CN110168073A

CN110168073A - 用于降解mtbe、tba和/或hcho的细菌菌株和包含所述细菌菌株的细菌聚生体

Info

Publication number: CN110168073A
Application number: CN201780078868.5A
Authority: CN
Inventors: L·巴斯蒂安; Q·西蒙斯; L·迪邦; D·莫尔斯
Original assignee: Vlaamse Instelling Voor Technologish Onderzoek NV VITO
Current assignee: Vlaamse Instelling Voor Technologish Onderzoek NV VITO
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2037-11-29
Also published as: EP3327149A1; US11213709B2; US20190314662A1; WO2018100011A1; JP7191825B2; EP3548639B9; EP3548639B1; EP3548639A1; CN110168073B; JP2020504998A; EP3548639C0

Abstract

本发明提供了使用细菌聚生体降解MTBE、TBA和/或HCHO的工具和方法，所述细菌聚生体包含选自甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的一种或多种菌株。

Description

用于降解MTBE、TBA和/或HCHO的细菌菌株和包含所述细菌菌株的细菌聚生体

技术领域

本发明涉及用于在降解甲基叔丁基醚(MTBE)、叔丁醇(TBA)和/或甲醛(HCHO)中使用的细菌聚生体及其应用。

背景技术

受甲基叔丁基醚(MTBE)污染的地下水是一个长期且全球性的环境问题。MTBE是合成汽车燃料添加剂，并且主要用作四乙基铅的替代，以提高无铅汽油的辛烷值。汽油中使用MTBE的另一个优点是改善了驱动含氧汽油的汽车的废气质量。然而，MTBE在汽油中的存在导致地下水被MTBE污染，这主要归因于地下油储气罐泄漏。由于MTBE在地下水中具有高溶解度，因此地下水中的MTBE浓度可能相对较高。叔丁基醇(TBA)(也称为叔丁醇或第三丁基醇，是MTBE降解中的中间体)和BTEX化合物(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)经常发现与MTBE污染相关。地下水中MTBE的存在对饮用水供应构成了威胁，这归因于MTBE在地球的地表下的高流动性、其顽固性以及MTBE在水中的低味道和气味阈值。MTBE水平超过国家阈值浓度的大量污染羽流表明需要有效的修复技术。为了处理受MTBE污染的地下水，生物修复被认为是物理方法的有价值的替代方法，物理方法对于处理MTBE和TBA污染是低效的。

迄今为止，已知有限数量的纯培养物(pure cultures)或纯性培养物(axeniccultures)和混合培养物具有使用MTBE和/或TBA作为唯一碳源和能源来源的能力。对于大多数混合培养物，尽管已经做出努力，但组成是未知的，并且尚未鉴定出导致MTBE和/或TBA降解的细菌。与许多其他污染的降解一样，MTBE的生物降解受到若干困难的挑战。大多数纯培养物在MTBE上生长非常缓慢，一些细菌很容易失去降解MTBE的能力，并且一些菌株需要添加特定的生长添加剂。

Moreels等人(2004；FEMS Microbiology Ecology 49(1):121-128)比较了来自受污染和未受污染的土壤和含水层的样品对MTBE进行生物降解的能力。Bastiaans等人(2013；Proc.Aquarehab,Sec.Eur.Symp.第70-75页)和Debor等人(2010,KULeuven论文)指出一种细菌M-聚生体，据称它适用于在地下水污染物的生物降解中使用。然而，M-聚生体没有以有条件完成的方式公开，并且不能基于这种教导再现。

发明内容

本发明提供了包含降解MTBE、TBA和/或HCHO的纯性培养物的聚生体，使用它们的方法和鉴定它们的工具。

本文所述的聚生体具有优异的降解MTBE、TBA和/或HCHO的能力，并且已成功用于MTBE去污。更具体地，本发明的聚生体能够降解以低浓度或高浓度存在的MTBE，因为MTBE的限制或过量不限制聚生体生长和降解MTBE、TBA和/或HCHO的能力。本文所述的聚生体即使在低营养素浓度下也具有相对高的MTBE和TBA降解速率，并且可以在宽范围的边界条件(如低温)下应用。此外，当使用本发明的聚生体时，生物降解在没有中间体的积累的情况下完成。

与先前所述的聚生体相反，本发明的聚生体非常稳定并且即使在亚培养若干年或当转移至不同环境条件时也保持其MTBE降解能力。

在第一方面，本申请提供了包含甲基养菌属(Methylibium)菌株LD3的分离的细菌聚生体，所述甲基养菌属菌株LD3是降解甲基叔丁基醚(MTBE)的菌株。细菌菌株甲基养菌LD3已经保藏为LMG P-27480，并且特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:1。已经发现，包含甲基养菌属菌株LD3的聚生体在降解MTBE及其分解产物TBA、HIBA和甲醛方面非常有效。

进一步发现，包含甲基养菌属菌株LD3与特定其他菌株组合的聚生体具有进一步改善的MTBE降解效率。因此，在具体实施例中，本文所述的聚生体进一步包含噬氢菌属(Hydrogenophaga)菌株噬氢菌LD1和/或分枝杆菌属(Mycobacterium)菌株分枝杆菌LD6。噬氢菌属菌株噬氢菌LD1已经保藏为LMG P-27479，并且特征在于存在16S rRNA序列SEQ IDNO:2。分枝杆菌属菌株分枝杆菌LD6被保藏为LMG P-27498，并且特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:3。在具体实施例中，本文所述的聚生体包含甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和分枝杆菌LD6，并且对应于保藏为LMG P-27478和LMG 27909的聚生体(M-聚生体)。在本发明的聚生体的另外的具体实施例中，甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和分枝杆菌LD6分别以1％-60％之间、40％-99％之间和0.005％-10％之间的比率存在，更具体地分别以1％-55％之间、45％-99％之间和0.005％-2％之间的比率存在。在本发明的聚生体的具体实施例中，甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和分枝杆菌LD6分别以10²至10⁸个细胞/ml之间(如10⁴-10⁸个拷贝/ml甲基养菌LD3、10⁶-10⁹个拷贝/ml噬氢菌LD1、以及10²-10⁶个拷贝/ml分枝杆菌LD6)存在。在本发明的聚生体的具体实施例中，甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和分枝杆菌LD6以约(％/％/％)1-55/45-99/0.005-2的相对丰度存在，如以4.5/95.5/0.03、51.3/48.7/0.005、47.6/52.4/0.008、2.1/97.9/0.006、7.3/92.6/0.02、36.3/63.6/0.07、1.3/98.4/0.3或13.9/86/0.02的相对丰度存在。

在具体实施例中，如通过q-PCR所确定，在MTBE降解期间和之后，如在载体材料上所测量的甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的相对浓度分别为0.01％-99.98％、0.01％-99,98％和0.01％-34％。在具体实施例中，在用实际地下水的非灭菌条件下降解MTBE期间和之后，如在载体材料上测量的聚生体中甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的相对浓度分别为0.1％-86％、0.1％-10％、<0.1％-7％(如通过q-PCR确定的)，以及分别为0.1％-57％、<0.1％-23％和<0.1％-35％(如通过使用特异性探针的FISH分析(荧光原位杂交)确定的)。

本文所述的细菌菌株和聚生体特别有利于降解受甲基叔丁基醚(MTBE)、叔丁醇(TBA)、羟基异丁酸(HIBA)、甲醛(HCHO)和/或BTEX-化合物污染的介质中的MTBE、TBA、HIBA、HCHO和/或BTEX-化合物。

在具体实施例中，包含甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6菌株的本文所述的细菌聚生体具有10-64mg MTBE/g干重生物质/小时的最大观察MTBE降解速率和/或30-80mg TBA/g干重生物质/小时的TBA降解速率。

因此，另一方面提供了用于利用本文所述的细菌菌株和/或聚生体来降解受甲基叔丁基醚(MTBE)、叔丁醇(TBA)、羟基异丁酸(HIBA)和/或甲醛(HCHO)污染的介质中的MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的方法。在具体实施例中，此类方法包括以下步骤：(i)提供如本文所述的聚生体；和(ii)用所述聚生体处理受污染的介质以降解至少一部分所述污染。在具体实施例中，处理步骤在生物反应器中发生或通过将聚生体添加到受污染的介质中而原位发生。原位受污染的介质可以处于约10℃的温度，具体是在5℃至15℃之间的温度，具体是在7℃至13℃之间的温度。

在本发明的方法的具体实施例中，将聚生体以在10²至10⁸个细胞/ml之间的细胞计数添加到受污染的介质中。在具体实施例中，方法涉及提供具有如上所述的甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的相对浓度的聚生体。根据本发明的具体实施例，方法包括确定介质中MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的浓度，和/或包括确定介质中MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的降解速率。

在本发明的具体实施例中，受污染的介质选自由以下构成的组：受污染的土壤、受污染的淤泥、受污染的沉积物、受污染的疏浚尾料(dredge tailing)、受污染的化学废物、受污染的流体和受污染的水。

在另一方面，本发明提供了用于检测样品中甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6微生物的存在的方法，所述方法包括鉴定所述样品中分别对应于SEQ ID NO:1(图3)、SEQ ID NO:2(图4)或SEQ ID NO:3(图5)的序列的存在。在具体实施例中，这些方法包括：将所述样品与引物或探针接触，所述引物或探针能够特异性杂交或扩增对SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3具有特异性的序列，以及确定存在杂交信号或扩增产物，所述杂交信号或扩增产物指示样品中分别存在甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6。

在又另一方面，本发明提供了分离的细菌菌株，其在降解MTBE、TBA，HIBA和/或HCHO中的用途是特别有意义的。更具体地，本发明提供了分离的降解MTBE、TBA、HIBA和甲醛的甲基养菌属菌株，其特征在于存在16S RNA序列SEQ ID NO:1和/或对应于保藏为LMG P-27480的菌株甲基养菌LD3。在另一实施例中，本发明提供了分离的降解叔丁醇(TBA)的噬氢菌属菌株，其特征在于存在16S RNA序列SEQ ID NO:2和/或对应于保藏为LMG P-27479的菌株噬氢菌LD1。本发明进一步提供分离的降解甲醛(HCHO)的分枝杆菌属菌株，其特征在于存在16S RNA序列SEQ ID NO:3和/或对应于保藏为LMG P-27498的菌株分枝杆菌LD6。所述分离的菌株可以用于降解MTBE、TBA、HIBA、甲醛和/或HCHO。

