CN103451161A

CN103451161A - 一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法

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Publication number: CN103451161A
Application number: CN2012101697930A
Authority: CN
Inventors: 张志才; 陈钧; 任晓锋; 李佳少; 黄达明
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: CN103451161B

Abstract

本发明一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，涉及生物工程领域。其生产工艺流程是秸秆经过粉碎、预湿等预处理工艺，米曲霉经过液体摇瓶培养、一级种子培养、与秸秆混合进行固态发酵，得到含有木质素过氧化物酶的秸秆发酵物，酶活性3～800U/g干发酵物，发酵物经过水提取、分子截留、冷冻干燥可以获得酶制剂粗品,酶活性达到900～8000U/g干粗品。此发酵工艺简便，不会对环境造成污染，也不会对资源造成浪费。采用此方法制得的木质素过氧化物酶可以用于降解木质素大分子结构、释放小分子物质，提高含有木质素秸秆的消化利用率，从而有助于提高秸秆的饲用价值。

Description

一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特指未经高温、高压处理的秸秆培养基经发酵制备木质素过氧化物酶制品，该制品用水提取，提取液经过分子截留，冷冻干燥获得木质素过氧化物酶的粗品。

背景技术

我国是农业大国，每年农作物秸秆年产量逾6亿吨，除少量被用作纺织、造纸行业，但大部分以堆积、焚烧的形式倾入环境，既浪费了资源也给环境造成了极大地危害。

秸秆含有植物光合作用所积累的一半以上的能量，富含粗糖、粗蛋白质等有利于家畜家禽所需的成分，作为非竞争性的饲料资源，只要能够进行合理的加工调制，用来饲喂畜禽，特别是用来饲喂牛、羊等反刍家畜，有可能成为优质的饲料资源。同时，我国又是一个饲料(尤其是蛋白质饲料)严重短缺的大国，每年需进口大量的鱼粉以弥补蛋白质饲料的不足。所以能否将秸秆纤维转化为动物可利用且营养价值高的蛋白质饲料，以解决饲料需求的严重不足，就显得尤为重要。

植物的秸秆主要有木质素和纤维素构成。木质素是一类由苯酚和非苯酚结构单元通过醚键和碳碳键等连接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在组分种类和连接键类型方面的多样性，意味着其结构的异质性与不规则性，也决定了对木质素进行生物降解的复杂性和特殊性，且其在植物细胞壁中与半纤维素以共价键形式结合后，将纤维素分子包埋在其中，形成坚固的天然屏障，使一般的微生物很难进入其中分解纤维素，因此，木质素的降解也是能否有效利用秸秆资源的关键因素。

目前降解秸秆的主要方法中有代表性的包括蒸汽汽爆预处理、硫酸预处理、氢氧化钠预处理、氨水预处理和生物预处理等5种方法。蒸汽汽爆则是以高压蒸汽渗入纤维内部，以气流的方式从封闭的空隙中释放出来，纤维发生一定的机械断裂，使原料中大部分半纤维素和少量木质素、纤维素降解溶出，该方法成分较高，需要大型的设备，木质素还需要处理；酸处理法是利用硫酸水解糖苷键、酯键等，使玉米秸秆纤维的网状结构疏松，但是该方法耗用大量的有机酸或无机酸，木质素仍需要进一步处理，不适应大规模的工业化生产。碱处理和氨水处理是利用木质素溶于碱性溶液，与酸处理一样同样存在环境污染问题。这些方法普遍都存在反应条件较难掌握、反应温度高、处理时间长、占用空间大、处理效果不理想,不能去除木质纤维素等问题，近年来生物处理秸秆越来越受到人们的重视，生物降解木质素的关键是微生物能够分泌降解木质素的酶：锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶。

对于生物法生产木质素过氧化物酶的专利、研究都较少。专利（申请号：200610109413）的目的在于克服目前白腐真菌降解木质素的不足之处，而提供一种新型的降解木质素的微生物菌剂以及利用上述菌剂降解木质纤维素的方法。微生物菌剂是由假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌组成。米曲霉是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种，但是未见米曲霉分泌木质素过氧化物酶的专利及其相关文献报道。

