CN117925907A - 检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域,所述试剂盒包括反应液，所述反应液含有：甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的扩增引物和荧光探针，以及副流感病毒I型和副流感病毒III型的引物；副流感病毒I型的引物为：FAM‑TAAGGATAAGTCACAGACATTT(BHQ1)GAT和ATTGATGCTCTTCTCCT；副流感病毒III型的引物为：FAM‑TTGGACCGACAATAACTGAT(BHQ1)GAC和AAAGACACCAAGAACCCTGCC，FAM为荧光基团、BHQ1为淬灭基团。在荧光探针的扩增检测的基础上，引入熔解曲线对样本进行检测，提高了多重PCR的检测通量，提高呼吸道病毒的检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法。
背景技术
呼吸道感染(RTI)是最常见的疾病之一，青少年和成人每年大约被感染2-4次，儿童每年大约被感染6-8次。儿童下呼吸道感染病原体中病毒占比高达61.4％，成人社区获得性肺炎中病毒也占有较高比例(15-34.9％)。除了极高的感染频率，部分严重的急性呼吸道病毒感染可以造成严重的后果。据世界卫生组织统计，每年因呼吸道病毒感染造成的社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)达2亿人次，其中1.5亿儿童患者为发展中国家的儿童，其中重症病例＞1460万例，死亡儿童＞100万例。同时，呼吸道病毒感染也可以导致多种并发症，包括中耳炎、鼻窦炎和继发细菌感染等。尤其重要的是，呼吸道病毒感染是儿童哮喘急性发作最为重要的诱因之一：呼吸道病毒感染占3岁以下儿童喘息发作诱因的90％以上；即使在学龄儿童，呼吸道感染也占其哮喘急性发作诱因的80％～85％。因此进行呼吸道病原体检测具有重要的临床意义。常见的呼吸道感染病毒主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、副流感病毒等。
呼吸道病毒的主要检测方式是血清学检查、病毒的分离和培养、抗原及抗体检查、PCR检测。病毒的分离和培养是证明呼吸道病毒感染的“金标准”，特异性高，但耗时长，操作复杂，对技术和环境要求高；抗原检测也是病毒感染早期诊断的主要方式之一，但其灵敏度低，容易出现假阴性结果；病毒抗体检测：机体感染病毒后，早期出现IgM抗体，随后IgG抗体升高，临床上IgG抗体升高在急性期和恢复期升高至4倍及以上，具有诊断价值，方法简便，结果可信，但是抗体的产生存在着窗口期。而病毒PCR检测技术的灵敏度高特异性强，可早期诊断，能快速准确区分病毒类型和亚型，并且多重PCR可检测多种病原体，大大提高了检测效率。目前，基于Taqman探针法的多重PCR技术的检测通量受限于荧光PCR仪的检测通道。主流的荧光PCR仪多为4-5个检测通道，因此单管多重PCR检测通量最多为4-5个。
随着检测行业发展的需求和人们对精准医疗的重视，多基因、多病原体的联合检测变得越来越迫切，同时第二代测序(NGS)等具有更高检测通量的新技术的兴起也对多重PCR技术提出了更高的要求。与多重PCR相比NGS技术具有高通量的技术优势，但其仪器试剂成本更高、检测周期长、操作复杂。若能提高多重PCR的检测通量能大大提高多重PCR技术的应用。因此需要设计一种可提高荧光PCR仪单管检测通量的试剂盒及其使用方法。
发明内容
针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法，基于探针法和熔解法分别进行检测，提高检测通道数和呼吸道病毒的检测效率。
本发明公开了基于探针法和熔解法检测呼吸道病毒的试剂盒,包括反应液，所述反应液含有：甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的扩增引物和荧光探针，以及副流感病毒I型和副流感病毒III型的引物；副流感病毒I型的引物为：FAM-TAAGGATAAGTCACAGACATTT(BHQ1)GAT和ATTGATGCTCTTCTCCT；副流感病毒III型的引物为：FAM-TTGGACCGACAATAACTGAT(BHQ1)GAC和AAAGACACCAAGAACCCTGCC，FAM为荧光基团、BHQ1为淬灭基团。
优选的，所述反应液还含有内标的引物，所述内标的引物为：FAM-AGCATCCTGCTGGTGGTT(BHQ1)AC和CAAAGAGTCCTGGCCCACAT。
优选的，所述甲型流感病毒的扩增引物为：TCACAGCAGACAGGGGGATA和ACGGCTAGGGGTGATACCAT，探针为：FAM-ATGATTCCTGAAAGGAATGA-BHQ1；
乙型流感病毒的扩增引物为：GTTGGCTAAAATTGAA和TTCTTTTCAATTCTTGAT，探针为：VIC-TAAAGCAGCTGTTAAGGGAC-BHQ1；
合胞病毒的扩增引物为：AACTCCTTTGGTTAGAGATG和TTCATCATTGTCAAACAGATT，探针为：CY5-AGCAACTCATTGAGTATGAT-BHQ3；
腺病毒的扩增引物为：ATCGTGTGGTGATTGGCTGT和TCCACCCCCACAAAACGTC，探针为：ROX-CCAATTGCCGATTTTCC-BHQ2；
其中，VIC、CY5和ROX分别为荧光基团，BHQ2和BHQ3分别为淬灭基团。
优选的，所述试剂盒还包括酶液和PCR缓冲液，所述酶液含有逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UDG酶；所述反应液含有：引物探针、氯化镁以及dNTP/dUTP。