在又另一方面，本发明提供了分离的核酸序列，所述核酸序列在检测本文所述的细菌菌株和聚生体方面是有意义的。更具体地，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的序列(对应于本文所述的细菌菌株的特异性16SRNA序列)或由其构成。

附图说明

通过以下附图来说明本发明，附图仅被认为是说明性的，并不以任何方式限制本发明的范围。

图1展示了根据本文设想的实施例，M-聚生体在50mg/L MTBE(a)、TBA(b)、HIBA(c)或HCHO(d)下的生长和对它们的降解。

图2展示了M-聚生体在实验室规模条件下在最小矿物介质中经长时间降解MTBE的稳定性，其中若干次重新添加作为唯一碳源的MTBE。

图3展示了甲基养菌属物种LD3的16S rRNA的序列。

图4展示了噬氢菌属物种LD1的16S rRNA的序列。

图5展示了噬氢菌LD6的16S rRNA的序列。

图6展示了从M-聚生体分离的纯细菌菌株对MTBE、TBA或HCHO的降解和相应的生长。箭头描绘了添加MTBE、TBA或HCHO底物的时间。通过OD₆₆₀测量来监测生长。

图7展示了如通过使用靶向甲基养菌属物种LD3、噬氢菌属物种LD1、分枝杆菌属物种LD6的16SrRNA基因的特异性引物进行的定量聚合酶链式反应(qPCR)所确定的，随时间采集的M-聚生体的不同生长培养物中甲基养菌属物种LD3、噬氢菌属物种LD1、分枝杆菌属物种LD6的绝对丰度。

图8展示了M-聚生体在非无菌环境基质(包括含水层物质和来自实际污染的地下水)中的稳定的MTBE降解特征。箭头描绘了添加MTBE的时间。

图9展示了当以50cm/天的速度通过充满(接种有M-聚生体的)载体材料的柱(L＝50cm)时，从(地下)水中去除MTBE和苯。

图10展示了根据本文设想的具体实施例的示例性反应器装置的示意性概览，示出了泵、管道和四个取样点。

图11展示了在含有(接种有M-聚生体的)膨胀黏土作为载体材料并进料含有MTBE的地下水的7L生物反应器系统)中实施的HRT、测量的MTBE浓度和计算的MTBE去除速率(a)和溶解氧浓度(b)。指示批处理操作期(灰色区域)、连续操作阶段的开始和营养素添加的开始(N/P，2.5mg/L K₂HPO₄.3H₂O和KNO₃)。

图12展示了接种有M-聚生体的中试规模生物反应器(300L)的流入物和流出物中TBA浓度(μg/L)随时间(天)的变化。

发明详述

除非另外定义，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术和科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，本文包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

如本文所使用的，单数形式不定冠词(a/an)和定冠词(the)”同时包括单数个和复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。

如本文所使用的，术语“包括(comprising)”、“包含(comprises)”和“由……组成(comprised of)”与“包括(including/includes)”或“含有(containing/contains)”同义，并且是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的成员、要素或方法步骤。在参照包含某些要素或步骤的实施例的情况下，这意味着还设想了基本上由所列举的要素或步骤构成的实施例。

由端点表述的数值范围包括包含在相应范围内的所有数字和分数，以及所列举的端点。

术语“分离的”是指本质上或基本上不含在其天然状态下发现时通常与之相伴随的化合物的物质。例如，术语“分离的”可以是指聚生体从包含MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的介质或样品中“分离”、“分开”或“纯化”的事实。可替代地，这一术语还可以是指以下事实：聚生体从如下微生物中分离，所述微生物是除本发明的聚生体中存在的那些之外、但通常存在于其天然环境中的微生物。

“细菌聚生体”是两种或更多种细菌物种的结合，其目的是参与共同活动以实现共同目标。术语“MTBE”是指甲基叔丁基醚和甲基叔丁基醚类化合物。术语“TBA”是指叔丁醇。术语“HCHO”是指甲醛。术语“HIBA”是指羟基异丁酸。术语BTEX是指单芳烃苯、甲苯、二甲苯和乙苯。

在第一方面，本发明提供了分离的细菌聚生体，其是降解甲基叔丁基醚(MTBE)的聚生体。实际上，已经鉴定了当在细菌聚生体中用于降解MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO时特别有意义的细菌菌株。

更具体地，已经发现细菌菌株甲基养菌属菌株LD3能够有效降解MTBE、TBA、HIBA和甲醛。甲基养菌属菌株LD3已经被Dirk Fransaer(以VITO NV董事总经理身份)在2013年2月28日，以LMG P-27480保藏于比利时微生物协调保存中心(Belgian coordinatedcollections of Micro-organisms)，其位于根特市K.L.Ledeganckstraat 35B-9000的根特大学(Universiteit Gent(UGent))微生物学实验室(Laboratorium voorMicrobiologie)。细菌菌株甲基养菌属菌株LD3的特征进一步在于存在16S rRNA序列SEQID NO:1(图2)。如上所述，已经发现包含甲基养菌属菌株LD3的聚生体在降解MTBE方面非常有效。

进一步发现，通过存在一种或多种降解TBA的菌株和/或一种或多种降解HCHO的菌株，可进一步改善本发明的细菌聚生体降解MTBE的能力。因此，除了菌株甲基养菌LD3之外，本文所述的分离的细菌聚生体可以进一步包含降解TBA的细菌菌株，更具体是来自噬氢菌属物种的菌株，最具体是噬氢菌属菌株噬氢菌LD1。后一种菌株已经被Dirk Fransaer(以VITO NV董事总经理身份)在2013年2月28日，以LMG P-27479保藏于比利时微生物协调保存中心(Belgian coordinated collections of Micro-organisms)，其位于根特市K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000的根特大学(Universiteit Gent(UGent))微生物学实验室(Laboratorium voor Microbiologie)。细菌菌株噬氢菌LD1的特征进一步在于存在16SrRNA序列SEQ ID NO:2(图3)。

类似地，除了甲基养菌属菌株LD3之外，本文所述的分离的细菌聚生体可以进一步包含降解HCHO的细菌菌株，更具体是来自分枝杆菌属的菌株，最具体是分枝杆菌LD6。菌株分枝杆菌LD6已经被Dirk Fransaer(以VITO NV总经理身份)在2013年3月29日，以LMG P-27480保藏于比利时微生物协调保存中心(Belgian co-ordinated collections ofMicro-organisms)，其位于根特市K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000的根特大学(Universiteit Gent(UGent))微生物学实验室(Laboratorium voor Microbiologie)。细菌菌株分枝杆菌LD6的特征进一步在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:3(图4)。

本发明的聚生体可以进一步包含除甲基养菌LD3；噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6之外的生物。实际上，可以设想，为了进一步提高MTBE降解的效率和/或为了实现其他污染产物的互补降解，其他菌株可以存在于本发明的聚生体中。这在例如混合废物流的处理中可以是有意义的。因此，在具体实施例中，本文所述的聚生体可以包含对给定污染物或其降解中间体具有不同特异性的生物。例如，除本发明的降解MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的甲基养菌属物种和/或降解TBA的噬氢菌属物种以外，聚生体可以包含变形菌(Proteobacteria)。其实例包括但不限于热单胞菌属(Thermomonas)物种、罗尔斯通菌属(Ralstonia)物种、Hyphomycrobium物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种和鞘氨醇单胞球菌属(Sphingomas)物种。

另外地或可替代地，本发明的细菌聚生体可以包含已显示可以用于降解MTBE、TBA和/或HCHO的其他菌株。其实例包括但不限于例如以下细菌：如Methylibiumpetroleiphilum PM1、甲基养菌属物种UC1、甲基养菌属物种R8、南非分枝杆菌(Mycobacterium austroafricanum)IFP2012、南非分枝杆菌IFP2015、分枝杆菌属物种UC3、Aquincola tertiaricarbonis L108、黄色噬氢菌(Hydrogenophaga flava)ENV735、深红红球菌(Rhodococcus ruber)I-1889、食醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans)10bc312、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)CL-8和菌株CIP I-2052。

另外地或可替代地，本发明的聚生体可以进一步包含生长组分、化学添加剂、载体材料和/或防腐剂。在含有MTBE(即10mg/ml)的标准矿物介质(WXP介质)中定期培养M-聚生体。因此，生长组分的实例包括存在于WXP介质中或添加到WXP介质中的组分，如碳源。防腐剂的另一实例包括但不限于甘油。载体的实例包括但不限于膨胀黏土、生物芯片、椰壳、玻璃珠，聚酯醇颗粒、海绵等。

如上所详述，已经发现本发明的细菌聚生体在MTBE的降解方面特别有效，并且在降解受污染的介质中的MTBE、TBA、HIBA和HCHO方面更加特别有效。可以使用本领域技术人员已知的技术测量MTBE、TBA、HIBA和HCHO的存在。可能使用的方法描述于本申请公开的实例中。可以使用不同方法来计算特定降解速率。可以将降解速率表示为nmol MTBE/天/细胞，然而，在本申请中，优选地使用mg MTBE/g DW(干重)h和mg MTBE/L h。在具体实施例中，本发明的细菌聚生体能够降解MTBE(MTBE降解速率在10至64mg MTBE/g DW(干重)h之间)和/或能够降解TBA(TBA降解速率在30至80mg TBA/g DW(干重)h之间)。

除了MTBE降解速率之外，本发明的细菌聚生体可以进一步通过生长速率、生物质产率和瞬时TBA积累来表征。降解的动力学由生长速率和MTBE降解速率确定。在本发明的具体实施例中，细菌聚生体以>120mg/L MTBE/TBA和80mg/L BTEX的初始浓度降解MTBE、TBA、HIBA和BTEX，并且能够将MTBE、TBA和BTEX降解至浓度低于气相色谱-质谱(GC-MS)的检测限(即2μg/L MTBE，65μg/L TBA和0.5μg/L BTEX)，伴随相关的生物质产生。MTBE降解速率的计算也在本申请公开的实例中举例说明。

