CN106566871A

CN106566871A - 基于不对称as2-pcr的基因变异检测方法及引物

Info

Publication number: CN106566871A
Application number: CN201510654829.8A
Authority: CN
Inventors: 黄新华; 戴慧清; 李冰
Original assignee: Shanghai Based Biopharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Ren Dong Medical Laboratory Limited
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2015-10-12
Publication date: 2017-04-19

Abstract

本发明公开了一种基于不对称AS2‑PCR的基因变异检测方法，步骤包括：1)提取样本DNA；2)扩增待测基因片段；3)将扩增产物加到不对称AS2‑PCR反应体系中，进行PCR扩增反应和探针外切反应；所述AS2‑PCR反应体系含有2条带荧光标记的通用标签信号探针、2条正向引物、1条反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR缓冲液；4)检测反应的荧光信号，计算两个通道的Ct差值，并根据Ct差值判断待测基因SNP。本发明还公开了用于上述方法的不对称AS2‑PCR寡核苷酸引物组及其用途。本发明通过设计不对称AS2‑PCR的引物，克服了传统AS2‑PCR假阳性率高的问题，提高了基因变异检测的准确性。

Description

基于不对称AS2-PCR的基因变异检测方法及引物

技术领域

本发明涉及DNA检测技术领域，特别是涉及组织、血液中的DNA位点突变检测，更具体地说，是涉及用不对称AS2-PCR实时、定点检测基因变异的方法，以及该方法所用的引物。

背景技术

基因科学是生物科学的一个重要领域，生命体的基因密码序列及其变异会影响生命体的多种生物功能和功能变异，通过检测基因SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)，可以了解和预估生命体的功能变异。当前，检测基因SNP已成为分析判断遗传病、药物反应特征的重要手段，也是预测和预防许多生命疾病的重要手段，例如，糖尿病等内分泌疾病，以及各种肿瘤的易感因素。

目前，基因SNP的检测方法主要有毛细管电泳测序法、Taqman探针法、等位基因特异PCR法(AS2PCR)和通用探针实时荧光PCR。

毛细管电泳测序法是基因变异检测的经典可靠方法，但需要使用昂贵的测序仪，检测成本较高，而且测序仪的操作使用和维护都比较复杂，因此大多数城市的医院和科研单位都没有配备测序仪。

Taqman探针法也是一种经典方法。Taqman探针法以两条15—25bp的探针片段中的1个碱基的微小杂交温度差异来鉴定目标位点的一个碱基的差异，这种方法的缺点是：1)探针的筛选比较困难，一般一对探针需要经过多次筛选，才能选出较为合适的探针，而且经常遇到多次筛选不成功的情况；2)检测一个基因的SNP需要两个特异探针，因此成本较高；3)不是定点识别，因此对单碱基突变检测的灵敏性和特异性不高，容易出现假阴性或假阳性。

等位基因特异PCR法(AS2-PCR)，经过人们改良后，其非特异性扩增有所降低，但PCR产物的鉴定，如果采用电泳来鉴定大小片段的有无，这种终点检测，容易将纯合型误判为杂合型，导致假阳性率较高；如果采用荧光法鉴定，就需要采用SYBgreen，并分两管检测，比较荧光起跳的循环数，这样带来了管间差异，也易造成纯合型误判为杂合型，导致假阳性率较高。

通用探针实时荧光PCR是Yuanli Zhang等2003年在Nucleic Acids Research首次提出的方法，涉及的通用探针技术是在某一普通引物5’端连接一段约20bp的寡核苷酸，这一寡核苷酸称为通用模板，可以和通用探针互补杂交，而后探针被外切而产生信号。这种方法的缺陷是：1、引物和探针就可触发外切而产生信号，产物多时信号强度高，产物少时，信号强度也可能高，无产物时，也可能产生信号，而且起始信号波动较大，加样时间到上机时间间隔越长，这种影响越大。因此，不能直接或完全反应PCR产物的量和性质，从而会影响检测的准确性。

KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)，即竞争性等位特异性PCR，已有十多年历史，现已广泛用于基因变异检测。其优点是采用独有的通用探针，在开发检测试剂时，方便快捷，成本低。KASP的原理是：采用2条通用荧光探针、2条通用淬灭探针，1条荧光探针和其对应的淬灭探针构成1个组合，共两个组合4条探针，再加2条位点特异探针来检测1个SNP位点的两个类型。具体检测方法可参见图1所示：第1步位点特异PCR扩增，使用2条带通用标签的位点特异PCR引物和1条对侧引物进行位点特异PCR反应，如图1所示，模板与可互补的(3'末端能配对的)PCR引物进行退火，并发生扩增，扩增出带有标签序列的PCR产物，这步完成SNP识别；第2步通用标签探针PCR扩增，应用2条荧光标记通用信号标签特异引物与第1步PCR产物上的标签互补扩增，同时，体系中还有2条淬灭标记的片段序列与荧光标记通用信号标签引物互补杂交，淬灭荧光信号。经过接下来几轮的PCR扩增，一方面淬灭探针被切碎，另一方面荧光引物更多地退火到新合成的、没有淬灭基团的互补链上，发出荧光，通过低温55度检测荧光，就可以检出SNP位点上的碱基类型。这种检测方法，优点是通用探针体系和特异的位点特异引物(带有标签生成序列)，位点特异引物体系首先起作用，进行位点特异PCR反应，而后需要通用探针体系中的标签通用引物对带有标签序列的位点特异PCR的产物进行扩增反应，然后探针体系才能产生信号，所以通用探针体系中既是探针体系，又是引物体系。荧光探针也是引物，比淬灭探针长约20bp，其3’端起引物作用。所以是一个接力PCR反应。这种反应的缺点是：一是接力PCR比较复杂，一步操作需要优化浓度差，困难较大，容易实验失败，或结果错误；分步操作就需要外切第一轮的剩余引物，再进行第二轮PCR，干扰因素少，但操作复杂；二是第二轮的PCR引物和探针杂交，在前期时，探针必然因杂交而被外切产生位点无关信号，就成了非特异信号，非特异信号越高，越容易判错；三是第一轮PCR和第二轮PCR在多个循环中同时进行，相互有干扰，会影响检测结果。

公开号为CN104404162A、名称为“采用引物关联通用探针检测多重基因或不同靶标的实时荧光PCR方法”的中国专利申请，采用了通用探针设计，其通用探针是与产物杂交，与Kasp方法不同，但仍未摆脱接力PCR的限制，其位点特异引物设置了三个区域，从3’端到5’端约需要60—70bp，分别安排了天然特异引物段、探针序列段和通用引物段。在第1轮扩增中不可能产生信号，在第2轮的扩增中，第2轮引物从自身的5’端向3’端延伸中外切探针产生信号，信号直接完全与产物关联。该方法的缺点是：1、仍然是复杂的接力PCR，需要引物浓度差的优化；2、有相当多的循环，是两个PCR反应同时发生，优化复杂，容易产生错误结果或导致实验失败。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种基于不对称AS2-PCR的基因变异检测方法，该方法准确性高，操作简便，成本低。

为解决上述技术问题，本发明的基于不对称AS2-PCR的基因变异检测方法，包括以下步骤：

1)提取样本DNA；

2)以所述DNA为模板，扩增待测基因片段；

3)将步骤2)的产物加入到不对称AS2-PCR反应体系中，进行AS2-PCR扩增反应和探针外切反应；所述AS2-PCR反应体系含有2条带荧光标记的通用标签信号探针、2条AS2-PCR正向引物、1条AS2-PCR反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR缓冲液；所述AS2-PCR反向引物的量多于所述AS2-PCR正向引物的量；

4)检测步骤3)的反应产生的荧光信号，计算两个通道的Ct值和Ct差值，根据Ct差值判断待测基因的SNP。

其中，每条AS2-PCR正向引物包括天然特异序列区段、标签信号序列发生区段和酶结合点发生区段。所述天然特异序列区段靠近3’端，序列长度为18～28bp，该天然特异序列区段的序列与待测基因片段预扩增产物(即步骤2)的产物)中的同等长度的一段序列互补。所述标签信号序列发生区段位于中间，序列长度为15～25bp，该段序列与所述通用标签信号探针的序列完全相同，作用是在不对称AS2-PCR的扩增产物中形成一段与通用标签信号探针互补的序列。所述酶结合点发生区段靠近5’端，序列长度为5～25bp，GC含量为0～30％，作用是在不对称AS2-PCR扩增产物中形成与所述有外切活性的聚合酶相结合的部位。

