JPS63137677A - アルカリセルラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なアルカリセルラーゼに−４２５及びこれ
を産生する、バチルス属に属し、中性培地に生育する微
生物に関する。

〔従来の抜術〕

繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離された来
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウトモナ
ス属、セルロモナス属、ルーミノコツカス局、バブール
ス属等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモア
クチノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しか
しながら、現時点では、バイオマス用セルラービの工業
的規模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界に於いて、微生物の産生ずるセルラーゼのほ
とんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵
素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーぜに分類
されるものであって、衣料用洗浄剤組成物中に配合する
ための条件を有するセルラーゼ、すなわち、アルカリ領
域で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有する
、所謂アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼ
の存在は、極めて少ないのが実情である。ここでアルカ
リセルラーゼとは、至適ｐＨがアルカリ領域にあるもの
を言い、アルカリ耐性セルラーゼとは、至適１）Ｈは中
性から酸性領域にあるが、アルカリ領域に於いても至適
ｐｌ＋に於ける活性に比較して十分に活性を有しかつ安
定性を保持するものを言う。また、中性とはｐＨ６〜８
の範囲を言い、アルカリ性ｉはこれより高いｐＨ範囲を
いう。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーぜ及びアルカリ耐性セルラーゼの生
産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養に
よりセルラーゼＡを採取する方法（特公昭５０−２８５
１５号公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細
菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生産する
方法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ
性バチルスＮＣＬ１１３９を培養してカルボキシメチル
セルラービを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ、Ｆ、　
。

にｕｄｏ、Ｔ、・ａｎｄ　Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、に、、
　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

１３１．３３３９．（１９８５）　）及びストレプトマ
イセス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する
方法〈特開昭６１−１９４８３号公報）が報告されてい
るに過ぎず、しかもいずれも工業的発酵生産に適うもの
では無かった。

ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌の一種で
あるバチルス　エスピーＫＳＭ−６３５（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｏ、ＫＳＭ−６３５）　　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８
８７２＞が衣料用洗浄剤配合成分として適したアルカリ
セルラーゼＫを収率良く生産すること及び更に培養条件
を選択することにより、より生産性が高まり、アルカリ
セルラーゼの工業的発酵生産が可能となることを見出し
た。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記バチルス　エスピーＫＳＭ−６３５
の培養条件は、必ずしも工業的に右利なものと言えない
。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、Ｉ）Ｈをアル
カリ性に保ち続ける必要があるが、現在までのところ、
好アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史
は浅く、通常の中性徴生物と比較するとこれら好アルカ
リ性微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積
されておらず、工業的発酵生産を行うにあたっての培地
調製、培養方法が操作上の難点となっていた。

更に、前述した報告例のうち、至適ｐｌ＋がアルカリ領
域にある本来のアルカリセルラーゼとしては、バチルス
　Ｎ１菌株、Ｎ２菌株、Ｎ３菌株（特公昭５０−２８５
１５＠公報）の生産する、至適ｐＨがそれぞれ８〜９．
９．８〜９の酵素、バチルス　ＮＱ１１３９の産生する
、至適ｐＨ９のもの及びバチルス　エスピーＫＳＭ−６
３５の産生ずる至適ｐＨ１０のアルカリセルラーゼＫが
存在するが、更に洗浄剤組成物に配合し用いることので
きる至適１）Ｈがアルカリ側にあり、かつその作用ｐＨ
範囲の広いアルカリセルラーゼの提供が求められていた
。

（問題点を解決するための手段〕 斯る実情において本発明者らは中性培地で生育し、しか
も作用の優れたアルカリセルラーゼを産生ずることので
きる菌株を得べく種々研究をおこなった。

