CN105039286B - 米曲霉发酵液、该发酵液降解稻草粉制备的糖液及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种米曲霉发酵液，所述米曲霉发酵液含有木质素过氧化物酶酶活性100‑1000U/L和外切纤维素酶酶活性100‑300U/L；米曲霉发酵液是以稻草粉为原料，米曲霉为菌株，依次经试管扩大培养、液体摇瓶培养、种子罐种子培养和液体发酵培养工艺制得的；并且还提供了利用稻草粉为主要原料，通过米曲霉发酵液，添加过氧化氢溶液降解稻草粉制备糖液的工艺技术；采用此工艺具有生产周期短、占用场地小、生产成本低、糖得率高的优点；并且制备的糖液可以用作发酵沼气的原料。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程和酶工程领域，特别涉及一种米曲霉发酵液、该发酵液降解稻草粉制备的糖液及制备方法和用途。
背景技术
我国是农业大国，每年农作物秸秆年产量逾6亿吨，除少量被用作纺织、造纸行业外，大部分以堆积、焚烧的形式倾入环境，既浪费了资源也给环境造成了极大地危害。而秸秆纤维素是可再生能源的一个重要来源，可开发利用秸秆来解决农村用能问题；其中，将秸秆用于沼气发酵是人类合理利用生物质能的最有效的手段。秸秆生物质应用在沼气池中可以提供大量的碳源，产生的沼气可供炊事照明，残渣还是良好的有机肥，是可再生能源的新途径。然而秸秆作为生物质能发酵沼气，如果不预处理，其发酵周期长、产气率不高。
植物的秸秆含有30％左右的纤维素、25％左右的半纤维素、15％左右的木质素，是天然的碳水化合物的来源。尤其纤维素和半纤维素，主要成分是碳水化合物，是微生物发酵工业最天然的来源。但是由于秸秆中存在木质素等不易降解的化合物，木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在中间，使降解木质素的酶不易与纤维素分子接触；此外，由于木质素的水不溶性、复杂的化学结构，也给降解带来极大的困难。上述种种原因导致秸秆作为农业废弃物，或者被燃烧或者直接弃之，既污染了环境，又浪费了资源。因此，如何降解秸秆中的木质素是开发利用秸秆资源成为农业可持续发展的首要问题，也是决定发酵产沼气的产气速率和产气量的主要因素。
目前降解秸秆的方法主要有物理处理、化学处理和生物处理。
物理处理主要有高压蒸汽爆破、挤压膨化和微波热解：高压蒸汽爆破和挤压膨化是通过压力的突然改变对物料进行爆破或膨化，破坏半纤维素和木质素连接层，使纤维素露出更多的活性基团，能够与纤维素酶分子充分接触而降解；这两种方法成分较高，需要大型的设备，而且木质素还需要额外处理。微波热解是以非热的形式引起热效应，加速离子与其他分子的碰撞，快速地旋转偶极子；但这种方法目前也只是限于在试验室中，很难形成大规模的优势产业。
化学处理法主要有稀酸处理、碱处理和氨水处理。稀酸处理是利用硫酸水解糖苷键、酯键等，使稻草粉纤维的网状结构疏松；碱处理和氨水处理是利用木质素溶于碱性溶液，其与稀酸处理同样存在环境污染问题。化学处理方法普遍都存在反应条件较难掌握、反应温度高、处理时间长、占用空间大、处理效果不理想，不能去除木质纤维素等问题。
近年来生物处理秸秆越来越受到人们的重视，生物处理方法主要包括青贮、微贮和酶解。青贮和微贮利用自身的有益菌或微生物添加剂对秸秆进行分解利用，使秸秆软化，将其中的纤维素、半纤维素及木质素等有机碳水化合物转化为糖类，最后发酵成为乳酸和其他一些挥发性脂肪酸，从而提高瘤胃微生物对秸秆的利用率。但是生物处理方法周期太长，占用产地较大，特别是好氧降解更是如此。酶解法则是选择能够水解纤维素、半纤维素和木质素的单一或复合酶类，在满足酶作用条件下对秸秆进行处理，从而降低纤维性物质比例，提高可溶性糖含量的方法。利用微生物降解木质素的关键是微生物能够分泌降解秸秆的酶：木质素过氧化物酶、纤维素酶。
现对于生物法生产降解秸秆的酶制剂的研究较少，一般地生物法所用的菌种是黄孢原毛平革菌、虫拟蜡菌以及一些食用菌菌种、细菌和放线菌，除食用菌之外其安全性都未经过论证；生物降解主要采用固态发酵技术，边发酵产酶，边降解木质素，但是在发酵过程中不可避免的伴随着纤维素降解，使得最终产品糖得率低；此外，大规模的固态发酵都是敞开式的发酵方式，而且发酵周期有很长，因此在发酵过程中不可避免的杂菌污染，特别是有毒有害箘的污染难以控制，并且发酵周期太长，占用场地较大。
专利申请号为200610109413的申请文件的目的在于克服目前白腐真菌降解木质素的不足之处，而提供一种新型的降解木质素的微生物菌剂以及利用上述菌剂降解木质纤维素的方法。微生物菌剂是由假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌组成。米曲霉是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种，但是未见米曲霉分泌木质素过氧化物酶的专利及其相关文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种以米曲霉为菌种，以稻草粉为原料进行液态发酵制备含有木质素过氧化物酶和外切纤维素酶的发酵液，以该发酵液或由该发酵液制得的粗酶制品作为催化剂，添加过氧化氢水解稻草粉制备糖液的方法。该方法具有生产周期短、占用产地小、生产成本低、产气率高等优点。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种米曲霉发酵液，所述米曲霉发酵液含有木质素过氧化物酶酶活性100-1000U/L和外切纤维素酶酶活性100-300U/L；所述米曲霉发酵液是以稻草粉为原料，米曲霉为菌株，依次经试管扩大培养、液体摇瓶培养、种子罐种子培养和液体发酵培养工艺制得的。
本发明所使用的主要原料稻草粉是任意一种稻草粉，如籼稻稻草粉和粳稻稻草粉、早稻稻草粉和中晚稻稻草粉；稻草首先经过粉碎，过20-100目筛。
本发明所使用的米曲霉菌种是被美国食品药物管理局(FDA)、美国饲料公定协会(AAFCO)和我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种；而以往用的菌种是黄孢原毛平革菌、虫拟蜡菌以及一些食用菌菌种、细菌和放线菌，除食用菌之外其安全性都未经过论证。
