KR20190055444A - 중국산 쌀 구별용 조성물 - Google Patents

Abstract

중국산 쌀 품종 구별용 조성물이 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 의한 쌀 품종 구별용 조성물은 서열번호1 및 서열번호2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

Description

중국산 쌀 구별용 조성물{COMPOSITION FOR DISTINGUISHING RICE FROM THE CHINA}

본 발명은 중국산 쌀 품종 구별을 위한 프라이머 및 이를 이용한 쌀 품종의 구별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 포함하는 중국산 쌀 품종 구별용 조성물과 이를 이용한 쌀 품종 구별 방법에 관한 것이다.

벼는 밀 다음으로 세계 제2의 식량작물이며 세계 인구의 절반 이상이 쌀을 주식으로 하고 있는 작물로서 아시아에서 90%이상 생산되고 대부분이 아시아에서 소비되고 있다. 한국도 다른 아시아 국가들과 같이 쌀을 주식으로 하고 있으며 또한 해마다 15∼20 품종씩 신품종이 육성, 보급되고 있으나 국내에 보급되고 있는 품종들은 대부분이 특정 품종(일품벼, 주남벼, 동진1호 등)으로 소개되고 있어 국내 소비자의 대부분은 이들 품종에 대한 확인이 불가능한 실정이다. 또한 수출입 개방에 따라 일부 유통업자들은 수입 쌀을 국내산으로 또는 국내산에 수입 쌀을 혼합하여 공급하고 있으며 이러한 불법 유통을 방지하기 위하여 정부에서는 원산지 표기를 제도화하고 있으나 실제 원산지 허위 표기의 적발에는 유통경로의 추적 및 원산지 확인 등의 복잡한 절차를 거쳐야 하는 등 매우 어려움을 겪고 있는 실정이다. 더구나 최근 일부 농촌지역에서 발생하는 수확물의 도난사건 등 벼 품종과 관련된 고소, 고발 사건에 대한 보다 과학적인 수사기법이 필요한 실정이므로 국내에서 육성되어 재배되고 있는 벼 품종들을 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 방법이나 기술의 확립이 절실하다고 하겠다.

한편, 최근 정보통신산업의 발달로 사람을 대상으로 본인을 확인할 수 있는 생체인식기술개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 생체인식기술에는 홍채, 지문, DNA 등 신체적 특징을 이용하는 방법과 서명, 음성, 걸음걸이 등 행동학적 특성을 이용하는 방법 등이 있다. 한편, 작물의 경우에도 지식재산권 등의 강화를 통한 개발된 품종의 권리를 확보하는 절차가 중요해지고 있어 사람의 고유 신분증과 같은 품종 구별기술개발이 절실하게 필요하게 되었다.

이에 따라, 분자 육종시스템에서 유용 형질 탐색, 생물의 종 인식, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등의 목적으로 분자마커(molecular marker)가 널리 이용되고 있다. 분자마커를 이용한 벼 육종은 환경변이에 영향을 받지 않고 어린 시기에 형질을 탐색할 수 있기 때문에 대량의 자원을 정확하고 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있다.

가장 먼저, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)을 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Taq DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism)검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR(single sequence repeat)방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있으나, 벼에서 기 개발된 SSR 마커의 수가 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 단점이 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 벼의 품종 구별을 위해 효율적으로 이용될 수 있는 분자 마커에 대한 연구를 수행하여, PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하며 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 Indel(insertion/deletion) 마커를 개발하였다.

본 발명의 일 실시예는 중국산 쌀 품종 구별용 조성물을 제공하는 것이다.

볼 발명의 일 실시예는 중국산 쌀 품종 구별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 의한 중국산 쌀 품종 구별용 조성물은 서열번호1 및 서열번호2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의한 중국산 쌀 품종 구별방법은, 쌀 시료에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 Indel 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서도, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면 국내산 쌀과 중국산 쌀을 구별하여, 국내 유통되는 쌀 중에 중국산 쌀의 혼입 여부를 판별할 수 있다.