本发明还提供一种利用上述试剂盒检测呼吸道病毒的使用方法，包括以下步骤：提取待测样本的核酸；利用试剂盒配制PCR反应液；利用所述核酸和PCR反应液进行扩增；获得扩增产物的多个通道荧光强度和熔解曲线；根据所述多个通道荧光强度，获得甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果；根据熔解曲线的检出峰获得副流感病毒I型和副流感病毒III型的检测结果。
优选的，在变性阶段采集所述通道荧光强度。
优选的，所述通道荧光强度的采集温度温92-96度。
优选的，所述副流感病毒I型的检出峰为80±1℃，所述副流感病毒III型的检出峰为85±1℃。
优选的，根据熔解曲线获得内标的检出峰，所述内标的检出峰为71±1℃。
优选的，采用约登指数判断甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：在荧光探针的扩增检测的基础上，引入熔解曲线对样本进行检测，提高了多重PCR的检测通量，提高呼吸道病毒的检测效率。
附图说明
图1是本发明的基于探针法和熔解法检测呼吸道病毒的使用方法流程图；
图2为FAM通道中甲型流感病毒的阳性检测结果图；
图3为VIC通道乙型流感病毒的阳性检测结果图；
图4为CY5通道合胞病毒的阳性检测结果图；
图5为ROX通道腺病毒的阳性检测结果图；
图6为副流感病毒I型病毒阳性检测结果图；
图7为副流感病毒III型病毒阳性检测结果图；
图8为阳性对照扩增曲线检测结果图；
图9为阳性对照熔解曲线检测结果图；
图10为阴性对照扩增曲线检测结果图；
图11为阴性对照熔解曲线检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
检测呼吸道病毒的试剂盒包括反应液和酶液，所述反应液主要成分包括引物探针、氯化镁，dNTP/dUTP；所述酶液为逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UDG酶。
其中，各引物的序列参见表1。
表1
其中，甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒分别设置了引物对和探针(Taqman探针)，探针中荧光基团(FAM、VIC、CY5或ROX)设置在5’端，淬灭基团(BHQ1、BHQ2或BHQ3)在3’端，起到了封闭的作用，因此该探针不能用作引物进行扩增；副流感病毒I型、副流感病毒III型和内标的F引物5’端连接有荧光基团FAM，淬灭基团BHQ1标记在F引物的中间位置，而不会封闭3’端，其可作为引物进行扩增。
在FAM通道下，甲型流感病毒的扩增检测、副流感病毒I型和副流感病毒III型的熔解检测条件各不相同，可精确检测出该通道下甲型流感病毒、副流感病毒I型和副流感病毒III型。
当引物为自由状态下，由于柔性卷曲荧光基团与淬灭基团距离较近，荧光被淬灭；当引物结合到模板链后，荧光基团和淬灭基团距离变远，荧光基团发出的荧光可以被接收和检测，并产生带有荧光标记的产物链。因此，通过监测荧光信号的强弱变化就可以检测是否有目的序列扩增，从而检测出是否有目的病毒。即引物和单链DNA产物没有荧光，在双链DNA产物状态下，有荧光信号产生。
实施例
试剂盒中各组分及原料浓度和PCR反应浓度参见表2。
表2
具体的使用方法包括：
步骤S1：核酸提取。取临床上疑似呼吸道病毒感染的咽拭子样本0.2mL于EP管中，利用磁珠法或柱式提取法提取待检样本中的核酸。阳性对照品与阴性对照品随待测样本一同提取。
步骤S2：配制PCR反应液。取19μL反应液和1μL酶液，配制20μL PCR定性反应液；所述反应液主要成分包括引物探针、氯化镁，dNTP/dUTP；所述酶液为逆转录酶、Taq DNA聚合酶、UDG酶。
步骤S3：利用所述核酸和PCR反应液进行扩增。
步骤S4：获得扩增产物的多个通道荧光强度和熔解曲线。
具体的，取步骤S1中得到的提取产物10μL、阳性对照品10μL、阴性对照品10μL，分别加入步骤(2)的20μL PCR反应液体，配制PCR体系共30μL，在不低于4色的荧光定量PCR仪上进行扩增和检测，以国产宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪为例，具体反应程序如表3所示。
表3
常规荧光PCR反应程序在退火延伸阶段采集荧光，为避免熔解曲线法引物在扩增时产生的荧光信号对探针的荧光信号造成干扰，将采集荧光的阶段改为变性阶段。更具体的，为避免对甲流FAM通道的影响，将扩增时的荧光采集阶段由常规的退火延伸改为95℃变性阶段，此时副流感病毒I型、副流感病毒III型和内标的标记引物为单链处于柔性卷曲状态，荧光强度最低。
步骤S5：根据所述多个通道荧光强度，获得甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果。
步骤S6：根据熔解曲线的检出峰获得副流感病毒I型和副流感病毒III型的检测结果。
具体的，依据各通道的扩增曲线结果以及熔解曲线的熔解峰结果进行结果判读。以待测靶标的假病毒为样本，样本、阳性对照和阴性对照分别进行核酸提取后，各取10μL核酸作为模板加入到配制好的PCR反应液中。在宏石仪器上进行PCR反应并依据各通道的扩增曲线和熔解峰的结果判定结果的准确性。
结果判定依据：阳性判断值：采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数(Youdenindex)确定阳性判断值。例如，FAM、VIC、ROX、CY5通道阳性判断值为37，待测样本Ct值不大于37即为阳性,如图2-图5所示，其中横坐标为循环数Ct、纵坐标为相对荧光强度Rn；阳性对照和阴性对照的扩增曲线分别如图8和10所示。