本发明人经过深入的研究，摸索出一种以秸秆为主要原料，通过米曲霉菌体固态培养获得木质素过氧化物酶的方法。该方法不同于过去的方法之处在于所使用的菌种是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种，采用秸秆作为主要原料，通过固态发酵获得含有木质素过氧化物酶的发酵物制品，该制品可以经过进一步提取制得木质素过氧化物酶粗品。

发明内容

本发明一个目的是提供了一种以米曲霉为菌种，以秸秆为原料进行固态发酵的方法，以及由该方法制备的米曲霉发酵物，该发酵物中含有木质素过氧化物酶。

本发明一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到含有木质素过氧化物酶的米曲霉固体发酵物,然后进行提取得到含有木质素过氧化物酶粗品。

其中所述的菌种是任何一种米曲霉菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。

其中所述的含有木质素的农作物秸秆原料是任意一种秸秆，如玉米秸秆、稻草秸秆、麦秸秆、高粱秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆等等所有含有木质素的农作物秸秆，秸秆首先经过粉碎，过20～100目的筛。

其中所述的试管扩大培养工艺中，其扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基；

其中所述的液体摇瓶培养和一级种子培养的培养基均为：葡萄糖5～30克，酒石酸铵0.1～5克，苯甲醇0.2～3克，硫酸镁0.2～1克，吐温80 0.5～10克，磷酸二氢钾2～9克，邻苯二甲酸3～18克，加水定容到1升，pH 5～8克，120～140℃灭菌20～40分钟。

其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有体积比16～48%培养基的三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时；在进行摇瓶培养之前，首先将米曲霉菌种接入新配置的马铃薯蔗糖培养基中进行培养，培养温度25～35℃，培养时间48～144小时；4～10℃保存备用。

其中所述的一级种子培养工艺为，按1～20%（体积比）的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养18～72小时；

其中所述的固体发酵培养中固体发酵培养基组成为：秸秆10千克，水20～60千克，葡萄糖0.5～3千克，黄豆饼粉0.5～2千克；硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按此比例放大；

其中所述的发酵工艺为：按2～20%（种子液体积/发酵培养基重量），培养料厚度为0.1～0.4米，料宽0.5～2米，长度不限，通气量为0.3～1.5：1（气体体积/发酵培养基重量）/每分钟，培养时间为3天～23天，中途翻料1～2次。

其中所述的生产木质素过氧化物酶粗品的工艺，将上述的固态发酵物粉碎，过20～100目筛，粉碎的发酵培养物与水按1：10～50比例混合，50～300转/分钟搅拌，5～10℃提取4～8小时，抽滤，滤渣用10～50倍的水混合，50～300转/分钟搅拌，5～10℃提取4～8小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量5000～10000的膜截留浓缩50～100倍，-20℃冷冻干燥，得到酶制剂粗品。由此工艺得到的酶制剂粗品，色质白色至褐色，木质素过氧化物酶活性可达到900～8000U/g干粗品。

由本发明获得秸秆发酵物含有大量的黄绿色米曲霉孢子，发酵物桔黄色至褐色，含有酒曲香味，木质素过氧化物酶活性达到3～800U/g干发酵物。

根据本发明所述的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识，可以根据生产需要，增加二级、三级甚至四级种子罐，进一步扩大固态发酵生产规模，以进行工业化生产。二级、三级甚至四级种子罐采用的培养基与摇瓶培养基和一级种子培养基相同，接种量为5～20%，培养条件同于一级种子培养，

采用此工艺的优点采用固态发酵，并且不经高温高压处理，这样不会给环境造成污染，也不会浪费资源。

附图说明

图1为本专利的工艺流程图。

具体实施方式

根据此工艺采用的木质素过氧化物酶测定方法为：准确称取1克发酵物或酶制剂粗品，溶于50mL水中，室温振荡2小时，抽滤，滤液定容至50mL,即为酶液。准确移取200 mM酒石酸缓冲液0.5 mL于容积为1.4 mL的比色皿中，加入40 mM黎芦醇0.1 mL。准确加入待测酶液XμL（X=0～400），加入纯净水（400-X）μL。30℃水浴，加入浓度为20 mM H₂O₂溶液0.01 mL启动反应，迅速测定310 nm处的吸光度，1 min后再测定1次计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（OD310变化）。

这里X:待测酶液体积（mL）

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例，但是这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。

实施例1

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（Aspergillus oryzae）（中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC5992），26℃，培养时间50小时；4℃保存备用。

