CN109207526B - 一种利用烟叶生产苯乙烯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用烟叶生产苯乙烯的方法，属于生物技术领域。根际芽孢杆菌（CGMCC No.14440）可以利用任意比例混合的烟叶和/或烟叶废弃物直接生产苯乙烯，该苯乙烯是用苯取代乙烯的一个氢原子形成的有机化合物，它不仅是工业上合成树脂、离子交换树脂及合成橡胶等重要的单体，而且在制药、染料、农药以及选矿等行业也有着广泛的应用。在本发明苯乙烯合成过程简单易行，绿色环保，此外，本发明中使用的发酵培养基成本低廉，不仅可实现资源多元化利用，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，这在合理利用资源和保护环境方面都有着积极的作用，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用烟叶生产苯乙烯的方法，特别涉及一株野生型根际芽孢杆菌利用烟叶和/或烟叶废弃物发酵生产苯乙烯的方法。
背景技术
苯乙烯（Styrene）分子式为C8H8，分子量为104.14，CAS号为100-42-5。苯乙烯是一种无色透明、有特殊香气的油状液体，不溶于水，可溶于有机溶剂如乙醇和乙醚。相对密度（20℃）为0.906 g/mL；闪点为34.4℃，熔点为-31℃，沸点（101.3 kPa）为145.2℃。它在自然界中存在于一种名为苏合香脂的香料中。苯乙烯作为现在工业生产中的一种重要的有机原料，主要用来生产聚苯乙烯（PS）树脂，不饱和聚酯，丁苯橡胶（SBR），离子交换树脂等。此外，苯乙烯在制药产业、染料生产、农药乳化剂的制造以及选矿等其他行业也有广泛的应用。它是位于聚乙烯（PE）、聚氯乙烯（PVC）和环氧乙烷（EO）之后的第四大乙烯衍生品。
烟草废弃物，是指未能用于制烟的烟草组成部分(制烟包括了用下脚料制造的膨胀烟丝与薄片等)，包括烟茎(又称烟杆、烟秆、烟梗)、无法进行卷烟加工的低等级或者等外级烟叶、烟草植株的上部烟叶、烟花、烟种、叶脉(烟筋)、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根、根出条。我国是烟草种植和生产大国，烟草种植面积和产量居世界首位。然而，在烟草种植和生产过程中，全国每年大约有百万吨废次烟叶、烟灰、烟末、烟梗等烟草固体废物产生。这些废弃物中含有大量可供利用的蛋白质、糖、脂和氮等物质，现今阶段合理利用这些废弃资源具有重要意义。烟叶也因其高含氮量、高富含营养物质使其成为备受关注的资源植物之一，应用前景广阔。
目前，苯乙烯的大规模生产主要依赖化学合成，包括乙苯脱氢法、乙苯共氧化法、乙苯氧化脱氢法，以及近几年新出现的裂解汽油抽提法、CO2氧化脱氢法、催化裂化干气法以及乙醇直接烃化法等。但是化学合成工艺不仅因高温、高压、强酸或强碱等条件对环境造成了很大的污染，而且化学合成方法过程中会产生大量不相关的副产品，降低了生产效率，增加了下游纯化成本。因此开发环境友好型，协调持续型的苯乙烯生产方法刻不容缓。生物法合成苯乙烯的出现为这一目标的实验带来希望，且越来受到各界关注。野生型菌株利用废弃物生产苯乙烯不仅开发出苯乙烯生产的新方法，也为生物法合成苯乙烯提供新思路。
发明内容
本发明的目的是为了实现资源的多元化及合理利用以及环境友好型苯乙烯生产方法的开发，提供一种野生型根际芽孢杆菌利用烟叶和/或烟叶废弃物生产苯乙烯的方法，该菌株易于分离和培养，该生产过程简单易行，除此之外，本发明中使用的发酵培养基不仅成本低廉，而且可确保资源利用的效能最大化。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种生产苯乙烯的方法：将烟叶作为发酵培养基成分，利用菌株发酵即可得到苯乙烯；
步骤1：发酵用烟叶和/或烟叶废弃物的制备
1）样品收集
烟叶类样本的收集采用随机抽样，主要采样的类型包括烟叶和/或烟叶废弃物；
2）样品制备
将采集的样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎，从烘箱中取出烘好的烟叶，马上研磨，持续研磨时间不超过2min，然后过40目筛，将过筛粉末立即装入洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来，充分摇动，混匀，此即为制备好的发酵用烟叶样品；
步骤2：制备苯乙烯
发酵培养基组分为：葡萄糖8-10 g/每升水，步骤1制备的烟叶样品10-15 g/每升水，pH值自然；在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50 mL灭菌的发酵培养基的250 mL的摇瓶中，并设置不接菌株的对照组，于180转/分钟的摇床中，37℃培养，培养48-96 h后利用GC-MS检测；