如图6、图7，副流感病毒I型和副流感病毒III型病毒的熔解峰不同。如图9和图11，熔解曲线中，71±1℃产生的熔解峰判定为内标、80±1℃产生的熔解峰判定为副流感病毒I型、85±1℃产生的熔解峰判定为副流感病毒III型，三个熔解峰温度差较大，荧光信号不会相互干扰。熔解曲线中，横坐标为温度℃、纵坐标为相对荧光强度变化速率-d(Rn)/dT。
本发明在Taqman探针荧光曲线PCR的基础上，引入了熔解曲线法的检测，在荧光PCR仪检测通道有限的基础上大大提高了多重PCR的检测通量。提高检测效率，降低了检测成本。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测呼吸道病毒的试剂盒,其特征在于，包括反应液，所述反应液含有：甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒、腺病毒的扩增引物和探针，以及副流感病毒I型和副流感病毒III型的引物；
其中，副流感病毒I型的引物为：FAM-TAAGGATAAGTCACAGACATTT(BHQ1)GAT和ATTGATGCTCTTCTCCT；
副流感病毒III型的引物为：FAM-TTGGACCGACAATAACTGAT(BHQ1)GAC和AAAGACACCAAGAACCCTGCC；
FAM为荧光基团、BHQ1为淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液还含有内标的引物，所述内标的引物为：FAM-AGCATCCTGCTGGTGGTT(BHQ1)AC和CAAAGAGTCCTGGCCCACAT。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲型流感病毒的扩增引物为：TCACAGCAGACAGGGGGATA和ACGGCTAGGGGTGATACCAT，探针为：FAM-ATGATTCCTGAAAGGAATGA-BHQ1；
乙型流感病毒的扩增引物为：GTTGGCTAAAATTGAA和TTCTTTTCAATTCTTGAT，探针为：VIC-TAAAGCAGCTGTTAAGGGAC-BHQ1；
合胞病毒的扩增引物为：AACTCCTTTGGTTAGAGATG和TTCATCATTGTCAAACAGATT，探针为：CY5-AGCAACTCATTGAGTATGAT-BHQ3；
腺病毒的扩增引物为：ATCGTGTGGTGATTGGCTGT和TCCACCCCCACAAAACGTC，探针为：ROX-CCAATTGCCGATTTTCC-BHQ2；
其中，VIC、CY5和ROX分别为荧光基团，BHQ2和BHQ3分别为淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶液和PCR缓冲液，所述酶液含有逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UDG酶；
所述反应液还含有：氯化镁以及dNTP/dUTP。
5.如权利要求1-4任一项所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样本的核酸；
利用所述试剂盒配制PCR反应液；
利用所述核酸和PCR反应液进行扩增；
获得扩增产物的多个通道荧光强度和熔解曲线；
根据所述多个通道荧光强度，获得甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果；
根据熔解曲线的检出峰获得副流感病毒I型和副流感病毒III型的检测结果。
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，在变性阶段采集所述通道荧光强度。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述通道荧光强度的采集温度温92-96度。
8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述副流感病毒I型的检出峰为80±1℃，所述副流感病毒III型的检出峰为85±1℃。
9.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，还根据熔解曲线获得内标的检出峰，所述内标的检出峰为71±1℃。
10.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，采用约登指数判断甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒和腺病毒的检测结果。
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| CN202311817182.7A CN117925907A (zh) | 2023-12-27 | 2023-12-27 | 检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法 |
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| CN202311817182.7A CN117925907A (zh) | 2023-12-27 | 2023-12-27 | 检测呼吸道病毒的试剂盒及其使用方法 |
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Family Applications (1)
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2023
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