かかる問題点を解決するには、中性領域で生育する菌株
を宿主として、該当するセルラーゼ遺伝子をクローニン
グする、所１３Ｕ伝子組換えの手法を取ることも可能で
あるが、アルカリ領域に至適ｐｌ＋を有するアルカリセ
ルラーゼ生産菌を生産する中性微生物を自然界に探索し
、これを分離することがより有効である。しかして、本
発明者らは上記微生物を自然界に求めた結果、栃木県芳
賀郡の土壌より分離した微生物は、上記要望を満すもの
であることを見出し、本発明を完成した。

本発明の菌株は、下に示すような菌学的性質を示す。な
お、菌株の分類には、次に示す１〜２５の培地を用いた
。（表示は、ｆｆｌｆｆｉ％）培地　１．肉エキス、　
１．０　：バクトペプトン、　１．０　：　ＮａＣ１！
。

０．５；バクト寒天、　１．５　（＋）Ｈ７，２）培地
　２．肉エキス、　１．０　：バクトペプトン、　１．
０　；　Ｈａ（Ｊ。

０．５　：　（ｐＨ７，２） 培地　３．肉エキス、　１．０　：バクトペブトン、　
１．０　：Ｎａｃｉ！。

０．５；ゼラチン、　１．０　（ｐＨ７，２）培地　４
．バクトリトマスミルク、１０．０培地　５．バタトベ
ブトン、　１．０　：　ＫＮ（ｈ、　０．１培地　６．
バクトペブトン、　１．０　：　　ＮａＮ（ｈ、　１．
０培地　７．バクトベブトン、　０．７　：ＮａＣｅ、
　０．５　ニブドウ糖。

０．５　（１）Ｈ７，０） 培地　８．バクトベブトン、１．０ 培地　９．ＴＳＩ寒天（栄研化学製）：指示量培地１０
．肉エキス、　１．０　：バクトペプトン、　１．０　
；　Ｎａｃｌ！。

０．５；可溶性澱粉、０．２：寒天、１．５培地１１．
　　ＮａＮＨａｔ−ＩＰＯａ・４８ｚｏ、０．１５：Ｋ
Ｈ２ＰＯ，ｓ。

０．１　：ＭＱＳＯａ・７Ｈ２０，０，０２：クエン酸
ナトリウム、　０．２５　（ｐＨ６，８） ゆｊｌ！１１２．爾清屯を荒麓）培地、１化学製）２指
示量　　！培地１３．ブドウ糖、１．Ｏ：Ｋ１１２　Ｐ
Ｏ４、０，１：ＭＱＳＯ４・７Ｈ２０，０，０５；ＫＣ
ｊ！、０．０２：窒素源、０．１（ｐＨ７，２） 窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムを用い
た。

培地１４．キングＡ培地“栄研″（栄研化学製）：指示
ω培地１５．キングＢ培地“栄研″（栄研化学製）：指
示量培地１６．尿素培地”栄研”（栄研化学製）：指示
量培地１７．チトクローム・オキシダーゼ試験用波紙（
日本製薬製） 培地１８．３％過酸化水素水 培地１９．ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）：指示量培
地２０．　　（ＮＨａ）２ＨＰＯａ、ｏ、１；ＫＣＪ！
、０．０２：ＭＱＳＯａ・７Ｈ２０，０，０２：酵母エ
キス、０．０２：バクト寒天、　２．０　；　ＢＣＰ　
（０，２％溶液）、０．４培地２１．バクト・サブ０−
・デキストロース寒天培地（Ｏｉ　ｆｃｏ社’１１）　
：指示は 培地２２．肉エキス、０．３：バクトベプトン、０．５
：［１エキス、　１．０　：グリセリン、２．０培地２
３．フェニルアラニンマロン酸塩培地（日本製薬社製）
：指示量 培地２４．スキムミルク、　５．０　：バクト寒天、１
．５培地２５．肉エキス、０．３：バクトベブトン、０
．５：Ｌ−チロシン、０．５：バクト寒天、１．５（菌
学的性１１） （ａ）ｆｆｉ［Ｊｔ的観察結果 菌体の大きさは、０．４〜０．８趨×１．５〜４．０趨
の桿菌であり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（０，８
〜１．２趨×１．２〜１．５　ｕｒｎ　）を作る。周鞭
毛を有し運動性がある。ダラム染色は不定。抗酸性はな
い。