根据另一方面，本申请提供了用于降解受甲基叔丁基醚(MTBE)、叔丁基醇(TBA)和/或甲醛(HCHO)污染的介质中的MTBE、TBA和/或HCHO的方法。

在具体实施例中，用于降解MTBE(更具体是MTBE、TBA和/或HCHO)的方法包括用本文所述的分离的微生物和/或聚生体处理受污染的介质的步骤。

如本文所设想的，处理可以非原位发生或原位发生。在具体实施例中，介质是地下水。

设想了将污染介质与本文所述的分离的细菌和/或聚生体接触的不同实践方式。例如，地下水中MTBE的生物降解可以通过在接种了一种或多种微生物和/或聚生体的生物反应器中泵送和处理地下水来进行，或者通过将一种或多种微生物和/或聚生体添加至地表下的受污染的介质中来进行。

通常，本领域的技术人员已知的各种生物反应器可以用于本发明的方法中。可以使用悬浮生长反应器，如膜反应器、标准连续搅拌釜反应器和活性淤泥系统(activatedsludge systems)。可替代地，如果需要，也可以使用固定膜反应器，如流化床反应器或固定支座反应器。可替代地，或互补的，细菌可限制在生物屏障、生物过滤器和/或生物堆中。本领域的技术人员通常使用此类生物屏障、生物过滤器和生物堆来防止污染扩散，例如当布置于污染源和所述污染下游的地下水之间时。

迄今为止，只有极少数研究描述了处理受MTBE污染的地下水的生物反应器的发展。

将本发明的分离的微生物和/或细菌聚生体用于本发明的方法，以降解受甲基叔丁基醚(MTBE)、叔丁基醇(TBA)和/或甲醛(HCHO)污染的介质中的MTBE、TBA和/或HCHO。术语“降解”意味着与初始浓度相比，MTBE、TBA和/或HCHO污染的最终浓度降低。在具体实施例中，在降解后，最终浓度达到或低于官方机构设定的监管限值。更优选地，一种或多种污染物的最终浓度不再可检测到。地下水中MTBE和TBA的浓度可能相对较高(例如，据报道MTBE高达830mg/L或更高，并且TBA高达78mg以上)。然而，通常地下水浓度为约0.5-50mg/L。包括比利时在内的若干个国家已对地下水中的MTBE采用了监管限值。已经将地下水的干预水平确定为300μg/L MTBE(比利时)、200μg/L MTBE(德国和瑞士)、以及9.4mg/L MTBE(荷兰)。然而，清污水平(clean-up level)优选地更低。因此，根据具体实施例，本文所述的方法涉及MTBE的降解，以便降低至小于300μg/L或更低，更具体是降低至200μg/L或更低，最具体是降低至低于100μg/L。在具体实施例中，本文所述的方法确保达到100μg/L MTBE的清污水平。

TBA是MTBE降解的稳定中间体，通常与MTBE污染相关，即浓度范围从4.10-4至78mg/L变化。在比利时，建议地下水中的水平低于660μg/L。BTEX化合物(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)是受MTBE污染的地下水中熟知的共污染物。BTEX在汽油中以约18％v/v存在，并且据报道在欧洲地下水中以0.2-147mg/L的浓度存在。因此，在具体实施例中，本发明的方法确保TBA的降解以降低至小于700μg/L。

发明人发现本发明的微生物和/或聚生体可以应用于在广泛的边界条件(包括针对原位生物强化的典型边界条件(低温和低溶解氧浓度)以及针对非原位生物修复的生物反应器中存在的条件(室温、中性pH、高溶解氧浓度和低营养素浓度))下生物降解MTBE和TBA。发明人发现，当使用中试规模生物反应器泵送和处理受MTBE污染的具有MTBE(5mg/LMTBE)的地下水时，1.6小时的最小水力停留时间足以将MTBE去除至低于地下水中100μg/LMTBE的再入渗(reinfiltration)限值。已经证明，还可以有效地去除较低的MTBE浓度(<1mg/L)，直至低于100μg/L MTBE的排放限值，其中水力停留时间可以减少至1小时。此外，已经证明可以有效地去除TBA(6mg/L)直至低于检测限。

在本发明的方法中，使用的分离的微生物和/或聚生体的细胞密度可以变化。在具体实施例中，添加的聚生体的细胞计数在10²至10⁸CFU/ml之间，更优选地在10⁵至10⁷CFU/ml之间。在含水层基质中，使用的分离的微生物和/或聚生体优选地为10⁶CFU/g含水层，但更小的接种物也可引发降解。在生物反应器应用中，设想使用的分离的微生物和/或聚生体优选地为在10³至10⁸CFU/g载体材料之间。

在具体实施例中，用于降解MTBE、TBA和/或HCHO的本发明的方法通过将受污染的介质与如本文所述的聚生体接触来进行。更具体地，聚生体包含甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和分枝杆菌LD6。这些菌株在聚生体中的相对浓度可以变化。在具体实施例中，用于处理受污染的介质的聚生体中的甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的绝对浓度分别为在10⁴-10⁸拷贝/ml之间、10⁶-10⁹拷贝/ml之间和10²-10⁶拷贝/ml之间。在本发明的聚生体的具体实施例中，甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和分枝杆菌LD6以(％/％/％)1-60/40-99/0.005-10，更具体是1-55/45-99/0.005-2的相对丰度存在，如以4.5/95.5/0.03、51.3/48.7/0.005、47.6/52.4/0.008、2.1/97.9/0.006、7.3/92.6/0.02、36.3/63.6/0.07、1.3/98.4/0.3和13.9/86/0.02的相对丰度存在，或在具体实施例中，分别为以18％-25％、72％-78％和1％-2％的相对丰度存在。根据具体实施例，用于降解MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的方法还包括确定MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的降解。因此，在本发明的方法的具体实施例中，可以引入另外的步骤，其中确定了介质中MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的浓度和/或介质中MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的降解速率。用于确定MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO浓度和/或计算MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的降解速率的方法在本文上文和本申请的实例中描述。

本文提供的方法涉及受污染的介质中MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的降解。如本文所使用的，术语“介质”意指包括但不限于：土壤、含水层、淤泥、沉积物、疏浚尾料、化学废物和其他流体如水。“土壤”是天然的物体，由可变厚度的主要是矿物成分的层构成，其质地、结构、结持性、颜色、化学性质、生物性质和其他物理性质与母质不同。土壤形成了充满孔隙空间的结构，并且可以被认为是固体、水和空气(气体)的混合物。“含水层”是指来自饱和区的土壤物质，其中地下水在水力梯度的影响下流动。“淤泥”是指工业废水或污水处理过程中残留的半固体物质。它还可以指从常规饮用水处理和许多其他工业过程获得的沉降悬浮液。“疏浚尾料”是在疏浚活动(从而挖出材料(砂、砾石、泥土等))期间冲走或清理的材料。“化学废物”是由有害化学物质(主要由大型工厂生产)制造的废物。在本文上下文中，废物可以指燃料废物、受醚衍生物(具体是MTBE、TBA和/或HCHO)污染的废物。“流体”是在施加剪切应力下连续变形(流动)的物质。流体是物质相的一个子集，并且包括液体、气体、等离子体，以及在某种程度上包括塑料固体。根据本申请，液体可以是水，具体是地下水或饮用水。

在具体实施例中，本发明的方法涉及一种或多种本文所述的分离的细菌菌株的用途。在用于降解本发明的受MTBE、TBA和/或HCHO污染的介质中的MTBE、TBA和/或HCHO的方法的这些实施例中，可以同时地、部分顺序地或顺序地向受污染的介质中添加本发明的菌株。在本文上下文中，分离的菌株可以在相同的物理空间(例如生物反应器)中与介质接触，或者可以在顺序放置的生物反应器中与介质接触。

在具体实施例中，将本发明的方法与除MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO之外的其他污染物的去除进行组合。在一些实施例中，这可以提高通过本文所述的方法所确保的去除MTBE、TBA、HIBA和/或CHCO的去除效率。因此，在具体实施例中，将本发明的方法与从受污染的介质中去除铁进行组合。在具体实施例中，本发明的方法与从地下水中去除铁组合使用。为了去除铁，可以使用除铁装置(优选地包括氧化装置和砂滤器)在预处理或后处理步骤中处理介质。

本文设想的另一方面涉及用于鉴定本文所述的细菌菌株和聚生体的方法。这些可以单独使用或与本文所述的用于降解MTBE、TBA、HIBA和/或HCHO的方法组合使用。实际上，在具体实施例中，检查细菌培养物中是否存在本发明的细菌菌株和/或聚生体可能是有意义的。

通常，可以使用不同分析方法或技术来鉴定(复合物)混合物或组合物中存在的细菌。例如，用于所述鉴定的方法可以基于所述细菌的代谢能力(即抗生素抗性、化合物发酵……)，基于它们的表达谱(即特定膜或细胞内蛋白质的表达……)和/或基于特定细胞组分的存在(即特定多核苷酸序列或特定内部蛋白的存在……)。

所有这些方法可以单独使用或在需要时组合使用。在本例中，独立于所应用的方法，可以使用参考菌株。在具体实施例中，用于鉴定甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6或本文所述的包含一种或多种这些菌株的聚生体的方法可以涉及：使用保藏为LMG P-27480、LMG P-27479、LMG P-27498和/或LMG P-27478或LMG P-27909的一种或多种菌株作为一种或多种参考菌株或聚生体。例如，可以使用含有MTBE、TBA和/或HCHO作为唯一碳源的选择介质来鉴定如本文所述的细菌。另外地或可替代地，可以使用特异性抗体使特定膜蛋白的存在可视化。此外，可以使用例如PAGE通过蛋白质指纹技术来鉴定细菌。另一种替代方法可以是使用杂交、扩增和/或测序技术的多核苷酸分析。独立于所应用的方法，技术人员能够使检测装置适应所分析的样品的种类和数量。

根据本发明，还可以使用16S rRNA基因PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)来鉴定本文使用的细菌菌株。另外地或可替代地，可以应用荧光原位杂交(FISH)，其可能与PCR-DGGE组合。此外，FISH可以快速检测和确定混合细菌培养物中特定细菌细胞的相对丰度，并用于研究降解MTBE的物种之间的相互作用。在具体实施例中，用于鉴定菌株甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的方法涉及鉴定菌株特异性16S rRNA序列。

