CN109628424A - 一种新型嵌合dna聚合酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明开发了一种新型的嵌合DNA聚合酶，在一些实施方式中，根据本发明设计的嵌合聚合酶具有基本上类似于第一DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率和热稳定性以及基本上类似于第二DNA聚合酶的保真性。本发明的第一DNA聚合酶是KOD聚合酶SEQ ID No.1，第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶SEQ ID No.2。本发明技术方案利用高保真DNA聚合酶中功能区切换，结合不同DNA聚合酶的期望的功能特性。本发明尤其提供了稳健、快速以及准确的DNA聚合酶，用于DNA扩增、合成、检测、测序以及其它重要的重组DNA技术。发明的创新的高保真DNA聚合酶是一种同时具有高保真性，高持续合成能力，高延伸率，热稳定性，对盐有耐受性的高保真DNA聚合酶。

Description

一种新型嵌合DNA聚合酶及其制备方法

技术领域

本发明属于分子和细胞生物学领域，特别涉及DNA聚合酶。

背景技术

DNA聚合酶，又称DNA依赖的DNA聚合酶(DNA—dependent DNApolymerase，DNApol)，它以DNA单链为模版，以4种脱氧核苷酸为底物由5'端点开始复制合成一条与模版链序列互补的DNA新链。高保真DNA聚合酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。普通DNA聚合酶(如taqDNA聚合酶)的错配率在10^-5，而高保真DNA聚合酶错配率可降到10^-6甚至10^-7，大大降低了出错的可能性；它适合对PCR保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等。

然而，高保真DNA聚合酶的优点被它的相对低的持续合成能力(其会降低DNA扩增产物的产率)所抵消。Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA polymerase)，又称Pfu聚合酶，是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，在所有热稳定性聚合酶中Pfu DNA聚合酶的错误几率最低，错误率约为2.0x10^-6,然而Pfu酶扩增伸速度缓慢(25nts/s)，扩增产量较低(～20nts)，给众多的使用者带来了不便。KOD DNA聚合酶是从日本鹿儿岛县小宝(Kodakara)岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌Thermococcus kodakaraensis KOD1分离出来的具有高扩增能力的DNA聚合酶，其扩增速度是Taq酶的2倍，Pfu酶的6倍，扩增产量较高(～300nts)(takagiet al.1997)。

发明内容

本发明技术方案利用高保真DNA聚合酶中功能区切换，结合不同DNA聚合酶的期望的功能特性(例如，高持续合成能力，高延伸率，热稳定性，对盐、PCR添加物的抗性，以及高保真性)。因此，本发明尤其提供了稳健、快速以及准确的DNA聚合酶，用于DNA扩增、合成、检测、测序以及其它重要的重组DNA技术。

根据本发明其中一种技术方案开发了一种新型的嵌合DNA聚合酶，本发明的方法包括以下步骤：(a)提供基于第一DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域、掌和指域以及拇指域；(b)提供基于第二DNA聚合酶的核酸外切酶域；(c)结合来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶；其中嵌合聚合酶具有高于第一DNA聚合酶的保真性以及高于第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率和热稳定性。在一些实施方式中，根据本发明设计的嵌合聚合酶具有基本上类似于第一DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率和热稳定性以及基本上类似于第二DNA聚合酶的保真性。本发明的第一DNA聚合酶是KOD聚合酶SEQ ID No.1，第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶SEQ ID No.2。

根据本发明其中一种技术方案提供了一种新型的嵌合DNA聚合酶，该嵌合DNA聚合酶包含第一域和第二域，

第一域取自第一DNA聚合酶中的氨基酸序列，第一DNA聚合酶的特征在于延伸率、高持续合成能力、热稳定性；

第二域取自第二DNA聚合酶中的氨基酸序列，第二DNA聚合酶的特征在于高保真性；嵌合DNA聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、热稳定性。

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，上述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，上述第二DNA聚合酶选自Pfu聚合酶。

