CN105395468A

CN105395468A - 一种仙人掌发酵原浆及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105395468A
Application number: CN201510994299.1A
Authority: CN
Inventors: 李萌; 王昌涛; 赵丹; 张佳婵; 王冬冬; 谢娅霏; 刘平平
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2015-12-25
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2016-03-16

Abstract

本发明公开了一种仙人掌发酵原浆及其制备方法与应用。仙人掌发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将仙人掌原浆、水和发酵菌混合得到初始体系，并对所述初始体系进行发酵培养，即得到仙人掌发酵原浆。本发明制备方法采用发酵技术，操作简单，且由于不添加任何外来物质，制备得到的仙人掌发酵原浆对皮肤安全无伤害，将其应用于化妆品中具有很好的消除自由基的能力和很高的抗衰老活性。

Description

一种仙人掌发酵原浆及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种仙人掌发酵原浆及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

仙人掌(Opuntiadillenii(Ker-Gawl.)Haw.)，是石竹目仙人掌科(Cactaceae)的植物总称，别名仙人扇、霸王树、观音掌、仙巴掌、火掌等，仙人掌的大小和形状具有广泛范围，常生长于沙漠及半沙漠等干燥少雨环境中，属于多肉植物。仙人掌繁殖力强盛，世界各地均广泛分布，原产于墨西哥东海岸、美国南部及东南部沿海地区，我国于明末引种，南方沿海地区常见栽培，现在主要分布在广西、福建、广东、江西、海南省(区)等地，资源极其丰富，但均为充分开发其价值。仙人掌具有多种用途，一些属种可作观赏植物，果实和茎叶可食用，同时它也具有丰富的药用价值。清《本草纲目拾遗》载：仙人掌味淡性寒，行气活血，清热解毒，消肿止痛，润肠止血，健脾止泻，安神利尿，可内服外用治疗多种疾病。众多史料记载，墨西哥人也早认识到仙人掌的价值并加以利用，该国国徽就有仙人掌的图样。

仙人掌的主要活性成分是仙人掌多糖(Opuntiadillenii(Ker-Gawl.)Haw.Polysaccharides,ODP)，是仙人掌具有众多药理功效的主要原因之一。仙人掌多糖主要提取自仙人掌的茎和果实，多糖主要是由极性大分子化合物葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖等组成，含量丰富活性较高。众多研究表明仙人掌多糖具有显著的抗癌、抗氧化、促伤口愈合、消炎、降血糖血脂等功效。仙人掌提取物在美容护肤中的应用已经有了很多，仙人掌对于皮肤的功效主要是抗衰老、抗炎等方面。

目前较为常用的提取仙人掌活性物质的方法有热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法，而使用微生物发酵法提取仙人掌活性物还未见报道。微生物法又可称为发酵法，是以细菌、霉菌等微生物为体系对外源底物进行结构修饰的化学反应，微生物转化不需要添加其它的催化剂，只需先培养出大量的微生物菌种，然后加入底物进行能实现的反应，所以微生物法比化学试剂的反应法更专一、更有效；反应条件温和，微生物发酵一般都是在常温和pH为7左右的条件下进行催化反应，不需要高温、高压等苛刻的条件；设备的运行操作也比较简单、安全，产生的公害较少，一般不会造成环境污染，后处理也相对简单；筛选不同的菌种与优化反应条件可提高转化率，对同一底物进行微生物转化的菌种可能有多种，通过筛选选出最佳菌种，可以保证较高的转化率。当今国内外许多研究者采用生物法生产多糖，即微生物法、酶法、植物细胞组织培养等多种生物转化法结合，已经呈现出明显优势。因为绝大多数的发酵过程所需条件非常温和，而且反应产物单纯和能耗少，是一个与环境友善的绿色化学过程。随着基因工程、细胞工程、酶工程技术的不断发展和完善，微生物发酵技术有了突飞猛进的发展，在天然活性物质提取和护肤品应用中发挥着越来越重要的作用。

当前化妆品中一般添加的化学成分有：硅油、增稠剂、pH调节剂、乳化剂、香精、抗氧化剂、色素等，这些成分对皮肤并没有实际功效，反而会增加潜在的皮肤刺激性。

发明内容

本发明的目的是提供一种仙人掌发酵原浆及其制备方法与应用。本发明制备方法采用发酵技术，操作简单，且由于不添加任何外来物质，制备得到的仙人掌发酵原浆对皮肤安全无伤害，将其应用于化妆品中具有很好的消除自由基的能力和很高的抗衰老活性。

本发明提供的仙人掌发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将仙人掌原浆、水和发酵菌混合得到初始体系，并对所述初始体系进行发酵培养，即得到仙人掌发酵原浆。

上述的制备方法中，所述仙人掌原浆、所述水和所述发酵菌的配比可为1g：(20～30)mL：(1.8～3.5)mL，具体可为1g：25mL：2mL；

所述发酵菌的浓度可为10⁶～10⁹CFU/mL。

上述的制备方法中，所述发酵培养的温度可为30～40℃，具体可为35℃，时间可为6～9h，具体可为7h；

所述发酵菌为乳杆菌，具体为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiibulgaricus)的ATCC编号为11842。