述的菌株为野生型根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）CGMCC No. 14440，是从醇化中期的烟叶上通过选择性培养基分离得到的。
所述的烟叶和/或烟叶废弃物包括：新鲜烟叶、烤制后的烟叶、醇化期中的烟叶，烟茎、无法进行卷烟加工的低等级或者等外级烟叶、烟草植株的上部烟叶、烟花、烟种、叶脉(烟筋)、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根、根出条，烟叶和/或烟叶废弃物可以任意比例混合。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1）本发明提供了一种新的方法生产苯乙烯。该苯乙烯为工业生产中的一种重要的有机原料，主要用来生产聚苯乙烯（PS）树脂，不饱和聚酯，丁苯橡胶（SBR），离子交换树脂等。此外，该苯乙烯在制药产业、染料生产、农药乳化剂的制造以及选矿等其他行业也有重要且广泛的应用。
2）本发明提供一种利用野生型菌株生产苯乙烯的方法，该野生型菌株可以利用烟叶和/或烟叶废弃物为主要营养源，这不仅开发出一种烟叶资源利用的新途径，也可以处理烟叶生产加工所产生的大量废弃物，在资源多元化利用和保护环境方面都有着积极的作用。
3）所使用的菌株不但不需要改造，而且易于分离和培养，所使用的生产方法不仅操作简单，而且可实现节能减排的目标，这也有望解决提供生物法合成苯乙烯的新途径，也可促进苯乙烯的工业化生产及更加广泛的应用。
本发明的方法提供了苯乙烯的一种新来源，该生产方法简单易行、绿色环保，除此之外，使用的发酵培养基不但成本低廉，而且可确保资源利用的效能最大化，这在实现资源的多元化、合理利用以及保护环境方面都意义重大。本发明提供的野生型根际芽孢杆菌利用烟叶和/或烟叶废弃物生产苯乙烯的方法有望提供生物法合成苯乙烯的新途径，也可加速苯乙烯工业化生产的绿色化。
附图说明
图1本发明发酵获得苯乙烯的质谱图。
图2为对照组与实验组发酵液检测的对比气相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
步骤1：发酵用烟叶和/或烟叶废弃物的制备
1）样品收集
采样：烟叶包括新鲜烟叶、烤制后的烟叶、醇化期中的烟叶；烟叶废弃物包括烟茎、无法进行卷烟加工的低等级或者等外级烟叶、烟草植株的上部烟叶、烟花、烟种、叶脉(烟筋)、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根、根出条等，烟叶和/或烟叶废弃物可以任意比例混合。
2）样品制备
将采集的烟叶样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎。从烘箱中取出烘好的烟叶，马上研磨，持续研磨时间不应超过2 min。然后过40目筛，未过筛的细脉应重新研磨过筛。注意研磨时间过长会造成样品温度升高，可能引起植物碱逸失。将过筛粉末立即装人洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来。充分摇动，混匀。此即为制备好的发酵用烟叶样品。
将采集的烟叶废弃物样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎。从烘箱中取出烘好的烟叶，马上研磨，持续研磨时间不应超过2 min。然后过40目筛，未过筛的细脉应重新研磨过筛。注意研磨时间过长会造成样品温度升高，可能引起植物碱逸失。将过筛粉末立即装人洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来。充分摇动，混匀。此即为制备好的发酵用烟叶废弃物样品。
步骤2：制备苯乙烯
发酵培养基组分为：葡萄糖10 g/每升水，制备的烟叶样品10 g/每升水， pH值自然；在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50 mL灭菌的发酵培养基的250 mL的摇瓶中，并设置不接菌株的对照组，于180转/分钟的摇床中，37℃培养，培养60 h后利用GC-MS检测。
所述的菌株为野生型根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）CGMCC No.14440，是从醇化中期的烟叶上通过选择性培养基分离得到的。