因此，本发明进一步涉及用于检测样品中甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6微生物的存在的方法，所述方法包括鉴定所述样品中分别对应于SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的序列的存在。如本文所使用的，术语“样品”是指样本或所研究的少量材料，即少量可能受MTBE、TBA和/或HCHO污染的介质。如上所指示的，为了鉴定对应于SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的序列，可以使用16S rRNA特异性引物扩增样品中存在的细菌的16S rRNA序列，并进行PCR-DGGE分析。以这种方式，获得的16S rRNA基因DGGE指纹或特征可以指示16S rRNA基因谱中的显性条带，其可以用于鉴定样品中存在的细菌。由此可以鉴定一种分离菌(isolate)或若干种分离菌。可替代地、或与上述步骤组合，可以克隆和/或测序细菌的16S rRNA序列以确定其多核苷酸组成。获得的多核苷酸序列可以用于比对研究以鉴定细菌并可能地分析它们的系统发育关系。对于序列比较，典型地，一个序列用作参考序列，测试序列与该参考序列进行比较。序列比对的方法是本领域熟知的。优选地，对于核酸序列比较，使用BLAST算法。使用BLAST算法可以确定序列同一性和序列相似性，并且可以使用的算法的实例描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。可以使用ARB人工检查和校正比对以及系统发育分析(Ludwig等人2004,Nucleic Acids Research 32(4):1363-1371)。由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3表示的16S rRNA序列与公共数据库中存在的16S rRNA序列的多序列比对的分析允许设计下述寡核苷酸引物(和探针)，所述寡核苷酸引物(和探针)能够扩增(或杂交)广泛或有限品种的细菌物种的16S rRNA基因区段。

具体地，根据本申请，用于检测样品中甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6微生物的存在的本发明方法可以包括将所述样品与引物或探针接触的步骤，所述引物或探针能够特异性杂交或扩增对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有特异性的序列，以及确定杂交信号或扩增产物的存在，所述杂交信号或扩增产物指示样品中存在甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6。进行DNA提取、杂交、扩增、测序和序列比较的方法是本领域的技术人员熟知的，并且可以根据具体条件容易地进行调整。使用的探针或引物可以是放射性标记的、荧光的、或甚至与酶偶联。

优选地，探针和/或引物在严格杂交条件下与存在于本发明的菌株中的多核苷酸杂交。具体地，探针或引物在严格条件下与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的序列杂交。“严格杂交条件”可以定义为以下条件：在约65℃，例如在6XSSC、0.5％SDS、5X登哈特溶液(Denhardts solution)和100μg/ml变性非特异性DNA的溶液中，或在等效离子强度的任何其他溶液中，并且在65℃，例如在至多0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中，或在等效离子强度的溶液中进行洗涤步骤后，使得两个单链DNA分子能够特异性杂交的条件。然而，本领域的技术人员可以根据杂交序列的大小、其GC含量和任何其他参数调整严格条件，例如根据Sambrook等人2001(Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],第3版,laboratory press[实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],N.Y.[纽约])所述的方案。探针和/或引物可以是长于10个核苷酸、优选地长于20个核苷酸、并且甚至更优选地长于50个核苷酸的“核苷酸片段”。引物和/或探针的序列是由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的序列或与其完全互补。

本发明进一步涉及分离的多核苷酸序列，所述序列包含由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3表示的序列或由其构成。在提及核苷酸序列的本文上下文中使用的术语“分离的”或“纯化的”是指本质上或基本上不含通常存在于其天然环境中的其他化合物(例如但不限于其他DNA序列)的物质。典型地使用分析技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定多核苷酸的纯度。术语“分离的”或“纯化的”表示核酸序列在电泳凝胶中产生一个条带。具体地，它意指核酸为至少85％纯、更优选地至少95％纯以及最优选地至少99％纯。术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷或核糖核苷及其聚合物。所述术语包括含有已知类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。具体的核酸序列还可以包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指示的序列。在如上所述的具体实施例中，分离的核酸适用于检测本文所述的细菌菌株。

此外，本发明涉及用于检测和鉴定样品中甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6菌株的存在的试剂盒，或含有一种或多种所述菌株的聚生体。在具体实施例中，根据本发明的试剂盒包含能够与对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3具有特异性的序列特异性杂交或扩增的一种或多种引物对或探针。本发明还涉及对聚生体具有特异性的探针和/或引物，用于鉴定介质或样品中本发明的细菌的存在、并且如果需要时用于分离此类微生物的方法和生物传感器。

在又另一方面，本发明提供了有用于降解MTBE、TBA和/或HCHO的分离的细菌菌株。

因此，本发明还涉及分离的降解甲基叔丁基醚(MTBE)的甲基养菌属菌株，所述甲基养菌属菌株对应于保藏为LMG P-27480的菌株甲基养菌LD3。这种菌株的特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:1。

本发明进一步提供了分离的降解TBA的菌株，其对应于保藏为LMG P-27479的菌株噬氢菌LD1，所述菌株的特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:2。

本发明进一步提供了保藏为LMG P-27498的分离的降解HCHO的菌株分枝杆菌LD6，其特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:3。

可以将根据本发明的分离的菌株进一步进行遗传修饰以包括异源多核苷酸序列。将包含异源多核苷酸的细菌称为重组细菌。术语“异源的”是指未在自然界中的细胞或微生物中发现的序列。例如，重组细菌可以包含负责(或提高)MTBE、TBA、HCHO或其他(醚)燃料污染物的降解的异源序列。在具体实施例中，异源DNA序列包含受启动子控制的基因。另外地或可替代地，根据本发明的重组细菌可以包含报道基因、抗性基因和/或易感基因。报道基因和/或抗性基因可以用于检测菌株。例如，当添加到介质中时，异源基因可以帮助鉴定本发明的菌株。合适的报道基因包括本领域已知的任何报道蛋白，例如生物发光蛋白如萤光素酶，或酶如过氧化物酶或β-半乳糖苷酶。揭示此类报道基因的表达的手段是本领域的技术人员已知的。另外地或可替代地，易感基因可以用于防止重组细菌在环境中不受控制的扩散，例如通过添加将选择性杀死携带易感基因的细菌的产品来实现。

现在通过以下非限制性实例进一步说明本发明。

实例

实例1：M-聚生体的MTBE降解特性的稳定性

通过定期进料纯氧和MTBE并偶尔转移到新鲜矿物介质(WXP，pH 7.1)，从土壤样品中富集M-聚生体。标准WXP介质(pH 7.1)含有8.8g/L Na₂HPO₄.2H₂O、3g/L KH₂PO₄、1g/L(NH₄)₂S0₄、0.2g/L MgCl₂.6H₂0、0.1g/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、4mg/L Na-EDTA、1.5mg/L FeCl₂、50μg/L MnCl₂.4H₂O、20μg/L CoCl₂.6H₂O、15μg/L NaMoO₄.2H₂O、10μg/L ZnCl₂、KBr和Kl、5μg/LCuSO₄和H₃BO₃以及2.5μg/L LiCl、SnCl₂.2H₂O和BaCl₂。

通过在含有120ml WXP介质、1.3g酵母提取物(0.1％)和8μg MTBE的无菌250ml小瓶中转移5ml无土培养物来评估M-聚生体培养物的MTBE降解能力的稳定性。将烧瓶用丁基橡胶塞密封并在摇床(rotary table)(100rpm)上孵育。孵育条件为pH 7.1、10mg/L溶解氧和30℃。使用10μL汉密尔顿玻璃注射器(汉密尔顿(Hamilton)，博纳杜茨(Bonaduz)，瑞士)，通过小瓶的丁基橡胶塞，使培养物定期接受8μg MTBE的增量(spike)。还经由注射器通过塞来定期添加纯氧(10-30ml)。通过CC-MS，经由5mL样品的液面上空间分析，来测量MTBE(50mg/L，HPLC级，Sigma-Aldrich，Bornem，比利时)和TBA(分析级，Merck，Darmstadt，德国)浓度，所述样品提供有2g/L NaN₃(以停止反应)，所述CC-MS使用Trace CC Ultra气相色谱仪(热电集团(Thermo Electron Corporation)，剑桥郡(Cambridgeshire)，英国)，其装备有DSQ质谱仪(热电集团)并配备有HP-VOC柱(长度30m，内径0.20mm，以及膜厚1.12μm，安捷伦科技(Agilent technologies)，迪更(Diegem)，比利时)和分流/不分流注射。使用d6-苯、d10-乙基苯和二丁醚作为内标，在0-5000μg/L范围内进行校准。检测限为2μg/L MTBE和65μg/L。使用pH电极(哈纳仪器公司(Hanna Instruments)，艾瑟尔斯泰恩(IJsselstein)，荷兰)测量pH，并使用流通电极(斯特拉什凯尔文仪器公司(Si Strathkelvin instruments)，纳曼(Namen)，比利时)测量溶解氧浓度。

图1显示了在第1天用M-聚生体接种的烧瓶中MTBE浓度的变化，并且指示超过350天，MTBE的每个增量完全降解而没有TBA积累。氧浓度在10mg/l和1mg/l之间波动，而pH从pH7.1略微降低至pH 6.7。

通过定期进料纯氧和MTBE并偶尔转移到新鲜矿物介质(WXP，pH 7.1)，M-聚生体已经保存了十多年。M-聚生体菌种培养物(stock culture)通常在玻璃容器如装有0.5L标准矿物介质(WXP)的1L瓶中生长。将烧瓶用丁基橡胶塞密封并在摇床(100rpm)上水平孵育。孵育条件为pH 7.1、10mg/L溶解氧和20℃。通过小瓶的丁基橡胶塞，培养物定期接受40至50mg/L MTBE和60mL纯氧的增量。