本发明所用米曲霉菌种是经保藏中心保藏的任一种米曲霉菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心(CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等保藏的菌种。
本发明的米曲霉发酵液还可制备成粉末状的粗酶粉使用，其制备方法为：将米曲霉发酵液通过分子量5000dal1ton的膜超滤去除无机盐，超滤浓缩的残留液冻干，即得粗酶粉。
本发明提供了一种米曲霉发酵液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中进行培养，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将米曲霉试管斜面孢子接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：将液体摇瓶菌种接种到种子罐培养基，进行培养，制成一级种子罐菌种；
d.液体发酵培养：将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，进行发酵培养，制得米曲霉发酵液。
所述马铃薯葡萄糖培养基来源(诸葛健、王正祥.工业微生物实验技术手册，1994:367页)。
其中，液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行灭菌制得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠0.2-2g 葡萄糖0.1-3g 酵母粉0.1-1g
氯化亚铁0.001-0.02g 硫酸镁0.001-0.2g
磷酸氢二钾0.01-0.2g；
优选地，发酵培养基通过将培养基原料进行灭菌制得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉1-8g 葡萄糖0.1-3g 酵母粉0.3-3g
氯化亚铁0.001-0.02g 硫酸镁0.001-0.2g
磷酸氢二钾0.01-0.2g 米糠0.1-5g；
优选地，所述米糠的粒度为10-100目。
进一步地改进；所述米曲霉发酵液的制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度25-45℃下培养2-8d后，进行1-10℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于于装有20-100ml液体摇瓶培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为50-160转/分，温度20-38℃的条件下，摇床培养18-56h，制成液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：按接种量为1％-20％将液体摇瓶菌种接种于种子罐培养基中，在温度为20-38℃，搅拌转速为50-160转/分，通气量为0.2-1.8:1的条件下，培养18-50h，制成一级种子罐菌种；
所述接种量为液体摇瓶菌种与种子罐培养基的体积比；所述通气量为每分钟通入气体的体积与种子罐培养基体积比；
d.液体发酵培养：按接种量为1-20％将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度20-38℃，搅拌转速50-200转/分，通气量为0.2-1.8：1的条件下，培养2-7d，得到米曲霉发酵液；
所述接种量为一级种子罐菌种与发酵培养基的体积比；所述通气量为每分钟通入气体的体积与发酵培养基的体积比。
进一步地，所述一级种子罐菌种经二级种子罐种子培养后，再进行液体发酵培养，所述二级种子罐种子培养工艺为：
按接种量为5-20％将一级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度20-30℃，搅拌转速52-100转/分，每分钟通气量为1-1.8：1的条件下，培养20-30h，制得二级种子罐菌种；
所述接种量为一级种子罐菌种与二级种子罐的种子罐培养基的体积比；所述通气量为每分钟通入气体的体积与二级种子罐的种子罐培养基体积比。
更进一步地，所述二级种子罐菌种经三级种子罐种子培养后，再进行液体发酵培养，所述三级种子罐种子培养工艺为：
按接种量为10-20％将二级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度20-30℃，搅拌转速52-80转/分，每分钟通气量为1-1.8：1的条件下，培养20-30h，制得三级种子罐菌种；
所述接种量为二级种子罐菌种与三级种子罐的种子罐培养基的体积比；所述通气量为每分钟通入气体的体积与三级种子罐的种子罐培养基体积比。
通过上述方法制备得到的米曲霉发酵液为浅黄色至褐色，含有木质素过氧化物酶酶活性100-1000U/L，外切纤维素酶酶活性100-300U/L。
木质素过氧化物酶测定方法为：取出适量的发酵液，抽滤，即为酶液。准确移取200mM酒石酸缓冲液3.4mL于容积为4mL的比色皿中，加入40mM黎芦醇0.1mL。准确加入待测酶液XμL(X＝0～400)，加入纯净水(400-X)μL。30℃水浴，加入浓度为20mM H2O2溶液0.01mL启动反应，迅速测定310nm处的吸光度，1min后再测定1次计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化(OD310变化)。
这里X:待测酶液体积(mL)
根据此工艺外切纤维素酶测定方法为：在试管中加0.1g滤纸和1.5mL的水，加适当稀释的发酵酶液0.5mL，于50℃水浴保温30min，取出后立即加入3，5一二硝基水杨酸试剂溶液1.5mL，煮沸5min，取出，冷却后加入蒸馏水21.5mL，混匀，测520nm处的OD值，以煮沸灭活15min的酶液作对照(3个重复)。用2mL不同浓度的标准葡萄糖溶液代替上述水和发酵液，重复上述步骤，在同样条件下测定吸光度，根据葡萄糖浓度和吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线计算由羧甲基纤维素得到的糖。1个外切纤维素酶活力单位定义为每分钟水解滤纸生成1μmol/L的葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
