KR102201499B1 - 탄저병 저항성 식물체 선발용 분자마커 및 이의 이용 - Google Patents

탄저병 저항성 식물체 선발용 분자마커 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄저병 저항성 식물체를 판별하기 위한 분자마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 탄저병 저항성 분자마커의 제공으로 탄저병 저항성을 나타내는 품종의 작물을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있고, 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 선별한 탄저병 저항성 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 작물 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

탄저병 저항성 식물체 선발용 분자마커 및 이의 이용{Molecular marker to select anthrocnose resistance of plants and use thereof}
본 발명은 탄저병 저항성 식물체를 판별하기 위한 분자마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 탄저병 저항성 식물체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물, 및 키트와 이를 이용하여 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법 등에 관한 것이다.
최근 차세대 염기서열 분석법의 발달에 따라 염기서열 분석 비용이 절감되어 식물의 염기서열 분석 또한 빠르게 진행되고 있으며, 박과 식물의 경우 오이, 멜론, 수박의 전장 염기서열이 공개되었다. 수박의 경우 최근 게놈의 서열분석을 통한 게놈서열 기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 이를 기반으로한 다량의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 정보의 결과로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 분자마커로서의 활용도가 증가되고 있다. 과거 전통육종에서는 원하는 형질의 게놈부위를 교배육종을 통해 형질도입을 하였는데, 이를 확인하기 위해서 해당 표현형까지 관찰하기 위해서는 노동력과 시간이 많이 걸리는 문제점이 있었다. 이를 해결하기 위해 원하는 형질과 연관된 분자마커의 개발이 이루어 지고 있으며, 나아가 개발된 마커로 유묘기때 개체를 선발하여 노동력 절감, 육종효율 증진, 및 육종기간 단축을 위한 연구 개발이 이루어지고 있다. 이와 같이 분자마커를 이용하여 특정 질병 저항성 작물을 판별하는 방법에 관하여 한국공개특허 제10-2016-0056219호에서 개시하고 있다.
한편, 탄저병은 탄저병균의 감염에 의하여 생기는 식물의 병해다. 고추, 벼, 콩, 오이, 국화과 등의 작물과 감나무, 매화나무, 복숭아나무, 감귤나무, 밤나무, 사과나무 등의 과수에서 탄저병균의 기생에 의해서 발생할 수 있다. 발병시 작물에 따라 증상이 다소 차이가 있으나, 잎에서는 담갈색 또는 갈색의 유원형 병반을, 과실 등에서는 갈색 또는 암갈색의 움푹 패인 원형 병반을 만들고, 후에 병반 표면에 분홍색의 특징이 있는 점질물(분생포자의 덩어리)이 생성되어 작물의 재배와 생산의 감소에 막대한 영향을 주고 있다.
현재까지 탄저병 방제는 주로 화학 농약에 의존하여 왔으나, 화학 농약의 사용은 점진적으로 탄저병의 약제 저항성을 증대시켜 농약의 효율성을 떨어뜨리게 되며, 결국 방제를 위해 과다한 화학 농약 살포를 필요로 하게 된다. 이로 인해, 과실에 높은 잔류 농약이 검출되고 화학 농약을 기피하는 소비자들에게 농약 사용 과채류가 기피되고 있는 실정이다.
이에, 탄저병 저항성 작물의 육종이 시급한 상황이며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다. 한편, 탄저병은 특히 박과 식물에서 빈번하게 발생하는데, 박과 식물은 오이, 참외, 수세미, 호박, 수박, 멜론, 동아, 여주 등 주요 작물을 포함하고 있다는 점에서, 탄저병 저항성 개체의 육종에 대한 필요가 높다.
한국공개특허 제10-2016-0056219호
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 탄저병 저항성 식물체를 판별하기 위한 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 탐지할 수 있는 조성물, 및 상기 SNP 마커를 탐지하여 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 상기 SNP에 의해 치환된 아미노산에 의해, 단백질의 구조적 변화를 예상하였으며, 식물체의 LRR 단백질을 구성하는 아미노산 치환을 탐지하는 제제를 포함하는 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물과 상기 치환된 아미노산 잔기를 탐지하는 단계를 포함하는 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법 등을 제공하는 것에 목적이 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 350번째 염기에 위치하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 350번째 염기 타입을 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 식물체는 박과(Cucurbitaceae) 식물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 박과 식물은 오이(Cucumis sativus), 참외(makuwa), 수세미(Luffa cylindrical), 호박(Cucurbita moschata), 수박(Citrullus lanatus), 멜론(Cucumis melo), 동아(Benincasa cerifera), 및 여주(Momordica charantia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물일 수 있으며, 바람직하게는 수박일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 제제는 프라이머, 프라이머 세트, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 탄저병 저항성 식물체 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 판별하고자 하는 식물체로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b) 상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 350번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 단계를 포함하고, 상기 식물체는 박과 식물인 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구현예로서, 상기 박과 식물은 오이, 참외, 수세미, 호박, 수박, 멜론, 동아, 및 여주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물일 수 있으며, 바람직하게는 수박일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (b) 단계는 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 7의 18번째 아미노산을 잔기를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 8의 18번째 아미노산 잔기를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 식물체는 쌍떡잎식물강(Magnoliopsida) 식물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 쌍떡잎식물강 식물은 박과(Cucurbitaceae), 콩과(Fabaceae), 또는 대극과(Euphorbiaceae) 식물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(arginine) 또는 리신(lysine)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 제제는 항체 또는 압타머일 수 있다.
또한, 본 발명은 식물체의 LRR(leucine-rich repeat) 단백질의 서열번호 7로 이루어진 모티프에서 18번째 아미노산 잔기를 검출하는 단계를 포함하는 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 식물체의 LRR(leucine-rich repeat) 단백질의 서열번호 8로 이루어진 모티프에서 18번째 아미노산 잔기를 검출하는 단계를 포함하는 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 식물체는 쌍떡잎식물강 식물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 쌍떡잎식물강 식물은 콩과, 박과, 또는 대극과 식물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 상기 18번째 아미노산 잔기가 리신(lysine)인 경우 식물체를 탄저병 저항성 개체인 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 식물체의 탄저병 저항성 유전자좌에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 SNP 마커와 탄저병 저항성 메커니즘에 작용하는 LRR 모티브의 아미노산 서열 변이 등에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 탄저병 저항성 분자마커의 제공으로 탄저병 저항성 계통 및 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 샘플로부터 바로 저항성 유무를 확인하여, 탄저병 저항성을 나타내는 품종의 작물을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있으므로, 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 선별한 탄저병 저항성 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 작물 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 Collectotrichum 균의 ITS 서열에 따라 구분되는 균주(strain)을 나타낸 것이다.
도 2는 C. orbiculare Race1 접종시 DrHs7250, Oto9491, 및 F1 집단의 표현형을 확인한 사진이다.
도 3은 탄저병 저항성 SNP 마커를 발굴하기 위한 실험을 개괄한 도면이다.
도 4a는 GBS를 이용하여 발굴한 SNP를 기초로한 F2 집단의 1, 2, 3, 4, 및 5번 염색체 지도를 나타낸 도면이다.
도 4b는 GBS를 이용하여 발굴한 SNP를 기초로한 F2 집단의 6, 7, 9, 10, 및 11번 염색체 지도를 나타낸 도면이다.
도 4c는 GBS를 이용하여 발굴한 SNP를 기초로한 F2 집단의 8번 염색체 지도를 나타낸 도면이다.
도 4d는 유전자형과 DSI 사이의 단일 요인 연관성 분석을 통해 탄저병 저항성 유전자좌가 8번 염색체의 0-51.8 cM 영역에 위치함을 확인한 도면이다.
도 5a는 QTLseqR을 이용한 BSA 분석의 결과도면으로 delta-SNP 지수를 계산한 그래프이다.
도 5b는 QTLseqR을 이용한 BSA 분석의 결과도면으로 예상되는 G’ 지수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 탄저병 저항성 유전자좌의 후보영역을 나타낸 도면이다. BSA와 dela-SNP 지수를 분석하여 발굴한 6개의 후보영역은 노란색과 보라색으로 표시하였으며, 12개의 후보 SNP는 빨강색으로 표시하였다. 상기 보라색으로 표시된 영역은 최종 CL14-27-76를 포함하는 영역이다.
도 7은 F2 집단과 F3 집단에서 12개의 후보 SNP를 검증하기 위한 HRM 분석 결과 도면이며, 최종 CL14-27-76를 포함하는 영역이다.
도 8a는 41개의 상업용 수박 재배종에서 CL14-27-76 SNP를 검증하기 위한 HRM 분석 결과 도면이다.
도 8b는 18종의 야생종 수박 에서 CL14-27-76 SNP를 검증하기 위한 HRM 분석 결과 도면이다.
도 9는 생어 염기서열분석을 이용한 CL14-27-76 SNP 부근의 1kb의 DNA 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 10은 8번 염색체의 CL14-27-76 SNP 부근의 1kb의 DNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸 도면으로, non-synonymous SNP는 빨간색으로 표시하였다.