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，上述一个DNA聚合酶是KOD聚合酶，而所述另一个DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，该酶为上述任意一种嵌合聚合酶，其中第一域选自N-末端域、拇指域以及掌域和指域。

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，该酶为上述任意一种嵌合聚合酶，其中第二域是核酸外切酶域。

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，该酶为上述任意一种嵌合聚合酶，其中第一DNA聚合酶中所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(如SEQ ID No.4所示)的氨基酸残基N-末端域，掌域，指域和拇指域。

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，其中第二DNA聚合酶中所述氨基酸序列对应于Pfu聚合酶(如SEQ ID No.5所示)的氨基酸残基核酸外切酶域。

根据本发明其中一种技术方案提供了嵌合聚合酶，其中嵌合聚合酶的氨基酸序列相同于SEQ ID No.6，其中，嵌合聚合酶具有高于KOD的保真性以及高于Pfu的持续合成能力、延伸率和热稳定性。

本发明技术方案还提供了一种嵌合聚合酶，该嵌合聚合酶包括第一域和第二域，

第一域，取第一DNA聚合酶中的氨基酸序列N-末端域、拇指域以及掌域和指域；

第二域，取自第二DNA聚合酶中的氨基酸序列核酸外切酶域，其中，所述嵌合聚合酶具有高于所述第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、热稳定性，以及高于所述第一DNA聚合酶的保真性。

本发明技术方案还提供了一种嵌合聚合酶，该嵌合聚合酶包括至少80％相同于SEQ ID No.6的氨基酸序列。

本发明技术方案还提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码根据上述技术方案中任意一种的嵌合聚合酶氨基酸序列而编码。

本发明技术方案还提供了一种DNA合成的方法，该DNA合成的方法使用上述任意一种嵌合聚合酶进行DNA合成的方法。

本发明技术方案还提供了一种设计嵌合聚合酶的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供基于第一DNA聚合酶的N-末端域、掌域和指域和拇指域；

(b)提供基于第二DNA聚合酶的核酸外切酶域；

(c)结合来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶；

其中，所述嵌合聚合酶具有高于所述第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性，以及高于所述第一DNA聚合酶的保真性。

本发明技术方案还提供了一种设计嵌合聚合酶的方法，其中第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶。

本发明技术方案还提供了一种设计嵌合聚合酶的方法，其中第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

本发明技术方案还提供了根据上述设计嵌合聚合酶的方法设计的嵌合聚合酶。

本发明技术方案还提供了一种改善DNA聚合酶的保真性的方法，该方法包括以下步骤：用PFU的DNA聚合酶的相应序列替代KOD的DNA聚合酶的N-末端域，核酸外切酶域，掌域，拇指域和指域内的序列，使得DNA聚合酶具有更高的保真性、抗盐性或热稳定性。

本发明技术方案还提供了一种改善DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、热稳定性的方法，该方法包括以下步骤：用KOD的DNA聚合酶的相应序列替代PFU的DNA聚合酶的N-末端域，核酸外切酶域，掌域，拇指域和指域内的序列，使得DNA聚合酶具有更高的持续合成能力、延伸率或PCR增强子抗性。

本发明还提供了使用上述改善DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、热稳定性的方法改进的DNA聚合酶。

附图说明

图1、为本发明其一个实施例中嵌合DNA聚合酶包含KOD聚合酶的N-末端域、3’-5’核酸外切酶域，拇指域，掌和指域，以及Pfu聚合酶的3’-5’核酸外切酶域；

图2、为本发明其一个实施例中嵌合DNA聚合酶电泳图；

图3、为本发明其中一个实施例中嵌合DNA聚合酶与KOD，Pfu的合成速率检测电泳图。

图4、为本发明其一个实施例中嵌合DNA聚合酶与KOD，Pfu热稳定性检测电泳图；

图5、为本发明其中一个实施例中嵌合DNA聚合酶与KOD，Pfu扩增能力检测电泳。

具体实施方式

下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：嵌合DNA聚合酶的设计

Pfu和KOD具有非常不同的表型特征，尤其是，就延伸率、持续合成能力以及错误率而言,Pfu在所有热稳定性聚合酶中Pfu DNA聚合酶的错误几率最低，错误率约为2.0x10^-6,KOD是具有高扩增能力的DNA聚合酶，扩增速度是Taq酶的2倍，Pfu酶的6倍，扩增产量较高(～300nts)(takagi et al.1997)。

