CN104651261B - 一种微生物菌株及其在降解烟草甾醇中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种微生物菌株及其在烟草及其衍生产品甾醇物质降解中的应用，属于烟草降害技术领域。所述微生物菌株为甾醇降解菌株TCD0002，保藏编号为CGMCC No. 9752，该菌株可用于工业烟草及其衍生产品甾醇类物质降解，反应条件温和，成本低，效率高，不会对环境造成二次污染。具体应用方式有：（1）为相关烟草企业提供特效甾醇降解菌剂，用于处理烟叶甾醇降解，降低甾醇含量，减少甾醇物质在燃烧过程中形成的有害物质含量；（2）为相关烟草企业提供特效甾醇降解菌剂，用于处理烟叶衍生产品‑烟浸膏中甾醇降解，降低甾醇含量，减少甾醇物质在燃烧过程中形成的有害物质含量，实现烟草产品减焦降害的目的。

Description

一种微生物菌株及其在降解烟草甾醇中的应用
技术领域
本发明属于烟草降害技术领域，也属于生物强化技术的范畴，具体涉及甾醇高效降解菌在降解烟叶及其衍生产品中甾醇的应用。
背景技术
植物甾醇是植物性甾体化合物，它不仅是植物细胞的重要组成成分，也是一种重要的植物活性成分，其基本结构为环戊氢化菲体系。目前烟草中已报道植物甾醇主要有胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，霉变烟叶中还可能含有麦角甾醇。除游离态甾醇外，甾醇类化合物还以结合态存在，结合态包括与脂肪酸结合成酯、与糖类的羟基形成糖苷。
烟草中植物甾醇主要存在于细胞膜中，不但能促进烟草生长，而且对烟草的安全、品质都有较大的影响。有研究表明烟草中的甾醇是卷烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体物，卷烟烟气中61％的苯并[a]芘是由它裂解产生的。不同于食品和其它植物中的甾醇，在卷烟抽吸时约有20-25％的烟草植物甾醇完整的转移到主流和侧流烟气中。甾醇中的羟基高温热解时会与其母体的四轮环戊烯[α]菲环结构形成稠环芳烃化合物。Stedman的研究表明豆甾醇在750℃下热解生成苯并[α]芘；Badger等的研究表明，在豆甾醇的裂解过程中，发生了甾醇骨架的一系列单分子反应后形成了菲、蒽等多环芳烃。
由于烟草中植物甾醇是卷烟烟气中苯并[α]芘生成的前体化合物，降解烟草及其制品中的植物甾醇对促进卷烟的减害降焦研究具有重要的参考价值和实践意义。
相关研究表明：节杆菌、诺卡氏菌和分枝杆菌均可切除甾醇的饱和侧链，得到雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，并且它们对甾体化合物的降解作用并不停留在ADD上，大多数野生菌株可以降解ADD直至最终产物CO2，完全降解甾醇母核需要20多种酶参与反应，其反应式如图1所示。这为开展烟草中植物甾醇降解研究奠定了良好的理论基础。
发明内容
本发明旨在筛选、培养条件优化及研发出烟草甾醇的高效降解微生物Acinetobacter pittii TCD0002菌株、菌剂，并用于降解烟草材料中的甾醇，以实现处理上的温和性与低成本。
本发明采用的技术方案如下：
一种甾醇降解菌株(Acinetobacter pittii)TCD0002，已于2014年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.9752。
所述的甾醇降解菌株(Acinetobacter pittii)TCD0002在降解甾醇中的应用。
上述技术方案中所述的甾醇为烟叶及其衍生产品中的甾醇。
所述的甾醇降解菌株(Acinetobacter pittii)TCD0002在降解甾醇中的应用，包括如下步骤：
步骤(1)，斜面培养：将甾醇降解菌株TCD0002于斜面培养基上培养，培养温度为28℃，培养时间为7d；然后用无菌水将斜面表面生长的菌苔用接种环刮洗，制备成第一菌悬液；
步骤(2)，扩繁培养：将步骤(1)得到的第一菌悬液接种至扩繁培养基上进行扩繁培养，接种量为5％，培养温度为28℃，培养时间为7d；
步骤(3)，降解应用：将步骤(2)培养的甾醇降解菌株TCD0002制成第二菌悬液，然后喷洒到烟叶及其衍生产品中进行降解。
上述技术方案中步骤(1)所述的斜面培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO34.5g，FeSO4·H2O 0.0075g，MgSO4 0.3g和1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL，琼脂30g，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞10mL玻璃试管内，每管分装量为4mL，接着121℃灭菌30分钟，然后放置成斜面，冷却至室温，即得。
上述技术方案中步骤(1)所述的第一菌悬液浓度为109CFU/mL。
上述技术方案中步骤(2)所述的扩繁培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO34.5g，FeSO4·H2O 0.0075g，MgSO4 0.3g，1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL和琼脂30g，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞500mL三角瓶，每瓶分装量为100mL，接着121℃灭菌30分钟，冷却至室温，即得。