본 명세서에서, 어떤 구성요소가 다른 구성요소 상에 있다고 언급되는 경우에 그것은 다른 구성요소 상에 직접 형성될 수 있거나 또는 그들 사이에 제 3의 구성요소가 개재될 수도 있다는 것을 의미한다. 또한, 도면들에 있어서, 형상 및 크기들의 두께는 기술적 내용의 효과적인 설명을 위해 과장된 것이다.

또한, 본 명세서의 다양한 실시 예 들에서 제1, 제2, 제3 등의 용어가 다양한 구성요소들을 기술하기 위해서 사용되었지만, 이들 구성요소들이 이 같은 용어들에 의해서 한정되어서는 안 된다. 이들 용어들은 단지 어느 구성요소를 다른 구성요소와 구별시키기 위해서 사용되었을 뿐이다. 따라서, 어느 한 실시 예에 제 1 구성요소로 언급된 것이 다른 실시 예에서는 제 2 구성요소로 언급될 수도 있다. 여기에 설명되고 예시되는 각 실시 예는 그것의 상보적인 실시 예도 포함한다. 또한, 본 명세서에서 '및/또는'은 전후에 나열한 구성요소들 중 적어도 하나를 포함하는 의미로 사용되었다. 명세서에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 또한, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징이나 숫자, 단계, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 또한, 본 명세서에서 "연결"은 복수의 구성 요소를 간접적으로 연결하는 것, 및 직접적으로 연결하는 것을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

또한, 하기에서 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.

본 발명에서 용어, “변이 영역”은 유전자 또는 염색체의 변화가 일어난 곳을 의미하며, 본 발명에서는 DMB(Dense mutation block)로 혼용하기도 한다. 즉, 품종간의 유전자의 차이가 존재하는 영역을 의미할 수 있고, 본 발명에서는 단일염기변이(SNV)가 밀집한 영역을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 표준유전체 유전체 정보와 차이를 보이는 단일염기변이(SNV) 수가 10kb 당 4개 이상일 때 이를 변이 영역이라 규정한다.

본 발명에서 용어, “단일염기변이(Single Nucleotide Variation)”는 "SNP(single nucleotide polymorphism)"라고도 하며, 이는 단일 염기에서의 다형성(polymorphism)을 의미한다. 즉, 어느 집단에 있어 전체 게놈(genomome)에 있는 일부 염기가 염색체마다 다른 경우가 존재하는 것을 말하며, 통상적으로 SNV는 300 내지 1000개의 염기에 하나 정도 존재하는 것으로 알려져 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “Indel(Insertion/deletion) 마커”는 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다.

본 발명에서 용어,“마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 용어, “유전자좌”는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.

본 발명에서 용어. “표준유전체”는 본 발명의 품종 인식함에 있어 기준이 되는 작물의 품종의 유전체를 의미한다. 바람직하게는 국내산 화영벼의 유전체가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “프라이머(primer)”는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명의 쌀 품종 구별용 프라이머 세트는, 표적 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 쌀 품종 구별을 위한 Indel 마커의 증폭을 위하여 사용될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에서 중국산 쌀 품종 구별을 위한 프라이머 세트는 하기 표1에 기재된 프라이머 세트일 수 있다.

Primer ID	서열번호	Forward Primer	서열번호	Reverse Primer
KM_IND_325	1	ATGCATCGGTAAATCACCTA	2	CATTAGTTCCCGTAACTCA

본 발명의 일 실시예에서 표1에 기재된 프라이머 세트에 의해 인식될 수 있는 쌀 품종은 중국산 칠하원 원립갱미(품종명: japonica)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 표2에 기재된 프라이머 세트에 의해 표3에 기재된 중국산 쌀 품종이 인식될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