本发明另一方面提供了一种利用米曲霉发酵液水解稻草粉制备糖液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)将热处理的稻草粉、米曲霉发酵液和水混合，预热；
或者将热处理的稻草粉、粗酶粉和水混合，预热；
b)添加H2O2溶液，搅拌，降解，获得混合液；
c)将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液；
优选地，所述方法包括如下步骤：
a)稻草粉进行100-130℃热处理20-60min，将热处理的稻草粉、米曲霉发酵液和水按1：0.2-5：5-50混合，20-60℃保温；
或者稻草粉进行100-130℃热处理20-60min，将热处理的稻草粉、粗酶粉和水按1：2.5×10-3：5-50混合，20-60℃保温；
优选地，所述稻草粉的粒度为20-100目；
b)搅拌转速30-180转/分条件下，进行搅拌；
c)在3-10h内，匀速加入稻草粉重量5-20倍的0.5-5％H2O2溶液，在温度为20-60℃，搅拌转速30-180转/分条件下，降解5-20h，获得混合液；
d)将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液。
糖测定方法为：3’5-二硝基水杨酸法(张志良、瞿伟菁：植物生理学实验指导(第三版，2003年，高等教育出版社。P129－130)。
根据此工艺沼气气体体积根据气体流量计测定，沼气中甲烷气体含量采用武汉四方光电科技有限公司GASBOARD-32XX型系列红外沼气检测仪,精确度为0.1％。测定方法:先用惰性气体校正后再直接测定,每天测定一次含量。稻草的产气率根据下列公式计算：
其中ε为稻草的产气率；qi：每天的气体量；ti：每天气体中的甲烷气体含量；m：投入的稻草粉重量。
本发明还提供了一种上述方法制备的降解稻草粉糖液，其特征在于，所述糖液的糖得率为20-45/100g稻草粉。
本发明另一方面提供了降解稻草粉糖液可作为发酵沼气的原料使用；
其中，发酵沼气的方法为：将糖液浓缩至糖度为150g/L，按100:1的比例加入活性污泥，在20～40℃的条件下进行厌氧发酵20～45天，即产生沼气。
本发明的有益效果：
1、本发明所使用的菌种是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种；
2、本发明使用的液体发酵制备酶液，利用酶工程技术，添加底物催化水解稻草木质素、纤维素，由于没有杂菌的干扰，糖得率高；
3、采用密闭的液态发酵，水解也可以在反应罐中进行，控制了杂菌的污染；
4、本发明的液态发酵周期短，场地占用小。
具体实施方式
实施例1米曲霉发酵液
米曲霉发酵液含有木质素过氧化物酶酶活性1000U/L和外切纤维素酶酶活性100U/L；所述米曲霉发酵液是以稻草粉为原料，米曲霉为菌株，依次经试管扩大培养、液体摇瓶培养、种子罐种子培养和液体发酵培养工艺制得的。
实施例2米曲霉发酵液
米曲霉发酵液含有木质素过氧化物酶酶活性100U/L和外切纤维素酶酶活性300U/L；所述米曲霉发酵液是以稻草粉为原料，米曲霉为菌株按照下述步骤制备：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在35℃培养5d，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将米曲霉试管斜面孢子接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，在转速为110转/分，温度30℃的摇床上培养30h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：将液体摇瓶菌种接种到种子罐培养基，在温度30℃的条件下培养30h，制成一级种子罐菌种；
d.液体发酵培养：将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度38℃的条件下培养5d，制得米曲霉发酵液。
实施例3米曲霉发酵液
所述米曲霉发酵液中含有木质素过氧化物酶酶活性500U/L和外切纤维素酶酶活性130U/L；所述米曲霉发酵液是按照下述方法制备得到的：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为25℃下培养3d，然后于10℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有100mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为50转/分在温度为38℃的摇床上培养40h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：按接种量为12％将液体摇瓶菌种接种于种子罐培养基中，在温度为24℃，搅拌转速为120转/分，每分钟通气量为0.8:1的条件下，培养45h，制得一级种子罐菌种；
d.液体发酵培养：按接种量12％将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度24℃，搅拌转速120转/分，每分钟通气量0.8:1条件下，培养2d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基中每100ml含有下列重量成分：
米糠0.2g 葡萄糖1.5g 酵母粉0.5g
氯化亚铁0.006g 硫酸镁0.1g 磷酸氢二钾0.08g；
所述发酵培养基中每100ml含有下列如下重量成分：
稻草粉4g 葡萄糖2g 酵母粉1.5g
氯化亚铁0.01g 硫酸镁0.12g 磷酸氢二钾0.12g
米糠3g。
实施例4米曲霉发酵液