上述技术方案中步骤(3)所述的第二菌悬液浓度为109CFU/mL。
上述技术方案中步骤(3)所述的降解应用是将每50mL菌悬液喷洒至1000g烟丝上，然后将其放置于恒温恒湿培养箱内，于温度为28℃，湿度为60％培养48小时后，50℃烘干20分钟，即可。
上述技术方案中步骤(3)所述的降解应用是每1mL菌悬液接种100mL烟浸 膏稀释液，然后放置于恒温摇床，于28℃下180rpm培养48小时，减压浓缩，50℃烘干，即可；所述的烟浸膏稀释液是将烟浸膏用自来水稀释5倍得到的。
本发明利用烟草种植区的土壤、根腐病烟株的根部及叶片的微生物细菌群，通过豆甾醇为唯一碳源诱导底物的培养基进行分离，再采用筛选验证，菌株对烟草甾醇具有良好降解性能。
同时，通过进一步采用工业烟叶产品进行菌剂处理，以未经过微生物菌剂处理的工业烟叶为空白对照，比较菌剂在工业烟叶产品甾醇降解处理工艺上的应用效果。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明微生物菌株为甾醇降解菌株TCD0002，保藏编号为CGMCC No.9752，该菌株可用于工业烟草及其衍生产品甾醇类物质降解，反应条件温和，成本低，效率高，不会对环境造成二次污染。具体应用方式有：(1)为相关烟草企业提供特效甾醇降解菌剂，用于处理烟叶甾醇降解，降低甾醇含量，减少甾醇物质在燃烧过程中形成的有害物质含量；(2)为相关烟草企业提供特效甾醇降解菌剂，用于处理烟叶衍生产品-烟浸膏中甾醇降解，降低甾醇含量，减少甾醇物质在燃烧过程中形成的有害物质含量，实现烟草产品减焦降害的目的。
附图说明
图1是豆甾醇的微生物降解途径的反应式；
图2是HPLC分析豆甾醇的标准曲线；
图3是菌株Acinetobacter pittii TCD0002降解豆甾醇HPLC分析谱图；其中，12.58min为豆甾醇的峰，其峰面积为15767.8；
图4采用邻接法构建基于菌株Acinetobacter pittii_TCD0002的16S rRNA基因部分序列构建系统发育树；
图5是菌株Acinetobacter pittii TCD0002的扫描电镜图；
图6是麦角甾醇标准工作液HPLC色谱图；
图7是β-谷甾醇标准工作液HPLC色谱图；
图8是豆甾醇标准工作液HPLC色谱图；
图9是胆甾醇标准工作液HPLC色谱图；
图10是实施例2中样品HPLC色谱图；
图11是实施例3中样品HPLC色谱图；
其中，1-内标物(6-酮胆甾烷醇)，2-麦角甾醇，3-胆甾醇，4-豆甾醇，5-β-谷 甾醇；
甾醇降解菌株(Acinetobacter pittii)TCD0002，已于2014年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.9752，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1.菌株TCD0002分离及降解甾醇性能筛选
(1)以豆甾醇为唯一碳源的富集、筛选培养基配制
NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O 0.0075g，MgSO4 0.3g和1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL，一起加入至自来水中定容成1.5L，pH＝7.0，分装至带棉塞500mL三角瓶(每瓶分装量为100mL)，121℃灭菌30分钟，自然冷却到室温，得到富集培养基，待用。
(2)甾醇降解菌的富集培养
富集培养时称取1克烟田土壤、烟叶或烟根部，加入到装有100mL富集培养基的三角瓶中，置于28℃恒温摇床中培养。次日起每天取样，显微镜下观察菌体生长情况，选择有微生物生长明显的样品涂平皿培养，待有单菌落长出时，挑取单菌落转入斜面保存。
(3)甾醇降解菌的初步筛选
经选择性培养基的富集培养、显微镜观察生物量来进行甾醇降解菌的初步筛选。将培养后生物量很大的样品进行稀释后涂平皿分离，分离得到单一的纯菌株斜面保存、编号。将分离得到的菌株转接到装有100mL液体培养液的三角瓶中培养，每瓶接种1支菌株斜面。不接菌空白培养基设为对照。每个菌株2个平行，培养温度为28℃，转速为200r/min，豆甾醇浓度为0.1％。
所述的液体培养液为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O0.0075g，MgSO4 0.3g，1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，分装至带棉塞500mL三角瓶(每瓶分装量为100mL)， 121℃灭菌30分钟，自然冷却到室温即可。
培养5d后每个样均用移液枪吸取培养液0.5-1.5mL到离心管内，同时吸取相同体积的分析纯氯仿加入到离心管，充分混匀萃取，去除水层部分。氯仿部分用毛细管半定量吸取，TLC薄层板上以0.01％豆甾醇为对照逐个点样，以体积比为1:1的氯仿和石油醚的混合溶剂作为展开剂扩展，之后用5％硫酸-乙醇的显色剂喷洒后加热显色。将不接菌空白培养基氯仿提取物设为空白对照。
试验结果表明，从烟叶和烟田土壤分离的54株细菌中，筛选获得可降解豆甾醇的菌株TCD0002。与空白对照相比，即与不接菌空白培养基氯仿提取物相比，菌株TCD0002可明显降解豆甾醇。
(4)甾醇降解菌的定量筛选