上述的制备方法中，所述仙人掌原浆来自仙人掌的叶片。

本发明中，所述仙人掌原浆的制备方法如下：将仙人掌叶片去皮、去刺后在匀浆机中粉碎后得到的浆状物；具体是匀浆机的转速为1000～1200r/min时粉碎3～5min获得所述仙人掌原浆。

上述的制备方法中，所述发酵菌以其培养液或悬浮液的形式存在；

所述发酵菌的培养液或所述发酵菌的悬浮液的pH值均可为4～6，具体可为5.0。

上述的制备方法中，上述制备方法中，在所述发酵培养之后，还包括对发酵液依次进行灭菌、离心和取上清液的步骤。

上述的制备方法中，所述灭菌的条件如下：灭菌温度可为110～121℃，具体可为115℃，灭菌时间可为15～25min，具体可为20min；

所述离心的条件如下：离心转速可为4700～5200r/min，具体8500r/min，离心时间可为20～25min，具体可为10min，离心半径可为9cm。

本发明还提供了上述的制备方法制得的仙人掌发酵原浆。

本发明进一步提供了所述的仙人掌发酵原浆在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：

1)清除自由基；

2)抗衰老。

上述的应用中，所述产品为化妆品、食品和保健品中的至少一种；

所述自由基为DPPH自由基、ABTS⁺自由基和羟基自由基中的至少一种；

所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。

本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的仙人掌发酵原浆的制备方法采用发酵工程技术，通过选择合适的菌种及发酵条件，从仙人掌中制得活性物质即仙人掌发酵原浆。一方面，最大程度的保留了植物中的活性成分，且相对与传统的水提法，避免了有机溶剂的引入，安全环保；另一方面，不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。

(2)本发明提供的仙人掌发酵原浆含有健康皮肤不可或缺的氨基酸、矿物质等自然成分，且由于在制备过程中未引入外来物质，不含任何化学成分，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用。

(3)本发明提供的仙人掌发酵原浆，具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，具有抗衰老的功效。

附图说明

图1为本发明不同浓度的仙人掌发酵原浆与DPPH自由基清除率的关系曲线。

图2为本发明不同浓度的仙人掌发酵原浆与ABTS⁺自由基清除率的关系曲线。

图3为本发明不同浓度的仙人掌发酵原浆与羟基自由基清除率的关系曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。

下述实施例中的仙人掌原浆由匀浆机粉碎后得到，由仙人掌叶片在1000～1200r/min转速下粉碎3～10min获得的浆状物质，所用仙人掌叶片来自市面销售。

下述实施例中的德氏乳杆菌Bifidobacteriumbifidum的ATCC编号为11842，公众可从ATCC购买得到。

下述实施例中的德氏乳杆菌通过如下步骤制备得到：

1、菌种的活化

挑取德氏乳杆菌菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后德氏乳杆菌菌液。

2、菌种的纯化

将步骤1得到的活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后德氏乳杆菌。

3、菌种的扩大培养

将步骤2得到的纯化后的菌种接种到MRS培养基(pH值为7.0)中，在25℃的摇床中培养，当OD值＝0.6～1.2时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为10⁶～10⁹CFU/mL)。

实施例1、制备仙人掌发酵原浆

按照如下步骤制备仙人掌发酵原浆

(1)将20mL浓度为10⁶～10⁹CFU/mL的德氏乳杆菌发酵菌菌液接种到10g的由仙人掌叶片制得的仙人掌原浆和250mL的水中，得到发酵体系；

(2)将发酵体系在35℃摇床中发酵7小时，得到发酵产物；

(3)将发酵产物在121℃下灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；

(4)将灭菌后的发酵产物在8500r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即得到仙人掌发酵原浆。

实施例2、仙人掌发酵原浆在作为化妆品中的应用

一、仙人掌发酵原浆化妆品的性质

将本发明实施例1所制备所得的仙人掌发酵原浆经活性炭脱色、去味后，制得仙人掌发酵原浆化妆品。其外观为粘稠液体、颜色为淡黄色至棕黄色。pH值5.2-6.1，粘度200-500cP，可溶性固含物含量1.8-3.9％，菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/mL，所以此发酵原浆符合化妆品质量要求。

对该仙人掌发酵原浆化妆品活性物质进行分析，仙人掌多糖检测方法参照GB/T5009.8-2008，所得结果如下：

本发明制得的仙人掌发酵原浆含有粗多糖2.81g/kg。

二、仙人掌发酵原浆的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1获得的仙人掌发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象

选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法

称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油(本实施例采用蒸馏水)。

试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。

3、试验结果

斑贴试验结果如表1所示，表1中各符号表示的含义如下："-"＝阴性反应；"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。

判断标准：根据化妆品卫生规范2007，30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或出现二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。

表1、实施例1获得的仙人掌发酵原浆的斑贴试验结果

由表1中可以看出：本发明实施例1得到的仙人掌发酵原浆发生一例可疑反应，说明本发明提供的仙人掌发酵物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。