（ｂ）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板環？！（培地１） 生育状態は弱い。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁も円滑である。又集落の色調は白色半透明で光沢
がある。

■肉汁寒天斜面培養　（培地１） 生育は弱く、その状態は拡布状で光沢が有り、白色半透
明である。

■肉汁液体培養　（培地２） 生育するが、その状態は弱く、表面生育、上層生育は無
い。

■肉汁ゼラチン穿刺培養　（培地３） 生育するが、その状態は弱く、ゼラチンの液化は認めら
れない。

■リドマスミルク培地　（培地４） ミルクの凝固、液化は認められない。又、リドマスの変
色も認められなかった。

（Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元及び脱窒反応　（培地５，６）共に、陰
性。

■ＭＲテスト　（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ｐＨ５，２）。

■ＶＰテスト　（培地７） 陰性（ｐｌｌ　　５．２）。

■インドールの生成　（培地８） 陰性。

■硫化水素の生成　（培地９） 陰性。

■澱粉の加水分解　（培地１０） 陽性。

■クエン酸の利用　（培地１・１．１２）コーサ培地及
びクリステンセン培地で、ともに陰性。

■無機窒素源の利用　（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに陰性。

■色素の生成　（培地１４．１５） 陰性。

■ウレアーゼ　（培地１６） 陰性。

■オキシダーゼ　（培地１７） 陽性。

＠カタラーゼ　（培地１８） 陽性。

■生育の範囲　（培地２） 生育の温度範囲は１５〜ｂ 温度範囲は２５〜３０℃。

生育（７）ｐＨＩｔ！［ＩＢハｐＨ５〜１０、生ＹＩＲ
適ｐＨ［１ｌｆｌはｐ１１６〜９であった。

［有］酸素に対する態度 通性嫌気性。

［相］Ｏ−Ｆテスト　（培地１９） 生育するが、好気嫌気共に生育悪し。

［相］糖の利用性（＋：利用する、−二利用しない）１
、　１−アラビノース　　　＋ ２、　０−キシロース　　　　＋ ３、　　Ｄ〜グルコース　　　　＋ ４、　　Ｄ−マンノース　　　　＋ ５、　フラクトース　　　　　＋ ６、　０−ガラクトース　　　＋ ７、麦芽糖　　　　　　　　十 ８、ショ糖　　　　　　　　十 ９、乳糖　　　　　　　　　十 １０、トレハロース　　　　　＋ １１、　Ｄ−ソルビット　　　　士 １２、０−マンニット　　　　＋ １３、　　イノジット　　　　　　− １４、グリセリン　　　　　　± １５、　　デンプン　　　　　　　＋ ＠ｖＰ培地に於けるｐｌｌ（培地７） ｐｌｌ　　５．２ ［相］食塩含有培地に於ける生育　（培地１を改変）５
％生育せず。