因此，本实施例的嵌合的DNA聚合酶是这两种酶的嵌合组合，其呈现比Pfu更低的错误率(0.93×I0-6)，并具有与KOD可比的持续合成能力和延伸率(分别为约300nt/s和106-138nt/s)。本发明提供的嵌合DNA聚合酶的核苷酸序列为SEQ ID No.3，具体是将KOD酶的N-末端域核苷酸序列(1-390&981-1104)，掌域核苷酸序列(1107-1347&1500-1761)，指域核苷酸序列(1350-1497)和拇指域核苷酸序列(1764-2322)与Pfu酶的3’5’核酸外切酶域核苷酸序列(393-978)的核苷酸序列构建到原核表达载体PET15b的NdeI/BamHI限制性酶切位点间，转入工程菌BL21(DE3)中，经培养后，获得表达菌株。

实施例2：嵌合DNA聚合酶的纯化

将获得的表达菌种1：100接种到LB培养基中，37℃，250rmp震荡培养到OD600＝2.5时，加入0.1mM IPTG诱导表达，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至16℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收菌。

1.破菌∶菌体总量与破菌缓冲液(50mM Tis-Hcl，pH 8.0)1∶10混合，即1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌。8000rpm离心30min收集上清。

2.将热变性缓冲液(25mM Tris，1mM EDTA，0.5％Tween20，pH8.0，)按1:1混合到超声完全的破菌液中，混匀后放入75℃水浴锅中变性30min，10000rpm离心20min收集上清。

3.NI柱纯化：将NI柱洗脱样品透析至Buffer A(20mM Tris,250mM NaCl,pH8.0)中，调节Buffer B(20mM Tris,250mM NaCl,500mM Imidazole,pH8.0)中咪唑的浓度进行梯度洗脱。

4.阴离子柱纯化：将NI柱洗脱的纯度较高的样品过离子柱，控核酸内外切酶残留及核酸残留。将NI柱洗脱样品透析至Buffer C(20mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)中，调节Buffer D(20mM Tris,1mM EDTA,1M NaCl,Ph8.0)中盐离子的浓度进行梯度洗脱，获得洗脱样品即为新型嵌合高保真DNA聚合酶。将获得样品透析至保存体系10mMTris-Hcl，1mMDTT，0.001％Tween20，0.001％NP40，50％甘油，PH8.0)，新型嵌合高保真DNA聚合酶电泳图如图1所示，其中泳道MK：Molecular weight marker；泳道SR：Final product(3μg,reduced)；泳道SN：Final product(3μg,non-reduced)。

实施例3：嵌合DNA聚合酶的延伸速率检测

将本发明实施例1制得的嵌合高保真DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶与Kod DNA聚合酶以λDNA为模板进行扩增，扩增片段为3000bp。结果如图3所示：Lnae1为嵌合DNA聚合酶。

反应体系及程序如下：

实施例3：嵌合DNA聚合酶的保真性检测

1)扩增LacIZα基因，引物序列如下：

F:GTTTTCCCAGTCACGAC

R:GGTATCTTTATAGTCCTGTCG

2)内切酶酶切，获得线性化载体：

3)将获得基因与载体连接，并将连接产物转化至宿主菌DH5a表达，在含有x-gal和IPTG培养基上培养，数蓝白斑数量，计算保真度。

根据以下公式计算：

结果如下表所示：

	白斑	蓝斑	总克隆数	错配率(x10<sup>-6</sup>)
					Pfu	120	6020	6140	1.31
Kod	370	5950	6320	4.02
					嵌合DNA聚合酶	85	5995	6080	0.93