实例2：M-聚生体的降解测试和动力学常数的计算

建立M-聚生体的平行培养物，初始浓度为50mg/L MTBE、TBA、HIBA或HCHO，以记录生长速率和生物质产率，并检测微生物群落结构作为时间的函数的变化。将M-聚生体培养物从菌种溶液(参见实例1)转移至含有WXP(含50mg/L MTBE、TBA、HIBA或HCHO任一)的一式三份批量烧瓶中。MTBE可以转化为TBA和HCHO；HIBA(2-羟基异丁酸)是TBA的降解产物。对于每种碳源，测量MTBE、TBA、HIBA和HCHO以及生物质浓度作为时间的函数的变化，直到底物浓度低于检测限。每种测试条件都包括有毒对照(2g/L NaN₃)。

如实例1中所述测量MTBE、TBA，pH和氧。使用配备有Alltech OA 1000有机酸柱和UV-VIS检测器(Hitachi L-4250，默克公司)的HPLC(1200系列，奥泰科技(AlltechTechnologies)，洛格伦(Lokeren)，比利时)，在214nm下，将17.5mM KH₂PO₄和1N H₂SO₄(pH2.5)用作载体，以0.8mL/min，在2mg/L的检测限下，测量无细胞样品中溶液中的HIBA(98％，阿克罗斯有机物公司(Acros Organics)，赫尔(Geel)，比利时)。基于一式三份测量的0-60mg/L HCHO溶液的标准曲线，在无细胞样品中测量HCHO(37％，具有约10％甲醇，分析级，默克公司)。检测限为0.2mg/L HCHO。使用分光光度计(阿莫仙医药生物技术公司(AmershamPharmacia Biotech)，罗森达尔(Roosendaal)，荷兰)将生物质浓度作为在660nm波长处的光密度(OD₆₆₀)进行测量。基于作为挥发性悬浮固体(volatile suspended solids)的函数的OD₆₆₀(范围为0.001-0.5OD₆₆₀)的多个独立的一式三份测量，通过关联式1OD₆₆₀＝390.14+/-3.79mg DW/L(R²＝0.95)，将光密度转换为生物质的干重(DW)。

通过作为时间的函数测量的生物质浓度(mg DW/L)的自然对数的线性回归计算比生物质生长速率(1/h)，从而假设指数生长和最大比生物质生长速率。使用测量的生物质浓度增加(mg DW/L)与测量的碳源浓度降低(mg/L)的比率来确定生物质产率(mg DW/mg碳源)。使用Excel计算一式三份实验的平均值和95％置信区间。

结果：M-聚生体在以50mg/L MTBE、TBA、HIBA和HCHO作为碳和能量的唯一来源的情况下生长(图2和表1)。在MTBE降解期间测量了TBA的临时积累。在MTBE生长培养物中未测量到HIBA或HCHO的积累(数据未显示)。M-聚生体基于TBA和HIBA生长，其生物质倍增时间少于一天；而基于MTBE和HCHO生长较慢，倍增时间约为1.5天。MTBE和TBA的生物质产率分别为0.5mg DW/mg MTBE和0.6mg DW/mg TBA，而基于HIBA和HCHO的产率较低，即分别为0.28mgDW/mg HIBA和0.12mg DW/mg HCHO(表1)。在50mg/L HCHO的一个增量降解后没有测量到光密度的增加(图2(d))。因此，基于50mg/L HCHO的7个增量生长75天的富集培养物的生长，计算在HCHO情况下的生长速率和生物质产率。

表1：记录在50mg/L MTBE、TBA、HIBA或HCHO中任一情况下培养的M-聚生体的生长速率和生物质产率。

a：在HCHO情况下计算的生物质产率是基于接受50mg/L HCHO的7个增量的培养物(在1×50mg/L的降解期间没有显著生长)。

实例3：降解MTBE/TBA的M-聚生体中关键生物的鉴定

与实例1平行，将M-聚生体的一式两份培养物在含有50mg/L MTBE、TBA、HIBA或HCHO中任一的液体WXP中培养75天。每天监测培养物的生长，并测量每个样品的pH和溶解氧浓度。如果需要，将纯氧提供到顶空(head space)中以恢复溶液中的饱和条件。定期检查培养物中碳源或中间体(即MTBE、TBA、HCHO和HIBA)的积累。当化合物耗尽时，添加新的碳源。75天后，将培养物铺板以分离细菌菌株(参见实例4)，并从细胞中提取DNA用于基于16SrRNA基因的分子分析分析。

从不同M-聚生体培养物中提取DNA并溶解于TE缓冲液(10mM This，1mM EDTA，pH8.0，含有HCl)中。为了扩增细菌16S rRNA基因的部分(El-Fantroussi等人,1999,Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:982-988)，PCR混合物由5μL 10x缓冲液、4μl dNTP溶液、0.25μL Taq聚合酶(宝生物工程株式会社(TaKaRa Bio Inc.)，志贺(Shiga)，日本)、0.25μL引物518R、0.5μL引物GC-63F，1μL的DNA提取物和39μL的PCR水构成。在T3热循环仪(Biometra公司，哥廷根(Goettingen)，德国)中进行PCR。将PCR产物首先通过琼脂糖凝胶电泳(1.5％(w/v)，85V)分析1小时，用0.01％GelRed(v/v)(VWR公司，勒芬(Leuven)，比利时)染色并使用带图像软件(Image Master VDS&Liscap Image Capture 1.0，法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech))的数字摄像系统在UV光下拍照。然后将PCR产物通过DGGE进行分析，所述DGGE使用在1x Tris-乙酸酯-EDTA缓冲液中的8％聚丙烯酰胺凝胶(伯乐公司(BioRad)，拿撒勒(Nazareth)，比利时)，变性梯度为35％至65％(如Muyzer等人(1993,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]59:695-700)所述)，使用IngenyphorU-2DGGE装置(Ingeny公司(Ingeny International)，约斯(Goes)，荷兰))。将凝胶在60℃和120V下运行15h，用0.01％GelRed(v/v)(VWR公司，勒芬(Leuven)，比利时)染色并如上所述拍照。

根据Lane(1991,Nucleic Acids techniques in Bacterial Systematics[细菌系统学中的核酸技术]第115-147页，John Wiley&Sons[约翰威利父子出版公司]，Chichester[奇切斯特])，使用特异性引物扩增和克隆16S rRNA基因。根据制造商(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，美国)的说明书，使用TOPO TA克隆试剂盒将16SrRNA基因片段克隆到pCR2.1-TOPO载体中。使用引物M13F/M13R(英杰公司)分析单个菌落的插入物，然后使用引物GC63F/518R对部分细菌16S rRNA基因指纹进行PCR-DGGE分析。根据制造商(凯杰公司(Qiagen)，芬落(Venlo)，荷兰)的说明书，使用Qiagen Plasmid Midi试剂盒从所选克隆中提取质粒DNA。通过BCCM/LMG细菌保存中心(27-1492序列，根特(Ghent)，比利时)或通过VIB遗传服务机构(VIB Genetic Service Facility)(部分序列，维尔赖克(Wilrijk)，比利时)进行测序。使用BLAST进行从M-聚生体和GenBank核苷酸序列数据库获取的16S rRNA基因序列的比较。使用ARB-silva比对聚生体和最近邻居的几乎全长的16SrRNA基因序列。使用ARB进行人工检查和校正比对以及系统发育分析。

结果：使用分离的16S rRNA基因的克隆和测序来分析存在于M-聚生体中的16SrRNA基因池。在两年的期间内，对基于MTBE生长的培养物进行了四次所述分析，而对基于TBA、HIBA和HCHO生长的培养物，进行了一次所述分析。从基于MTBE、TBA、HIBA或HCHO中任一生长的培养物中回收显示不同DGGE谱的七种不同16S rRNA基因序列(<80％序列相似性)。

总共从基于MTBE生长的培养物中回收了64个克隆。在这些克隆中，52个显示的16SrRNA基因谱具有对应于MTBE生长培养物的DGGE群落谱中记录的显性带F/G/H的单一条带。对这些克隆中的五个进行测序。所有5个序列是相同的并且显示出与属于噬氢菌属(即噬氢菌属物种Rs71)的细菌的16S rRNA基因序列具有最高相似性。将表示这种序列的克隆命名为克隆MTBE1。

由克隆MTBE2表示的16S rRNA序列显示出与未发表的未培养细菌(GenBank登录号EF664640，未发表)的16S rRNA基因序列具有最高相似性。从克隆MTBE3中回收的16S rRNA序列具有与热单胞菌属物种ROi19相似的16S rRNA基因序列。克隆MTBE2和MTRE3明显表示MTBE生长培养物的群落DGGE谱中的非显性条带。

从基于TBA生长的培养物中回收18个克隆。所有这些克隆显示与克隆MTBE1(其来自MTBE生长培养物)相同的DGGE谱，并且2个测序的克隆具有相同的16S rRNA基因序列。将表示这些序列的克隆命名为克隆TBA1。

两个克隆(HIBA1和HIBA2)的细菌16S rRNA基因序列彼此几乎相同(99％)，并且显示出与属于罗尔斯通菌属(罗尔斯通菌属物种K401)的细菌的16S rRNA基因序列具有最高相似性。

从基于HCHO生长的培养物中回收了4个序列，由克隆HCHO1、HCHO2、HCHO3和HCHO4表示。克隆HCHO3和HCHO4分别与从HIBA生长培养物中回收的克隆HIBA1和克隆HIBA2相同。基于部分16S rRNA基因序列，克隆HCHO1和克隆HCHO2都与未发表的α-变形菌相关(表2)。

实例4：从M-聚生体中分离纯细菌菌株

两种方法用于从聚生体中分离纯细菌菌株。一方面，如实例3中所述，将基于50mg/L MTBE、TBA、HIBA或HCHO中任一富集75天的M-聚生体的连续稀释在R2A介质(15g/L琼脂)上铺板。R2A介质(pH 7.0)含有0.5g/L蛋白酶蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、D+葡萄糖和淀粉，0.3g/L丙酮酸钠和K₂HPO₄以及0.1g/L MgSO₄.7H₂O。将琼脂板在20℃孵育至少21天，然后挑取并分析菌落。另一方面，通过将M-聚生体铺板在含有MTBE、TBA、HCHO或HIBA作为唯一碳源的WXP矿物介质琼脂板上，使用饱和MTBE或TBA气氛或以琼脂中50mg/L TBA、HCHO或HIBA的浓度，将板在29℃孵育至少48天，获得分离菌。挑取单个菌落并通过转移到R2A介质上而纯化。如实例3中所述，用PCR-DGGE确定16S rRNA基因指纹。将分离菌在4℃储存在10^-2MMgSO₄中，并在-20℃储存在甘油(15％v/v)和0.85％(w/v)NaCl中。使用前，检查它们在R2A板上的纯度和正确的PCR-DGGE谱。使用靶向纯培养物DNA中存在的基因组重复元件的引物进行PCR，以获得细菌基因组的指纹。根据Versalovic等人(1991,Nucl.Acids Res.[核酸研究]19:6823-6831)和Versalovic等人(1994,Meth.Mol.Cell.Biol.[分子与细胞生物学方法]5:25-40)，使用的引物是BOX A1R、REP2和REP1R或ERIC2和ERIC-1R。将PCR产物用1％(w/v)琼脂糖凝胶在180V下分析4小时，并如前所述拍照。