７％生育せず。

１０％生育せず。

［相］ｐＨ５，７に於ける生育　（培地２１）生育せず
。

［相］ジ、ハイドロキシアセトンの生成　（培地２２）
陰性、陽性は、はっきりせず。

０フエニルアラニンの脱アミノ化　（培地２３）陰性。

Ｏカゼインの分解　（培地２４） 陰性。

■ヂロシンの分解　（培地２５） 陰性。

以上の菌学的性質について、バーシーズ・マニュアル・
オプ・デイタミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒ
ｇｃｙ　’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇＶ　）　、第８版
及びザ・ジーナス・バチルス（”Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　
Ｂａｃｉｌｌｕｓ”　、　Ｒｕｔｈ、　Ｅ、Ｇｏｒ−ｄ
ｏｎ著Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　
ＮＱ　４２７　、＾ｇｒｉｃ−ｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ　、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｗａｓ
ｈｉｎｏｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，（１９７３））を参照し比較
、検索した結果、本発明の菌株は、有胞子桿菌であるバ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ａの一種であると認めら
れる。そして本菌株は、最近、掘越と秋葉　（“°へＩ
ｋａｌＯＩ）ｈｉｌｉｃ　　ＨｉＣｒＯＯｒｌ；１ａｎ
ｉｓｌ”　　、ＪａｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏ
ｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（Ｔｏｋｙｏ）　　、　　１９
８２刊年）の主張している、所謂アルカリ性（八１ｋａ
ｌｏｐ−ｈｉｌｉｃ　）微生物が０１１８以上のアルカ
リ培地に於いて生育し、これ以下の中性ｐＨ領域では生
育出来ないのに対し、弱酸性領域からアルカリ領域（ｐ
Ｈ５〜１０）に於いて生育が可能である事からこの好ア
ルカリ性微生物とは明らかに異なるものであり、一般的
な中性で生育するバチルス属微生物と判断できる。

更に本菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較すると
、最も類縁の種としてバチルス・サーキュランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）が挙げられる。

しかしながら、公知のサーキュランスに属する菌株と本
菌株とを比較すると、ゼラチンの加水分解能の点に於い
て相異する。更に上記公知菌株は少なくともアルカリセ
ルラーゼを産生じないので、本発明者らは本菌株を新菌
株と判断し、バチルス　エスピー　ＫＳＭ−４２５と命
名して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（Ｆ
ＥＲＭＰ−９００７）。

本発明の菌株を用いてアルカリセルラーゼ　Ｋ−４２５
を得るには、培地に該菌株を接種し、常法に従って培養
すれば良い。培地中には、責化し得る炭素源及び窒素源
を適当量含有せしめておくことが好ましい。この炭素源
及び窒素源については特に制限はないが、その例として
は、窒素源としてコーングルテンミール、大豆粉、コー
ンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマ
メディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、バイブ
ロ、アジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒー粕
、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジブ
ロン、ゼスト、フレックスなどが挙げられる。又、炭素
源としては、籾殻、麩、濾紙、−絞紙類、おが屑などの
植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ）、アビセル、セルロース綿、キシラン、
ペクチンに加え、責化し得る炭素源、例えば、アラビノ
ース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノ
ース、フラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロ
ース、マンニット、ソルビット、グリセリン、可溶性デ
ンプンや寅化し得る有ＩＩＭ！、例えば酢酸などが挙げ
られる。また、その他、リン酸、Ｈａ２◆、　Ｃａ２＋
　、　Ｈｎ２＋　、　Ｚｎ２÷　（：０２４゜Ｈａ”、
に＋などの無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄
養源を培地中に適宜添加することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるセルラ
ーゼ　Ｋ−４２５の採取及び精製は、一般の酵素の採取
及び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、遠
心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により１体を培
養液から除去して粗酵素液を得ることが出来る。この粗
酵素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に応
じて、塩析法、１ｌｉｔｌｌｌ法、限外枦３１Ｂ法等の
分離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製
結晶化して、精製ｎＮとして使用することも可能である
。

斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼ　Ｋ、−
４２５は、以下に示すＭ素学的性質を有する。なお、酵
素活性の測定は、以下の方法に従って行ない、用いた緩
衝液は次の通りである。

ＤＨ３〜８　　　マクイルバイン緩！７′ａ１）８８〜
１１　　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液 酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０ηＣＭＣ（Ａ−０１１，山鳩国策バルブ社）、１０
０μｓｏｌ各種緩衝液（マクイルパイン、リン酸、グリ
シン−Ｎ　ａ　Ｏｔｌ等）を含む！ｊ質用液０．９ａｅ
ｋ−０，１ｄ！＋７）酵素溶液を加え、３０”Ｃｌ２Ｏ
分反応した、反応後、３．５−ジニトロ−サリチル酸（
３、５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉ
ｄ（ＤＮＳ）　）法にて還元糖の定量を行った。すなわ
ち、反応液１．０ｄ１．：ＤＮＳ試ＩＢ１．ｃ）ｄを加
え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷ｕ１後、４．
０　ｍの脱イオン水を加えて希釈した。これを波長５３
５ｎ■で比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１
分間に１μｓｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成
する酵素量を１単位とした。