所述米曲霉发酵液中含有木质素过氧化物酶酶活性750U/L和外切纤维素酶酶活性112U/L；所述米曲霉发酵液是按照下述方法制备得到的：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为45℃下培养8d，然后于1℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有80mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为100转/分在温度为35℃的摇床上培养20h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：按接种量为8％将液体摇瓶菌种接种于种子罐培养基中，在温度为24℃，搅拌转速为120转/分，每分钟通气量为0.6:1的条件下，培养42h，制得一级种子罐菌种；
d.二级种子罐种子培养：按接种量为8％将一级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度为24℃，搅拌转速为120转/分，每分钟通气量为0.6:1的条件下，培养42h，制得二级种子罐菌种；
e.液体发酵培养：按接种量10％将二级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度28℃，搅拌转速120转/分，通气量0.6:1条件下，培养7d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行110℃灭菌100min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠1.5g 葡萄糖0.3g 酵母粉0.5g
氯化亚铁0.005g 硫酸镁0.005g 磷酸氢二钾0.01g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行110℃灭菌100min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉3g 葡萄糖2g 酵母粉1.5g
氯化亚铁0.01g 硫酸镁0.12g 磷酸氢二钾0.2g
米糠3g。
实施例5米曲霉发酵液
所述米曲霉发酵液中含有木质素过氧化物酶酶活性900U/L和外切纤维素酶酶活性105U/L；所述米曲霉发酵液是按照下述方法制备得到的：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为30℃下培养3d，然后于5℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有40mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为150转/分在温度为25℃的摇床上培养50h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：按接种量为14％将液体摇瓶菌种接种于种子罐培养基中，在温度为26℃，搅拌转速为66转/分，每分钟通气量为1.2:1的条件下，培养25h，制得一级种子罐菌种；
d.二级种子罐种子培养：按接种量为16％将一级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度为26℃，搅拌转速为66转/分，每分钟通气量为1.2:1的条件下，培养25h，制得二级种子罐菌种；
e.三级种子罐种子培养：按接种量为16％将二级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度为26℃，搅拌转速为66转/分，每分钟通气量为1.2:1的条件下，培养25h，制得三级种子罐菌种；
f.液体发酵培养：按接种量16％将三级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度26℃，搅拌转速130转/分，每分钟通气量0.5:1条件下，培养2d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基中每100ml含有下列重量成分：
米糠1.8g 葡萄糖2g 酵母粉0.4g
氯化亚铁0.011g 硫酸镁0.01g 磷酸氢二钾0.13g；
所述发酵培养基中每100ml含有下列重量成分：
稻草粉5g 葡萄糖1.8g 酵母粉0.5g
氯化亚铁0.01g 硫酸镁0.14g 磷酸氢二钾0.06g
米糠4g。
实施例6米曲霉发酵液的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为26℃下培养50h，然后于4℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有100mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为55转/分在温度为38℃的摇床上培养18h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：在15L的种子罐中配置种子罐培养基，按接种量为1％将液体摇瓶菌种接种于10L的种子罐培养基中，在温度为38℃，搅拌转速为160转/分，每分钟通气量为0.3:1的条件下，培养50h，制得一级种子罐菌种；
d.液体发酵培养：在750L的发酵罐中配置发酵培养基，按接种量2％将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度38℃，搅拌转速50转/分，每分钟通气量1.8:1条件下，培养4d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行100℃灭菌120min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠2g 葡萄糖0.1g 酵母粉0.1g
氯化亚铁0.001g 硫酸镁0.001g 磷酸氢二钾0.2g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行130℃灭菌30min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉1g 葡萄糖3g 酵母粉0.3g