①豆甾醇标准曲线建立
精密称取60℃下干燥12h的豆甾醇5.2mg，用甲醇溶解定容于25mL容量瓶中，制成0.208mg/mL的溶液，用微量移液管(进样器)精密量取该溶液适量，分别稀释成浓度为0.1664，0.1248，0.0832，0.0416，0.0208mg/mL的对照品溶液，分别取20μL进样，每个样品平行进样3次，取平均值，以色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制校准曲线。高效液相色谱仪(型号：LC-310)溶剂系统为色谱纯甲醇(100％)。色谱柱型号：Phecda C18(5μm，150×4.6mm)，柱温30℃。检测波长210nm。流速1.0mL/min。进样量：20μL。标准曲线见图2。标准曲线R2＝0.9998，满足定量分析要求。
②甾醇降解菌的定量筛选
配制液体培养液：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O0.0075g，MgSO40.3g，1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，分装至带棉塞500mL三角瓶(每瓶分装量为100mL)，121℃灭菌30分钟，自然冷却到室温即可，得到液体培养液，待用。
将菌株TCD0002的斜面菌株转接到装有100mL液体培养液的三角瓶中培养，每瓶接种1支菌株斜面，设2个平行，不接菌的作为空白对照，培养温度为28℃，转速为200r/min，培养7d后，用等体积氯仿萃取发酵液3次，分离、合并、浓缩氯仿相，然后甲醇溶解并定容氯仿提取物至25mL。HPLC测定经菌株TCD0002发酵后豆甾醇的浓度，计算菌株TCD0002对豆甾醇的降解率。
实验结果表明菌株TCD0002对豆甾醇的降解率为62.46％，见图3。
③菌株TCD0002的生物学鉴定
菌株TCD0002通过测序后利用Blast软件在GenBank等数据库中进行相似性搜索，选用同源性比较高的典型菌株的16S rDNA序列作为参比对象，然后用CLUSTAL X软件进行多序列比对，并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，采用邻接法(Neighbor-joining)用MAGE 4软件构建以16S rDNA序列为基础的供试菌与参比菌之间的系统发育树，分析结果表明：TCD0002属于Acinetobacter pittii菌株，16S rRNA基因相似性相似性99.89％，如图4。
④菌株Acinetobacter pittii TCD0002扫描电镜观察
用移液管向离心管中移取5mL戊二醛。在紫外线接种间中酒精灯消毒条件下挑取适量TCD0002菌落置于装有戊二醛的离心管中，并混匀，盖好盖子封存，待过夜后用移液管移取适量菌液至玻片上，待晾干后喷金处理，然后用电子显微镜观察。观察结果表明TCD0002菌为典型细菌形态。菌体为长杆菌。菌体直径大约0.4um；长度2.1～2.2um不等，如图5所示。
该菌株已与2014年10月8日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”进行了有效保藏。保藏编号为：CGMCC No.9752。
实施例2菌株Acinetobacter pittii TCD0002在降解工业烟丝中甾醇的应用
①工业烟丝甾醇含量测定
系列标准工作溶液：准确称取50mg麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇置于不同的100mL棕色容量瓶中，精确至0.0001g，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为0.50mg/mL的标准储备溶液。该标准储备溶液在2-8℃下密封避光保存，有效期为1个月。
分别准确移取麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的标准储备溶液0.5mL、1.0mL、1.0mL、1.0mL至25mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、20μg/mL、20μg/mL的一级混合标准溶液，该溶液应即配即用。
称取50mg 6-酮胆甾烷醇于100mL棕色容量瓶中，精确至0.0001g，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为0.50mg/mL的内标储备液。该内标储备液在2-8℃下密封避光保存，有效期为1个月。移取1.0mL 6-酮胆甾烷醇内标储备液至25mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度约为20.0μg/mL的内标工作溶液，该溶液应即配即用。
移取8.0mL内标工作溶液于1000mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，该 萃取溶液应即配即用。
分别准确移取0.1mL、0.2mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL一级混合标准溶液至不同的25mL棕色容量瓶中，再准确加入0.2mL内标工作溶液，用甲醇稀释定容至刻度，得到系列标准工作溶液，该溶液应即配即用。
液相色谱条件：