（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性０．１
μｓｏｌ　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社
）、１００μｍｏｌリン酸緩衝液（ｐ１１７、Ｏ）を含
む反応液１．Ｏｄ中に適当量のＣＭＣアーゼを３０℃で
作用させた後、１８　Ｎ８２ＣＯ３を０、３　ｄ　Ｓ脱
イオン水を１．７ｄ順次加え、遊離するｐ−ニトロフェ
ノールを４００　ｎｍで比色室Ｒした。

酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μｓｏｌのｐ−
ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセラーゼ、セルロース粉末分解、及び濾紙分
解活性 ２０ＩＩｇアビセル（メルク社）、２００．ｃｚｍｏｌ
　リン酸緩衝液（ｐｌ＋　　７．０＞を含む反応液２．
　Ｏｄ中に適当量のＣＭＣアーゼを加え、３０℃、２５
０ｒｐｍで振とうしながら作用させた。反応後、冷却遠
心弁１！ｔ（５℃、３０００ｒｐｍ　、２０分）を行い
、その上清１．０ｍを３．５−ジニトロ−サリチル酸（
３，５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉ
ｄ（ＤＮＳ）　）法にて還元糖の定量を行った。セルロ
ース粉末分解活性はセルロース粉末（東洋濾紙社）を、
濾紙分解活性は濾紙（ワットマンＩＩＱ１、ワットマン
社）を用い、アビセラーゼ活性の時と同様に行った。酵
素力価は、上記の条件下で１分間に１μｓｏｌのグルコ
ースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした
。

（４）セロビオーゼ活性 １０■セロビオース（関東化学社）、１００μｍｏｌリ
ンＭＭｌｉ液（ｐＨ７，０）を含む反応液１、Ｏｍ！中
に適当ｌのＣＭＣアーゼを３０℃で作用させた後、１０
０℃、２分処理しＣＭＣアーゼを失活させた後、生成グ
ルコース酸をムロターゼ・ＧＯＤ法（ＧｌｔＩＣＯ３ｅ
　ｃ−ｒｅｓｔ、和光純薬工業社）で測定した。酵素力
価は、上記の条件下で１分間に２μａ＋ｏｌのグルコー
スを生成する酵素ωを１単位とした。

（酵素学的性質） （１）作用 ＣＭＣ１セルロース、濾紙、アビセル等のｍＭ素によぐ
作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を
生成する。

（２）基質特異性 本酵素は、ＣＭＣの他にも、セルロースパウダー、アビ
セル、濾紙及びｐ−ニトロフェニルセロビオシド、セロ
ビオースに対する活性を有していた。セロビオース分解
活性は、ＣＭＣアーゼ活性の約４％であった。

（３）作用ｐＨ及び至適１）Ｈ 作用１）１１範囲は、３．５〜１２．５と極めて広範囲
にわたる。最適１１Ｈは、８〜１０と幅広＜、５．５〜
１０．５の範囲に於いても至適ｐｌ＋に於ける活性の５
０％以上の相対活性を有しており、従って過去に研究さ
れたアルカリセルラーゼの中でも最もアルカリ側で充分
活性が発揮される酵素と言える（第１図）。

（４）ｐＨ安定性 各々のｐＨで３０℃、１時間保持した侵の残存活性を測
定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ＤＨ５〜１１で
極めて安定で失活せず、ｐＨ３〜１２に於いても、約５
０％以上の活性を維持していた。本酵素は、このように
高アルカリ領域に於いても充分に安定である（第２図）
。

（５）最′Ｍ温度 作用温度は、１５〜７５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は５０℃であった。又、３５〜５５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していた（第
３図）。