苯乙烯的定性检测：取上述发酵液经12000转/分钟离心10分钟，弃除沉淀，将发酵液上清用环己烷萃取，得环己烷萃取物，旋蒸去除部分溶剂，用无水硫酸钠除水后，用0.22μm膜过滤，利用GC-MS进行定性检测。采用DB-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样口温度325℃，离子源温度230℃，升温程序为50℃维持1分钟，然后10℃/分钟程序升温至300℃，维持5 min。获得结果质谱图如图1所示，经与标准库比对为苯乙烯。图2为根际芽孢杆菌发酵液产苯乙烯，而对照组中不产苯乙烯，说明产物确实为此根际芽孢杆菌发酵烟叶所产生的。
实施例2
发酵培养基组分为：葡萄糖8 g/每升水，制备的发酵用烟叶样品15 g/每升水，pH值自然；
在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50mL灭菌的发酵培养基的250mL的摇瓶中，并设置不接菌株的对照组，于180转/分钟的摇床中，37℃培养。培养80 h后利用GC-MS检测。
苯乙烯的定性检测：取上述发酵液经12000转/分钟离心10分钟，弃除沉淀，将发酵液上清用环己烷萃取，得环己烷萃取物，旋蒸去除部分溶剂，用无水硫酸钠除水后，用0.22μm膜过滤，利用GC-MS进行定性检测。采用DB-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm.），进样口温度325℃，离子源温度230℃，升温程序为50℃维持1分钟，然后10℃/分钟程序升温至300℃，维持5 min。获得结果质谱图如图1所示，经与标准库比对为苯乙烯。图2为根际芽孢杆菌发酵液产苯乙烯，而对照组中不产苯乙烯，说明产物确实为此根际芽孢杆菌发酵烟叶所产生的。
实施例3：
发酵培养基组分为：葡萄糖9g/每升水，制备的烟叶样品5g/每升水，制备的烟叶废弃物样品5g/每升水，pH值自然；
在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50 mL灭菌的发酵培养基的250 mL的摇瓶中，并设置不接菌株的对照组，于180转/分钟的摇床中，37℃培养。培养50 h后利用GC-MS检测。
苯乙烯的定性检测：取上述发酵液经12000转/分钟离心10分钟，弃除沉淀，将发酵液上清用环己烷萃取，得环己烷萃取物，旋蒸去除部分溶剂，用无水硫酸钠除水后，用0.22μm膜过滤，利用GC-MS进行定性检测。采用DB-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm.），进样口温度325℃，离子源温度230℃，升温程序为50℃维持1分钟，然后10℃/分钟程序升温至300℃，维持5 min。获得结果质谱图如图1所示，经与标准库比对为苯乙烯。图2为根际芽孢杆菌发酵液产苯乙烯，而对照组中不产苯乙烯，说明产物确实为此根际芽孢杆菌发酵烟叶和/或烟叶废弃物所产生的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (1)
1.一种利用烟叶生产苯乙烯的方法，其特征在于按以下步骤进行：
步骤1：发酵用烟叶和/或烟叶废弃物的制备
1）样品收集
烟叶类样本的收集采用随机抽样，主要采样的类型包括烟叶和/或烟叶废弃物；
2）样品制备
将采集的样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎，从烘箱中取出烘好的烟叶，马上研磨，持续研磨时间不超过2min，然后过40目筛，将过筛粉末立即装入洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来，充分摇动，混匀，此即为制备好的发酵用烟叶样品；
步骤2：制备苯乙烯
发酵培养基组分为：葡萄糖8-10 g/每升水，步骤1制备的烟叶样品10-15 g/每升水，pH值自然；在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50 mL灭菌的发酵培养基的250 mL的摇瓶中，并设置不接菌株的对照组，于180转/分钟的摇床中，37℃培养，培养48-96 h后利用GC-MS检测；
取上述发酵液经12000转/分钟离心10分钟，弃除沉淀，将发酵液上清用环己烷萃取，得环己烷萃取物，旋蒸去除部分溶剂，用无水硫酸钠除水后，用0.22 μm膜过滤，利用GC-MS进行定性检测；
所述的菌株为野生型根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）CGMCC No. 14440，是从醇化中期的烟叶上通过选择性培养基分离得到的；
所述的烟叶和/或烟叶废弃物包括：新鲜烟叶、烤制后的烟叶、醇化期中的烟叶，无法进行卷烟加工的低等级或者等外级烟叶、烟草植株的上部烟叶，烟叶和烟叶废弃物可以任意比例混合。
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