实施例5：嵌合DNA聚合酶的热稳定性

将本发明实施例1制得的高保真DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶与Kod DNA聚合酶以λDNA为模板进行扩增，扩增片段为500bp。其中嵌合DNA聚合酶与Kod DNA聚合酶延伸时间为15s/kb,Pfu DNA聚合酶的延伸时间为60s/kb，结果如图4所示。

反应体系及程序如下：

实施例6：嵌合DNA聚合酶的扩增性能

将本发明实施例1制得的嵌合DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶与Kod DNA聚合酶以λDNA为模板进行扩增，扩增片段为4K-30K。其中嵌合DNA聚合酶与Kod DNA聚合酶延伸时间为15s/kb,Pfu DNA聚合酶的延伸时间为60s/kb，结果如图5所示。

上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

序列表

<110> 吴江近岸蛋白质科技有限公司

<120> 一种新型嵌合DNA聚合酶及其制备方法

<130> 2018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2408

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223> KOD密码子优化的核苷酸序列

<400> 1

atgattctgg ataccgacta tatcacggaa gatggcaaac cggtgatacg tatttttaag 60

nnaaagagaa tggtgagttc aaaatcgagt acgaccgcac ttttgagcca tatttctacg 120

cgnnttactg aaggacgata gcgccattga agaagttaaa aaaatcaccg cagagcggca 180

tgggnnacag tggtaaccgt gaagagagtt gaaaaagtcc agaaaaaatt tttgggacga 240

cctgtannga agtgtggaaa ctttatttca ctcaccccca agatgttccg gctatacgtg 300

ataaaattnn cgcgaacatc cagcggtcat tgatatttac gaatatgata taccttttgc 360

caagcgttac nnctcatcga caaaggcctg gtgccgatgg aaggtgatga agaattaaaa 420

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ccatcctgat gattnntctt atgcggatga agagggtgcc cgcgtaataa cctggaagaa 540

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aaaggccgga ttcatttcga cctgnntatc cggtaattcg tcgcactatc aacctcccca 840

catacacgtt agaagccgtc tatgagnngc agtttttggt caaccgaagg aaaaagttta 900

cgctgaggaa attaccactg cgtgggaann acaggcgaga atctggaacg tgtagcccgc 960

tattctatgg aggatgcaaa agttacctat nngaattggg taaggaattt cttccaatgg 1020

aggcgcagct gtcgagatta atagggcaga gcnnctgtgg gacgtgtctc gaagttcaac 1080

gggaaacctc gtcgaatggt ttctgttgcg gaaanngcat acgagcgtaa tgaacttgcc 1140

cctaacaaac cggatgaaaa ggagctggca cgccgtnncg ccaatcctat gaaggcggtt 1200

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ggctgtaaag aatatgatgt cgcgccgcag gttggtcata gannttttgc aaggacttcc 1380

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gaaaatgaaa gctacaatcg atccgataga acgtaagctg ctcgacnnta ccgccagcgg 1500

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ggtattgtaa agagtgcgcc gaatccgtga cggcatgggg ccgtgaatac nnatcaccat 1620

gactattaag gagatagaag agaaatatgg tttcaaagta atctactcgg atnnacagac 1680

ggattctttg cgacgattcc cggtgccgat gcagaaaccg tcaagaaaaa agcgnnatgg 1740

aattccttaa gtatataaat gctaaattac ctggtgccct ggagctggaa tacgaanngg 1800

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ggcaagatta cgaccagagg cctcgagatt gtacggcgtg attggagcga aatcgctaaa 1920

nngaaacaca ggcacgtgtc ttggaggcat tactgaaaga tggggacgtt gaaaaggcgg 1980

tgnncgaatt gtaaaagaag tcaccgaaaa actttctaag tacgaagttc cgccagagaa 2040

actgnngtga tacacgaaca aatcactcgt gatctgaaag actataaggc tacaggcccg 2100

catgtanngc agtcgccaaa cgcctcgcgg ctcggggtgt taaaattcgt cccggaacgg 2160

tgatcagtcn acnannntac attgtattga agggctcagg tcgcataggg gatagagcaa 2220

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gaacgtaa 2408

<210> 2

<211> 2403

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223>Pfu 密码子优化的核苷酸序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 2325