在R2A板上铺板基于MTBE生长的M-聚生体，产生4种分离菌(LD1、LD4、LD5和LD7)。分离菌LD1和分离菌LD4在R2A琼脂板上分别形成亮黄色和深黄色菌落。分离菌LD5形成亮白色菌落，具有特征性的红色边缘和中心。分离菌LD7在R2A介质上形成亮白色菌落。将分离物LD2和LD3从MTBE生长的培养物(使用在MTBE和TBA氛围下孵育48天的WXP板)中分离，但也从不含碳源的WXP板中挑取。这些菌株在含有和不含MTBE的WXP琼脂板上和R2A板上生长缓慢，并在所有板上形成白色(LD2)和淡黄色(LD3)菌落。在含有50mg/L HCHO的WXP板上分离出分离菌LD6。这种细菌不存在于含有MTBE、TBA或HIBA的WXP板上。分离菌LD6在R2A上形成白色菌落，具有不规则边缘。除了基于MTBE生长的培养物中分离的那些之外，不能从使用R2A板和WXP琼脂板基于TBA、HIBA或HCHO生长的培养物中分离出另外的细菌菌株。分离菌LD4仅在基于MTBE生长的培养物中发现，并且基于HCHO生长的培养物仅含有分离菌LD2和LD6。

在研究期间，基于时间函数的铺板的M-聚生体的细菌物种组成发生变化。最初，从MTBE培养物生长的板上主要是分离菌LD4和LD5，并且在较小程度上，发现了分离菌LD7和LD1。在研究结束时(两年后)，分离菌LD3和LD1选择性地富集在M-聚生体中，并且在R2A板上发现最高数量。

从液体R2A中过夜生长的分离菌培养物的沉淀中提取DNA，并如实例3中所述进行处理。从分离菌扩增的16S rRNA基因的测序显示，分离菌LD1和LD5分别是在群落16S rRNA基因池中由克隆MTBE1和MTBE3(先前从基于MTBE和TBA生长的培养物中获得)表示的分离菌。通过相同的16S rRNA基因DGGE谱确认相应克隆和分离物的相同16S rRNA基因(数据未显示)。基于几乎全长的16S rRNA基因序列，分离菌LD1和LD5分别被鉴定为噬氢菌属物种和热单胞菌属物种。分离菌LD7的16S rRNA基因未测序，但分离菌LD7可通过细菌16S rRNA基因PCR-DGGE谱分析与克隆HIBA1和HIBA2相关(数据未显示)。罗尔斯通菌属物种基因组含有4个rRNA基因拷贝的信息支持分离菌LD7是罗尔斯通菌属菌株的假设。未确定分离菌LD4的16S rRNA基因序列。将甲基养菌属物种LD3的BOX、ERIC和REP基因组指纹谱与降解MTBE和TBA的PM1产生的那些进行比较(数据未显示)。结果指示菌株具有不同基因组谱，并且因此分离物甲基养菌属物种LD3和M.petroleiphilum PM1是甲基养菌属的不同细菌菌株。

甲基养菌属物种LD3、噬氢菌属物种LD1和分枝杆菌属物种LD6的16S rRNA基因的序列分别如图3-5所示。

保藏：根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)，甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6菌株被Dirk Fransaer(代表VITO)在2013年2月28日和3月29日(针对LD6)，作为保藏物保藏于比利时根特市K.L.Ledeganckstraat 35,9000的根特大学(Ghent University)分子生物系(Department of Molecular Biology)的比利时微生物协调保存中心(BelgianCoordinated Collections of Micro-organisms(BCCM/LMG))，并且分别赋予保藏号LMGP-27480、LMG P-27479和LMG P-27498。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)，M-聚生体被Dirk Fransaer(代表VITO)在2013年10月3日，作为保藏物保藏于比利时根特市K.L.Ledeganckstraat 35,9000的根特大学(Ghent University)分子生物系(Departmentof Molecular Biology)的比利时微生物协调保存中心(Belgian Co-ordinatedCollections of Micro-organisms(BCCM/LMG))，并且赋予保藏号LMG P-27909。

实例5：从M-聚生体分离的纯培养物的降解能力

通过矿物介质中50mg/L MTBE、TBA、HIBA和20或50mg/L HCHO的降解来评估除罗尔斯通菌属物种LD7之外所有获得的分离菌的生长。分离菌在液体R2A上生长，用10^-2MgSO₄洗涤两次，并测试1L瓶中50mg/L MTBE、50mg/L TBA、50mg/L HIBA、以及20或50mg/L HCHO的降解，如上针对聚生体所述的(实例2)。

分离的甲基养菌属物种LD3降解并基于50mg/L MTBE(图6a)、TBA(图6b)和HIBA以及以20mg/L HCHO生长，但不基于50mg/L HCHO生长。噬氢菌属物种LD1降解并基于50mg/LTBA(图6c)和HIBA以及基于20mg/L HCHO生长，但不基于50mg/L MTBE或HCHO生长。分枝杆菌属物种LD6降解并基于20至80mg/L HCHO生长(图6d)，但不基于MTBE、TBA或HIBA生长。然而，甲基养菌属物种LD3在MTBE降解期间在约0.12的光密度处停止生长。在整个实验期间，这种培养物中的TBA浓度保持低于0.06mg/L的检测限，而在实验结束时HCHO浓度略微增加至高达0.42mg/L。其他分离物不基于任何这些测试化合物生长或不降解任何这些测试化合物。通过与50mg/L MTBE(混合有0.01％(w/v)酵母提取物(YE))或50mg/L MTBE(混合有50mg/LTBA(针对噬氢菌属物种LD1)或50mg/L HCHO(针对分枝杆菌属物种LD6))一起孵育，另外测试噬氢菌属物种LD1和分枝杆菌属物种LD6的MTBE的共代谢降解。培养物不降解MTBE，而酵母提取物和各自的碳源TBA和HCHO被快速去除。

实例6：M-聚生体内关键分离菌的相对丰度

基于图3至5中显示的16S rRNA基因序列，开发了特异性qPCR引物并用于确定M-聚生体培养物中甲基养菌属物种LD3、噬氢菌属物种LD1和分枝杆菌属物种LD6的丰度；图7显示了8种不同M-聚生体菌种培养物的结果(参见实例1)。在检测的M-聚生体培养物中，甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和分枝杆菌LD6的绝对浓度分别为在10⁴-10⁸拷贝/ml、10⁶-10⁹拷贝/ml和10²-10⁶拷贝/ml之间。

实例7：M-聚生体作为接种物用于从受污染的土壤和地下水中去除污染物。

在需氧条件下在封闭的120ml血清小瓶中进行批处理降解实验，所述血清小瓶具有来自受MTBE污染的场地的含水层材料(75g)和Mo等人描述的矿物介质(145ml)(1997,Apppl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]47:69-72))。通过隔膜添加150μL的纯MTBE，最终浓度为15mg/L。将培养物在20℃孵育。及时跟踪非生物对照和测试小瓶中MTBE浓度的变化，以及pH和溶解氧浓度(参见实例1)。然而，在超过2年的实验时间内没有获得MTBE的降解(图8)。孵育约500天后，将M-聚生体的2.6 10⁸个活细胞添加到一些测试小瓶中。添加接种物后，MTBE浓度在几周内从15mg/L降低至低于10μg/l(图8)，并且在未接种的条件下没有观察到MTBE浓度的降低。接种的批处理测试在超过1年的期间继续降解再添加的MTBE，而不需要添加另外的M-聚生体。这种结果指示没有抑制因子阻止此处的MTBE降解，而是缺乏合适的微生物。在不同土壤类型(砂、壤砂土、……)的类似测试中，M-聚生体也成功地用作接种物来刺激MTBE降解。

为了评估作为连续系统中的接种物的M-聚生体，将Plexiglas柱(直径4cm，长度50cm)中充满不同载体材料(珍珠岩、含水层材料、滤砂和聚合物珠)并接种M-聚生体(±610 ¹⁰cfu/柱)。将未接种的柱平行设置作为对照。仅受MTBE(10-40mg/L)污染的或受与BTEX-化合物(5mg/L苯)组合污染的人造地下水(稀释的最小矿物介质)从底部向上泵送通过柱。根据填充材料，柱中的水力停留时间(HRT)为1至2天。沿着柱，从入口(柱底部)的不同距离处存在取样点，这允许确定污染物浓度谱以及沿着柱的pH和溶解氧浓度(DO)的变化。使用注射泵通过稀释的过氧化氢溶液(最终浓度<0.01％)将额外的氧添加到需氧柱(流入物，并且离入口15cm)系统中。苯的大部分在接种的和未接种的柱中快速降解。另一方面，当存在M-聚生体时，MTBE仅从水中去除(图9-滤砂)。通常，在苯的存在下，观察到MTBE降解的延迟，如图2.C所示。在此延迟期间，BTEX-化合物降解，消耗可用的氧。一旦BTEX-化合物降解并且剩余或添加足够的氧，则MTBE降解开始。没有观察到TBA的显著积累。