氯化亚铁0.005g 硫酸镁0.05g 磷酸氢二钾0.12g
米糠0.1g。
制得的米曲霉发酵液为浅黄色，含有木质素过氧化物酶酶活性101U/L，外切纤维素酶酶活性300U/L。
实施例7米曲霉发酵液的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为45℃下培养75h，然后于1℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有20mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为160转/分在温度为20℃的摇床上培养56h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：在15L的种子罐中配置种子罐培养基，按接种量为20％将液体摇瓶菌种接种于10L的种子罐培养基中，在温度为20℃，搅拌转速为50转/分，每分钟通气量为1.8:1的条件下，培养18h，制得一级种子罐菌种；
d.液体发酵培养：在750L的发酵罐中配置发酵培养基，按接种量20％将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度20℃，搅拌转速200转/分，每分钟通气量0.2:1条件下，培养5d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行130℃灭菌30min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠0.2g 葡萄糖2.8g 酵母粉0.5g
氯化亚铁0.02g 硫酸镁0.15g 磷酸氢二钾0.04g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行100℃灭菌120min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉7g 葡萄糖2g 酵母粉0.7g
氯化亚铁0.002g 硫酸镁0.002g 磷酸氢二钾0.08g
米糠2g。
制得的米曲霉发酵液为浅黄色，含有木质素过氧化物酶酶活性100U/L，外切纤维素酶酶活性240U/L。
实施例8米曲霉发酵液的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为25℃下培养100h，然后于10℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有60mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为50转/分在温度为30℃的摇床上培养30h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：在15L的种子罐中配置种子罐培养基，按接种量为10％将液体摇瓶菌种接种于10L的种子罐培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为105转/分，每分钟通气量为0.8:1的条件下，培养36h，制得一级种子罐菌种；
d.液体发酵培养：在750L的发酵罐中配置发酵培养基，按接种量10％将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度30℃，搅拌转速75转/分，每分钟通气量0.8:1条件下，培养7d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行115℃灭菌75min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠1g 葡萄糖3g 酵母粉1g
氯化亚铁0.02g 硫酸镁0.02g 磷酸氢二钾0.01g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行115℃灭菌75min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉4g 葡萄糖0.1g 酵母粉3g
氯化亚铁0.02g 硫酸镁0.2g 磷酸氢二钾0.2g
米糠5g。
制得的米曲霉发酵液为浅黄色，含有木质素过氧化物酶酶活性200U/L，外切纤维素酶酶活性170U/L。
实施例9米曲霉发酵液的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为26℃下培养50h，然后于4℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有60mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为105转/分在温度为30℃的摇床上培养36h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：在15L的种子罐中，按接种量为10％将液体摇瓶菌种接种于10L的种子罐培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为100转/分，每分钟通气量为1:1的条件下，培养30h，制得一级种子罐菌种；
d.二级种子罐种子培养：在150L的种子罐中，按接种量为10％将一级种子罐菌种接种于100L的种子罐培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为100转/分，每分钟通气量为1:1的条件下，培养30h，制得二级种子罐菌种；
e.液体发酵培养：在1200L的发酵罐中，按接种量8％将二级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度30℃，搅拌转速100转/分，每分钟通气量1:1条件下，培养5d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行120℃灭菌60min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠1g 葡萄糖1.5g 酵母粉0.6g
