CN104894247B - 与大白菜cca1基因编码区突变相关的功能性标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记，包括：与区分5'端6bp插入相关的功能性标记，分别命名为5‑InDel‑W150和5‑InDel‑m156，5‑InDel‑W150的片段大小为150bp，如SEQ ID No.1所示，5‑InDel‑m156的片段大小为156bp，如SEQ ID No.2所示；与区分3'端6bp插入相关的功能性标记，分别命名为3‑InDel‑W133和3‑InDel‑m139，3‑InDel‑W133的片段大小为133bp，如SEQ ID No.3所示，3‑InDel‑m139的片段大小为139bp，如SEQ ID No.4所示。本发明为培育耐抽苔大白菜提供了辅助选择的工具，同时也可用于大白菜种质资源鉴定。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

Description

与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记及其应用
技术领域
本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及两个与大白菜光周期调控关键基因CCA1编码区突变的功能性分子标记及其应用。
背景技术
大白菜(Brassica rapa L.ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物，原产于中国，在世界各地尤其是东南亚广泛种植。目前，已经育成了适合春、夏、秋不同季节栽培的大白菜新品种，使得大白菜实现了周年供应，这对保证蔬菜市场供应、稳定物价起到了积极的作用。
在不同季节栽培的大白菜品种中，春白菜对品种耐抽苔性的要求最高，主要是因为春白菜栽培季节面临前期环境低温和后期环境日照较长的影响。如果春白菜品种的耐抽苔能力不强，则前期低温极易使幼苗通过春化，导致后期叶球内短缩茎较长、甚或已经抽薹，从而影响产品的商品价值和品质。所以，春白菜育种的关键是拥有极耐抽薹的育种材料以及获得与耐抽苔特性紧密连锁的分子标记，以提高春白菜的育种效率。
目前，与大白菜抽薹开花相关的分子标记报道主要有：【卓祖闯.大白菜耐抽薹性状遗传规律分析及其分子标记的筛选.西北农林科技大学硕士学位论文；郁有健.大白菜抽薹开花相关基因SNP分析与晚抽苔开花性状QTL定位.东北农业大学硕士学位论文；高颖，罗双霞，王彦华，顾爱侠，赵建军，陈雪平，申书兴.大白菜抽薹开花时间与SSR和InDel标记的关联分析.园艺学报.2012,39(6):1081-1089】，但上述研究所得到的标记要么是数量性状位点，要么连锁程度不够紧密，很难用于育种辅助选择。因此，有必要寻找基于抽薹开花途径关键基因突变的位点特异性分子标记，以提高选择的精准度。
大白菜与模式植物拟南芥亲缘关系较近，同属于芸薹属，因此拟南芥抽薹开花机制研究的有关结果可以为大白菜相关研究提供借鉴。对模式植物拟南芥的研究结果表明：植物开花受四条途径控制，即自主途径、赤霉素途径、春花途径和光周期途径。四条途径并非彼此相互独立，而是通过一些整合基因形成一个复杂的调控网络，协同控制拟南芥的开花【徐雷,贾飞飞，王利琳.拟南芥开花诱导途径分子机制研究进展.西北植物学报.2011,31(5):1057-1065】。在光周期控制的开花途径中，起关键作用的是光受体及其介导的信号传导，拟南芥基因组中的光受体有3类，即光敏色素、隐花色素和向光色素，其中光敏色素和隐花色素参与光周期调节的植物开花【赵淑清,罗志鹏,李昱.拟南芥光周期调控开花的研究进展.山西大学学报(自然科学版).2009,32(2):308-314】，其中的光周期调节涉及相互连锁的反馈环(Pruneda-Paz and Kay,An expanding universe of circadian networks inhigher plants.Trends Plant Sci.2010，15：259-265)，起关键作用的是光周期调控因子CCA1、LHY和TOC1。已有研究表明，CCA1是一个MYB类转录因子，其突变后直接影响拟南芥感受光周期的响应能力，减少拟南芥的昼夜节律振幅、缩短了光周期。所以，研究CCA1基因对了解光周期依赖的植物开花途径有重大意义。对CCA1的结构分析表明：N端第11-82位氨基酸残基是MYB结构域，与DNA结合有关(Zhi-Yong Wang,David Kenigsbuch,Lin Sun,EitanHarel,May S.Ong,Elaine M.Tobin，A Myb-Related Transcription Factor 1s lnvolvedin the Phytochrome Regulation of an Arabidopsis Lhcb Gene,The Plant Cell,1997,9,491-507)；N端第136-316位氨基酸残基与蛋白二聚化有关；C端是磷酸化调节区(Xavier Daniel,Shoji Sugano,Elaine M.Tobin，CK2phosphorylation of CCA1isnecessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis，PNAS，2004,101:3292–3297).因此关键区域氨基酸突变都有可能影响上述功能区，从而影响其介导的光周期开花响应。