——色谱柱：C18柱(填料粒径1.7μm，内径2.1mm，长度100mm)或等效柱；
——流速：0.4mL/min；
——柱温：40℃；
——进样量：5μL；
——流动相A：甲醇，流动相B：水；
——梯度洗脱条件见表1。
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
6.0 100 0
7.5 100 0
8.0 95 5
12.0 95 5
质谱条件：
——离子源：大气压化学电离源(APCI)；
——扫描方式：正离子扫描；
——检测方式：多反应监测(MRM)；
——离子源温度：500℃；
——离子对的驻留监测时间(dwell time)：100ms
——辅助气Gas1压力：0.349MPa；
各分析物的定量离子对、定性离子对及去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)见表2。
表2质谱检测参数表
将标准工作溶液按上述仪器分析条件依次进样分析，绘制标准工作曲线，见附图6-9。
烟草及烟草制品中游离态甾醇的含量由式(1)计算得出：
式中：
X——样品中游离甾醇的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
C——从标准工作曲线上得到甾醇浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
v——样品萃取液定容体积，单位为毫升(mL)；
m——试样质量，单位为克(g)；
ω——试样水分质量分数。
取两次平行测定结果的算术平均值作为最终测定结果，精确至0.01mg/kg。两次平行测定结果的相对平均偏差应小于10％。
②菌株Acinetobacter pittii TCD0002适应性扩繁培养
将菌株Acinetobacter pittii TCD0002于斜面培养基上培养，培养温度为28℃，培养时间为7d；用无菌水将斜面表面生长的菌苔用接种环刮洗，制备成菌悬液，该菌悬液的浓度为109CFU/mL；然后按5mL/瓶接种量用无菌吸管转移到100mL扩繁培养基上，于28℃培养箱内培养7天即可。
所述的斜面培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O0.0075g，MgSO4 0.3g和1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL，琼脂30g，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞10mL玻璃试管内，每管分装量为4mL，接着121℃灭菌30分钟，然后放置成斜面，冷却至室温，即得。
扩繁培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O 0.0075g，MgSO40.3g，1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL和琼脂30g，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞500mL三角瓶，每瓶分装量为100mL，接着121℃灭菌30分钟，冷却至室温，即得。
每瓶扩繁菌种采用50mL无菌水刮取菌苔，合并制备成菌悬液，所述的菌悬液浓度为109CFU/mL，放置于4℃冰箱备用。采用该扩繁方法可以有效避免其他扩繁方式(比如液体扩繁)将残余甾醇物质带入烟丝处理样中的实验误差。
③菌株Acinetobacter pittii TCD0002扩繁菌悬液降解工业烟丝中的甾醇
每50mL菌悬液喷洒1000g烟丝。将喷洒菌液之后的烟丝放置于恒温恒湿培养箱内(28℃，湿度60％)培养48小时，50℃烘干20分钟，用自封袋口。即可用于分析。
取样品0.2g，用40mL含内标甲醇溶液萃取，将处理的样品用0.22μm有机滤膜过滤后，进行高效液相色谱-串联质谱分析，测定方法见实施例2中①工业烟丝甾醇含量测定，见附图10，其结果如表3所示。
表3菌株Acinetobacter pittii TCD0002扩繁菌悬液处理工业烟丝后的甾醇测定结果。
实施例3菌株Acinetobacter pittii TCD0002在降解工业烟浸膏中甾醇的应用
①菌株Acinetobacter pittii TCD0002适应性扩繁培养
将菌株Acinetobacter pittii TCD0002于斜面培养基上培养，培养温度为28℃，培养时间为7天；用无菌水将斜面表面生长的菌苔用接种环刮吸，制备成菌悬液，该菌悬液的浓度为109CFU/mL；然后按5mL/瓶接种量用无菌吸管转移到100mL扩繁培养基上，于28℃培养箱内培养7天即可。
所述的斜面培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O0.0075g，MgSO4 0.3g和1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL，琼脂30g，一起加入至 自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞10mL玻璃试管内，每管分装量为4mL，接着121℃灭菌30分钟，然后放置成斜面，冷却至室温，即得。