氯化亚铁0.01g 硫酸镁0.1g 磷酸氢二钾0.1g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行120℃灭菌60min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉4g 葡萄糖1.5g 木糖1.5g
酵母粉2.0g 氯化亚铁0.01g 硫酸镁0.01g
磷酸氢二钾0.01g 米糠2.5g。
制得的米曲霉发酵液为浅褐色，含有木质素过氧化物酶酶活性450U/L，外切纤维素酶酶活性150U/L。
实施例10米曲霉发酵液的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为30℃下培养55h，然后于6℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有60mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为90转/分在温度为30℃的摇床上培养28h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：在15L的种子罐中，按接种量为5％将液体摇瓶菌种接种于10L的种子罐培养基中，在温度为20℃，搅拌转速为60转/分，每分钟通气量为1.8:1的条件下，培养20h，制得一级种子罐菌种；
d.二级种子罐种子培养：在150L的种子罐中，按接种量为5％将一级种子罐菌种接种于100L的种子罐培养基中，在温度为20℃，搅拌转速为60转/分，每分钟通气量为1.8:1的条件下，培养20h，制得二级种子罐菌种；
e.液体发酵培养：在1200L的发酵罐中，按接种量9％将二级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度34℃，搅拌转速60转/分，每分钟通气量1.8:1条件下，培养3d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行105℃灭菌90min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠1.8g 葡萄糖0.8g 酵母粉0.2g
氯化亚铁0.003g 硫酸镁0.003g 磷酸氢二钾0.04g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行105℃灭菌90min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉2g 葡萄糖2.3g 酵母粉0.4g
氯化亚铁0.005g 硫酸镁0.005g 磷酸氢二钾0.06g
米糠3.5g。
制得的米曲霉发酵液为浅褐色，含有木质素过氧化物酶酶活性410U/L，外切纤维素酶酶活性162U/L。
实施例11米曲霉发酵液的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为26℃下培养50h，然后于4℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有20mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为160转/分，在温度为21℃的摇床上培养56h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：在15L的种子罐中，配置10L种子罐培养基，按接种量为18％将液体摇瓶菌种接种于液体摇瓶培养基中，在温度为20℃，搅拌转速为53转/分，每分钟通气量为1.8:1的条件下，培养20h，制得一级种子罐菌种；
d.二级种子罐种子培养：在300L的种子罐中配置200L种子罐培养基，按接种量为10％将一级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度为20℃，搅拌转速为52转/分，每分钟通气量为1.8:1的条件下，培养20h，制得二级种子罐菌种；
e.三级种子罐种子培养：在6000L的种子罐中配置4000L种子罐培养基，按接种量为20％将二级种子罐菌种接种于液体摇瓶培养基中，在温度为20℃，搅拌转速为52转/分，每分钟通气量为1.8:1的条件下，培养20h，制得三级种子罐菌种；
f.液体发酵培养：按接种量20％将三级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度22℃，搅拌转速200转/分，每分钟通气量0.3:1条件下，培养3d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行130℃灭菌30min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠0.3g 葡萄糖2.8g 酵母粉1g
氯化亚铁0.02g 硫酸镁0.2g 磷酸氢二钾0.02g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行105℃灭菌120min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉8g 葡萄糖0.1g 木糖3g 酵母粉3g
氯化亚铁0.02g 硫酸镁0.2g 磷酸氢二钾0.01g
米糠5g 玉米粉1g。
制得的米曲霉发酵液为褐色，含有木质素过氧化物酶酶活性1000U/L，外切纤维素酶酶活性100U/L。
实施例12米曲霉发酵液的制备方法