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223>嵌合DNA聚合酶的核苷酸序列

<400> 3

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gataccctga accgcgaagg ctgcaaagaa tatgatgtgg cgccgcaggt gggccatcgc 1320

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atggaatttc tgaaatatat taacgcgaaa ctgccgggcg cgctggaact ggaatatgaa 1740

ggcttttatg aacgcggctt ttttgtgacc aaaaaaaaat atgcggtgat tgatgaagaa 1800

ggcaaaatta ccacccgcgg cctggaaatt gtgcgccgcg attggagcga aattgcgaaa 1860

gaaacccagg cgcgcgtgct ggaagcgctg ctgaaagatg gcgatgtgga aaaagcggtg 1920

cgcattgtga aagaagtgac cgaaaaactg agcaaatatg aagtgccgcc ggaaaaactg 1980

gtgattcatg aacagattac ccgcgatctg aaagattata aagcgaccgg cccgcatgtg 2040

gcggtggcga aacgcctggc ggcgcgcggc gtgaaaattc gcccgggcac cgtgattagc 2100

tatattgtgc tgaaaggcag cggccgcatt ggcgatcgcg cgattccgtt tgatgaattt 2160

gatccgacca aacataaata tgatgcggaa tattatattg aaaaccaggt gctgccggcg 2220

gtggaacgca ttctgcgcgc gtttggctat cgcaaagaag atctgcgcta tcagaaaacc 2280

cgccaggtgg gcctgagcgc gtggctgaaa ccgaaaggca cctga 2325

<210> 4

<211> 798

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223>KOD氨基酸序列

<400> 4

Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile

1 5 10 15

Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg

20 25 30

Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile

35 40 45

Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Xaa Xaa Thr Val

50 55 60

Val Thr Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg

65 70 75 80

Pro Val Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro

85 90 95

Ala Ile Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr

100 105 110

Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Xaa Xaa Leu Ile Asp Lys

115 120 125

Gly Leu Val Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe

130 135 140

Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro

145 150 155 160

Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr

165 170 175

Trp Lys Asn Val Asp Leu Pro Tyr Xaa Xaa Val Asp Val Val Ser Thr

180 185 190

Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp

195 200 205

Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr

210 215 220

Leu Lys Lys Arg Cys Glu Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg

225 230 235 240

Asp Gly Ser Glu Pro Lys Xaa Xaa Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe

245 250 255

Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile

260 265 270

Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu

275 280 285

Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr

290 295 300

Thr Ala Trp Glu Xaa Xaa Thr Gly Glu Asn Leu Glu Arg Val Ala Arg

305 310 315 320

Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe

325 330 335

Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu Ile Gly Gln Ser Leu Trp

340 345 350

Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu

355 360 365

Arg Lys Xaa Xaa Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro

370 375 380

Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr Glu Gly Gly Tyr

385 390 395 400

Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp

405 410 415

Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro

420 425 430

Xaa Xaa Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala

435 440 445

Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro

450 455 460

Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Lys Lys

465 470 475 480

Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp Xaa Xaa

485 490 495

Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr

500 505 510

Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser

515 520 525

Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile

530 535 540

Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Xaa Xaa Thr Asp

545 550 555 560

Gly Phe Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys

565 570 575

Lys Ala Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala

580 585 590

Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr

595 600 605

Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Xaa Xaa Gly Lys Ile Thr

610 615 620

Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys

625 630 635 640

Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val

645 650 655

Glu Lys Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys

660 665 670

Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Xaa Xaa Val Ile His Glu Gln Ile