扩繁培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O0.0075g，MgSO40.3g，1.0g/L豆甾醇乳浊液150mL和琼脂30g，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH＝7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞500mL三角瓶，每瓶分装量为100mL，接着121℃灭菌30分钟，冷却至室温，即得。
每瓶扩繁菌种采用50mL无菌水刮取菌苔，合并制备成菌悬液，所述的菌悬液浓度为109CFU/mL，放置于4℃冰箱备用。采用该扩繁方法可以有效避免其他扩繁方式(比如液体扩繁)将残余甾醇物质带入烟丝处理样中的实验误差。
②菌株Acinetobacter pittii TCD0002扩繁菌悬液降解工业烟浸膏中的甾醇
每1mL菌悬液接种100mL烟浸膏稀释液(烟浸膏用自来水稀释5倍)。将接种菌液之后的烟浸膏放置于恒温摇床(28℃，180rpm)培养48小时，减压浓缩，50℃烘干后用自封袋口。即可用于分析。
准确称取烟丝浸膏0.2000g，用80mL含内标的甲醇溶液溶解，将处理的样品用0.22μm有机滤膜过滤后，进行高效液相色谱-串联质谱分析，测定方法见实例2中①工业烟丝甾醇含量测定，见附图11，图11中麦角甾醇含量为0，结果如表4所示。
表4菌株Acinetobacter pittii TCD0002扩繁菌悬液处理工业烟浸膏后的甾醇测定结果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002，已于2014年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 9752。
2.根据权利要求1所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于所述的甾醇为烟叶及其衍生产品中的甾醇。
3.根据权利要求2所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于包括如下步骤：
步骤（1），斜面培养：将甾醇降解菌株TCD0002于斜面培养基上培养，培养温度为28℃，培养时间为7d；然后用无菌水将斜面表面生长的菌苔用接种环刮洗，制备成第一菌悬液；
步骤（2），扩繁培养：将步骤（1）得到的第一菌悬液接种至扩繁培养基上进行扩繁培养，接种量为5%，培养温度为28℃，培养时间为7d；
步骤（3），降解应用：将步骤（2）培养的甾醇降解菌株TCD0002制成第二菌悬液，然后喷洒到烟叶及其衍生产品中进行降解。
4.根据权利要求3所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于步骤（1）所述的斜面培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5 g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O 0.0075g，MgSO4 0.3g和1.0g/L豆甾醇乳浊液150 mL，琼脂30g，一起加入至自来水中定容成1.5L，调整pH=7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞10mL玻璃试管内，每管分装量为4mL，接着121℃灭菌30分钟，然后放置成斜面，冷却至室温，即得。
5.根据权利要求3所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于步骤（1）所述的第一菌悬液浓度为109CFU/mL。
6.根据权利要求3所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于步骤（2）所述的扩繁培养基为：NaCl 1.5g，K2HPO4 1.5 g，NaNO3 4.5g，FeSO4·H2O 0.0075g，MgSO4 0.3g，1.0g/L豆甾醇乳浊液150 mL和琼脂30g，一起加入至自来水中定容成1.5L ，调整pH=7.0，加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞500mL三角瓶，每瓶分装量为100mL，接着121℃灭菌30分钟，冷却至室温，即得。
7.根据权利要求3所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于步骤（3）所述的第二菌悬液浓度为109CFU/mL。
8.根据权利要求7所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于步骤（3）所述的降解应用是将每50mL菌悬液喷洒至1000g烟丝上，然后将其放置于恒温恒湿培养箱内，于温度为28℃，湿度为60%培养48小时后，50℃烘干20分钟，即可。
9.根据权利要求7所述的甾醇降解皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）TCD0002在降解甾醇中的应用，其特征在于步骤（3）所述的降解应用是每1mL菌悬液接种100mL烟浸膏稀释液，然后放置于恒温摇床，于28℃下180rpm培养48小时，减压浓缩，50℃烘干，即可；所述的烟浸膏稀释液是将烟浸膏用自来水稀释5倍得到的。
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