Primer ID	서열번호	Forward Primer	서열번호	Reverse Primer
KM_IND_102	3	TCCCTTGTAGGCTCCTATCT	4	TTGGTACTTAACTACCAGAG
KM_IND_104	5	CCATTATCATTCTGGACAAC	6	TGCACGATGTGGACAGAATA
KM_IND_106	7	ACTTCACGCCATTCCACCTA	8	TCTCAAGTTTAGATCAAAGG
KM_IND_109	9	GCATGTACTCTACCTTCAAA	10	TCATTCTGGCTTAAACTAGG
KM_IND_117	11	ACACTGTCCTTCGTTACCGT	12	ATTCATTAGCTTCTAGATAC
KM_IND_235	13	GCCTATTCTTACCATCTGCA	14	TTCACTGGAAGCATTATCAA
KM_IND_237	15	AGTCGTCGCAATTACGTTTG	16	GCACTTATAGCAAGCATTTA
KM_IND_254	17	TAATGCCACCATTGATTCGC	18	CACACTACTTTAGATCTTGA
KM_IND_301	19	AACTGATCTCCCTATTTGAA	20	GTCACCGTGCCATTACGTGT
KM_IND_401	21	ATGCAATGAACTTACTTAGT	22	AAGCATCAAGCATATCTAGT
KM_IND_406	23	ACTTCACTCCTACACAATCC	24	TGCATTCATCTTGACTAGGC
KM_IND_421	25	GATCAGATGGCTTGCACATC	26	TGTCACATTCAGTTTCACTG
KM_IND_424	27	AAAACATCTCTAACGCAACT	28	TCGTCCTACCCAATCGTCTG
KM_IND_518	29	ACAAATTCGGATTGCTAATT	30	ATGTCCTAATTCAGATTAGA
KM_IND_619	31	TAGAAAGGCCTTTAAGATAG	32	CTTGGTTCAGCTTAAATCCG
KM_IND_804	33	CATCGGATTAGTCATCGATA	34	ACCTAGCATTACTGCCACCT
KM_IND_805	35	GCTAACAGTTTGACGTCTTG	36	ATTCCACACCCGTTTACTTG
KM_IND_839	37	TCTACTTGAGTGCTTCAATA	38	AGAGATCATTTTTGACCTAG
KM_IND_907	39	ATCTCGGTTCGGTATCCTTA	40	GTAATGATAGACATCCTTTG
KM_IND_925	41	CTATGCTAGCTTCGATACAC	42	CATCTTATACATACCGTTGG
KM_IND_1021	43	AAACACCTACACCCTTCTCG	44	TTATGCGAATGATGCATTGT
KM_IND_1113	45	TTACTCCATCTAGTTAGCAG	46	TCCGGATTTAAATTAGCCAT
KM_IND_1122	47	GGCTAAGTTCAAGCATCACC	48	CTTATGAGCATCTGCATATC
KM_IND_1237	49	ATCACTCCTAGATGTCGATT	50	AGTCAAGTTCCACTGAGCGC

No.	산지	품종	브랜드명
시료1	중국	japonica	복림문 동북대미 수정미
시료2	중국	japonica	복림문 동북대미 금갱도
시료3	중국	japonica	복림문 반금생태미
시료4	중국	japonica	칠하원 원립갱미
시료5	중국	japonica	칠하원 반금장립갱미
시료6	중국	japonica	금용어 청향도
시료7	중국	japonica	금용어 반금대미
시료8	중국	japonica	해전 (금주반금대미)
시료9	중국	japonica	미 (금주반금대미)
시료10	중국	japonica	향만원 반금생태진주미
시료11	중국	japonica	금도전 우질호전출호도 동북대미
시료12	중국	japonica	오호 우질호수출 호미 동북대미
시료13	중국	japonica	고선 동북대미
시료14	중국	japonica	복립문 동정월광미(중량)
시료15	중국	Aroma	복림문 도화향
시료16	중국	Aroma	규화양광 오상원산 도화향대미

본 발명의 일 실시예에서는, 쌀 시료에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 쌀 품종 구별방법을 제공할 수 있다.