大白菜全基因测序工作已经完成【Wang et al.,2011，the genome of themesopolyploid crop species Brassica rapa.Nature Genetics.43(10):1035-103)】，通过与拟南芥全基因比较，其相关功能基因的预测和注释也已完成并制作成BRAD数据库【Cheng F,Liu S,Wu J,Fang L,Sun S,Liu B,Li P,Hua W,Wang X.BRAD,the geneticsand genomics database for Brassica plants.BMC Plant Biol.2011,11:136】，其中对开花基因的注释有专门的检索菜单。在大白菜基因组中有一个拷贝的CCA1编码基因，位于第五染色体。我国有适合不同季节栽培的大白菜种质资源，其抽薹开花性状差异较大，其中不乏长、短日照条件下开花时间存在显著差异的材料，但至今未见有关光周期响应调节因子CCA1突变与开花时间的有关报道。
插入/缺失多态性(Insertion/Deletion，InDel)标记是由于同一位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。由于这种标记直接位于功能基因内部，有可能导致所编码蛋白的结构变异和功能差异，因此又称为功能性标记。InDel标记的检测手段因插入片段大小而定，插入片段较大的(大于50bp)一般采用操作简单的琼脂糖凝胶顶用分离、而插入片段较小的(小于30bp)一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，前者操作简单、后者操作繁琐。然而高分辨率琼脂糖可以实现4-6bp差异片段的检测。
鉴于在模式植物拟南芥中发现的CCA1突变对抽薹开花时间影响的相关结果，推测在大白菜中也存在类似突变控制的晚开花突变体资源，因此，有必要对我国丰富的大白菜资源在CCA1位点进行筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。
发明内容
针对目前大白菜在CCA1基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明的目的是提供一种与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记，以及用于鉴别上述功能性标记的引物。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先对两份开花时间存在显著差异的大白菜自交系材料He102(长、短日照下开花早)和06-247(长、短日照下开花晚)进行全基因组重测序，从测序结果中分析发现二者光周期响应因子CCA1编码区存在差异，即易抽薹大白菜资源He102中获得的CCA1基因编码区存在小片段插入突变，与BRAD数据库中Chiifu401大白菜的CCA1相比，其在编码区330bp和1416bp之后分别插入6个碱基。因此，可以开发成用于大白菜CCA1基因编码区突变检测的功能性标记。
与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记，包括：与区分5'端6bp插入相关的功能性标记，分别命名为5-InDel-W150(野生型)和5-InDel-m156(突变体)，5-InDel-W150(野生型)的片段大小为150bp，如SEQ ID No.1所示，5-InDel-m156(突变体)的片段大小为156bp，如SEQ ID No.2所示；
与区分3'端6bp插入相关的功能性标记，分别命名为3-InDel-W133(野生型)和3-InDel-m139(突变体)，3-InDel-W133(野生型)的片段大小为133bp，如SEQ ID No.3所示，3-InDel-m139(突变体)的片段大小为139bp，如SEQ ID No.4所示。
用于鉴别5'端6bp插入相关的功能性标记的引物为：
正向引物PF5：5'-CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3'；(如SEQ ID No.5所示)。
反向引物PR5：5'-CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3'；(如SEQ ID No.6所示)。
用于鉴别3'端6bp插入相关的功能性标记的引物为：
正向引物PF3：5'-TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3'；(如SEQ ID No.7所示)。
反向引物PR3：5'-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3'；(如SEQ ID No.8所示)。
所述与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记的筛选过程如下：
(1)以长/短日照下大白菜早花自交系He102与晚花自交系06-247为材料，提取两者基因组DNA；
(2)依据测序结果发现的突变位点，在突变位点两侧保守区设计引物，引物序列分别如SEQ ID No.5-SEQ ID No.8所示，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测；