도 11은 C. orbiculare 접종 전 후의 저항성 및 감수성 계통에서 Cla001017 유전자 발현량의 변화를 확인한 도면이다.
도 12는 Cla001017의 병렬상동 단백질 탐색 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 LRR 도메인에서 CL14-27-76 SNP의 위치를 나타낸 도면으로, CL14-27-76 non-synonymous SNP는 Cla001017 단백질의 617 번째 아미노산임을 알 수 있다.
도 14는 88개 종에서 병렬상동 LRR 단백질을 기준으로 작성한 계통수이다.
도 15a는 18개 과(Family)에서 LRR 도메인 서열을 기준으로 작성한 계통수 이다.
도 15b는 serine/threonine-protein kinase fls2를 주형으로한 Cla001017의 LRR 도메인 서열의 3D 구조 예측도이다.
도 15c는 HMM-HMM 정렬을 이용하여 LRR 도메인 구조를 예측한 도면이다. LRR 도메인의 N-말단은 파란색으로 나타내었으며, C-말단은 빨강색으로 나타내었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 식물체의 탄저병 저항성 유전자좌에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 SNP 마커와 탄저병 저항성 메커니즘에 작용하는 LRR 모티브의 아미노산 서열 변이 등에 관한 것으로서, 상기 SNP 마커 또는 아미노산 서열 변이를 검출하여 탄저병에 저항성을 갖는 식물체를 판별할 수 있다.
본 발명자들은, 구체적인 실시예를 통해서, 국립농업유전자원센터에서 분양받은 균주의 ITS 서열을 분석하여 상기 균주가 C. orbiculare CL14-27임을 확인하고, 상기 균주를 다양한 수박 품종에 접종하여 C. orbiculare Race 1임을 확인하였다(실시예 1 참조). 이에 확인된 균주를 탄저병 저항성 계통(DrHs7250), 감수성 계통(Oto9491), 및 이들을 양친으로 하는 F1 집단과, BC1P1(F1을 P1에 역 교배), BC1P2 (F1을 P2에 역 교배) 및 F3 집단을 제조하고, DrHs7250, Oto9491, 및 F2 집단의 GBS 분석을 통해 탄저병 저항성에 기여하는 후보 영역으로 8번 염색체의 0-14.878 Mbp 영역을 발굴하였으며, BSA 시퀀싱과 delta-SNP 지수 비교를 통해 상기 영역 내에서 6개의 후보 영역을 추발하였다(실시예 2 참조).
또한, 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해서, 상기 영역 내에서 12개의 프라이머 세트를 제작하여 HRM 분석을 통해 후보 영역 내의 SNP를 검증하고자 하였으며, 그 결과, CL14-27-76 SNP를 통해 F2 집단과 41개의 상업용 재배종에서 탄저병 저항성 개체를 완벽하게 판별할 수 있음을 확인하였다. 한편, 토종 수박에서는 생어 염기서열 분석을 통해 상기 SNP에 의해 탄저병 저항성이 결정됨을 확인하였으며, 특히 CL14-27-76 SNP에 의해 탄저병 저항성 개체의 식별이 보다 명확함을 확인할 수 있었다(실시예 3 참조).
이에, 본 발명자들은 서열번호 1의 350번째 염기(CL14-27-76 SNP)를 탄저병 저항성 식물체를 판별하기 위한 SNP 마커로 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 SNP 마커는, 서열번호 1의 염기서열 내에서 350번째 염기에 위치하는 염기가 (G->A)인 경우, 탄저병에 대한 저항성이 있는 개체인 것으로 판별할 수 있는바, 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 분자마커로 사용함으로써 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 상기 SNP 마커를 탐지하는 제제를 이용한 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물과, 식물체의 DNA샘플로부터 상기 SNP 마커를 검출하여 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 SNP 마커를 탐지하는 제제는 변이된 염기에 결합할 수 있는 프로브, 압타머, 또는 상기 SNP를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성된 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있는 프라이머 및/또는 프라이머 세트일 수 있으며, 상기 SNP 마커를 검출하여 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정 등의 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 HRM 또는 생어 염기서열분석 방법에 의할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 3개의 CL14-27-76 SNP 마커는 Cla001017 영역에 위치하는바, 본 발명자들은 상기 SNP에 의한 유전적 변이가 유전자 발현에 영향을 미치고, 상기 유전자 발현의 변화가 탄저병 저항성 메커니즘의 활성화에 영향을 미친다는 가정을 세우고, C. orbiculare 접종 전/후의 저항성 및 감수성 계통의 유전자 발현량을 확인하였다. 그 결과, 감수성 계통과 비교하여 저항성 계통의 Cla001017 의 발현량이 월등히 높았으며, 병원균 자극에 의해 그 발현이 더욱 증가됨을 확인할 수 있었다(실시예 4 참조). 상기로부터, CL14-27-76 SNP가 유전자 발현에 영향을 미치고, 변화된 유전자 발현 패턴에 의해 탄저병 저항성 메커니즘이 활성화됨을 알 수 있다.
한편, 상기 Cla001017는 CC-NBS-LRR 단백질을 암호화 하는 유전자이며, LRR 도메인은 식물계에서 선천적 면역력과 병원균에 대한 방어력에 기여함이 알려져 있다. LRR(Leucine-rich repeat) 단백질은 보존적인 부분(highly conserved segment: HCS)과 가변적인 부분(variable segment: VS)로 나눌 수 있으며, 보존적인 부분은 일반적으로 LxxLxLxxN/CXL의 잔기를 갖는 모티프를 구성하고, 상기 모티프는 외부로 노출된 β-가닥을 형성하고, 특히 상기 모티프에서 xxLxLxx 잔기는 리간드와 결합하는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 CL14-27-76 non-synonymous SNP와 LRR 단백질을 진화론적으로 분석하여 식물계 전역에 걸쳐 병렬상동 단백질(orthologues protein)을 탐색하였으며, 같은 clade에 속하는 박과(Cucurbitaceae), 목화속(Gossypium), 및 참깨속(Sesamum) 식물과 이와는 다른 clade에 속하는 콩과(Fabaceae) 식물에서 CL14-27-76 SNP에 의해 발생하는 아미노산 변이와 동일한 위치에서 아르기닌 또는 리신이 발현됨을 확인하였다(실시예 5 참조). 상기로부터 LRR 단백질에 기초한 수박의 탄저병 저항성 메커니즘이 다른 쌍떡잎식물에서도 동일하게 기능함을 알 수 있었다. 이어진 계통 분석과 진화론적 LRR 모티프 분석을 통해 다양한 쌍떡잎식물에서 LRR 모티프의 아미노산 서열변이를 통해 탄저병 저항성을 판별할 수 있으며, 특히 박과 식물과 콩과 식물에서 큰 의미를 제공할 수 있음을 알 수 있다(실시예 6 참조).
따라서, 본 발명자들은 서열번호 7 또는 8의 18번째 아미노산을 잔기를 검출하여 쌍떡잎식물강에 속하는 식물체의 탄저병 저항성 유무를 판별할 수 있으며, 특히 상기 아미노산 잔기가 리신인 경우 탄저병 저항성 개체임을 알 수 있다.
보다 구체적으로, 박과식물, 특히 수박에서 LRR 모티프는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 8의 18번째 아미노산 잔기가 리신인 경우 탄저병 저항성 개체인 것으로 판별할 수 있다.
본 명세서에서 "단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism: SNP) 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 LRR 모티프 아미노산 서열의 변이 또는 탄저병 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 “탄저병(Anthrocnose)”은 콜레트트리쿰속(Colletotrichum)에 속하는 곰팡이균에 의한 식물의 질병으로서, 상기 균은 옥수수, 딸기, 감귤류, 바나나, 사탕수수, 일반적인 콩 및 박과 식물 등 넓은 숙주 범위를 가진다. 콜레트트리쿰속 중에서 C. orbiculare 종은 주로 박과 식물에 감염되어 탄저병을 유발하는 것으로서 숙주에 따라 3가지 Race로 분류된다. Race 1의 경우 오이와 수박에서 다양한 증상을 나타내며, 특히 오이에서 심각한 병징을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 “쌍떡잎식물강(Magnoliopsida)” 식물은 상기 모티프가 보존된 LRR 단백질을 발현하는 것이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 서열번호 7으로 이루어진 보존적인 모티프를 갖는 LRR 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 상기 쌍떡잎식물강에 속하는 식물은 박과, 콩과, 및 대극과 식물을 포함한다.
본 명세서에서 “박과(Cucurbitaceae)” 식물은 뚜껑덩굴속(Actinostemma), 동아속(Benincasa), 수박속(Citrullus), 오이속(Cucumis), 호박속(Cucurbita), 돌외속(Gynostemma), 박속(Lagenaria), 수세미오이속(Luffa), 새박속(Melothria), 여주속(Momordica), 산외속(Schizopepon), 왕과속(Thladiantha), 하늘타리속(Trichosanthes)을 포함한다.