675 680 685

Thr Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val

690 695 700

Ala Lys Arg Leu Ala Ala Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val

705 710 715 720

Ile Ser Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala

725 730 735

Ile Pro Phe Asp Glu Phe Xaa Xaa Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp

740 745 750

Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile

755 760 765

Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr

770 775 780

Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp Leu Lys Pro Lys Gly Thr

785 790 795

<210> 5

<211> 799

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223>Pfu 氨基酸序列

<400> 5

Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile

1 5 10 15

Arg Leu Phe Lys Lys Glu His Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg

20 25 30

Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile

35 40 45

Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Xaa Xaa Lys Ile

50 55 60

Val Arg Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys

65 70 75 80

Pro Ile Thr Val Lys Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro

85 90 95

Thr Ile Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe

100 105 110

Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Xaa Xaa Leu Ile Asp Lys

115 120 125

Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe

130 135 140

Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro

145 150 155 160

Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu His Glu Ala Lys Val Ile Thr

165 170 175

Trp Lys His Ile Asp Leu Pro Tyr Xaa Xaa Val Glu Val Val Ser Ser

180 185 190

Glu Arg Glu Asn Ile Lys Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp

195 200 205

Pro Asp Ile Ile Val Thr Tyr His Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr

210 215 220

Leu Ala Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg

225 230 235 240

Asp Gly Ser Glu Pro Lys Xaa Xaa Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr

245 250 255

Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile

260 265 270

Thr Arg Thr Ile His Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu

275 280 285

Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala

290 295 300

Lys Ala Trp Glu Xaa Xaa Ser Gly Glu His Leu Glu Arg Val Ala Lys

305 310 315 320

Tyr Ser Asn Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe

325 330 335

Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu Val Gly Gln Pro Leu Trp

340 345 350

Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu

355 360 365

Arg Lys Xaa Xaa Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala Pro His Lys Pro

370 375 380

Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Thr Gly Gly

385 390 395 400

Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu His Ile Val Tyr Leu

405 410 415

Asp Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser

420 425 430

Xaa Xaa Pro Asp Thr Leu His Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr Asp Ile

435 440 445

Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly Phe Ile

450 455 460

Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Thr

465 470 475 480

Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu Xaa Xaa

485 490 495

Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala His Ser Phe Tyr Gly

500 505 510

Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu

515 520 525

Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu

530 535 540

Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Xaa Xaa Asp Thr

545 550 555 560

Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys

565 570 575

Lys Lys Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr Ile His Ser Lys Leu Pro Gly

580 585 590

Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val

595 600 605

Thr Lys Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Xaa Xaa Glu Gly Lys Val

610 615 620

Ile Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala

625 630 635 640

Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Gly Asp

645 650 655

Val Glu Glu Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala

660 665 670

His Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys Xaa Xaa Leu Ala Ile Tyr Glu Gln

675 680 685

Ile Thr Arg Pro Leu His Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala

690 695 700

Val Ala Lys Lys Leu Ala Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met

705 710 715 720

Val Ile Gly Tyr Ile Val Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser His Arg

725 730 735

Ala Ile Leu Ala Glu Glu Xaa Xaa Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr

740 745 750

Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg

755 760 765

Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys

770 775 780

Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Ser Trp Leu Asn Ile Lys Lys Ser

785 790 795

<210> 6

<211> 774

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221>

<223>嵌合DNA聚合酶的氨基酸序列

<400> 6

Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile

1 5 10 15

Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg

20 25 30

Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile

35 40 45

Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr

50 55 60

Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val

65 70 75 80

Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile

85 90 95

Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro

115 120 125

Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr

130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile

165 170 175

Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys

180 185 190

Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr

195 200 205

Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu

210 215 220

Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys

225 230 235 240

Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile

245 250 255

His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr

260 265 270

Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu

275 280 285

Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn

290 295 300

Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr

305 310 315 320

Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335

Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu

340 345 350

Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala

355 360 365

Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr

370 375 380

Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile

385 390 395 400

Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His

405 410 415

Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp

420 425 430

Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe

435 440 445

Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys

450 455 460

Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp

465 470 475 480

Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr

485 490 495

Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser

500 505 510

Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile

515 520 525

Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe

530 535 540

Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala

545 550 555 560

Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu

565 570 575

Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys

580 585 590

Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu

595 600 605

Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala

610 615 620

Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val

625 630 635 640

Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro

645 650 655

Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp

660 665 670

Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala

675 680 685

Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu

690 695 700

Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe

705 710 715 720

Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln

725 730 735

Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys

740 745 750

Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp

755 760 765

Leu Lys Pro Lys Gly Thr

770

Claims (20)