2、液体摇瓶培养菌种的制作

精确称取葡萄糖5克，酒石酸铵0.1克，苯甲醇0.2克，硫酸镁0.2克，吐温80 0.5克，磷酸二氢钾2克，邻苯二甲酸缓冲液3克，水1000 mL, pH 5，分装250mL三角瓶，每瓶50克，共20瓶，120 ℃灭菌 40分钟；冷却后，每瓶接入一环4℃保存的米曲霉菌种，在25℃，150转/分，培养 72小时；

3、一级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖50克，酒石酸铵1克，苯甲醇2克，硫酸镁2克，吐温80 5克，磷酸二氢钾20克，邻苯二甲酸30克，水10L，装于15L的种子罐中，130℃灭菌30分钟；灭菌冷却后，在温度25 ℃，搅拌转速50 转/分，通气量0.2 ：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养 72小时；

4、固态发酵生产木质素过氧化物酶

稻草秸秆粉碎，过20目筛，称取该秸秆粉750千克，水1500 千克，葡萄糖37.5 千克，黄豆饼粉37.5 千克；硫酸铜375 克，硫酸亚铁375 克，硫酸锰375 克，充分拌匀，接入上述一级种子培养液，混合均匀，制成培养料厚度为0.1米，料宽0.5米，长度37.5米的料堆，控制温度25 ℃培养 23天，中途翻料 2次。

获得秸秆发酵物含有大量的黄绿色米曲霉孢子，发酵物桔黄色至褐色，有酒香味。木质素过氧化物酶活性为25U/g干发酵物。

5、粗酶制品的制备

固态发酵物粉碎，过20 目筛，粉碎的发酵培养物与水按1：10 比例混合，60转/分钟搅拌，10℃提取6小时，抽滤，滤渣用10倍的水混合，60转/分钟搅拌，10℃提取6小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量5000的膜截留浓缩50倍，-20℃冷冻干燥，得到酶制剂粗品。由此工艺得到的酶制剂粗品，色质白色至褐色，木质素过氧化物酶活性可达到1090U/g干粗品。

实施例2

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（Aspergillus oryzae），30℃，培养时间100小时；7℃保存备用。

2、液体摇瓶培养菌种的制作

精确称取葡萄糖150克，酒石酸铵250克，苯甲醇15克，硫酸镁0.4克，吐温80 4克，磷酸二氢钾5克，邻苯二甲酸缓冲20克，水10 L, pH 6，分装250mL三角瓶，每瓶100克，共100瓶，130℃灭菌30分钟；冷却后，每瓶接入一环7℃保存的米曲霉菌种，在30℃，150转/分，培养50小时；

3、一级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖2000克，酒石酸铵200克，苯甲醇150克，硫酸镁60克，吐温80 60克，磷酸二氢钾400克，邻苯二甲酸1000克，水100L，装于130L的种子罐中，130℃灭菌30分钟；冷却后，在温度30℃，搅拌转速125转/分，通气量1：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养50小时；

4、固态发酵生产木质素过氧化物酶

玉米秸秆粉碎，过60目筛，称取该秸秆粉1000千克，水3000千克，葡萄糖150千克，黄豆饼粉100千克；硫酸铜600克，硫酸亚铁600克，硫酸锰1000克，充分拌匀，接入上述一级种子培养液，混合均匀，制成培养料厚度为0.2米，料宽1米，长度225米的料堆，控制温度30℃培养15天，中途翻料2次。

获得秸秆发酵物含有大量的黄绿色米曲霉孢子，发酵物黄褐色，有酒香味。木质素过氧化物酶活性为395U/g干发酵物。

5、粗酶制品的制备

固态发酵物粉碎，过50目筛，粉碎的发酵培养物与水按1：30比例混合，150转/分钟搅拌，10℃提取8小时，抽滤，滤渣用30倍的水混合，150转/分钟搅拌， 10℃提取8小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量10000的膜截留浓缩70倍，-20℃冷冻干燥，得到酶制剂粗品。由此工艺得到的酶制剂粗品，色质白色至褐色，木质素过氧化物酶活性可达到4900U/g干粗品。

实施例3

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（Aspergillus oryzae），35℃，培养时间144小时；10℃保存备用。