본 명세서에서 “수박(Citrullus lanatus: watermelon)”은 한반도에서 재배되거나 혹은 품종 개량을 목적으로 육종된 수박을 의미하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 “콩과(Fabaceae)” 식물은 실거리나무아과(Caesalpinioideae), 미모사아과(Mimosoideae), 콩아과(Faboideae)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드” 또는 “폴리뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 (폴리)뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도, 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15bp 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브”는 DNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 변이된 염기의 존재 여부를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 및 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 상기 프로브는 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 “HRM(High resolution melting)” 분석 방법은 PCR 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 90℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다.
본 발명에서 “생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)” 방법은 ddNTP (di-deoxynucleotidetriphosphate)를 이용하여 PCR을 수행하고, ddNTP에 의한 chain-termination 원리에 따라 증폭 산물을 전기영동하여 염기서열을 분석하는 방법을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 식물 품종 및 매핑 집단(mapping population)
본 실험에서는 이용된 저항성 계통 DrHs7250, 감수성 계통 Oto9491은 파트너 종묘(안성, 한국)에서 분양받아 사용하였다. F1, F2, 및 F3 분리집단은 상기 DrHs7250과 Oto9491을 교잡하여 획득하였으며, 이외의 품종은 국립원예특작과학원 (완주, 한국) 및 국립농업유전자원센터 (완주, 한국)에서 제공받아 이용하였다.
2. 탄저병원균의 준비
Colletotrichum orbiculare 분리 균주는 국립농업유전자원센터에서 분양받아 인공적으로 수박에 접종하여 병원성을 회복시켰다. 감염된 상기 수박의 배축 표면을 멸균하고, 작은 조각으로 절단하여, 감자 덱스트로스 한천배지(potato dextrose agar: PDA; Difco Lab., USA)에서 28℃, 암 조건하에 4일간 배양하였다. 이어서, 새로운 PDA 배지에 배양된 병원균을 28℃ 생육온도에서 빛이 있는 조건에서 12시간 동안 배양하고, 다시 빛이 없는 조건에서 10일 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 분리, 배양하여 ITS(internal transcribed spacer) 영역의 시퀀스를 분석하였으며, 접종원의 농도는 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 현미경을 통해 확인하였다. Collectotrichum 속의 ITS 서열에 따른 strain 분류는 도 1에 나타내었다.
3. 병원성 분석(Pathogenicity assay)
분리된 C. orbiculare 균주의 Race를 확인하기 위하여, 4개 품종(Charleston Gray, Congo, Fairfax, 및 New Hampshire Midget)의 수박의 잎에 5×105 spore/mL 농도의 상기 균주를 공중에 분사하여 접종하였다.
탄저병 저항성 유전자양상을 분석하기 위하여, 탄저병 저항성 DrHs7250(Female)과 감수성 Oto9491(Male)을 교배하여 F1, F2, BC1P1, 및 BC1P2 계통을 획득하였으며, 각 식물을 24 ± 3 ℃, 12 시간 광주기 조건의 성장실에서 저온살균된 상업용 토양 혼합물 (peatmoss : perlite = 1 : 1, v/v)을 이용하여 7-10일 동안 재배하였다. 이어서, 상기 계통의 식물을 25-28℃ 온도 및 70-100% 상대습도 하의 조건에서 48시간 동안 배양하여 곰팡이 포자를 유도하고, 다시 상기 성장실의 조건하에서 재배하였다. 탄저병 저항성은 질병 중증도 지수 (disease severity index: DSI)를 사용하여 0-5점으로 평가하였다.
4. GBS 라이브러리 구축 및 저항성 유전자좌 탐색
각 개체에서 어린 잎을 분리하여 DAN가 추출될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 이어서, 개량된 CTAB (cyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 게놈 DAN를 분리하였다. 분리된 DNA는 전기영동(2% 아가로스 겔), 분광 광도계 (DeNovix DS-11; DeNovix, USA) 및 dsDNA 검출 분석 키트(Quant-iT ™, Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 정량 분석 및 정성 분석하였으며, PCR 및 염기서열 분석에 이용되었다. 각 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. Elshire의 방법을 이용하여 GBS(Genotyping By Sequencing) 라이브러리를 제작하였으며, Hiseq2000 플랫폼 (Illumina, Inc., USA)을 이용하여 상기 라이브러리의 염기서열을 분석하였다. 로(raw)데이터는 BWA v0.5.9-r16을 이용하여 수박 97103을 참조 게놈(reference genome)으로 하여 매핑되었다. 보다 구체적으로, F2개체의 각 샘플을 ApeKI endonuclease (C/WGC) (New England Biolabs, Ipswitch, MA)로 분해하고, 분해된 조각들을 구별 가능한 바코드 어댑터에 부착하였다. 부착된 생성물을 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 정제하고, adaptor-specific primer set와 Takara Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japan)을 이용하여 PCT 증폭을 수행하였다. 증폭산물은 2 % 아가로오스 겔 (Agarose SFR TM, Amresco, USA)에 로딩하여 GBS 라이브러리의 적절한 증폭을 확인하였고, BioAnalyzer 2100 (Agilent, USA)을 이용하여 adaptor dimer를 제외한 DNA의 길이가 170-350 bp임을 확인하였다. 상기 GBS 라이브러리는 Hiseq2000 sequencing platform(Illunmina)을 이용하여 시퀀싱되었으며, Raw fastq 파일을 기반으로, Cucurbit Genome Database의 수박 97103을 참조 게놈으로 하여 매핑하여 각 염색체별 VCF(variant calling format)을 제작하였다.
5. GBS 라이브러리를 이용한 유전자 지도 제작 및 유전자 연관 분석
TASSEL-GBSv2 (http://www.maizegenetics.net/tassel)을 이용하여 유전자 분석을 수행하였다. MAF (minor allele frequency)는 0.02로 설정하였다. minimum mapping quality = 30, minimum base quality = 20, minimum coverage = 7, 및 missing genotype <= 0.3의 필터링 조건하에서 VCF 파일을 필터링 하였으며, 검출된 SNP는 TASSEL-GBS을 사용하여 유전자형 ‘a, b, h’로 변환하였다. 'a'와 'b'는 parental homozygous genotypes을 나타내고, ‘h’는 F2 자손의 유전자 지도 작성을 위한 이형 접합체를 나타낸다. F2 집단에서 동일한 염기서열 비율이 91% 이상일때 SNP는 동형 접합체 유전자형 'a' 또는 'b'로 변환하였고, 'h'의 이형 접합 유전자형은 각각의 SNP에서 0.25에서 0.75까지의 대체 서열 비율에 의해 결정하였다. 상기 SNP를 기반으로 JoinMap® 4.14를 사용하여 유전자 지도를 구축하였으며, 유전자 거리는 Haldane mapping function을 사용하여 계산하였다. 또한, QTL Cartographer ver.2.56을 사용하여 질병 중증도 지수(DSI)와 유전자형간의 단일 요인 연관성 테스트를 수행하였다.
6. 집단 분리 분석 (Bulked segregant analysis: BSA)
F2 분리집단에서 각각 30개의 저항성 개체(DSI 0) 및 감수성 개체(DSI 5)의 DNA를 추출하고, 동량으로 혼합하여 Hiseq2500 플랫폼 (Illumina, Inc., USA)을 이용한 Whole genome resequencing을 수행하였다. GATK v1.4.11 pipeline을 이용하여 변형부분을 확인하고, 이후 delta-SNP 지수를 구하고, QTLseqR를 이용하여 저항성 영역을 확인하였다. 한편, 게놈상의 SNP는 LD(linkage disequilibrium)를 가지고 있는바, 게놈상의 물리적 거리를 고려하여 SNP 전후의 위치가 2kb보다 작으면 동일 bin으로 그룹화하였다. 이어서, 대상 bin과 동일한 염색체에 있는 다른 bin 사이의 평균 deltaSNP 값을 두 그룹 t- 검정을 사용하여 비교하였다.
7. 고해상도 용융 (High resolution melting: HRM) 분석
HRM 분석은 1×LightCycler® 480 High Resolution Melting Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 3 mM MgCl2 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 하기 표 1의 프라이머 0.5 μM, dsDNA template 1ng 을 포함한 10 μL 반응액을 이용해서 수행하였다. PCR 조건은 하기와 같다. 95℃에서 10분동안 예비 배양한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 증폭 사이클을 55회 수행하였다. 이어서 95℃에서 60초, 40℃에서 60초, 65℃에서 60초의 전처리 후, 65℃ 에서 97℃까지 초당 0.07℃씩 온도를 올려 HRM을 수행하였다. dsDNA의 변성 정도는 초당 15회 확인하였으며, HRM 데이터는 LightCycler® 96 SW 1.1 program (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 이용하여 분석하였다. 또한, 모든 증폭 산물은 전기영동(1.5% 아가로스 겔)을 수행하여 크기를 확인하였다.