1.一种新型的嵌合DNA聚合酶，其特征在于：所述嵌合DNA聚合酶包含第一域和第二域，

所述第一域取自第一DNA聚合酶中的氨基酸序列，所述第一DNA聚合酶的特征在于延伸率、高持续合成能力、热稳定性；

所述第二域取自第二DNA聚合酶中的氨基酸序列，所述第二DNA聚合酶的特征在于高保真性；所述嵌合DNA聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、热稳定性。

2.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶。

3.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述第二DNA聚合酶选自Pfu聚合酶。

4.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述一个DNA聚合酶是KOD聚合酶，而所述另一个DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述第一域选自N-末端域、拇指域以及掌域和指域。

6.根据权利要求5所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述第二域是核酸外切酶域。

7.根据权利要求6所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述第一DNA聚合酶中所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID No.4)的氨基酸残基N-末端域，掌域，指域和拇指域。

8.根据权利要求7所述的嵌合聚合酶，其特征在于，在所述第二DNA聚合酶中所述氨基酸序列对应于Pfu聚合酶(SEQ ID No.5)的氨基酸残基核酸外切酶域。

9.根据权利要求8所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述的嵌合聚合酶的氨基酸序列相同于SEQ ID No.6，其中，所述嵌合聚合酶具有高于KOD的保真性以及高于Pfu的持续合成能力、延伸率和热稳定性。

10.一种嵌合聚合酶，其特征在于，所述嵌合聚合酶包括第一域和第二域，

所述第一域，取第一DNA聚合酶中的氨基酸序列N-末端域、拇指域以及掌域和指域；

所述第二域，取自第二DNA聚合酶中的氨基酸序列核酸外切酶域，其中，所述嵌合聚合酶具有高于所述第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、热稳定性，以及高于所述第一DNA聚合酶的保真性。

11.根据权利要求10所述的一种嵌合聚合酶，其特征在于，包括至少80％相同于SEQ IDNo.6的氨基酸序列。

12.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合聚合酶编码。

13.一种DNA合成的方法，其特征在于，所述DNA合成的方法使用权利要求1～12中任一项所述的嵌合聚合酶进行DNA合成的方法。

14.一种设计嵌合聚合酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)提供基于第一DNA聚合酶的N-末端域、掌域和指域和拇指域；

(b)提供基于第二DNA聚合酶的核酸外切酶域；

(c)结合来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶；

其中，所述嵌合聚合酶具有高于所述第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性，以及高于所述第一DNA聚合酶的保真性。

15.根据权利要求14所述的设计嵌合聚合酶的方法，其特征在于，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶。

16.根据权利要求14所述的设计嵌合聚合酶的方法，其特征在于，所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

17.一种利用根据权利要求14～16中任一项所述的方法设计的嵌合聚合酶。

18.一种改善DNA聚合酶的保真性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：用PFU的DNA聚合酶的相应序列替代KOD的DNA聚合酶的N-末端域，核酸外切酶域，掌域，拇指域和指域内的序列，使得DNA聚合酶具有更高的保真性、抗盐性或热稳定性。

19.一种改善DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、热稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：用KOD的DNA聚合酶的相应序列替代PFU的DNA聚合酶的N-末端域，核酸外切酶域，掌域，拇指域和指域内的序列，使得DNA聚合酶具有更高的持续合成能力、延伸率或PCR增强子抗性。

20.根据权利要求18或19所述的方法的改进的DNA聚合酶。