(3)将扩增产物克隆后进行测序验证，结果与全基因组重测序一致，即野生型在靠近编码区5'-端和3'-端的扩增产物分别比突变体少6个碱基。对来自5'-端和3'-端的野生型和突变体标记分别进行了命名，即5'-端野生型命名为5-InDel-W150，突变体命名为5-InDel-m156；3'-端野生型命名为3-InDel-W133，突变体命名为3-InDel-m139，字母W和m后的数字表示标记片段的大小。
上述与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记及其用于鉴别该功能性标记的引物在大白菜种质资源鉴定和辅助育种中的应用。
具体应用方法为：
利用SEQ ID No.5-SEQ ID No.8所示的引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物采用电泳检测扩增片段的大小，如果扩增出150bp和133bp的条带，则为晚抽薹类型；扩出156bp和139bp的条带，则为早抽薹类型；如果同时扩出150/156bp和133/139bp的四条带，则为杂合型。
对于杂合型个体应视情况而定：如果杂合型材料是一份资源，则表明该资源在此位点不纯，需要继续自交分离，直至在其后代中获得纯合晚抽苔类型；如果是回交转育后代，则继续选择杂合型个体为母本，用纯合晚抽苔类型的花粉给其授粉，经过6～8代转育后，最后再自交一次，即可将早抽薹类型的材料改造成晚抽苔类型。如果扩不出条带，可能是基因组DNA提取的不纯或该材料在此位点发生了其它类型的突变。
进行PCR扩增的反应体系，每20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfubuffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mM dNTPmix；1个标准单位的TransStartFastPfu DNA聚合酶(TransGen AP221)。
PCR循环条件：95℃预变性5分钟；接着是95℃变性30秒，58.5℃退火30秒，72℃延伸10秒，35～38个循环，最后72℃延伸5分钟。
电泳检测采用的是操作简单的高分辨率琼脂糖凝胶电泳。本发明所用的高分辨率琼脂糖为常规的市售产品。
本发明采用特异位点扩增技术从两份开花时间存在显著差异的大白菜自交系材料He102(长、短日照下开花早)和06-247(长、短日照下开花晚)的基因组DNA中分别克隆到了CCA1基因5'端编码区约150bp和3'端编码区约140bp的四段DNA序列，将来自两份材料的DNA片段与BRAD数据库中相应的基因组序列进行比对发现：来自晚开花材料06-247的两个DNA片段与BRAD数据库中的序列完全一致，而来自极早开花材料He102中的序列则在该区域存在小片段的插失，与全基因组测序结果一致，称其为cca1。在插入部位两侧的保守区域设计引物，开发了区分该种等位变异的两个共显性功能性标记。为了验证该标记的可用性，我们用设计的引物扩增了申请人创制的一系列大白菜自交系资源，结果表明该标记对纯合cca1和野生型CCA1的鉴别准确率达100％。
本发明的有益效果：
(1)由于大白菜光周期调控因子CCA1的作用机制比较复杂，除了自身具有转录因子活性、直接与DNA结合外，其发挥作用尚需正确的磷酸化修饰、形成同源或异源(与LHY)二聚体，本发明鉴别的两处突变中一处位于二聚化蛋白-蛋白相互作用结构域、一处位于磷酸化修饰区域，这些区域的突变都可能影响其功能，导致大白菜光周期依赖的抽薹开花时间发生改变。本发明根据插入区域两侧保守序列设计两对引物，通过对基因组DNA进行PCR扩增，用高分辨率琼脂糖就能很容易区分野生/突变类型，避免了聚丙烯酰胺凝胶的繁琐操作过程。该标记不仅可用于对大白菜种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料，还可以用于对杂交后代进行标记辅助选择，以转育晚花性状。
(2)本发明获得的与CCA1基因编码区突变直接相关的共显性功能性标记，结果准确、稳定、操作简便。适用于不同遗传背景大白菜材料的筛选，是一个普遍性标记，它能够准确鉴定大白菜种质资源在该位点的基因型，极大地提高了大白菜种质资源在CCA1位点等位变异的鉴定效率。
(3)在大白菜CCA1基因序列及突变体研究方面，国内外未见相关报道。本发明鉴定了CCA1基因编码区5'-端和3'-端两处突变点，其中与晚花有关变异类型的野生型标记可以为培育耐抽苔大白菜提供辅助选择的工具，同时也可以用于大白菜种质资源鉴定。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。
(4)当多个位点的突变位于不同的材料中时，可以通过本发明的标记辅助选择手段将多位点突变聚合在一起，创造极耐抽薹的大白菜新种质。
(5)本发明所设计的用于与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记鉴别的引物序列，并非是常规的引物设计方法所能得到的，本发明的引物设计综合考虑了插入片段的长度、突变位点之间的距离、扩增片段的长度、高分辨率琼脂糖分辨率等因素，由于插入片段的长度仅为6bp，两处突变位点相差1000bp以上，扩增片段只有介于100-200bp才能在3％的高分辨率琼脂糖上实现有效分离，因此设计了两组引物，分别用于5'端6bp插入相关的功能性标记的鉴别和3'端6bp插入相关的功能性标记的鉴别。
附图说明
图1为特异引物在06-247(泳道1、3)与He102(泳道2、4)中扩增结果的高分辨率琼脂糖检测结果；(1、2对应引物PF5/PR5；3、4对应引物PF3/PR3)，M(图1中最右侧泳道)为DNA分子量标准DL2000；