Primer name SNP Position (bp) Forward sequence (5'-3') Reverse sequence (5'-3') Product size (bp)
CL14-27-76 11,761,530 TCTCGGATAAGAAAGCTTCCAA
(서열번호 3)		 TGACCAATTTCCTTAGTTTTGTAGG
(서열번호 4)		 109
8. 생어 염기서열 분석 (Sanger sequencing)
Sanger의 ddNTP에 의한 PCR 종결 반응을 이용하여 후보 SNP 주변의 약 1kb의 DNA를 시퀀싱 하였다. PCR 프라이머는 HRM 표적 SNP 위치 밖에 설계하였으며, 구체적인 정보는 하기 표 2에 나타내었다. 50 μl의 PCR 혼합물은 1 x Ex-taq 완충액, 1 U의 Ex-taq 효소, dNTP 0.2 mM (TaKara, Japan), 100 ng의 DNA, 및 500 nM의 각 프라이머를 포함하고, PCR 조건은 하기와 같다: 95℃에서 10분 전처리 - [95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분] ×35회 - 72℃에서 5분. PCR 산물은 전기영동(1.2% 아가로스 겔)을 통해 크기를 확인하였다. Geneclean Turbo Kit (MP Biomedicals, OH, USA)을 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여 각 amplicon을 겔에서 분리하고, pGem T-Easy vector에 삽입하여 E. coli DH5α에 형질주입하고, 각 클론은 T7 및 SP6 프라이머 (Bionics, 서울, 한국)를 이용하여 시퀀싱하였다. 분석된 시퀀스는 CLC Genomics Workbench software (CLC Bio, Aarhus, Denmark)를 이용하여 조립하였다.
SNP SNP location Forward sequence (5'-3') Reverse sequence (5'-3') Product size (bp)
CL14-27-76 11761530 CTCGCTCCTTGTTTCAAGATG
(서열번호 5)		 TCCCCAATGCTTTTTACACTG
(서열번호 6)		 1003
9. 정량적 역전사 중합효소연쇄반응 (reverse-transcription quantitative PCR: RT- qPCR )
Race 1으로 확인된 C. orbiculare 을 DrHs7250 및 Oto9491에 접종하고, 0, 0.5, 1, 3, 6, 9, 18, 24, 72, 및 120 시간이 경과한 후에 샘플을 채취하고, 상기 샘플에서 1 % mercaptoethanol을 함유한 Tri-Reagent® (MRC, OH, USA)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 이어서, 1 μg의 RNA 부터 Transcriptor first-strand cDNA synthesis kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 cDNA를 획득하여, RT-qPCR을 하기와 같은 조건에서 수행하였다: 95℃에서 10분 전처리 - [95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 10초] ×40회 - 72℃에서 5분. 18s rRNA를 기준으로 △ Cq (타겟 유전자의 Cq 값 - 18s rRNA의 Cq 값)를 계산하여 유전자의 상대적 발현 정도를 측정하였다.
10. 분자계통학 기반의 상동 단백질 탐색
Cucurbit Genome Database의 수박 단백질 서열로부터 NR 단백질 데이터베이스의 BLASTp (E-value < 0.01, query sequence coverage ≥ 95%) 를 이용하여 병렬상동 단백질(Orthologous protein)을 확인하였다. 진화적 거리를 계산하기 위하여 COBALT와 확인된 병렬상동 단백질을 이용하여 Constraint-based multiple sequence alignment을 수행하였다. neighbor-joining method을 사용하여 단백질 서열로부터 계통수(phylogenetic tree)를 제작하였다. LRR 도메인의 반복서열은 [Max target sequences: 10k, Expected number of chance matches in a random model: 10, Scoring matrix: BLOSUM62 , Gap costs: Existence: 11 Extension: 1] 옵션의 PSI-BLAST(position-specific iterated BLAST)에 이용되었다. 계통간의 진화적 거리와 계통수는 [Gap penalties: -11 and -1, End-Gap penalties: -5 and -1, and Constraint E-value: 0.003] 옵션의 COBALT를 이용하여 결정하였다.
11. LRR 도메인의 모티프 서열 및 구조 예측
NR 단백질 데이터 베이스는 동종의 다양한 단백질 카피본을 포함하고 있기 때문에, 중복되는 단백질은 Cla001017의 병렬상동 단백질에서 제거하였다. 필터링된 병렬상동 단백질과 직렬상동 단백질(paralogues protein)을 이용하여 다중 서열 정렬 (multiple sequence alignment)을 수행하였으며, 모티프(motif) 서열은 관심 부위 부근에서 동일한 서열을 탐색하여 결정하였다. NCBI taxonomy database를 기반으로 하는 iTOL를 이용하여 계통수를 가시화하였으며, Cla001017의 LRR 도메인 서열을 이용하여 Phyre2 web에서 LRR 도메인의 2차 구조를 예측하였다.
[실험결과]
실시예 1. 탄저병원균 확보 및 Race 확인
국립농업유전자원센터에서 분양받은 균주의 단일 콜로니에서 ITS 서열을 분석한 결과 상기 균주가 C. orbiculare CL14-27임을 확인하였다. 이어서, Charleston Gray, Congo, Fairfax, 및 New Hampshire Midget 품종의 수박에 상기 균주를 접종한 결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 New Hampshire Midget을 제외한 3개의 기주 식물에서 저항성을 확인할 수 있었는바, 상기 균주는 Race 1에 속함을 알 수 있었다. 한편, 도 2에 나타낸 바와 같이, CL14-27 균주 접종 후 약 3일이면 감수성 개체들에서 하배축의 수침현상(water-socking)과 잎의 괴사 및 잎자루 시듦 증상이 시작되었고 5일째에는 감수성 식물의 배축 괴사가 관찰되는 반면, 저항성 식물은 배축과 잎에 괴사가 관찰되지 않았다.
기주 식물 저항성 개체수 감수성 개체수
New Hampshire Midget 0/20 20/20
Fairfax 20/20 0/20
Congo 20/20 0/20
Charleston Gray 20/20 0/20
실시예 2. 탄저병 저항성 영역 확인
2-1. GBS 라이브러리를 이용한 저항성 영역 탐색
도 3에 나타낸 바와 같이, 수박에서 탄저병 Race 1에 대한 저항성 영역을 확인하기 위하여, DrHs7250(P1; 저항성), Oto9491(P2; 감수성), 및 이들을 양친으로 하는 F2 집단의 표현형을 확인하고, 하기 표 4의 GBS(Genotyping by Sequencing) 플랫폼을 사용하여 유전자형을 확인한 후, 품질 관리 프로세스 후, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 353개의 SNPs를 발견하였다.
Lane 1 Lane 2 Lane 3 Sum
Total No. of Reads 273,096,210 279,298,889 294,224,034 846,619,133
Total No. of High-Quality Barcoded Reads 193,249,334 211,004,389 222,934,549 627,188,272
tagCntMap size 25,127,053 25,828,045 26,243,321 77,198,419
Initial Map Tags 26,243,321
Tags Without Replication 2,045,199
Map Tags 2,045,199
Total Depth: 588,944,117
Avg. Depth Per Tag 287
Total No. of Tags Mapped 389,172
Total No. of Tags Not Mapped 1,387,806
Total No. of Tags in the Tag Table 1,778,811
Total No. of Taxa in the Taxon Table 150
Total No. of Positions in the SNP Position Table 35,673
Chromosome Number of SNPs Total
Length (cM) 		Average
Distance (cM)
1 43 273 4.88
2 38 281 6.39
3 46 208 3.65
4 19 117 4.88
5 40 280 5.96
6 35 251 4.56
7 22 171 6.33
8 31 190 5.14
9 28 247 7.48
10 22 238 7.21
11 29 231 6.42
Total/Average 353 2487 5.54
상기 표로 확인되는 SNP를 이용하여 참조 게놈의 유전자 지도를 제작하였다. 각 염색체의 유전자 지도는 도 4a 내지 4c에 나타내었다. 생성된 지도의 총 길이는 2,487 cM이며, 평균 마커의 거리는 5.54 cM이다. 질병 중증도 지수(disease severity index: DSI)와 유전자형간의 단일 요인 연관성 분석(single factor analysis) 결과, C. orbiculare race 1에 대한 저항성 유전자는 8번 염색체의 0-51.8 cM 영역에 위치함을 확인할 수 있었다(도 4c 및 4d). 상기 영역은 하기 표 6에 나타낸 12개의 SNP를 포함하고 있으나, SNP 마커와 8번 염색체 내의 위치가 일치하지 않음을 관찰하였다. 이를 보완하기 위하여 이하 BSA 분석을 수행하였다.