표적 서열을 증폭하는 단계는 인식하고자 하는 쌀 품종의 게놈 DNA에 대하여 상기 프라이머 세트를 사용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계일 수 있다.

쌀의 게놈 DNA를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 표적 서열을 증폭하는 단계에서 프라이머 세트는 표적 서열을 증폭시킴으로써 표 2에 기재된 쌀 품종을 인식할 수 있는, 서열번호 1 내지 48의 염기서열로 구성되는 24개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머 세트를 의미한다. 여기서 “표적 서열”은 변이 영역에 특이적인 Indel 마커를 의미한다.

또한, 표적 서열을 증폭하는 단계에서 게놈 DNA의 증폭은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이며, 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용할 수도 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 쌀 품종에서 분리된 게놈 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및/또는 물을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

증폭 산물을 검출하는 단계는 상기 증폭 산물을 검출 및/또는 분석하는 단계이다. 바람직하게는, 상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.

본 발명의 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고, 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한 것이다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체 또는 다른 쌀 품종과 비교할 때, 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion) 두 종류의 밴드를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 Indel 마커를 사용함으로써 인식하고자 하는 쌀 품종이 표준유전체 또는 다른 쌀 품종과 상이한 고유의 증폭 결과를 나타내므로, 이들 간의 증폭 산물을 비교함으로써 품종을 인식할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<쌀 DNA 추출>

표3에 기재된 품종의 쌀에서 DNA 추출은 Saghai Maroof(1984)의 방법으로 수행하였다. 분말 상태의 쌀을 5 내지 10 ㎖의 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)을 가하여 더욱 곱게 분쇄한 후 15 ㎖ 원심분리 튜브에 넣은 뒤 60℃ 수조에 2시간 이상 진탕하였다. 클로로포름/이소아밀 알코올(Chloroform/isoamyl alcohol, 24:1) 용액 10 ㎖을 각각의 샘플에 첨가한 후, 손으로 뒤집어 주면서 섞은 뒤 3200 rpm, 4℃에서 15분 정도 원심분리 하였다. 상층액을 새 튜브에 옮긴 뒤 10 ㎕(10 ㎎/㎖) RNase A를 넣어 두었다. 30분 후에 아이소프로판올을 2/3 정도 넣고 섞어주어 DNA를 침전시켰다. 침전된 펠럿(pellet)을 꺼내어서 70℃ 에탄올, 10 mM NH₄OAc 20 ㎖에 첨가하였으며, 그 상태로 밤샘(overnight)시킨 후, DNA pellet을 말려서 10 mM NH₄OAc, 0.25 M EDTA를 1㎖ 첨가하였다. 추출한 DNA는 λDNA(100 ng/㎕)와 함께 1% 아가로스 겔에서 확인하였고, 20 ng/㎕로 정량하여 실험에 사용하였다.

이후 염색체 염기서열 해독을 위해 추출된 각 품종 DNA을 대상으로 DNA 라이브러리를 제작하고 일루미나(Illumina)사의 하이식2000(HiSeq2000) 염기서열해독기(sequencer)에서 표준 프로토콜(protocol)에 따라 각 품종의 염기서열을 해독하였다. 그 결과로 생산된 101-bp 또는 104-bp의 단편서열(read)을 생물정보분석에 사용하였다.

<변이영역 탐색>

변이 영역을 탐색하는 방법은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 분석하고자 하는 품종의 염기서열 정보를 10kb 단위로 표준유전체(국내산 화영 쌀)와 비교하면서 단일염기변이(SNV, Single nucleotide variation)를 검출하였다. 이 때 표준유전체 유전체 정보와 차이를 보이는 단일염기변이(SNV) 수가 10kb 당 4개 이상일 때, 본 발명에서는 이를 변이 영역(DMB, Dense mutation block)이라 규정하였다.