（６）温度安定性 至適ｐＨに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存
活性を測定した結果、３０℃では安定しており、５０℃
に於いても約５０％の残存活性を有していたく第４図）
。

（７）分子量 本酵素をセファデックス　Ｇ−１００（Ｓｅｐｈａ−ｄ
ｅｘＧ−１００）によるゲル濾過法に基づき分子量を測
定したところ、約３．５万であった。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Ａｉ！　”　、　Ｆ
ｅ３＋。

Ｂａ２÷　、　　　Ｃａ２÷　、　　　Ｃｄ２＋　　、
　　　Ｃｏ２＋　　、　　　Ｃｒ”　　、　　　Ｃｕ２
÷　　　　ｐＢ２＋　　。

Ｈｇ”　、　　Ｈｎ２÷　　１０２＋　、　　Ｎ、２＋
　、　　ｐｌ）２＋　、　　７ｎ２÷、　　Ｌｉ”　　
。

に＋　、　Ｈａ”　）を活性測定時に共存させて、その
彰１を検討した（　に“、　Ｈａ＋については濃度を５
０鳳Ｈとし、他のイオンについては、１１１Ｈとした）
。

その結果、ｌａ２÷、　ＢａＺ＋で阻害が、Ｃ０２＋に
より活性化が認められた。

（９）界面活性剤の影響 酵素サンプルは、各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳｌＡ
ｓ、ＥＳ、ＡＯ８，α−８ＦＥ。

ＳΔＳ１石鹸、ポリオキシエチレン（７）セカンダリア
ルキルエーテル）の活性に及ぼす影響を調べた。本酵素
を界面活性剤０．０５％溶液で３０℃、１５分聞処理後
、活性測定を行った。その結果、何れの界面活性剤によ
っても阻害を受けなかった。

強力なデタージエントであるソデイウム・ドデシルサル
フェートによっても活性の阻害は認められなかった。

（１０）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工）
、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノボ社
）を、活性測定時に共存（０，１ａ９／ｄ）させてその
影響を調べたところ、何れのプロテアーゼによっても、
本酵素がプロテアーゼに対して強い耐性を有することが
わかった。

（１１）キレート剤の影響 キレート剤　ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ１トリポリリン酸、ビ
オライト、クエン酸を活性測定時に共存させ、その影響
を検討したが、はとんど阻害は認められなかった。

〔発明の効果〕

本発明のアルカリセルラーゼ　Ｋ−４２５は、従来のア
ルカリセルラーゼに比較して高アルカリ側（ｐＨ１０）
に至適ｐＨを有している。その上、ｐＨ５，５〜１０．
５の広範囲に於いて、至適ｐＨにおける活性の５０％以
上の活性を有しており更に０１１５〜１１に於いても極
めて安定である。

また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗浄
剤配合成分によってもほとんど阻害を受けない。したが
って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として有利に使
用することができるものである。

更に、本発明の菌株、バシルス　エスピーＫＳＭ−４２
５は中性で生育する菌株であるので、好アルカリ性菌株
と比べ容易にアルカリセルラーゼを工業的に生産するこ
とができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯（約０．５ｇ）、
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した
。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培
地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３
日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣの
溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣア
ーゼ生産菌を取得した。更に、取得筒を培地２の液体培
地に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠
心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性を、ｐＨ４
〜１２にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌をスクリ
ーニングした。

上述の方法により、本発明のバチルス　エスピーＫＳＭ
−４２５株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９００７）を取得するこ
とが出来た。