所述通用标签信号探针为MGB探针，序列长度为15～25bp，一端标记荧光基团(FAM、VIC、Rox或Cy5等)，另一端标记MGB，起淬灭作用。

步骤3)中，每条AS2-PCR正向引物与AS2-PCR反向引物的摩尔数之比为1：10～1：100，较佳的为1：50。

在步骤3)的反应过程中，由于不对称AS2-PCR扩增反应中反向引物多于正向引物，因此在不对称AS2-PCR扩增产物中会存在大量单链产物。因为该单链产物与通用标签信号探针互补杂交不会被竞争干扰，所以在该单链产物与通用标签信号探针高效互补杂交后，就会被聚合酶外切而产生相应的荧光检测信号。

步骤4)，将两个通道中的任意一个通道设定为参照通道，用另一个通道的Ct值去减所述参照通道的Ct值，得到两个通道的Ct差值；若Ct差值在设定的杂合判定值范围内，则判定为杂合型；若Ct差值高于设定的杂合判定值范围，则判定为参照通道的基因纯合型，若Ct差值低于设定的杂合判定值范围，则判定为另一通道的基因纯合型。所述判定值范围依不同基因的引物体系，通过多次实验确定。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于上述不对称AS2-PCR基因变异检测方法的寡核苷酸引物组。

为解决上述技术问题，本发明的不对称AS2-PCR的寡核苷酸引物组，包括2条AS2-PCR正向引物和1条AS2-PCR反向引物，所述正向引物包括天然特异序列区段、标签信号序列发生区段和酶结合点发生区段。

所述天然特异序列区段靠近3’端，序列长度为18～28bp；所述标签信号序列发生区段位于中间，序列长度为15～25bp；所述酶结合点发生区段靠近5’端，序列长度为5～25bp，GC含量为0～30％。

与现有技术相比，本发明的检测方法具有以下优点和有益效果：

1.与毛细管电泳测序法相比，本发明的检测方法，不需要PCR后的纯化和上机前的纯化，只需要在实时荧光定量PCR仪上实时检测即可，如此不仅操作简单方便，可以对多个基因同时扩增，再进行鉴定，大幅节省检测时间和人工成本，而且由于不需要高价购买荧光标记ddNTP，因此还可节省材料成本(材料成本只需3元人民币)。

2.与Taqman探针法相比，本发明采用了两种带标签信号序列的特异引物分别与两种基因型杂交，实现了点对点的鉴定，因此对基因SNP检测的特异性和灵敏性更高，同时本发明由于应用的是通用的MGB标签信号探针，只需更换天然区段的序列即可，不需合成和筛选探针，因此成本也大幅度降低。

3.与常规等位基因特异PCR法(AS2-PCR)相比，既不需要电泳鉴定，也不需要分两管鉴定，不仅操作方便，而且假阳性大幅度降低，准确度大幅度提高。

4.与通用探针实时荧光PCR相比，本发明产生的信号直接并完全与PCR产物的性质和数量相关，不会产生产物无关信号，所以更加准确，能完全代表产物的性质和数量。

5.与基因芯片法相比，本发明实时的点对点的鉴定检测，特异性更高，比基因芯片法的终点法检测的准确性高，同时还免去了基因芯片制备、杂交、扫描的过程，因此更加方便、灵活。

6.与KASP方法及公开号为CN104404162A的中国专利申请披露的方法相比，本发明是一个单纯PCR，只需要一个PCR引物系统，不像KASP和公开号为CN104404162A的中国专利申请是复杂的接力PCR，需要2个PCR引物系统。由于本发明没有接力PCR的相互干扰，因此产生的信号直接并完全与产物相关。同时，由于不对称PCR正反向引物量之比比较固定，因此也更容易优化。

附图说明

图1是KASP检测原理示意图；

图2是本发明的不对称AS2-PCR基因变异检测方法原理图。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图和实施例，对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1BDNF基因的变异分型检测

1.样本DNA的提取

取适量的口腔黏膜，用试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司提供)提取其基因组DNA。

2.预扩增PCR

以所提取的DNA为模板，对该DNA中的BDNF基因片段进行PCR预扩增。

预扩增PCR引物的序列为：

BDNF-F：AAACATCCGAGGACAAGGTG (SEQ NO.1)

BDNF-R：AGAAGAGGAGGCTCCAAAGG (SEQ NO.2)