구체적으로, 바로 옆에 인접한 변이 영역이 90kb 간격 내에 있을 경우, 이를 합쳐서 하나의 변이 영역으로 표시하였다. 또한 변이 영역 이외의 영역은 변이가 없는 공통 영역으로 표시하며, 이웃한 공통 영역이 30kb 간격 내에 있을 때 동일 영역으로 표시하였다.

<변이영역 특이 Indel마커 선발>

변이영역 특이 Indel 마커를 선발하기 위하여, 상기에서 분석된 염기서열을 바탕으로 변이영역에서 5 bp이상의 Indel을 포함한 부분에서 primer3 프로그램을 이용하여 디자인하였고, 증폭산물의 예상크기는 100 내지 150 bp 정도로 하여 제작하였다.

PCR 반응의 혼합액(maxter mix)은 10 ㎕로 수행을 하였으며, 그 안에는 20 ng의 genomic DNA, 0.4 pmole의 각각의 프라이머 및 5 ㎕의 GoTaq Green Master Mix(Promega, Madison, WI, USA)로 구성하였다. PCR 증폭은 Biometra thermocycler(Biometra, Gottingen, Germany)를 사용하여 초기 변성(denaturation)을 95℃에서 5분간 수행하였고, 95℃에서 30초간 변성한 후, 48℃의 온도에서 30초간 어닐링(annealing)하였고, 72℃에서 30초간 증폭(extension) 과정을 총 34사이클을 반복했으며, 72℃에서 10분간 최종적인 증폭하였고, 4℃에서 PCR 증폭반응을 종결시켰다. 증폭된 PCR 산물은 3% 아가로스 겔에 로딩한 뒤 150V에서 60 내지 80분 가량 진행하였으며, 전기영동이 끝난 뒤 EtBr(Ethidium bromide)로 염색한 후 UV를 이용하여 밴드를 확인하였다.

상기 과정에 의하여 변이영역 특이 Indel 마커 선발을 위해 유전체 해독 정보를 바탕으로 최초 12,174개의 마커를 디자인하였다. 상기 정보를 바탕으로 595개의 Indel 마커 프라이머를 제작하고, 이 중 Indel 마커의 특징인 2가지 밴드타입(type)이 정확히 증폭되는 마커를 선발하였다(표2).

또한, 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머세트는 표3의 시료1과 시료2 내지 6을 구분할 수 있는 마커로 작용하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (3)

1. 서열번호1 및 서열번호2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 중국산 쌀 품종 구별용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은, 서열번호3 및 서열번호4로 구성되는 프라이머세트, 서열번호5 및 서열번호6으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호7 및 서열번호8로 구성되는 프라이머세트, 서열번호9 및 서열번호10으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호11 및 서열번호12로 구성되는 프라이머세트, 서열번호13 및 서열번호14로 구성되는 프라이머세트, 서열번호15 및 서열번호16으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호17 및 서열번호18로 구성되는 프라이머세트, 서열번호19 및 서열번호20으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호21 및 서열번호22로 구성되는 프라이머세트, 서열번호23 및 서열번호24로 구성되는 프라이머세트, 서열번호25 및 서열번호26으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호27 및 서열번호28로 구성되는 프라이머세트, 서열번호29 및 서열번호30으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호31 및 서열번호32로 구성되는 프라이머세트, 서열번호33 및 서열번호34로 구성되는 프라이머세트, 서열번호35 및 서열번호36으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호37 및 서열번호38로 구성되는 프라이머세트, 서열번호39 및 서열번호40으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호41 및 서열번호42로 구성되는 프라이머세트, 서열번호43 및 서열번호44로 구성되는 프라이머세트, 서열번호45 및 서열번호46으로 구성되는 프라이머세트, 서열번호47 및 서열번호48, 서열번호49 및 서열번호50으로 구성되는 프라이머세트를 더 포함하는 중국산 쌀 품종 구별용 조성물.
   
3. 쌀 시료에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 중국산 쌀 품종 구별방법.