图2为引物组合PF5/PR5和PF3/PR3在06-247与He102中的扩增序列比对结果；(A：引物组合PF5/PR5的扩增序列比对；B：引物组合PF3/PR3的扩增序列比对；图中可以明显看出He102的两段序列都插入6个碱基)；
图3为所开发标记对大白菜资源的检测结果(A：PF5/PR5对8份资源的检测；B：PF3/PR3对8份资源的检测结果。W/m为野生型/突变体对照)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：不同大白菜自交系材料中含CCA1突变位点的DNA片段克隆及共显性功能性标记的开发
1.1大白菜基因组DNA提取
(1)将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入0.6ml预热至65℃的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液，融化后，剧烈振荡混匀样品，65℃水浴放置40-60分钟使细胞裂解；
(3)裂解结束后，取出样品使其完全冷却至室温。加入等体积的氯仿(chloroform)，轻轻颠倒使混匀，室温放置10分钟；
(4)室温，12000rpm离心15分钟；
(5)用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，室温沉淀10min；
(6)4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；
(7)DNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；
(8)重复用75％乙醇洗涤一次DNA沉淀；
(9)去上清，DNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，DNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的10mM的Tris.HCl，pH8.0使沉淀溶解(可放于4℃冰箱溶解过夜)；
(10)紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测DNA浓度及质量。
1.2含CCA1突变位点的DNA片段克隆及测序
(1)根据测序数据提供的基因ID号，检索BRAD数据库中相应基因组序列信息，在插入突变位点两侧设计引物如下：
5'端突变正向引物PF5：5'-CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3'；(如SEQ ID No.5所示)。
5'端突变反向引物PR5：5'-CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3'；(如SEQ ID No.6所示)。
3'端突变正向引物PF3：5'-TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3'；(如SEQ ID No.7所示)。
3'端突变反向引物PR3：5'-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3'；(如SEQ ID No.8所示)。
引物的合成委托华大基因有限公司完成。
(2)PCR扩增：在20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfu buffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mM dNTPmix；1个标准单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶(TransGen AP221)。PCR循环条件：95℃预变性5分钟；接着是95℃变性30秒，58.5℃退火30秒，72℃延伸10秒，35～38个循环，最后72℃延伸5分钟。
(3)PCR产物的电泳检测：
PCR结束后，取10μlPCR扩增产物加入1μl 10×loading buffer，在3％的高分辨率琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后EB染色，自动凝胶成像系统观察拍照。结果如图1。
(4)PCR产物的克隆测序及序列分析
电泳确认目的条带被扩增后，取1μl PCR扩增产物加1μl pEasy-Blunt(TransGenCB101)载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen：CD501)，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取阳性克隆委托北京华大基因有限公司进行DNA序列的测定。
测序结果表明，引物组合PF5/PR5从06-247与He102中分别扩增得到150和156bp条带，二者测序结果比对如图2所示。
1.3功能性标记的获得
由于最初引物设计就是基于06-247与He102的序列差异，因此得到的四段序列就是四个标记，即耐抽苔06-247中的两段，一段位于5'-端，片段大小150bp，命名为5-InDel-W150，如SEQ ID No.1所示，一段位于3'-端，片段大小133bp，命名为3-InDel-W133，SEQ IDNo.3所示；另两段来自极早花突变体材料He102，位于5'-端的片段大小156bp，命名为5-InDel-m156，如SEQ ID No.2所示，位于3'-端的片段大小139bp，命名为3-InDel-m139，SEQID No.4所示。