预扩增PCR反应体系为：10×PCR缓冲液1.5μL，25mM Mg²⁺1.2μL，10mM dNTP 0.3μL，甜菜碱(Betaine)2μL，DNA模板1μL，0.1μM正向引物1μL，5μM反向引物1μL，5U/μL100μM通用标签信号探针1μL，5U/μl rtaq DNA聚合酶0.2μL，H₂O 5.8μL，总体积15μL。

预扩增PCR反应条件如表1所示：

表1 预扩增PCR反应条件

3.实时荧光检测AS2-PCR

实时荧光AS2-PCR正向引物为：

野生型(通道1，FAM荧光)

BDNF-W：ACACCCACTTCACTCCTCTGGTCCTGC-TTGGCTGACACTTTCGAACATG (SEQ NO.3)

突变型(通道2，VIC荧光)

BDNF-M：ACACCCACTTGTGCTCTCCAGGGACTC-TTGGCTGACACTTTCGAACATA (SEQ NO.4)

实时荧光AS2-PCR反向引物为：

BDNF-R1：GGTCCTCATCCAACAGCTCT (SEQ NO.5)

实时荧光通用标准信号探针：

FAM-MGB：FAM-CACTCCTCTGGTCCTGC-MGB (SEQ NO.6)

VIC-MGB：VIC–GTGCTCTCCAGGGACTC-MGB (SEQ NO.7)

上述引物和探针由上海百力格生物技术有限公司合成。

取预扩增PCR产物2μl作为实时荧光AS2-PCR的DNA模板。

实时荧光检测AS2-PCR反应体系为：10×PCR缓冲液1.5μL，25mM Mg²⁺1.2μL，10mM dNTP0.3μL，甜菜碱(Betaine)2μL，DNA模板1μL，0.1μM正向引物1μL，5μM反向引物1μL，5U/μL 100μM通用标签信号探针1μL，5U/μl rtaq DNA聚合酶0.2μL，H₂O 5.8μL，总体积15μL。

实时荧光检测AS2-PCR反应条件如表2所示：

表2 实时荧光检测AS2-PCR反应条件

反应结束后，实时荧光PCR系统直接得到如下表3所示结果：

表3 实施例1的实时荧光检测AS2-PCR反应结果

反应孔	通道	Ct	Ct差	基因型
					C3	1	6.18	-3.4	CC
C3	2	9.58
					D3	1	5.50	0.56	CT
D3	2	4.94
					E3	1	6.45	0.98	CT
E3	2	5.47

基因型判别方法：计算两个通道Ct值差，Ct差在0～2范围，判断为杂合CT型；Ct差在-0.1～-5范围，判断为纯合CC型；Ct差在2.1～5范围，判断为杂合TT型。

用一代测序法验证上述基因型判定结果的准确性，结果表明，表3的基因型判定结果与一代测序法测出的基因型结果完全吻合。

实施例2BDNF、GRIN2B复合基因的SNP检测(复合PCR预扩增后单管鉴定)

1.样本DNA的提取

取适量的人口腔上皮黏膜细胞(由JANPA DNA BASED TESTING Co.Ltd.提供)，提取其基因组DNA。

2.PCR预扩增

以所提取的DNA为模板，对该DNA中的BDNF、GRIN2B基因片段进行PCR复合扩增。

复合PCR反应的引物序列如下：

BDNF-F：AAACATCCGAGGACAAGGTG (SEQ NO.1)

BDNF-R：AGAAGAGGAGGCTCCAAAGG (SEQ NO.2)

GRIN2B-F：CACAATCAACAAGACATGAAACA (SEQ NO.8)

GRIN2B-R：AGGAATGGAGATTTGGTGGA (SEQ NO.9)

上述引物由上海百力格生物技术有限公司合成。

PCR反应体系和反应条件同实施例1中的预扩增PCR。

3.实时荧光检测AS2-PCR

1)BDNF检测管

正向引物：

野生型(通道1，FAM荧光)：

BDNF-W：ACACCCACTTCACTCCTCTGGTCCTGC-TTGGCTGACACTTTCGAACATG (SEQ NO.3)

突变型(通道2，VIC荧光)：

BDNF-M：ACACCCACTTGTGCTCTCCAGGGACTC-TTGGCTGACACTTTCGAACATA (SEQ NO.4)