SNPs Position
(cM) 		Position
(Mbp) 		P -value LOD DPI
(Days post inoculation)
1 0 0.438 1.15e-03 2.34 4
2 0 0.438 1.15e-03 2.34 4
3 5.1 2.544 1.22e-04 3.27 4
4 8.2 2.922 1.52e-04 3.17 4
5 14.7 10.619 6.31e-05 3.54 4
6 16 10.856 7.76e-05 3.45 4
7 38.1 5.215 8.37e-04 2.47 4
8 40.3 5.566 1.16e-03 2.34 4
9 41.6 5.818 1.65e-03 2.19 4
10 51 14.908 9.15e-03 1.50 4
11 51.1 14.888 9.11e-03 1.50 4
12 51.8 14.878 1.04e-02 1.45 4
1 0 0.438 1.00e-09 14.03 7
2 0 0.438 1.00e-09 14.03 7
3 5.1 2.544 1.00e-09 19.53 7
4 8.2 2.922 1.00e-09 17.55 7
5 14.7 10.619 1.00e-09 19.93 7
6 16 10.856 1.00e-09 20.40 7
7 38.1 5.215 2.00e-08 6.96 7
8 40.3 5.566 4.20e-08 6.65 7
9 41.6 5.818 6.60e-08 6.46 7
10 51 14.908 4.09e-07 5.67 7
11 51.1 14.888 4.24e-07 5.66 7
12 51.8 14.878 1.06e-06 5.27 7
1 0 0.438 1.00e-09 15.32 12
2 0 0.438 1.00e-09 15.32 12
3 5.1 2.544 1.00e-09 21.04 12
4 8.2 2.922 1.00e-09 19.35 12
5 14.7 10.619 1.00e-09 22.30 12
6 16 10.856 1.00e-09 22.77 12
7 38.1 5.215 2.00e-09 7.94 12
8 40.3 5.566 7.00e-09 7.44 12
9 41.6 5.818 1.40e-08 7.13 12
2-2. BSA을 통한 저항성 영역의 탐색
BSA 시퀀싱을 통해 219,524 개의 SNP를 검출할 수 있었다. 저항성 개체와 감수성 개체간의 delta-SNP 지수를 계산하여 저항성 유전자좌를 탐색하였으며, 조정된 P-value < 1e-06에서 하기 표 7에 나타낸바와 같이, 7개의 후보 영역을 확보할 수 있었다(도 5a 및 도 5b).
Start End Length # of SNPs Avg.
Delta
SNP 		G`
value 		Avg.
Q-value
8:156 8:766,496 766,340 379 0.36 13.25 3.50e-08
8:2,258,793 8:3,602,283 1,343,490 1,516 0.33 21.87 5.20e-09
8:4,842,452 8:6,262,626 1,420,174 1,483 -0.27 9.32 1.14e-08
8:8,756,306 8:11,183,440 2,427,134 2,323 0.42 16.22 4.30e-09
8:11,491,291 8:12,026,980 535,689 659 0.37 8.26 1.83e-08
8:12,322,363 8:13,612,158 1,289,795 1,096 0.31 11.57 9.45e-09
8:14,087,666 8:14,960,294 872,628 951 0.22 6.37 2.34e-07
GBS 분석 결과와 마찬가지로, 확인된 SNP는 8번 염색체의 0-14.9 Mbp 영역에 위치함을 알 수 있었다. 보다 구체적인 영역을 확인한 결과, 8번 염색체에서 평균 18.702개의 SNP를 포함하는 1,565 개의 bin이 생성되었으며, Within-bin과 between-bin 간의 DeltaSNP 지수 비교를 통해 Bonferroni’s adjusted P < 0.05에서 55개의 중요 bin을 확인하였다(표 7 참조). 두 가지 다른 유전적 분석을 통해, 최종적으로 Chr.8 의 6개의 후보영역 : 2.515-3.334 Mbp, 8.991-9.932 Mbp, 10.028-10.931 Mbp, 11.749-11.888 Mbp, 12.674-12.717 Mbp, 및 13.260-13.318 Mbp을 확인하였다. 상기 6개 후보영역은 도 6에 나타내었다.
Bin Start
Position 		End
Position 		# of SNPs Mean delta SNP SD
(bin 내의
deltaSNP 값의
표준편차) 		SEM
(bin 내의
deltaSNP 값의
표준 오류) 		P_value Bonferroni_P
1 31016 34038 9 0.44 0.11 0.04 1.94E-06 3.68E-02
2 88547 92489 10 0.54 0.15 0.05 9.47E-07 1.80E-02
3 95171 103045 17 0.43 0.17 0.04 1.43E-08 2.73E-04
4 429853 460254 80 0.43 0.2 0.02 3.13E-31 5.96E-27
5 2515041 2566601 157 -0.51 0.29 0.02 3.27E-49 6.23E-45
6 2873267 2910932 136 -0.63 0.22 0.02 1.52E-66 2.89E-62
7 2931068 2950734 49 -0.59 0.33 0.05 8.45E-17 1.61E-12
8 2953271 2961472 20 -0.53 0.28 0.06 7.05E-08 1.34E-03
9 3013866 3024185 26 -0.62 0.16 0.03 5.08E-17 9.66E-13
10 3042329 3057027 43 -0.56 0.32 0.05 1.41E-14 2.69E-10
11 3069515 3071405 6 -0.67 0.05 0.02 3.76E-07 7.15E-03
12 3073585 3085187 30 -0.45 0.29 0.05 3.00E-09 5.70E-05
13 3092000 3096148 20 -0.67 0.12 0.03 4.83E-16 9.20E-12
14 3152517 3166002 32 0.53 0.3 0.05 3.53E-11 6.71E-07
15 3168721 3234620 338 0.5 0.31 0.02 2.71E-96 5.15E-92
16 3237050 3254997 45 0.65 0.15 0.02 1.14E-30 2.18E-26
17 3274992 3291968 85 0.61 0.2 0.02 7.77E-45 1.48E-40
18 3294369 3298444 18 0.56 0.29 0.07 2.90E-07 5.51E-03
19 3302061 3313860 42 0.42 0.34 0.05 8.38E-10 1.59E-05
20 3317092 3334868 62 0.61 0.3 0.04 1.87E-23 3.56E-19
21 5021666 5028130 21 0.41 0.11 0.02 2.07E-13 3.93E-09
22 5532815 5549294 40 0.41 0.15 0.02 1.08E-19 2.05E-15
23 8991074 8996319 11 0.58 0.16 0.05 2.48E-07 4.71E-03
24 8998934 9009807 24 0.51 0.22 0.04 6.60E-11 1.26E-06
25 9087770 9104048 32 0.44 0.29 0.05 1.41E-09 2.69E-05
26 9154857 9171417 50 0.51 0.22 0.03 9.56E-22 1.82E-17
27 9179529 9185050 8 0.58 0.11 0.04 1.07E-06 2.04E-02
28 9247574 9254898 14 0.6 0.1 0.03 6.65E-12 1.26E-07
29 9440529 9461097 43 -0.5 0.25 0.04 1.40E-16 2.67E-12
30 9507530 9513356 12 -0.6 0.16 0.05 6.67E-08 1.27E-03
31 9515563 9526009 20 -0.51 0.28 0.06 1.38E-07 2.62E-03
32 9535634 9569060 89 -0.47 0.25 0.03 2.37E-30 4.52E-26
33 9574470 9583896 32 -0.45 0.25 0.04 1.16E-11 2.20E-07
실시예 3. HRM 분석을 통한 SNP 마커 검증
3-1. F 2 및 F 3 집단에서의 검증
상기 SNP 마커를 검증하기 위하여, 상기 후보영역에서 1개의 프라이머 세트를 개발하여 F2 (n = 104) 집단에서 HRM 마커 검정을 실시하였다. 상기 프라이머 세트의 정보는 표 1에 나타내었고, HRM 검정 결과는 도 7에 나타내었다.
그 결과, F2 집단에서 8번 염색체의 11.749-11.888 Mbp지역에서 해당 SNP (CL 14-27-76) 표현형과 유전자형이 완벽하게 분리되었으며, CL14-27-76의 추가 검증을 위하여 CL14-27-76를 이용하여 F3 (n = 181)집단에서 HRM을 동일하게 수행하였다.
그 결과, 1개 개체를 제외하고 예상된 표현형을 나타내었으며, 이에 8번 염색체의 11.749-11.888 Mbp 영역이 수박에서 탄저병 저항성에 관여하는 영역임을 검증되었다(도 7).
3-2. 다른 수박 품종에서의 검증
상기 확인된 SNP가 다양한 품종의 수박에서 탄저병 저항성의 마커로 이용될 수 있는지 확인하기 위하여, 41개의 상업용 수박 재배종과 18개의 야생종 수박에서 CL14-27-76을 사용하여 HRM을 수행하였다. 그 결과 도 8a에서 확인되는 바와 같이, 상업용 재배종에서는 SNP 유전자형에 따라 탄저병 저항성을 명확하게 구분할 수 있었으나, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 야생동 수박에서는 탄저병 저항성을 완벽하게 구별하지 못하였으며, 예상된 대립 유전자와 규칙적으로 일치하기 않았다. 이 패턴은 야생종 수박의 저항성 유전자좌에서 상업용 재배종과 다른 대립유전자 서열을 갖는 다는 것을 의미한다.
이어서, 18개의 상업용 재배종에서 생어 염기서열 분석을 수행하여 HRM 분석을 통한 유전자형 검증이 정확한지 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 해당 SNP를 통해 저항성을 판별할 수 있으며, 특히 도 10에 나타낸 바와 같이, 인접하는 1bp DNA 서열 중에서 CL14-27-76가 탄저병 저항성 개체를 보다 명확하게 지시할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. C. orbiculare 접종 후 유전자 발현의 변화
CL14-27-76 SNP는 유전자 영역에 존재한다. CL14-27-76 SNP는 Cla001017(CC-NBS-LRR 저항성 단백질을 암호화하는 유전자) exon(서열번호 2)에 위치하고 non-synonymous subsitution이 일어날 것으로 가정한다. 우리는 SNP에 의한 유전적 변이가 유전자 발현에 영향을 미칠것이라는 가정하에 탄저병 저항성 계통인 DrHs7250과 감수성 계통인 Oto9491에 C. orbiculare을 접종한 후 시간의 흐름에 따른 Cla001017 유전자 발현의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 저항성 계통에서 Cla001017 의 발현이 크게 증가하였으며, 접종 전 Cla001017 의 발현의 증가는 SNP에 의한 유전적 차이에 의함을 시사한다.
