び各種リンカー型SNP−オリゴDNAを用いたときのTm解析の結果のうち、25℃において、完全マッチ及びミスマッチ間の蛍光強度の差が大きいオリゴDNAをスクリーニングし、その測定結果をまとめたものを図4に示す。この結果から、インターバルの長さ及びリンカーの長さは、0よりも長い方がSNPの判別能に優れるが、長すぎても判別能が低下することがわかった。つまりインターバルの長さ及びリンカーの長さのうち片方のみを設定するのではなく、両者の長さのバランスをとることが重要であることが示された。中でも、リンカーの長さに対し、−3〜+3ほどの長さのインターバルを設定することで、完全マッチ/ミスマッチ間の蛍光強度の差が大きくなり、SNPの判別能に優れることが明らかになった。
実施例2の結果を受けて設計したリンカー型QProbe結合プローブを用いて、各種合成DNAとハイブリダイゼーションを行い、SNPの判別能を検討した。
合成DNA:配列番号23、25、27又は29の塩基配列を有し、リンカー型QProbe結合プローブと完全マッチするDNA、あるいは配列番号24、26、28又は30の塩基配列を有し、リンカー型QProbe結合プローブとミスマッチするDNA。
リンカー型QProbe結合プローブ:配列番号31〜34のいずれかの塩基配列を有するヌクレオチドにQProbeを結合させたプローブ。
ハイブリダイズ用バッファー:50mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.0)、0.1% Tween−20。
各種合成DNA及びリンカー型QProbe結合プローブを用いたこと以外は、実施例1に記載の方法と同様に行った。
試験結果を図5に示す。すべてのリンカー型QProbe結合プローブは、25℃付近において、対応する合成DNAに対する完全マッチ及びミスマッチの蛍光強度に顕著な差が生じた。特に、GST A1遺伝子を用いたときに完全マッチ及びミスマッチの蛍光強度の差が大きく、SNPの判別能が高かった。そのため、今後の実験系ではGST A1遺伝子を用いることにした(図5(b))。
短い塩基配列を有するQProbe結合プローブ(GST−QP−short)、長い塩基配列を有するQProbe結合プローブ(GST−QP−long)、リンカー領域を有するQProbe(GST−QP−linker)をそれぞれ作製し、GST遺伝子に対するSNPの判別能を、LAMP法を用いて測定した。
鋳型GST−DNA:配列番号35の塩基配列を有するDNA(GST−PM)又は配列番号36の塩基配列を有するDNA(GST−MM)。
QProbe結合プローブ:GST−QP−short、GST−QP−long、GST−QP−linker。
LAMP用プライマー:配列番号37〜40のいずれかの塩基配列を有するプライマー。
LAMP用マスターミックス:50mM KCl、20mM Tricine(pH8.8)、1.4mM dNTPs、8mM Mg2SO4、0.1% Tween−20、0.2μM GST−F3 primer 、0.2μM GST−B3 primer、2.4μM GST−FIP primer、0.8μM GST−BIP primer、16U Bst pol.。
LAMP用マスターミックス19.75μLと10μMの各種QProbe結合プローブ0.25μLを混合し、8連チューブに20μLずつ分注した。8連チューブにコントロール用DNAを5.0μL添加した。配列番号35又は36の鋳型DNAを95℃で5分間処理し、変性させた。変性させた配列番号35又は36の鋳型DNAを105cps/test又は103cps/testになるように8連チューブに添加した。リアルタイム濁度計測器LA−200(テラメックス社製)を用いて、8連チューブを65℃、1時間インキュベートさせてLAMP法を行った。反応中、濁度をリアルタイムに測定し、Tt値を求めた。Tt値は、各検体が濁度0.1に到達するまでの時間(分)を示す。
GST−PM又はGST−MMを鋳型とした場合、リアルタイム濁度測定におけるTt値には差がないことを確認した(図6)。したがって、GST−PM及びGST−MMを用いたLAMP法による増幅効率には、差がないことが分かった。
リンカー領域を有するQProbe結合プローブを用いて、PCR法によるSNPの検出を行った。
鋳型GST−DNA:配列番号35の塩基配列を有するDNA(GST−PM)又は配列番号36の塩基配列を有するDNA(GST−MM)。
QProbe結合プローブ:GST−QP−short、GST−QP−long、GST−QP−linker。
PCR用プライマー:配列番号43又は44の塩基配列を有するプライマー。
PCR用バッファー:1×Pwo Super yield Buffer、0.2mM dNTPs、1U Pwo Super yield pol.、0.5×Gelgreen。
各種PCR用プライマー0.2μL、及びPCR用バッファー14.8μLを混合し、8連チューブに15μLずつ分注した。8連チューブにコントロール用DNAを5.0μL添加した。配列番号35又は36の鋳型DNAを103cps/testになるように8連チューブに添加した。Mx3005P Real−Time PCR Systemを用いて、下記の条件で反応を行った。(1)95℃、2分、(2)95℃、15秒、(3)53℃、30秒、(4)72℃、45秒で反応を行い、(2)〜(4)の工程は50サイクル繰り返した。反応後のPCR産物に、0.25μMの各種QProbe結合プローブを5.0μL添加し、Mx3005P Real−Time PCR Systemを用いてTm解析を行った。Tm解析は、99℃から25℃までの降温時の蛍光強度を測定した。降温速度は−2℃/30秒で行った。
蛍光インターカレーターである0.5×Gelgreenを用いて、鋳型DNAの増幅を測定した(図8)。その結果、GST−PM又はGST−MMを鋳型にしたPCR法による増幅効率は、差がないことが分かった。
Claims (6)
- 一塩基多型が存在する標的核酸に対して用いられる一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記標的核酸が、一塩基多型が存在する領域である第一の標的塩基配列と、前記第一の標的塩基配列の3’又は5’側に位置し、一塩基多型が存在しない領域である第二の標的塩基配列と、を含み、
前記プローブが、一塩基多型を検出するレポーター領域と、アンカー領域と、リンカー領域と、を含み、
前記レポーター領域が、前記第一の標的塩基配列に対して、一塩基多型のヌクレオチドが第一のヌクレオチドのときには完全マッチし、前記第一のヌクレオチド以外のときにはミスマッチとなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、前記第一の標的塩基配列及び前記レポーター領域がハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素と、を有し、
前記アンカー領域が、前記第二の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、
前記リンカー領域が、前記レポーター領域及び前記アンカー領域を連結しており、前記標的核酸における前記第一の標的塩基配列及び前記第二の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する。 - 前記レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さが、前記アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短い、請求項1に記載のプローブ。
- 前記リンカー領域が、ユニバーサル塩基を含まない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1又は2に記載のプローブ。
- 前記リンカー領域が、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンのいずれか1種の塩基のみからなるオリゴヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプローブ。
- 前記リンカー領域が、3〜11個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプローブ。
- 一塩基多型を検出するための方法であって、
請求項1〜5のいずれか一項に記載のプローブ及び一塩基多型が存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程と、
前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸の一塩基多型の有無を検出する工程と、を備える方法。
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