培地１．　０Ｍ０　　　　　　　　２％ポリペプトン　
　　　　　　　　０．５％酵母エキス　　　　　　　　
　　０．０５％ＫＨ２ＰＯａ　　　　　　　　　　０．
１％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２００，２５％ｆＶ１ｇｓ
Ｏａ・７Ｈ２００，０２％ 培地２．　０Ｍ０　　　　　　　　１％ポリペプトン　
　　　　　　　　１％ 酵母エキス　　　　　　　　　　０．５％ＫＨ２ＰＯ４
０，１％ Ｎａ２ＨＰＯａ　・１２Ｈ２００，２５％ＭＱＳＯ４・
７Ｈ２００，０２％ １）Ｈ６，８ 実施例２ 実施例１で得たバチルス　エスピーＫＳＭ−４２５株を
同実施例の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪培
養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液を
得た。この粗酵素液１（に対してドライアイス−エタノ
ール中で、３１のエタノールを加え、生じた沈澱を遠心
分離し、更に凍結乾燥を行ない、乾燥粉末として、アル
カリセルラー１（Ｋ−４２５（比活性本１０単位／ｇ）
１０ｇを得た。

本　酵素活性はｐＨ９に於ける測定値である。

実施例３ ＣＭＣを蔗糖に代え、ポリペプトンを７％Ｃ８Ｌに代え
る以外は実施例１の液体培地２と同じ組成の培地にバチ
ルス　エスピーＫＳＭ−４２５株を接種し、３０℃で２
日間振盪培養した。