所述制备方法包括如下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度为32℃下培养80h，然后于3℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于装有20mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶的转速为140转/分，在温度为26℃的摇床上培养48h，制得液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：在15L的种子罐中，配置10L种子罐培养基，按接种量为8％将液体摇瓶菌种接种于液体摇瓶培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为80转/分，每分钟通气量为1:1的条件下，培养30h，制得一级种子罐菌种；
d.二级种子罐种子培养：在300L的种子罐中配置200L种子罐培养基，按接种量为10％将一级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为80转/分，每分钟通气量为1:1的条件下，培养30h，制得二级种子罐菌种；
e.三级种子罐种子培养：在6000L的种子罐中配置4000L种子罐培养基，按接种量为10％将二级种子罐菌种接种于液体摇瓶培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为80转/分，每分钟通气量为1:1的条件下，培养30h，制得三级种子罐菌种；
f.液体发酵培养：按接种量10％将三级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度25℃，搅拌转速150转/分，每分钟通气量0.5:1条件下，培养5d，制得米曲霉发酵液；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行125℃灭菌45min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠0.2g 葡萄糖3g 酵母粉0.8g
氯化亚铁0.01g 硫酸镁0.16g 磷酸氢二钾0.1g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行125℃灭菌45min所得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉7g 葡萄糖1g 酵母粉2g
氯化亚铁0.012g 硫酸镁0.012g 磷酸氢二钾0.2g
米糠2g。
制得的米曲霉发酵液为褐色，含有木质素过氧化物酶酶活性950U/L，外切纤维素酶酶活性104U/L。
实施例13米曲霉发酵液降解稻草粉制备糖液的方法
所述方法包括如下步骤：
1)将稻草粉粉碎至20目，130℃热处理20min；按稻草粉、米曲霉发酵液和水1：0.2：5混合，60℃保温；
2)搅拌转速180转/分条件下，进行搅拌；
3)在10h内，匀速加入稻草粉重量20倍的0.6％H2O2溶液，在温度为60℃，搅拌转速180转/分条件下，降解20小时，获得混合液；
4)将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液。
制得的降解稻草粉糖液色质为浅黄色，糖得率达到20g/100g稻草粉。
实施例14米曲霉发酵液降解稻草粉制备糖液的方法
所述方法包括如下步骤：
1)将稻草粉粉碎至60目，115℃热处理40min；按稻草粉、米曲霉发酵液和水1：2.5：25混合，40℃保温；
2)搅拌转速110转/分条件下，进行搅拌；
3)在60h内，匀速加入稻草粉重量12倍的2.5％H2O2溶液，在温度为40℃，搅拌转速110转/分条件下，降解13小时，获得混合液；
4)将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液。
制得的降解稻草粉糖液色质为褐色，糖得率达到37g/100g稻草粉。
实施例15米曲霉发酵液降解稻草粉制备糖液的方法
所述方法包括如下步骤：
1)将稻草粉粉碎至100目，100℃热处理60min；按稻草粉、米曲霉发酵液和水1：5：12混合，21℃保温；
2)搅拌转速30转/分条件下，进行搅拌；
3)在3h内，匀速加入稻草粉重量5倍的5％H2O2溶液，在温度21℃，搅拌转速30转/分条件下，降解5小时，获得混合液；
4)将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液。
制得的降解稻草粉糖液色质为浅褐色，糖得率达到45g/100g稻草粉。
实施例16粗酶粉
制备方法为：将实施例1的米曲霉发酵液通过分子量5000dalton的膜超滤去除无机盐，超滤浓缩的残留液冻干，即得粗酶粉；粗酶粉得率为0.2-0.6g/L发酵液。
实施例17米曲霉发酵液的粗酶粉降解稻草粉制备糖液的方法
所述方法包括如下步骤：
1)将稻草粉粉碎至60目，115℃热处理40min；按稻草粉、米曲霉发酵液的粗酶粉和水1：1.3×10-3：25混合，40℃保温；
2)搅拌转速110转/分条件下，进行搅拌；
3)在60h内，匀速加入稻草粉重量12倍的2.5％H2O2溶液，在温度40℃，搅拌转速110转/分条件下，降解13小时，获得混合液；
4)将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液。
制得的降解稻草粉糖液色质为浅褐色，糖得率达到41g/100g稻草粉。
实施例18降解稻草粉糖液发酵沼气的方法
降解稻草粉糖液浓缩糖度达到150g/L；按100：1的比例加入活性污泥，20℃厌气发酵45d或40℃厌气发酵20d，沼气产气率达到800L/kg秸秆。
对照实施例米曲霉发酵液的制备和降解玉米秸秆的方法
所述米曲霉发酵液是以玉米桔杆为原料，米曲霉为菌株按照下述步骤制备：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在28℃培养4d，制得米曲霉试管斜面菌种；
b.种子罐种子培养：将斜面菌种接种到250ml含有15g玉米秸秆和45ml水的锥形烧瓶中，在28℃条件下培养5d，制成种子罐菌种；
c.固态发酵培养：将种子罐菌种接种到固体发酵培养基中进行固态发酵，在温度38℃的条件下培养10d，制得米曲霉发酵液；
d.木质素降解：取5g固体发酵培养基加入适量的水、过氧化氢，在pH6.0、温度55℃条件下水解6h，获得秸秆糖液；