三、仙人掌发酵原浆的抗氧化性能检测

1、仙人掌原浆对DPPH自由基的清除能力测试

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

取不同量的实施例1制备得到的仙人掌发酵原浆溶于去离子水中，制得体积百分浓度为0.63％、1.25％、2.50％、5.00％和10.00％的一系列仙人掌发酵原浆待测液。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

(1)取等体积(一般为3mL)的待测液与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A₁管)；

(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A₂管)；

(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(A₃管)；

(4)反应30min后，在517nm下测A₁、A₂、A₃管吸光度值。

清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A₂+A₃)-A₁]/A₂(1)

以仙人掌发酵原浆的体积百分浓度为横坐标，清除率为纵坐标，做出仙人掌发酵原浆对DPPH自由基清除作用曲线，如图1。

由图1可知，本发明实施例1所得仙人掌发酵原浆对DPPH清除作用的IC₅₀＝5.58mg/ml，说明本发明仙人掌发酵原浆具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。

2、仙人掌原浆对ABTS⁺自由基的清除能力测试

在氧化作用下，ABTS会氧化形成蓝绿色的ABTS+自由基，当加入抗氧化剂时，其会抑制自由基ABTS+生成，使反应体系颜色变浅，在734nm吸光度下测定吸光值即可评价抗氧化的能力。具体操作如下：

取4ml的ABTS⁺工作液置于试管中，加入40μL样品待测液，准确振荡30s，6min后测定在734nm下的吸光度，取三个平行取平均值，记为A。

ABTS⁺自由基清除率的计算公式为：清除率(％)＝100％×(1-A/0.700)

实验结果如图2所示，仙人掌发酵原浆对ABTS⁺自由基清除作用的IC50＝8.78mg/ml，说明本发明仙人掌原浆对ABTS⁺自由基也具有显著的清除效果。

3、仙人掌原浆对羟基自由基清除能力测试

目前水杨酸法是国内外运用比较广泛的方法。本实验就采用水杨酸法探究，其原理是：在Fenton反应体系中，H₂O₂与Fe²⁺反应生成·OH，生成的·OH在与水杨酸进一步反应，在510nm处有较强吸收，使得反应体系颜色加深。当加入抗氧化剂后，体系吸光度就会降低，由此判断自由基清除率效率。

水杨酸法具体操作如下：

A：依次加入FeSO₄1ml，水杨酸溶液1ml，样品液1ml，蒸馏水5ml，H₂O₂1ml，迅速置于37℃的水浴锅中保温30min，使其充分反应，测定其在510nm下的吸光值，取3个平行取平均值，记为A。

A₀₁：依次加入FeSO₄1ml，水杨酸溶液1ml，样品液1ml，蒸馏水6ml，迅速置于37℃的水浴锅中保温30min，使其充分反应，测定其在510nm下的吸光值，取3个平行取平均值，记为A₀₁。

A₀：依次加入FeSO₄1ml，水杨酸溶液1ml，蒸馏水6ml，H₂O₂1ml，迅速置于37℃的水浴锅中保温30min，使其充分反应，测定其在510nm下的吸光值，取3个平行取平均值，记为A₀。

·OH自由基清除率的计算公式为：

清除率(％)＝100％×[1-(A/A₀₁)]/A₀

上式中，A₀为未加入样品时反应体系的吸光度；

A为加入不同浓度样品后反应体系的吸光度。

A₀₁为没有H₂O₂以蒸馏水代替时反应体系的吸光度；

实验结果如图3所示，本发明仙人掌原浆对羟自由基的清除能力与其浓度具有量效关系，随仙人掌原浆浓度增高，其对羟自由基的清除能力不断增加。仙人掌原浆清除羟自由基的IC5＝10.04mg/ml。

上述的实验结果说明，本发明仙人掌原浆自由基的清除能力强，说明其具有抗衰老的能力。

Claims

1.一种仙人掌发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将仙人掌原浆、水和发酵菌混合得到初始体系，并对所述初始体系进行发酵培养，即得到仙人掌发酵原浆。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述仙人掌原浆、所述水和所述发酵菌的配比为1g：(20～30)mL：(1.8～3.5)mL；

所述发酵菌的浓度为10⁶～10⁹CFU/mL。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为30～40℃，时间为6～9h；

所述发酵菌为乳杆菌。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述仙人掌原浆来自仙人掌的叶片。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述发酵菌以其培养液或悬浮液的形式存在；

所述发酵菌的培养液或所述发酵菌的悬浮液的pH值均为4～6。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：上述制备方法中，在所述发酵培养之后，还包括对发酵液依次进行灭菌、离心和取上清液的步骤。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述灭菌的条件如下：灭菌温度为110～121℃，灭菌时间为15～25min；

所述离心的条件如下：离心转速为4700～5200r/min，离心时间为20～25min，离心半径为9cm。

8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的仙人掌发酵原浆。

9.权利要求8所述的仙人掌发酵原浆在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：

1)清除自由基；

2)抗衰老。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产品为化妆品、食品和保健品中的至少一种；

所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。