실시예 5. CC-NBS-LRR의 계통 발생 분석
상기 실시예 4로부터 Cla001017는 탄저병 저항성에 관여하며, Cla001017의 발현은 CL14-27-76 SNP의 유전자형의 변화(AGG에서 AAG 로의 변화: 아르기닌에서 리신으로 아미노산 치환)에 의해 영향을 받음을 추정할 수 있었다. 이를 검증하기 위하여, NR 단백질 데이터베이스와 Cla001017의 아미노산 서열을 기초로 상동 단백질(homologous protein) 탐색을 통해 진화관계를 추적하였다.
그 결과, 하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 호박, 오이, 멜론 등을 포함하는 박과 식물에서 총 6개의 병렬상동 유전자를 확인하였으며, 이는 박과 식물에 특정 CC-NBS-LRR 단백질이 발현됨을 의미한다.
Accession Description Species Max score Total score Query cover E-value Target cover
XP_022932643.1 disease resistance protein RGA2-like Cucurbita moschata 1239 1239 97% 0 62%
XP_016901478.1 putative disease resistance protein RGA3 Cucumis melo 862 1552 95% 0 70%
XP_004152291.1 putative disease resistance protein RGA3 Cucumis sativus 1676 1676 98% 0 79%
XP_022979680.1 putative disease resistance protein RGA3 Cucurbita maxima 1299 1299 97% 0 63%
XP_023527716.1 putative disease resistance protein RGA3 Cucurbita pepo subsp. pepo 1306 1306 97% 0 64%
XP_022145225.1 putative disease resistance protein RGA3 Momordica charantia 1466 1466 97% 0 71%
또한, 도 12에 나타낸 상기 병렬상동 단백질 사이에 진화관계의 계통수는 Citrullus 속의 Cla001017가 Cucumis 속의 RGA3 단백질과 진화론적으로 가장 유사함을 시사한다. 한편, 도 13에서 확인할 수 있는바와 같이, CL14-27-76 SNP는 LRR 도메인(domain)에 위치하며, LRR 도메인은 모든 식물에서 보존적임이 알려져 있다. 이에, LRR 도메인과 병렬상동 단백질을 탐색하였다.
그 결과, 하기 표 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 88개의 Mesangiospermae 종에서 1,861개의 병렬상동 단백질을 확인하였다. 하기 표 10에서 점(.)의 개수는 taxonomy level을 의미한다.
Taxonomy Number of Hits Number of Organisms
....... Ricinus communis 6 1
Mesangiospermae 1861 88
.... Vitis vinifera 247 1
. eudicotyledons 1849 84
.... malvids 131 14
.. Pentapetalae 1840 82
..... Eucalyptus grandis 20 1
... rosids 1654 57
..... Malvaceae 79 7
.... fabids 1276 42
...... Byttnerioideae 58 2
..... Cucurbitaceae 76 6
....... Herrania umbratica 3 1
...... Cucumis 32 2
....... Theobroma cacao 55 1
....... Cucumis sativus 17 1
...... Gossypium 18 4
....... Cucumis melo 15 1
....... Gossypium barbadense 4 1
...... Momordica charantia 13 1
....... Gossypium raimondii 6 1
...... Cucurbita 31 3
....... Gossypium hirsutum 5 1
....... Cucurbita pepo subsp. pepo 11 1
....... Gossypium arboreum 3 1
....... Cucurbita maxima 4 1
...... Durio zibethinus 3 1
....... Cucurbita moschata 16 1
..... Brassicales 32 6
..... Rosales 636 14
...... Brassicaceae 28 5
...... Rosaceae 571 10
....... Brassiceae 21 4
....... Rosoideae 207 2
........ Brassica 19 3
........ Fragaria vesca subsp. vesca 24 1
......... Brassica napus 6 1
........ Rosa chinensis 183 1
......... Brassica oleracea var. oleracea 3 1
....... Amygdaloideae 364 8
......... Brassica rapa 10 1
........ Maleae 215 5
........ Raphanus sativus 2 1
......... Pyrus x bretschneideri 117 1
....... Arabidopsis thaliana 7 1
......... Malus 98 4
...... Carica papaya 4 1
.......... Malus domestica 93 1
... Chenopodiaceae 5 2
.......... Malus x robusta 2 1
.... Beta vulgaris subsp. vulgaris 4 1
.......... Malus baccata 1 1
.... Spinacia oleracea 1 1
.......... Malus prunifolia 2 1
... lamiids 181 23
........ Prunus 149 3
.... Solanales 161 19
......... Prunus avium 60 1
..... Solanaceae 160 18
......... Prunus mume 22 1
...... Solanoideae 146 14
......... Prunus persica 67 1
....... Capsicum 71 5
...... Ziziphus jujuba 27 1
........ Capsicum baccatum 7 1
...... Cannabaceae 19 2
........ Capsicum annuum 53 1
....... Trema orientalis 10 1
........ Capsicum chinense 9 1
이어서, 한 종내에 여러 직렬상동 단백질을 포함하고 있기 때문에, 가장 낮은 E-value를 가진 종을 각 종의 대표로 선정하여, 하기 표 11에 나타낸 88개의 병렬상동 단백질과 수박의 Cla001017을 다중 서열 정렬을 수행하였으며, 그 결과, 29개 종에서 LRR 도메인 내의 한 부위에서 아르기닌(arginine) 또는 리신(lysine)이 발현됨을 확인하였다.
Accession Hit
score 		E-value Description Taxonomy Cla001017 protein의 617번째 Amino Acid
ADH94055 68.6 1.00E-11 putative disease resistance protein R3, partial Solanum bulbocastanum L
XP_018493469 68.6 1.00E-11 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Raphanus sativus (radish) L
XP_004152291 118 3.00E-29 putative disease resistance protein RGA3 Cucumis sativus (cucumber) R
KDP43598 68.6 1.00E-11 hypothetical protein JCGZ_16885 Jatropha curcas K
XP_022145225 118 4.00E-29 putative disease resistance protein RGA3 Momordica charantia K
AKU37069 68.6 1.00E-11 FB_Mr5-like protein Malus x robusta I
XP_016901478 115 3.00E-28 putative disease resistance protein RGA3 Cucumis melo (muskmelon) -
AKU37068 68.6 1.00E-11 FB_Mr5-like protein Malus baccata I
XP_023521027 107 2.00E-25 disease resistance protein RGA2-like Cucurbita pepo subsp. pepo (vegetable marrow) K
AKU37071 68.6 1.00E-11 FB_Mr5-like protein Malus prunifolia I
XP_022973478 107 2.00E-25 putative disease resistance protein RGA3 Cucurbita maxima
(winter squash)		 K
AID55047 68.2 1.00E-11 disease resistance protein, partial Solanum habrochaites L
XP_022932629 99 2.00E-22 disease resistance protein RGA2-like isoform X2 Cucurbita moschata (crookneck pumpkin) K
XP_011000587 68.2 1.00E-11 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Populus euphratica I
XP_011470082 82 2.00E-16 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Fragaria vesca subsp. vesca L
BAK03190 67.8 2.00E-11 predicted protein Hordeum vulgare subsp. vulgare (domesticated barley) D
XP_019073357 81.3 3.00E-16 putative disease resistance RPP13-like protein 1 isoform X1 Vitis vinifera (wine grape) M
XP_019190007 67.8 2.00E-11 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Ipomoea nil
(Japanese morning glory)		 D
XP_023889040 80.5 6.00E-16 putative disease resistance protein At3g14460 Quercus suber N
ADH94057 67.8 2.00E-11 putative disease resistance protein R3, partial Solanum cardiophyllum L
XP_024190438 80.1 8.00E-16 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Rosa chinensis I
XP_009146351 67.4 2.00E-11 Ziziphus jujuba Rhamnaceae
(field mustard)		 26
Fragaria vesca subsp. vesca Rosaceae 256 Malus baccata Rosaceae Malus domestica
Rosaceae Malus prunifolia Rosaceae Malus x robusta Rosaceae Prunus avium
Rosaceae Prunus mume Rosaceae Prunus persica Rosaceae Pyrus x bretschneideri