この培養物を遠心分離し、得られた上清のＣＭＣアーゼ
活性を測定したところ１６０単位／１であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素反応ｐＨと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第２図は、酵素処理ｐＨと相対活性の関゛係を示す図面
である。 第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 第４図は、酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 以上 第１ｍ 反応ｐＨ 第２図 処理ｐＨ 第３図 反応温度（°Ｃ） 第４図 処理温度（Ｃ） 手続補正書（自発） 昭和６２年３月　４日 昭和６１年特許願第　２８３７４２　　号２、　発明の
名称 アルカリセルラーゼ及びこれを産生ずる微生物３、　補
正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　（０９１）花王株式会社 氏　名　（６８７０）弁理士　有　賀　三　用ユ　　　
。 氏　名　（８６３２）弁理士　小　野　信　央′：°゛
：“、°″′ ５、補正命令の日付 α　補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」及び「発明の詳細な説明」
の欄 ７　補正の内容 （１）　　明細書の特許請求の範囲を別紙の通シ訂正す
る０ （２）　　明細書中、第１１頁、第１３行ないし第１４
行 「生育するが・・・・・・・・・無いＯ」と６るを、「
生育し、混濁する０」と訂正する０ （３）　　同、第１４頁第１５行ないし第１７行「５％
生育せず。 ７％生育せず０ １０％生育せず０」とあるを。 「５％で生育せず０ ７％で生育せず。 １０％で生育せず。」と訂正する。 （４）　　同、第１６頁、第２行 「所謂アルカリ性」とあるを、 「所謂好アルカリ性」と訂正する。 （５）　　同、第１９頁、第１行及び同同第９行「マク
イルパイン」とあるを、 「マクルペイン」と訂正する。 （６）　　同、第１９頁、第１０行 「基質用液」とあるを、 「基質溶液」と訂正する。 （７）　　同、第２０頁、第１１行 「アピセラーゼ、セルロース粉末分解、」とあるを、 「アビセル、セルロース粉末」と訂正する。 （８）　　同、同第１５行及び同第２１頁、第１０行「
ＣＭＣアーゼ」とあるを、 「酵素液」と訂正する。 （９）　　同、第２１頁、第２行 「（ワットマンｒＩ＆１１　ｓ　　ワットマン社）」と
あるを、 「（セルラーゼ活性検定用濾紙、東洋＋１＆１５１−特
）」と訂正するＯ （ト）　同、同第１１行 「ｃＭｃアーゼ」とあるを、 「酵素」と訂正する。 Ｕυ　同、第２４頁、第７行 「酵素サンプルは、」とあるを削除する。 α２　同、同第９行ないし第１０行 ［、ｔＰリオキシェテレン・・・・・・・・・の活性に
」とあるを、 「？リオキシエチレンセカンダリーアルキルエーテル）
の酵素活性に」と訂正する。 Ｑ３　　同、第２５頁第２行ないし第３行「よっても・
・・・・・・・・強い耐性を」とあるを、「対しても強
い耐性を」と訂正する。 α乃　同、同第６行 「ン酸、」とあるを 「ン酸ソーダ、」と訂正する。 α９　同、第２６頁、第１行 「バシルス」とあるを、 「バチルス」と訂正する０ （ｌｌ１９　　同、量子から第２行 「ｐａ４〜１２」とあるを、 「ｐＨｓ〜１３」と訂正する０ ση　同、第７頁、第１２行 「アルカリセルラーゼＫ」とあるを、 「アルカリセルラーゼＫ（特願昭６１−２５７７７６号
）」と訂正する０ αｅ　同、第８頁、第５行 「アルカリセルラーゼ生産菌」とあるを「アルカリセル
ラーゼ」と訂正するＯ 特許請求の範囲 １、　次の酵素学的性質を有するアルカリセルラーゼに
−４２５゜ （１）作用 力Ａ／コキシメチルセルロース、セルロース、Ｆ紙、ア
ビセル等の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、
グルコース等の還元糖を生成する。 （２］　　基質特異性 力Ａ／セキジメチルセルロースの他にも、セルロース／
Ｑウダー、アビセル、Ｐ紙及ヒｐ　−二トロフェニルセ
ロピオシド、セロビオースに対する活性を有する。 （３）　　作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐｌ（範囲は、３５〜１２６である。最適ｐＨは、
８〜１０でｓｂ、ａ５〜Ｉ　Ｑ１５＋７）範囲に於いて
も至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を有す
る。 （４）　　ｐｌ（安定性 ＰＨ５〜１１で極めて安定で失活せずｓ　　ｐ）Ｉ３〜
１２に於いても、約５０％以上の活性を維持する。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜７５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は５０℃である０又、３５〜５５℃の範囲に於いて
も、至適温度での活性の５０％以上を有する。 （６）分子量 約３５万（セファデックスＧ１００を用いるダル濾過法
による） （７）　　金属イオンの影響 Ｈｇ冨＋及びＢａ”＋により阻害され、Ｃｏ”　Ｋよシ
活性化される。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＮ％Ａｓ％Ｉｓ、　ＡＯ８，４−８ＦＥ％ＳＡＳ、
石鹸、？リオキシエチレンセヵンダリーアルキルエーチ
ルにはとんど活性を阻害しない。 （９）　　プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 叫　キレート剤の影響 ソーダ、ゼオライトは活性を阻害しない。 ２、　バチルス属に属し、アルカリセルラーゼに一４２
５生産性を有する微生物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の酵素学的性質を有するアルカリセルラーゼＫ−
   ４２５。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース、セルロース、濾紙、アビ
   セル等の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、グ
   ルコース等の還元糖を生成する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロースの他にも、セルロースパウ
   ダー、アビセル、濾紙及びｐ−ニトロフェニルセロビオ
   シド、セロビオースに対する活性を有する。セロビオー
   ス分解活性は、ＣＭＣアーゼ活性の約４％である。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３．５〜１２．５である。最適ｐＨは
   、８〜１０であり、５．５〜１０．５の範囲に於いても
   至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を有する
   。 （４）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１１で極めて安定で失活せず、ｐＨ３〜１２に
   於いても、約５０％以上の活性を維持する。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜７５℃の広範囲にわたり、その至適
   温度は５０℃である。又、３５〜５５℃の範囲に於いて
   も、至適温度での活性の５０％以上を有する。 （６）分子量 約３．５万（セファデックスＧ１００を用いるゲル濾過
   法による） （７）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋及びＢａ＾２＾＋により阻害され、Ｃｏ＾
   ２＾＋により活性化される。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石
   鹸、ポリオキシエチレン（７）セカンダリアルキルエー
   テルはほとんど活性を阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （１０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、トリポリリン酸、ゼオ
   ライトは活性を阻害しない。 ２、バチルス属に属し、アルカリセルラーゼ　Ｋ−４２
   ５生産性を有する微生物。