11个月的操作后，所有13个柱都被拆卸。通过测量蛋白质浓度来量化柱的不同级分中的生物质。将细胞蛋白质在0.5M NaOH中于100℃溶解10分钟，并通过Lowry等人(1951,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志](193),265-275)的方法用分光光度法测定。用在0.5M NaOH中的牛血浆γ-球蛋白制备标准品。从不同级分中提取总DNA(Hendrickx等人,2006,FEMS Microbiology Ecology[FEMS微生物生态学]55:262-273)并通过使用通用的真细菌引物扩增的16S rRNA-基因片段(63-518)的变性梯度凝胶电泳(DGGE)来评估微生物群落的多样性。在柱入口附近和氧添加点(150mm)附近发现了最高量的生物质(图3)。尽管接种的柱中的蛋白质浓度显著高于对照柱中的蛋白质浓度，但是在后者中也检测到增加的量。这可以通过几个月的半无菌操作后柱中的微生物污染来解释。基于PCR-DGGE DNA指纹谱，接种的降解MTBE/TBA的聚生体可以在大多数载体材料中清楚地可见。在未接种的对照中，未检测到聚生体。

实例8：使用接种M-聚生体的固定床反应器对受MTBE污染的地下水进行生物修复

图10中提供了反应器设置的示意图。这展示了示例性设置，但是应该理解，技术人员可以开发其他设置。反应器由PVC连接器和PVC管构成，高度为63cm，总体积为7L，包括再循环回路。将约1.5kg膨胀黏土颗粒(ECP，4至5mm，Argex公司，兹韦恩德雷赫特(Zwijndrecht)，比利时)用作载体材料，用于固定M-聚生体。反应器的孔体积为3.8L。反应器作为上流式固定床反应器操作，并使用蠕动泵(沃森玛洛公司(Watson Marlow)，康沃尔(Cornwall)，英格兰)从含有流入物的1000L方容器进料(图10)。使用的流入物由来自受污染的加油站场地的地下水构成，并在除铁装置的流出物中取样。使用前，将pH调节至pH 7.5并添加MTBE使最终浓度达到5mg/L。使用蠕动泵，将地下水从载体材料上方以流入物流速的10x至20x再循环至反应器底部。使用纯氧将氧添加到再循环回路中的地下水中。就在流入物取样点和反应器入口之前，使用注射泵以200-400μL/h将营养液(K₂HPO₄.3H₂O和KNO₃，pH7)添加到流入物中，以实现基于重量的流入物(2.5mg/L K₂HPO₄.3H₂O和KNO₃)中C/N/P比率为100/10/10。反应器配备有四个取样点，即在两个不同高度处对反应器内流入物、流出物和水进行取样(图10)。有规律地使用具有鲁尔锁尖(Luer lock tip)的10mL玻璃注射器在不同的取样点对反应器取样。分析所有样品的MTBE、TBA和BTEX浓度以及温度、pH和溶解氧浓度(参见上文)。

将反应器操作130天。图11总结了与实施的HRT具有函数关系的流入物、反应器和流出物中的MTBE浓度。由于生物活性，反应器的流入物的pH在6.9和8.0之间，并且在流出物中pH降低至6.8至7.4之间(数据未显示)。由于除铁系统中的氧化方法不同，流入物中含有的DO浓度在7和23mg/L之间。流出物中的DO浓度在2至19mg/L之间(图11(b))。反应器中地下水的温度在17℃至22℃之间(数据未显示)。将MTBE去除速率计算为去除的MTBE量(mg/L)除以水力停留时间(h)，并在图11(a)中提供。在第1天，将1.4x 10⁶cfu的M-聚生体/g ECP添加到反应器中。首先，在批处理条件下将反应器操作14天，以使添加的细胞附着到载体材料上。在反应器接种后立即测量反应器中的MTBE去除。在第7天，当反应器中的MTBE浓度低于2μg/L的检测限时，向反应器中添加5mg/L MTBE和营养素。在第14天实施HRT为6.4h的连续操作模式后，在第17天记录MTBE的去除，其中MTBE的流出物浓度为约2mg/L，对应于由于营养素限制的77％的MTBE去除百分比。流出物中的TBA浓度低于65μg/L的检测限(数据未显示)。在25天期间内没有观察到去除效率的变化。在第42天，装入连续剂量的营养素，其后MTBE去除百分比从第49天开始从77％增加至>99％(图11(a))。因此，在HRT为6.4h时获得0.01-0.03mg/L的MTBE流出物浓度，其中流出物中的TBA浓度从低于0.065mg/L的检测限至0.08mg/L(数据未显示)。允许所有HRT的稳态条件至少持续3天，即在实施的HRT为6h时最小12个孔体积。从第53天开始，通过增加流入物和营养素流速，实施的HRT在59天的时间段内从6.4h逐渐降低至0.7h。在此期间，在HRT为6.4至1.6h时，MTBE流入物浓度(在2mg/L和5mg/L之间变化)被去除至流出物中低于0.1mg/L MTBE的排放限值的浓度。在这些适应阶段期间，最大MTBE和TBA流出物浓度分别为0.4mg/L和0.1mg/L。在实施的HRT为1.6h时，到恢复MTBE的完全去除(流出物浓度为0.043mg/L MTBE)仅需要3天的响应时间。在这些条件下，MTBE流出物浓度低至1μg/L，并且记录到MTBE去除百分比高于99.98％。在HRT为0.6h时，流出物MTBE浓度增加至在2.3mg/L至3.8mg/L之间。然而，在此期间TBA流出物浓度仍低于检测限，其中一个峰值为0.14mg/L TBA。因此，意味着总MTBE去除至低于MTBE排放限值的最小HRT为1.6h。意味着完全MTBE去除的最高记录MTBE去除速率为2.5mg MTBE/L h，是在实施的HRT为1.6h时在第104天测量的(图11b)。在MTBE浓度突然增加后，生物反应器迅速恢复，并且MTBE的去除被证明是纯生物的。

实例9：在接种M-聚生体的中试生物反应器系统中处理受MTBE/TBA污染的地下水

使用300L原型生物反应器(图10中所示系统的升级)评估接种M-聚生体的中试规模生物反应器的性能。它涉及上流式生物反应器，其中含有MTBE/TBA的水通过接种有M-聚生体的载体材料床从底部到顶部泵送。生物反应器作为主要含聚苯乙烯颗粒(PSG，莎斯特公司(Sarstedt)，布雷希特(Nümbrecht)，德国)的部分浮床系统进行操作。水再循环回路将部分水从反应器的顶部返回到底部以(1)改善生物反应器的均匀性和(2)向生物反应器供应氧。处理的水的出口位于反应器的顶部。除了添加氧外，还集成了连续营养素(氮和磷)剂量系统和pH校正系统，为细菌活动创造了更佳的条件。生物反应器集成在由以下构成的移动处理系统中：(1)除铁装置，(2)连接到流入物和流出物池的生物反应器，和(3)抛光活性炭过滤器。

使用MTBE作为唯一碳源，在实验室中在介质WXP(参见实例1)上培养M-聚生体。将生物反应器系统离场加载4L的M-聚生体(>8.2 108个细胞/ml，假设一个16S RNA-基因拷贝/细胞)。在1个月的再循环模式操作期间证实了系统的反应性，并随后连续操作1个月(水力停留时间＝10h)，其中地下水被8mg/L MTBE和4mg/L TBA人工污染。观察到有效去除(>97％)(结果未显示)。

接下来，将中试规模接种的生物反应器(300L)运输到实际污染场地，以评估其在5个月测试期间在实际场地条件下的性能。测试场地是工业场地(化学品储存)，其中用作中试系统的流入物的泵送的地下水含有MTBE 300-5000μg/L MTBE以及3500-10000μg/L TBA。图12显示了在中试系统的流入物和生物反应器的流出物中(在GAC步骤之前)TBA浓度随时间变化的评估。发现MTBE和TBA均被中试系统有效去除(低于100μg/L)，所述中试系统在低流量(50L/h，HRT＝6h)下操作(表2)。MTBE浓度从高达4.500μg/L的浓度降低至低于110μg/L的浓度(>97％去除率)。高达10.000μg/L的TBA浓度降低至低于180μg/L(>98％去除)。包括在系统中作为抛光步骤的活性炭过滤器将流出物浓度进一步降低至低于100μg/L，通常低于检测限。地下水中高浓度的溶解铁是仅在短时间内实施高流量(100l/h，HRT＝3h)的原因。尽管在系统中应用了许多非理想但实际的情况(pH波动、温度升高超过30℃、非操作期间、流量波动……)，但是系统快速适应并且不需要重新接种就保持活性。

表2：用M-聚生体进行中试生物反应器测试的操作数据

基于图3至5中显示的16S rRNA基因序列，开发了特异性qPCR引物和FISH引物，并用于确定中试处理系统中甲基养菌属物种LD3、噬氢菌属物种LD1和分枝杆菌属物种LD6的丰度。基于FISH，来自M-聚生体的这三种分离菌占生物反应器的流出物中总细菌的25％。在来自生物反应器的淤泥中和在载体材料上，这分别平均为20％(5个数据点)和26％(3个数据点)。在除铁装置中，高达31％的总细菌可以与M-聚生体中的关键生物相关联。基于q-PCR分析，甲基养菌属物种LD3、噬氢菌属物种LD1和分枝杆菌属物种LD6的总和被定量为在生物反应器的流出物(6个数据点)中平均1.4 10⁴个细胞/ml，来自生物反应器的淤泥(4个数据点)中平均9 10⁶个细胞/g，载体材料(2个数据点)上平均3.5 10⁷个细胞/g。在生物反应器中，在整个测试期间甲基养菌属菌株仍然是主要的，但是也发现了噬氢菌属物种和分枝杆菌属物种存在于不同取样时间内(表3)。

表3：在用M-聚生体接种的中试生物反应器系统中的甲基养菌属物种LD3、噬氢菌属物种LD1和分枝杆菌属物种LD6的如通过q-PCR确定的绝对丰度。

序列表

<110> 佛兰芒技术研究所有限公司（VITO NV）

<120> 用于降解MTBE、TBA和/或HCHO的细菌菌株和包含所述细菌菌株的细菌聚生体

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1661

<212> DNA

<213> 甲基养菌属物种(Methylibium sp.)