Rosaceae Rosa chinensis Rosaceae Coffea canephora Rubiaceae 13
Populus euphratica Salicaceae 4 Populus trichocarpa Salicaceae Capsicum annuum
Solanaceae 106 Capsicum baccatum Solanaceae Capsicum chacoense Solanaceae
Capsicum chinense Solanaceae Capsicum frutescens Solanaceae Nicotiana attenuata Solanaceae
Nicotiana sylvestris Solanaceae Nicotiana tabacum Solanaceae Nicotiana tomentosiformis Solanaceae
Solanum bulbocastanum Solanaceae Solanum cardiophyllum Solanaceae Solanum demissum Solanaceae
Solanum habrochaites Solanaceae Solanum hougasii Solanaceae Solanum lycopersicum
(English walnut)		 Solanaceae
Solanum pennellii Solanaceae Solanum stoloniferum Solanaceae Solanum tuberosum Solanaceae
Vitis vinifera Vitaceae 71 Total number of proteins 1,007 L
XP_015579869 66.6 5.00E-11 putative disease resistance protein RGA3 Ricinus communis
(castor bean)		 K
XP_010279598 76.3 2.00E-14 disease resistance protein RGA2-like Nelumbo nucifera K
XP_022854712 66.6 5.00E-11 putative disease resistance protein RGA1 Olea europaea var. sylvestris D
XP_008347843 75.9 2.00E-14 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Malus domestica (apple) L
NP_188065 66.6 6.00E-11 NB-ARC domain-containing disease resistance protein Arabidopsis thaliana
(thale cress)		 L
XP_020237495 75.9 3.00E-14 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Cajanus cajan
(pigeon pea)		 K
XP_009595301 66.6 6.00E-11 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Nicotiana tomentosiformis L
AEI87114 75.9 3.00E-14 CC-NBS-LRR resistance-like protein Beta vulgaris subsp. vulgaris (sugar beet) L
XP_020187354 66.2 6.00E-11 putative disease resistance protein RGA4 Aegilops tauschii subsp. tauschii K
AAX89382 75.5 3.00E-14 NB-LRR type disease resistance protein Rps1-k-1 Glycine max (soybean) K
XP_016506414 66.2 6.00E-11 putative disease resistance protein RGA3 Nicotiana tabacum (common tobacco) I
PON33383 75.1 5.00E-14 NB-ARC domain, LRR domain containing protein Parasponia andersonii L
Cla001017
[Query]		 NA NA Cc-nbs-lrr resistance protein Citrullus lanatus subsp. vulgaris cv . 97103 R
XP_007134629 74.7 7.00E-14 hypothetical protein PHAVU_010G063000g Phaseolus vulgaris K
XP_016652537 74.7 8.00E-14 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Prunus mume
(Japanese apricot)		 L
PHT54341 74.3 1.00E-13 hypothetical protein CQW23_08803 Capsicum baccatum L
AAU90295 74.3 1.00E-13 Disease resistance protein I2, putative Solanum demissum L
CDP17833 73.6 2.00E-13 unnamed protein product Coffea canephora R
XP_020412748 73.6 2.00E-13 putative disease resistance RPP13-like protein 1 Prunus persica (peach) L
AAW48300 73.6 2.00E-13 potato resistance-like protein I2GA-SH23-1 Solanum tuberosum (potato) L
PNT42104 73.6 2.00E-13 hypothetical protein POPTR_004G196100v3 Populus trichocarpa
(black cottonwood) 		L
XP_014492420 73.2 2.00E-13 putative disease resistance RPP13-like protein 1 isoform X1 Vigna radiata var. radiata (mung bean) K
이어서, 상기 병렬상동 LRR 도메인의 진화시기를 추정하기 위하여 계통수를 작성하였으며(도 14), 상기 계통수를 통해 박과(Cucurbitaceae), 목화속(Gossypium), 및 참깨속(Sesamum)이 같은 clade에 집성되고, 상기 속에 속하는 종(species)은 LRR 도메인의 동일한 위치에서 아르기닌 또는 리신이 위치함을 확인하였다. 한편, 콩과(Fabaceae) 식물은 다른 clade에 속하였으나, 콩과 식물이 속하는 clade에서도 LRR 도메인의 동일한 위치에서 아르기닌 또는 리신이 발현됨을 확인하였다. 상기 결과로부터, Cucurbitaceae 및 Fabaceae을 포함한 다른 식물에서 수박과 동일한 탄저병 저항성 매커니즘이 존재함을 알 수 있다.
실시예 6. LRR 도메인에서 모티프 서열 확인
상기 확인된 SNP가 LRR 모티프에서 아미노산 치환을 야기할 것이라는 가정하에, SNP에 의해 아미노산이 치환된 LRR 모티프를 탐색하였다.
상기 실시예 5에서 확인한 1,861개의 병렬상동 단백질 중에서 동종 내에서 중복된 단백질을 필터링하여, 하기 표 12에 나타낸바와 같이, 26개 과(Family)와 89개 종(species)에 걸쳐 1,007개의 상동 단백질을 확인하였다.
Species Family Number of orthologues and paralogues
Beta vulgaris subsp. vulgaris Amaranthaceae 5
Spinacia oleracea Amaranthaceae
Elaeis guineensis Arecaceae 1
Arabidopsis thaliana Brassicaceae 9
Brassica napus Brassicaceae
Brassica oleracea var. oleracea Brassicaceae
Brassica rapa Brassicaceae
Raphanus sativus Brassicaceae
Parasponia andersonii Cannabaceae 19
Trema orientalis Cannabaceae
Carica papaya Caricaceae 1
Ipomoea nil Convolvulaceae 1
Cucumis melo Cucurbitaceae 66
Cucumis sativus Cucurbitaceae
Cucurbita maxima Cucurbitaceae
Cucurbita moschata Cucurbitaceae
Cucurbita pepo subsp. pepo Cucurbitaceae
Momordica charantia Cucurbitaceae
Hevea brasiliensis Euphorbiaceae 31
Jatropha curcas Euphorbiaceae
Manihot esculenta Euphorbiaceae
Ricinus communis Euphorbiaceae
Arachis duranensis Fabaceae 197
Arachis ipaensis Fabaceae
Cajanus cajan Fabaceae
Cicer arietinum Fabaceae
Citrullus lanatus subsp. Vulgaris Fabaceae
Glycine max Fabaceae
Glycine soja Fabaceae
Lupinus angustifolius Fabaceae
Medicago truncatula Fabaceae
Phaseolus vulgaris Fabaceae
Trifolium pratense Fabaceae
Trifolium subterraneum Fabaceae
Vigna angularis Fabaceae
Vigna angularis var. angularis Fabaceae
Vigna radiata var. radiata Fabaceae
Quercus suber Fagaceae 86
Juglans regia Juglandaceae 38
Durio zibethinus Malvaceae 39
Gossypium arboreum Malvaceae
Gossypium barbadense Malvaceae
Gossypium hirsutum Malvaceae
Gossypium raimondii Malvaceae
Herrania umbratica Malvaceae
Theobroma cacao Malvaceae
Morus notabilis Moraceae 13
Eucalyptus grandis Myrtaceae 3
Nelumbo nucifera Nelumbonaceae 8
Olea europaea var. sylvestris Oleaceae 5
Oryza sativa Japonica Oleaceae
Macleaya cordata Papaveraceae 1
Sesamum indicum Pedaliaceae 1
Erythranthe guttata Phrymaceae 5
Aegilops tauschii subsp. tauschii Poaceae 2
Hordeum vulgare subsp. vulgare Poaceae
상기 1,007개의 상동 단백질을 기초로 다중 서열 정렬을 수행하여 19개의 아미노산 잔기(IxxLPxSxxxLYNLQTLxL)를 갖는 모티프를 확인하였다(도 15a). 상기 모티프에서 18번째 아미노산 잔기는 상기 실시예 1 내지 4에서 검증된 탄저병 저항성 식별의 SNP이다. 한편, 상기 모티프의 11-19번째 아미노산 잔기(LxxLxxLxL)는 전체 과(Family)에서 진화론적으로 잘 보존되어 있는 LRR 모티프다. 89개 종의 식물에서 루이신(leucine), 이소루이신(isoleucine), 아르기닌(arginine), 리신(lysine), 또는 아스파라긴(asparagine) 아미노산 잔기가 상기 모티프의 18번째에 위치하였으며, 계통수에서 더 낮은 clade에 속하는 박과(Cucurbitaceae), 콩과(Fabaceae), 및 대극과(Euphorbiaceae)에 속하는 식물은 상기 18번째 위치에서 아르기닌 또는 리신 잔기가 위치함을 확인하였다. 상기 5개의 잔기 중에서 아르기닌과 리신은 염기성(양전하성)을 가진다.