2、液体摇瓶培养菌种的制作

精确称取葡萄糖300克，酒石酸铵50克，苯甲醇30克，硫酸镁10克，吐温80 100克，磷酸二氢钾90克，邻苯二甲酸缓冲液180克，水10L, pH7.5，分装250mL三角瓶，每瓶120 mL，共80瓶， 140℃灭菌20分钟；冷却后，每瓶接入一环10℃保存的米曲霉菌种，在35℃，150转/分，培养72小时；

3、一级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖1500克，酒石酸铵250克，苯甲醇150克，硫酸镁50克，吐温80 500克，磷酸二氢钾450克，邻苯二甲酸缓冲液900克，水50L，装于70L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟；灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养72小时；

4、二级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖15000克，酒石酸铵2500克，苯甲醇1500克，硫酸镁500克，吐温80 5000克，磷酸二氢钾4500克，邻苯二甲酸缓冲液9000克，水500L，装于700L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟；灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养18小时；

5、固态发酵生产木质素过氧化物酶

麦草秸秆粉碎，过100目筛，称取该秸秆粉3500千克，水21000千克，葡萄糖525千克，黄豆饼粉525千克；硫酸铜5000克，硫酸亚铁5000克，硫酸锰6000克，充分拌匀，接入上述二级种子培养液，混合均匀，制成培养料厚度为0.3米，料宽2米，长度300米的料堆，控制温度35℃培养6天，中途翻料1次。

获得秸秆发酵物含有大量的黄绿色米曲霉孢子，发酵物褐色，有酒香味。木质素过氧化物酶活性为768U/g干发酵物。

6、粗酶制品的制备

固态发酵物粉碎，过80目筛，粉碎的发酵培养物与水按1：50比例混合，250转/分钟搅拌，5℃提取4小时，抽滤，滤渣用50倍的水混合，250转/分钟搅拌，5℃提取4小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量7000的膜截留浓缩100倍，-20℃冷冻干燥，得到酶制剂粗品。由此工艺得到的酶制剂粗品，色质灰白色，木质素过氧化物酶活性可达到8770U/g干粗品。

Claims

1.一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到含有木质素过氧化物酶的米曲霉固体发酵物,然后进行提取得到含有木质素过氧化物酶粗品。

2.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的菌种是任何一种米曲霉菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。

3.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的含有木质素的农作物秸秆原料是任意一种秸秆，如玉米秸秆、稻草秸秆、麦秸秆、高粱秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆等等所有含有木质素的农作物秸秆，秸秆首先经过粉碎，过20～100目的筛。

4.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的试管扩大培养工艺中，其扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基。

5.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的液体摇瓶培养和一级种子培养的培养基均为：葡萄糖5～30克，酒石酸铵0.1～5克，苯甲醇0.2～3克，硫酸镁0.2～1克，吐温80 0.5～10克，磷酸二氢钾2～9克，邻苯二甲酸3～18克，加水定容到1升，pH 5～8克，120～140℃灭菌20～40分钟。

6.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有体积比16～48%培养基的三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时；在进行摇瓶培养之前，首先将米曲霉菌种接入新配置的马铃薯蔗糖培养基中进行培养，培养温度25～35℃，培养时间48～144小时；4～10℃保存备用。

7.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的一级种子培养工艺为，按1～20%（体积比）的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养18～72小时。

8.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的固体发酵培养中固体发酵培养基组成为：秸秆10千克，水20～60千克，葡萄糖0.5～3千克，黄豆饼粉0.5～2千克；硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按此比例放大。

9.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的发酵工艺为：按2～20%（种子液体积/发酵培养基重量），培养料厚度为0.1～0.4米，料宽0.5～2米，长度不限，通气量为0.3～1.5：1（气体体积/发酵培养基重量）/每分钟，培养时间为3天～23天，中途翻料1～2次。

10.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的生产木质素过氧化物酶粗品的工艺，将上述的固态发酵物粉碎，过20～100目筛，粉碎的发酵培养物与水按1：10～50比例混合，50～300转/分钟搅拌，5～10℃提取4～8小时，抽滤，滤渣用10～50倍的水混合，50～300转/分钟搅拌，5～10℃提取4～8小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量5000～10000的膜截留浓缩50～100倍，-20℃冷冻干燥，得到酶制剂粗品，由此工艺得到的酶制剂粗品，色质白色至褐色，木质素过氧化物酶活性可达到900～8000U/g干粗品。