其中，所述固体发酵培养基中的组分及其重量比如下：
玉米杆：30％过氧化氢：水为10:3:25。
制得的米曲霉发酵液含有木质素过氧化物酶酶活性在第10天达到最大值3.695U/g；发酵液降解玉米秸秆后的糖得率为0.2g/5g。
实验结果
由各实施例1-15与对照实施例的结果比对见表1；
表1 液态发酵和固态发酵制备的酶液结果和降解木质素的结果比对
上述结果表明，相较于现有技术中固态发酵，本发明的液态发酵制备的发酵液的生产周期短、酶活性高，且利用该发酵液降解木质素制备的糖液糖得率高。由于以往的固态发酵技术，边发酵产酶，边降解木质素，在发酵过程中不可避免的伴随着纤维素降解，使得最终产品糖得率低；而本发明使用的液体发酵制备酶液，利用酶工程技术，添加底物催化水解稻草木质素、纤维素，由于没有杂菌的干扰，糖得率高。
以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种米曲霉发酵液的制备方法，其特征在于，所述米曲霉发酵液含有木质素过氧化物酶酶活性100-1000U/L和外切纤维素酶酶活性100-300U/L；所述米曲霉发酵液是以稻草粉为原料，米曲霉为菌株制备而成，所述制备方法包括以下步骤：
a.试管扩大培养：将米曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，在温度25-45℃下培养2-8d后，进行1-10℃保藏，制得米曲霉试管斜面孢子；
b.液体摇瓶培养：将一环米曲霉试管斜面孢子接种于于装有20-100ml液体摇瓶培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为50-160转/分，温度20-38℃的条件下，摇床培养18-56h，制成液体摇瓶菌种；
c.一级种子罐种子培养：按接种量为1%-20%将液体摇瓶菌种接种于种子罐培养基中，在温度为20-38℃，搅拌转速为50-160转/分，通气量为0.2-1.8:1的条件下，培养18-50h，制成一级种子罐菌种；
所述接种量为液体摇瓶菌种与种子罐培养基的体积比；所述通气量为每分钟通入气体的体积与种子罐培养基体积比；
d.液体发酵培养：按接种量为1-20%将一级种子罐菌种接种到发酵培养基中，在温度20-38℃，搅拌转速50-200转/分，通气量为0.2-1.8：1的条件下，培养2-7d，得到米曲霉发酵液；
所述接种量为一级种子罐菌种与发酵培养基的体积比；所述通气量为每分钟通入气体的体积与发酵培养基的体积比；
其中，所述液体摇瓶培养基和种子罐培养基通过将培养基原料进行灭菌制得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
米糠0.2-2g 葡萄糖0.1-3g 酵母粉0.1-1g
氯化亚铁0.001-0.02g 硫酸镁0.001-0.2g
磷酸氢二钾0.01-0.2g；
所述发酵培养基通过将培养基原料进行灭菌制得，每100ml培养基中含有的原料各成分的重量为：
稻草粉1-8g 葡萄糖0.1-3g 酵母粉0. 3-3g
氯化亚铁0.001-0.02g 硫酸镁0.001-0.2g
磷酸氢二钾0.01-0.2g 米糠0.1-5g。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述米糠的粒度为10-100目。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述一级种子罐菌种经二级种子罐种子培养后，再进行液体发酵培养，所述二级种子罐种子培养工艺为：
按接种量为5-20%将一级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度20-30℃，搅拌转速52-100转/分，每分钟通气量为1-1.8：1的条件下，培养20-30h，制得二级种子罐菌种；
所述接种量为一级种子罐菌种与二级种子罐的种子罐培养基的体积比。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二级种子罐菌种经三级种子罐种子培养后，再进行液体发酵培养，所述三级种子罐种子培养工艺为：
按接种量为10-20%将二级种子罐菌种接种于种子罐培养基中，在温度20-30℃，搅拌转速52-80转/分，每分钟通气量为1-1.8：1的条件下，培养20-30h，制得三级种子罐菌种；
所述接种量为二级种子罐菌种与三级种子罐的种子罐培养基的体积比。
5.一种利用权利要求1所述制备方法获得的米曲霉发酵液水解稻草粉制备糖液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a）将热处理的稻草粉、米曲霉发酵液和水混合，预热；
或者将热处理的稻草粉、粗酶粉和水混合，预热；
b）添加H2O2溶液，搅拌，降解，获得混合液；
c）将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a）稻草粉进行100-130℃热处理20-60min，将热处理的稻草粉、米曲霉发酵液和水按1：0.2-5：5-50混合，20-60℃保温；
或者稻草粉进行100-130℃热处理20-60min，将热处理的稻草粉、粗酶粉和水按1：2.5×10-3：5-50混合，20-60℃保温；
b）搅拌转速30-180转/分条件下，进行搅拌；
c）在3-10h内，匀速加入稻草粉重量5-20倍的0.5-5%H2O2溶液，在温度为20-60℃，搅拌转速30-180转/分条件下，降解5-20h，获得混合液；
d）将混合液抽滤，收集滤液，获得降解稻草粉糖液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中的稻草粉的粒度为20-100目。
8.一种利用权利要求5所述方法制备的降解稻草粉糖液进行发酵沼气的方法，其特征在于，所述糖液的糖得率为20-45/100g稻草粉，所述发酵沼气的方法为：将糖液浓缩至糖度为150g/L，按100:1的比例加入活性污泥，在20~40℃的条件下进行厌氧发酵20~45天，即产生沼气。
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