상기 위치에서 아미노산의 성질이 단백질 구조에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, Phyre2 protein fold recognition web server를 사용하여 LRR- 수용체와 유사한 serine/threonine-protein kinase fls2를 주형으로 하여 Cla001017의 LRR 도메인 서열의 3D 구조를 예측하고 신뢰도가 99.4 %의 구조를 밝혀내었다(도 14b). 상기 SNP에 의해 아미노산이 치환되는 위치는 LRR 도메인의 β- 가닥에서 잔기 30이며, 이 위치에서, 아르기닌 또는 리신 잔기는 양전하에 의한 염다리(salt bridge)를 구성함을 확인할 수 있었다(도 15c).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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tttctgatct agattttcaa 660 tggagttgga gaagtgaaag agaattagat tttaataaca atgatttgaa tgtgttggaa 720 gggcttcaac cacacaaaaa ccttaaagcc ttgaaaatta aaaactttgc aggtgaaggt 780 cttcctactg gtatttttgt tgaaaacttg gtcgagataa ttctatacga atgcaaaaga 840 tgtgaaactt tgccaatgtt ggggcagtta tcgaagcttg aattacttca tattcgtaac 900 ctagacagtg taaaaagcat tggggatgaa ttttatggga gtaattatga cagtgagagg 960 acttcattat tccctaaact caagacactt catatttccc aaatgaaaag tttagagcat 1020 tggaatgaaa tagggagtgt atcaaatggt gcaagttttc ctcatcttga aagcttgagc 1080 attatttgtt gttggaaatt 1100 <210> 2 <211> 3279 <212> DNA <213> Cucurbitaceae <400> 2 atggcagaat ttctgtggag ctttgctgta gaggaagtgt tgaagaagac agtgaaggtt 60 gtggcagagc aaatgggtct ggcatggggg tttaagaagg agctctcaaa gctcagagac 120 tctttgctca tggtagaagc catcctacgg gatgctgaca gaatcagagc agagcatcaa 180 gccctgaagc tatggttgga gaagcttgaa gatatcgttt tcgaagccga tgttttactt 240 gacgagcttt catacgaaga tcttcgacgt aaggtggaaa ccggactagt acgtagtttc 300 gtttcatctt ccaaaaatcc tcttgttttt cgtctcaaaa tggccaatag aataaaaact 360 attgctaaaa atttagatga gcattattct gcggccacag ttgtggggct tgttgctata 420 acatccaaag aagttgaatc cgatcttagc cagattctag agacggactc gtttcttgat 480 gagattgaag ttatagggag ggaaattgaa gtgttggaga tactgaataa actacttgat 540 cttagcagtc aggaagtagc tctagctgtt ttgcctattg ttggtatagg tggaatagga 600 aaaacatctt tggcgaaagt gatctttcat catgaaatga taagggagaa tttcgataga 660 gcaatatggg tgtgtgtgtc tgaacctttt gttatcaaca agattttaag agcaattttg 720 gaaactctta atgtttatgt tggtggctta gacacaaagg aagctatact tcaaaagctc 780 gaaaaattgt tgaggaacaa aaagtatttt ctcgtgcttg atgatgtttg gaatgagaat 840 cccaatctat ggaatgagtt aagggcttgt ttgctaaagg ttaataaaaa atttggaagt 900 gttattgttg tgactactag gagtgatgaa gttgcaaaca ttgtggagac gcattatcaa 960 agacatcatc tgaaaaaatt gtcagatgat cattgttgga ctttatttga aaaatgtgca 1020 tttggaagcg atttggcaat gattccaaga gttgatcatg tagttcgaga agtgcttgtt 1080 aaaaagtttg gtgggatacc attggttgtg aaagtgtttg gaggaatggt gaagttagac 1140 aagaatagtt gtgaaggatt gcaatcaact ttggaaaatc taatgagaat tccattacaa 1200 gatgaaaatc atatattatc taccataaaa ttaagtgtag accgtctgcc atcttcctcg 1260 ctaaaacaat gttttgccta ttgttcaaat tttccacgag acttcttatt tataagagaa 1320 gcactggttc aaatgtggat agcacaaggg tttattcaac tacctagcgg gagcaatgta 1380 atgatggagg atattggagc aaactacttc aatcttttgt tgtctcgctc cttgtttcaa 1440 gatgttgtca aggataacag agggagaatt atatattgca agatgcatga tgtcatacac 1500 gacgttgcat gtgctatttc aaatgctcaa aaattcagat tggatctttt agttgatgaa 1560 aaatcccaaa gagatgaggt tctttcggtc ggtcgtggaa taagaacatt ttattgcagt 1620 gaaaatgttg ttggaaagtt tcacatgcca acctttgata gtcacgtgtt tcagaataag 1680 atcaccaact tcatctactt gtgcgtttta attatccatt cctggtttat acatgaatta 1740 ccatattccc ttgctaaatt gaagcatcta aggtatcttg acatttcaca ctctcggata 1800 agaaagcttc caaaatctat tgttttgctt tataatttgc agacattgag gcttggaagt 1860 gatatgatag accttcctac aaaactaagg aaattggtca atttaaggca tttagaattt 1920 tctcaattga caacttcaat tgagcaaatg cctcaacatt tgagtcgatt gattcaactt 1980 caaacgcttt ccaaatttgt agttgggttt gacgaacgat gtaagatagg ggagcttgga 2040 ccattgagaa atctcaaagg tgaattaagc ctttttcctc tcgagcgtgt tggaagtaaa 2100 aacgaggcca tggctgcaaa tttggcagag aaggaaaaca tttctgatct agattttcaa 2160 tggagttgga gaagtgaaag agaattagat tttaataaca atgatttgaa tgtgttggaa 2220 gggcttcaac cacacaaaaa ccttaaagcc ttgaaaatta aaaactttgc aggtgaaggt 2280 cttcctactg gtatttttgt tgaaaacttg gtcgagataa ttctatacga atgcaaaaga 2340 tgtgaaactt tgccaatgtt ggggcagtta tcgaagcttg aattacttca tattcgtaac 2400 ctagacagtg taaaaagcat tggggatgaa ttttatggga gtaattatga cagtgagagg 2460 acttcattat tccctaaact caagacactt catatttccc aaatgaaaag tttagagcat 2520 tggaatgaaa tagggagtgt atcaaatggt gcaagttttc ctcatcttga aagcttgagc 2580 attatttgtt gttggaaatt agtgaatatt ccgaaccttt ttcaaggttc tccaaagctt 2640 agatctctca agattattca ttgtgaagaa ttgacaaaac taccaaactg gttagatctc 2700 tgcagctccc ttgaagatat gagcttatgc gattgtccta acgttaacaa ttctcttcca 2760 aatttggaaa acatgccaag cttgtcttca ttaagtgtcg taaacttcaa aaacttgcca 2820 gagggacttg cctgcattcg taacttgaaa agattgaaag ttcatgggga attgcaaggt 2880 ttggattgga gtccattcat gcatctcaat tcatcacttg aaaatcttga gttggttgaa 2940 atgggagtaa gtagtttact accgcaactt cctcgactac tcgagcatct cacggcttta 3000 aaatctttgc aaattgtggg ttccaacggc cttgaatctt tgcctgaatg gttgggaaac 3060 cttacatctt tagagacatt gaatctatac cgttgcagaa atttgaaaag cttgccttcc 3120 aaagaagtca tgtcaaatct cacccgatta aatcatttgt tagtttctgg atgttcccgg 3180 cttcaacttg gcgaaggtag ctcttcgagc gggagaaagt ttcgcatgta cctgatgtta 3240 acattcaaga tgagactact aacatgttct tgtctgtaa 3279 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM_Primer_F <400> 3 tctcggataa gaaagcttcc aa 22 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM_Primer_R <400> 4 tgaccaattt ccttagtttt gtagg 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sanger sequencing_Primer_F <400> 5 ctcgctcctt gtttcaagat g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sanger sequencing_Primer_R <400> 6 tccccaatgc tttttacact g 21 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Magnoliopsida <220> <221> VARIANT <222> (2)..(3) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)..(10) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (18) <223> Xaa = any one of: leucine, isoleucine, arginine, lysine, or asparagine <400> 7 Ile Xaa Xaa Leu Pro Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Asn Leu Gln Thr 1 5 10 15 Leu Xaa Leu <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Cucurbitaceae <220> <221> VARIANT <222> (18) <223> Xaa = Arginine or Lysine <400> 8 Ile Arg Gln Leu Pro Lys Ser Ile Val Leu Leu Tyr Asn Leu Gln Thr 1 5 10 15 Leu Xaa Leu

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 염기서열 내에서 350번째 염기에 위치하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물로서,
    상기 식물체는 수박인 것을 특징으로 하는, SNP 마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 350번째 염기 타입을 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물로서,
    상기 식물체는 수박인 것을 특징으로 하는, 판별용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제제는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물.
  6. 제5항의 조성물을 포함하는, 탄저병 저항성 식물체 판별용 키트.
  7. (a) 판별하고자 하는 식물체로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
    (b) 상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 350번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 단계를 포함하고,
    상기 식물체는 수박인 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법.
  10. 서열번호 7의 18번째 아미노산 잔기를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물로서,
    상기 식물체는 수박인 것을 특징으로 하는, 판별용 조성물.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    상기 아미노산 잔기는 아르기닌(arginine) 또는 리신(lysine)인 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 제제는 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체 판별용 조성물.
  14. 식물체의 LRR(leucine-rich repeat) 단백질의 서열번호 7로 이루어진 모티프에서 18번째 아미노산 잔기를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 식물체는 수박인 것을 특징으로 하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 방법은 상기 18번째 아미노산 잔기가 리신(lysine)인 경우 식물체를 탄저병 저항성 개체인 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는, 탄저병 저항성 식물체를 판별하는 방법.
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