实施例2：功能性标记对不同遗传背景的大白菜资源的检测
(1)大白菜资源各单株基因组DNA提取采用CTAB法，具体操作同实施例1中的1.1；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增所用的反应体系、扩增条件同实施例1中1.2的步骤(2)；
(3)对扩增产物进行电泳检测，检测方法同实施例1中1.2的步骤(3)，检测结果如图3所示，A是PF5/PR5对16份资源的检测；B是PF3/PR3对8份资源的检测结果。W/m为野生型/突变体对照。)
由图3可以看出：1号和8号单株的突变类型同He102，5'-端和3'-端同时发生插入突变；2、3、6号单株5'-端为突变型，3'-端为野生型；4、5、7单株5'-端为野生型，3'-端为突变型。两套引物综合使用，可以实现对资源的精准鉴定。

Claims (10)

1.一种与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记，其特征在于，包括：与区分5'端6bp插入相关的功能性标记，分别命名为5-InDel-W150和5-InDel-m156，5-InDel-W150的片段大小为150bp，如SEQ ID No.1所示，5-InDel-m156的片段大小为156bp，如SEQ ID No.2所示；
与区分3'端6bp插入相关的功能性标记，分别命名为3-InDel-W133和3-InDel-m139，3-InDel-W133的片段大小为133bp，如SEQ ID No.3所示，3-InDel-m139的片段大小为139bp，如SEQ ID No.4所示。
2.用于鉴别权利要求1所述的与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记的引物，其特征在于，用于鉴别5'端6bp插入相关的功能性标记的引物为：
正向引物PF5：5'-CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3'，如SEQ ID No.5所示；
反向引物PR5：5'-CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3'，如SEQ ID No.6所示；
用于鉴别3'端6bp插入相关的功能性标记的引物为：
正向引物PF3：5'-TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3'，如SEQ ID No.7所示；
反向引物PR3：5'-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3'；如SEQ ID No.8所示。
3.权利要求1所述的与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记的筛选方法，其特征在于，步骤如下：
(1)以长/短日照下大白菜早花自交系He102与晚花自交系06-247为材料，提取两者基因组DNA；
(2)依据测序结果发现的突变位点，在突变位点两侧保守区设计引物，引物序列分别如SEQ ID No.5-SEQ ID No.8所示，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测；
(3)将扩增产物克隆后进行测序验证，结果与全基因组重测序一致，即野生型在靠近编码区5'-端和3'-端的扩增产物分别比突变体少6个碱基。
4.权利要求1所述的与大白菜CCA1基因编码区突变相关的功能性标记在大白菜种质资源鉴定和辅助育种中的应用。
5.如权利要求2所述的引物在大白菜种质资源鉴定和辅助育种中的应用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，应用方法为：利用权利要求2所述的引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物采用电泳检测扩增片段的大小，如果扩增出150bp和133bp的条带，则为晚抽薹类型；扩出156bp和139bp的条带，则为早抽薹类型；如果同时扩出150/156bp和133/139bp的四条带，则为杂合型。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，进行PCR扩增的反应体系，每20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfu buffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mMdNTPmix；1个标准单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR循环条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58.5℃退火30秒，72℃延伸10秒，35～38个循环，最后72℃延伸5分钟。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，电泳检测采用的是高分辨率琼脂糖。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述高分辨率琼脂糖为3％的高分辨率琼脂糖。
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