<400> 1

tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attgggccct ctagatgcat gctcgagcgg 60

ccgccagtgt gatggatatc tgcagaattc gcccttagag tttgatcctg gctcagattg 120

aacgctggcg gcatgcctta cacatgcaag tcgaacggca gcacgggagc aatcctggtg 180

gcgagtggcg aacgggtgag taatacatcg gaacgtgccc agttgtgggg gatagcccgg 240

cgaaagccgg attaataccg catacgacct acgggtgaaa gcgggggatc gcaagacctc 300

gcgctattgg agcggccgat gtcggattag ctagttggtg gggtaaaagc ctaccaaggc 360

tacgatccgt agctggtctg agaggacgac cagccacact gggactgaga cacggcccag 420

actcctacgg gaggcagcag tggggaattt tggacaatgg gcgcaagcct gatccagcca 480

tgccgcgtgc gggaagaagg ccttcgggtt gtaaaccgct tttgtcaggg aagaaacggt 540

ttgggctaat accccgaact aatgacggta cctgaagaat aagcaccggc taactacgtg 600

ccagcagccg cggtaatacg tagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg 660

tgcgcaggcg gctttgcaag acagatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt 720

tgtgactgca aggctggagt gcggcagagg gggatggaat tccgcgtgta gcagtgaaat 780

gcgtagatat gcggaggaac accgatggcg aaggcaatcc cctgggcctg cactgacgct 840

catgcacgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccctaaac 900

gatgtcaact ggttgttgga cggcttgctg ttcagtaacg aagctaacgc gtgaagttga 960

ccgcctgggg agtacggccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa 1020

gcggtggatg atgtggttta attcgatgca acgcgaaaaa ccttacctac ccttgacatg 1080

tctagaagtt accagagatg gtttcgtgct cgaaagagaa ctagaacaca ggtgctgcat 1140

ggccgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1200

gtcattagtt gctacgtaag ggcactctaa tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1260

tggggatgac gtcaggtcat catggccctt atgggtaggg ctacacacgt catacaatgg 1320

ccggtacaga gggctgccaa cccgcgaggg ggagccaatc ccagaaaacc ggtcgtagtc 1380

cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc 1440

ttgccgcggt gaatacgttc ctgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagcgg 1500

gttctgccag aagtagttag cctaaccgca aggagggcga ttaccacggc agggttcgtg 1560

actggggtga agtcgtaaca aggtaaccaa gggcgaattc cagcacactg gcggccgtta 1620

ctagtggatc cgagctcggt accaagcttg gcgtaatcat g 1661

<210> 2

<211> 1665

<212> DNA

<213> 噬氢菌属物种(Hydrogenophaga sp.)

<400> 2

catgattacg ccaagcttgg taccgagctc ggatccacta gtaacggccg ccagtgtgct 60

ggaattcgcc cttagagttt gatcctggct cagattgaac gctggcggca tgctttacac 120

atgcaagtcg aacggtaaca ggccgcaagg tgctgacgag tggcgaacgg gtgagtaatg 180

catcggaacg tgcccagtcg tgggggataa cgcagcgaaa gctgtgctaa taccgcatac 240

gatctatgga tgaaagcggg ggaccgtaag gcctcgcgcg attggagcgg ccgatgtcag 300

attagctagt tggtggggta aaggcccacc aaggcgacga tctgtagctg gtctgagagg 360

acgaccagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 420

aattttggac aatgggcgca agcctgatcc agcaatgccg cgtgcaggaa gaaggccttc 480

gggttgtaaa ctgcttttgt acggaacgaa acggtctggg ttaatacctc gggctaatga 540

cggtaccgta agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg 600

tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgtgcgc aggcggtgat gtaagacagt 660

cgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaatt gcgattgtga ctgcatcgct ggagtgcggc 720

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tggcgaaggc aatcccctgg gcctgcactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa 840

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atgcaacgcg aaaaacctta cccacctttg acatgtacgg aatttgccag agatggctta 1080

gtgctcgaaa gagaaccgta acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1140

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcat tagttgctac attcagttgg 1200

gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc 1260

atggccctta taggtggggc tacacacgtc atacaatggc cggtacaaag ggtcgcaaac 1320

ccgcgagggg gagccaatcc atcaaagccg gtcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg 1380

actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tggatcagca tgtcacggtg aatacgttcc 1440

cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagcggg tctcgccaga agtagttagc 1500

ctaaccgcaa ggagggcgat taccacggcg gggttcgtga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1560

ggtagccgta agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca 1620

tctagagggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca attca 1665

<210> 3

<211> 1652

<212> DNA

<213> 分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)

<400> 3

tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attgggccct ctagatgcat gctcgagcgg 60

ccgccagtgt gatggatatc tgcagaattc gcccttagag tttgatcctg gctcaggacg 120

aacgctggcg gcgtgcttaa cacatgcaag tcgaacggaa aggcccttcg gggtgctcga 180

gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtga tctgccctgc actttgggat aagcctggga 240

aactgggtct aataccgaat aggactccgg actgcatggt ctggggtgga aagcttttgc 300

ggtgtgggat gggcccgcgg cctatcagct tgttggtggg gtgatggcct accaaggcga 360

cgacgggtag ccggcctgag agggtgaccg gccacactgg gactgagata cggcccagac 420

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg 480

ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagcacagac gaagcgcaag 540

tgacggtatg tgcagaagaa ggaccggcca actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 600

gggtccgagc gttgtccgga attactgggc gtaaagagct cgtaggtggt ttgtcgcgtt 660

gttcgtgaaa actcacagct taactgtggg cgtgcgggcg atacgggcag actggagtac 720

tgcaggggag actggaattc ctggtgtagc ggtggtatgc gcagatatca ggaggaacac 780

cggtggcgaa ggcgggtctc tgggcagtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 840

gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgg tgggtactag gtgtgggttt 900

ccttccttgg gatccgtgcc gtagctaacg cattaagtac cccgcctggg gagtacggcc 960

gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgtggatt 1020

aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg ggtttgacat gcacaggacg ccggcagaga 1080

tgtcggttcc cttgtggcct gtgtgcaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1140

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc tcatgttgcc agcacgttat 1200

ggtggggact cgtgagagac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1260

tcatcatgcc ccttatgtcc agggcttcac acatgctaca atggccggta caaagggctg 1320

cgatgccgtg aggtggagcg aatcctttca aagccggtct cagttcggat cggggtctgc 1380

aactcgaccc cgtgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat 1440

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatga aagtcggtaa cacccgaagc 1500

cggtggccta accccttgtg ggagggagcc gtcgaaggtg ggatcggcga ttgggacgaa 1560

gtcgtaacaa ggtagccgta agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actagtggat 1620

ccgagctcgg taccaagctt ggcgtaatca tg 1652

Claims

1.一种分离的细菌聚生体，所述分离的细菌聚生体包含保藏为LMG P-27480并且特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:1的甲基养菌属菌株LD3，所述分离的细菌聚生体是降解甲基叔丁基醚(MTBE)的聚生体。

2.根据权利要求1所述的细菌聚生体，所述细菌聚生体进一步包含保藏为LMG P-27479并且特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:2的噬氢菌属菌株噬氢菌LD1。

3.根据权利要求1或2所述的细菌聚生体，所述细菌聚生体进一步包含保藏为LMG P-27498并且特征在于存在16S rRNA序列SEQ ID NO:3的分枝杆菌属菌株分枝杆菌LD6。

4.根据权利要求3所述的细菌聚生体，其中所述细菌聚生体中的甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的相对浓度为约(％/％/％)1-60/40-99/0.005-10，和/或其中所述甲基养菌属菌株LD3以10⁴-10⁸个细胞/ml之间的浓度存在、所述噬氢菌属菌株噬氢菌LD1以10⁶-10⁹个细胞/ml之间的浓度存在，并且保藏的分枝杆菌属菌株分枝杆菌LD6以10²-10⁶个细胞/ml之间的浓度存在。

5.根据权利要求3或4所述的细菌聚生体，所述细菌聚生体包含所述甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6菌株，其中所述聚生体的MTBE降解速率为至少10mg MTBE/克细胞干重/小时。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的细菌聚生体，所述细菌聚生体已保藏为LMG P-27909。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的细菌聚生体降解受甲基叔丁基醚(MTBE)、叔丁醇(TBA)、甲醛(HCHO)和/或BTEX污染的介质中的MTBE、TBA和/或HCHO的用途。

8.一种用于降解受甲基叔丁基醚(MTBE)、叔丁醇(TBA)和/或甲醛(HCHO)污染的介质中的MTBE、TBA和/或HCHO的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供根据权利要求1至5中任一项所述的聚生体；和

(ii)用所述微生物、组合物或聚生体处理所述受污染的介质以降解至少一部分所述污染。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述处理在生物反应器中发生或通过将聚生体添加到受污染的介质中原位发生。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中以在10⁴至10⁹CFU之间的细胞计数添加聚生体。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述聚生体中的甲基养菌LD3、噬氢菌LD1和/或分枝杆菌LD6的相对浓度为约(％/％/％)1-60/40-99/0.005-10。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，所述方法进一步包括确定所述介质中MTBE、TBA和/或HCHO的浓度和/或确定所述介质中MTBE、TBA和/或HCHO的降解速率。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述受污染的介质选自由以下构成的组：受污染的土壤、受污染的淤泥、受污染的沉积物、受污染的疏浚尾料、受污染的化学废物、受污染的流体和受污染的水。

14.一种用于检测样品中存在保藏为LMG P-27480的甲基养菌LD3微生物、保藏为LMGP-27479的噬氢菌LD1微生物和/或保藏为LMG P-27498的分枝杆菌LD6微生物的方法，所述方法包括：任选地通过将所述样品与引物或探针接触，来鉴定所述样品中分别对应于SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列的存在，所述引物或探针能够特异性杂交或扩增对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有特异性的序列，以及确定存在杂交信号或扩增产物，所述杂交信号或扩增产物指示所述样品中存在保藏为LMG P-27480的甲基养菌LD3微生物、保藏为LMG P-27479的噬氢菌LD1微生物和/或保藏为LMG P-27498的分枝杆菌LD6微生物。

15.一种分离的降解甲基叔丁基醚(MTBE)的甲基养菌属菌株，所述甲基养菌属菌株的特征在于存在16S RNA序列SEQ ID NO:1，并且是保藏为LMG P-27480的菌株甲基养菌LD3。