反向引物：

BDNF-R1：GGTCCTCATCCAACAGCTCT (SEQ NO.5)

通用标准信号探针：

FAM-MGB：FAM-CACTCCTCTGGTCCTGC-MGB (SEQ NO.6)

VIC-MGB：VIC–GTGCTCTCCAGGGACTC-MGB (SEQ NO.7)

PCR反应体系和反应条件同实施例1中的实时荧光检测AS2-PCR。

2)GRIN2B检测管

正向引物：

突变型(通道1，FAM荧光)：

GRIN2B-W：ACACCCACTTCACTCCTCTGGTCCTGC-TCCCCTACTCTTGGTCCTT (SEQ NO.10)

野生型(通道2，VIC荧光)：

GRIN2B-M：ACACCCACTTGTGCTCTCCAGGGACTC-TCCCCTACTCTTGGTCCTC (SEQ NO.11)

反向引物：

GRIN2B-R1：TCTGCTAGGAGCATAAAAGGA (SEQ NO.12)

通用标准信号探针：

FAM-MGB：FAM-CACTCCTCTGGTCCTGC-MGB (SEQ NO.6)

VIC-MGB：VIC–GTGCTCTCCAGGGACTC-MGB (SEQ NO.7)

PCR反应体系和反应条件同实施例1中的实时荧光检测AS2-PCR。

反应结束后，实时荧光PCR系统直接得到如下表4所示结果：

表4 实施例2的实时荧光检测AS2-PCR反应结果

基因型判别方法：

BDNF变异基因型判断标准：两个通道Ct值差在0～2范围，判断为杂合CT型；Ct值差在-0.1～-5范围，判断为纯合CC型；Ct值差在2.1～5范围，判断为杂合TT型；

GRIN2B变异基因型判断标准：两个通道Ct值差在0～-3.5范围，判断为杂合CT型；Ct值差在-3.6～-5范围，判断为纯合TT型；Ct值差在0.1～5范围，判断为杂合CC型。

用一代测序法验证上述基因型判定结果的准确性，结果表明，表4的基因型判定结果与一代测序法测出的基因型结果完全吻合。

Claims

1.基于不对称AS2-PCR的基因变异检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样本DNA；

2)以所述DNA为模板，扩增待测基因片段；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，每条AS2-PCR正向引物包括天然特异序列区段、标签信号序列发生区段和酶结合点发生区段，所述标签信号序列发生区段的序列与所述通用标签信号探针的序列完全相同。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述天然特异序列区段靠近3’端，序列长度为18～28bp；所述标签信号序列发生区段位于中间，序列长度为15～25bp；所述酶结合点发生区段靠近5’端，序列长度为5～25bp；所述通用标签信号探针的序列长度为15～25bp，一端标记荧光基团，另一端标记MGB。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酶结合点发生区段GC含量为0～30％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，每条AS2-PCR正向引物与AS2-PCR反向引物的摩尔数之比为1：10～1：100。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)，每条AS2-PCR正向引物与AS2-PCR反向引物的摩尔数之比为1：50。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)，将两个通道中的任意一个通道设定为参照通道，用另一个通道的Ct值去减所述参照通道的Ct值，得到两个通道的Ct差值；若Ct差值在设定的杂合判定值范围内，则判定为杂合型；若Ct差值高于设定的杂合判定值范围，则判定为参照通道的基因纯合型，若Ct差值低于设定的杂合判定值范围，则判定为另一通道的基因纯合型。

8.不对称AS2-PCR的寡核苷酸引物组，其特征在于，包括2条AS2-PCR正向引物和1条AS2-PCR反向引物，所述正向引物包括天然特异序列区段、标签信号序列发生区段和酶结合点发生区段。

9.根据权利要求8所述的寡核苷酸引物组，其特征在于，所述天然特异序列区段靠近3’端，序列长度为18～28bp；所述标签信号序列发生区段位于中间，序列长度为15～25bp；所述酶结合点发生区段靠近5’端，序列长度为5～25bp，GC含量为0～30％。

10.根据权利要求9所述的寡核苷酸引物组，其特征在于，2条正向引物的序列分别如SEQ NO.3～4所示，反向引物的序列如SEQ NO.5所示；或者，2条正向引物的序列分别如SEQNO.10～11所示，反向引物的序列如SEQ NO.12所示。