CN110343618A - 一类helminthosporol型倍半萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一类helminthosporol型倍半萜类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小麦根腐平脐蠕孢菌，已于2019年04月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.17767。本发明还公开了一类来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物，其结构式如下所示：所述helminthosporol型倍半萜类化合物是从小麦根腐平脐蠕孢菌经过发酵培养分离获得。本发明提供的化合物BS11134‑1、BS11134‑2和BS11134‑3具有一定的抗老年痴呆活性。

Description

一类helminthosporol型倍半萜类化合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一类来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
平脐蠕孢菌属(Biopolaris)是一类非常有名的植物病原真菌，它能够产生多种植物毒素，引起大麦和小麦作物的根腐病、叶斑病、苗枯病和头枯病等。目前从Biopolaris属的不同菌株里分离得到的植物毒素中有一大部分为倍半萜类化合物，该类植物毒素是由FPP经I型倍半萜合成酶(STPSs)催化，从而形成多种具有新颖骨架和有效生物活性的倍半萜。目前报道的helminthosporol型倍半萜类化合物大约有20个，这一类型倍半萜类是一类具有细胞毒性、抗菌、杀线虫和抗病毒活性的重要天然产物，广泛用于食品和化妆品行业。选择该骨架类型的倍半萜化合物进行深入研究，对发现新结构、新活性的化合物具有良好的前景。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一类来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物。
本发明的第二个目的是提供一种所述来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物的制备方法。
本发明的第三个方法是提供一种所述来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面提供了一种小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134，已于2019年04月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.17767。
所述小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134的培养方法为：
将平板培养基在121℃下灭菌20min，制成平板，于37℃恒温培养3d，至表面水分稍干，无杂菌生长时，将小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养7d，外观为墨绿至黑色，气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到平板菌种。
所述平板培养基是由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L。
所述小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134的分离方法如下：
将新鲜草地早熟禾(Poa pratensis)叶片部位植物样品用无菌水清洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小片做表面消毒处理：75％酒精漂洗3min，无菌水冲洗4-5次，5％次氯酸钠溶液漂洗3min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸干水分，将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm2小块，放入含有菌株分离培养基的平板中28℃恒温培养3-15d，培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养。
所述菌株分离培养基的配制方法如下：
土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L，高温灭菌，在制备平板时加入青霉素100mg/L和链霉素200mg/L的混合液20mL。
所述小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134的保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。
本发明的第二个方面提供了一类来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物，其结构式如下所示：
所述helminthosporol型倍半萜类化合物是从小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolarissorokiniana)BS11134经过发酵培养分离获得。
本发明的第三个方面提供了一种所述来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将固体发酵培养基灭菌，然后将体积百分比为5％的种子液接种于固体发酵培养基，于28℃静置培养，40d后收获固体发酵物，固体发酵物为容器内的所有物质，将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述helminthosporol型倍半萜类化合物。
所述固体发酵培养基为大米：水(W:V)＝2:3。
所述种子液的制备方法如下：在多个250mL玻璃瓶中分别装入40mL种子培养基，于121℃下灭菌20min，使用含有小麦根腐平脐蠕孢菌的平板菌种由平板挖块接种，于28℃在旋转摇床旋转培养(转速为220rpm)48h，得到种子液。
所述种子培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L。
所述将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述helminthosporol型倍半萜类化合物，包括以下步骤：
将上述得到的固体发酵物经乙酸乙酯提取三遍，提取液经纱布过滤去除固体发酵物，收集上清液，将上清液用旋转蒸发仪浓缩蒸干，称重，通过硅胶色谱(50×80mm柱)分离(硅胶的型号为Greagent，AR级，300-400目)，用正己烷：乙酸乙酯：甲醇按如下比例3:1:0、1:1:0、0:1:0、0:0:1，对乙酸乙酯提取物进行梯度洗脱，共得到六个组份E1-E6，组分E1和E6进一步用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，用50％二氯甲烷和甲醇溶液等梯度洗脱，E1得到4个子组分E1A-E1D，E6得到2个子部分E6A-E6B，亚组分E1C用ODS-MPLC进行分离，用60％-100％甲醇水溶液梯度洗脱100分钟，得到11个组分E1C1-E1C11，E1C7和E1C8组分分别进一步用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，经甲醇溶液洗脱，E1C7得到6个亚组分E1C7A-E1C7F，E1C8得到4个亚组分E1C8A-E1C8D，亚组分E6B用ODS-MPLC进行分离，用5％-50％、50％-80％、80％-100％甲醇水溶液分别梯度洗脱100分钟、50分钟、20分钟，得到亚组分E6B1-E6B11，E6B7硅胶色谱(20×80mm柱)进行CH2Cl2-CH3OH梯度分离(100％-0％到0％-100％)得到亚组分E6B7-1～E6B7-13；
采用反相高效液相色谱法通过Eclipse XDB-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E1C7D组分(89mg)，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，50％乙腈水溶液；30min，50％乙腈水溶液；60min，70％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-4(1.5mg，tR＝13.9min)；
采用反相高效液相色谱法通过Eclipse XDB-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E6B7-2组分(100mg)，流速为3.0mL/min，梯度洗脱：0min，20％乙腈水溶液；30min，20％乙腈水溶液；42min，23％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-1(9.5mg，tR＝40.1min)；
采用反相高效液相色谱法通过Zorbax RX-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E6B7-10组分(145mg)，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，25％乙腈水溶液；26min，34％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-2(22.0mg，tR＝21.4min)；
用反相高效液相色谱法通过Zorbax RX-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E6B7-8组分(142mg)，用梯度洗脱以3.0mL/min的流速洗脱：0min，20％乙腈水溶液；24min，36％乙腈水溶液，获得化合物BS11134-3(26.2mg，tR＝16.6min)；
E3组分用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，经二氯甲烷与甲醇1:1混合溶剂洗脱，分离得到33个部分(1-33)。亚组分E3-24(150mg)通过反相高效液相色谱法制备纯化，使用Zorbax RX-C8(9.4×250mm)柱，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，35％乙腈水溶液；50min，45％乙腈水溶液，获得化合物BS11134-5(9.9mg，tR＝30.1min)和化合物BS11134-6(4.4mg，tR＝40.0min)。
本发明的第四个方面提供了一种所述来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物在制备抗老年痴呆药物中的应用。
所述抗老年痴呆体现为具有神经细胞保护活性，所述神经细胞为SH-SY5Y细胞株。
本发明的第五个方面提供了一种药物组合物，包括所述来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物、其顺反异构体、溶剂化物或其药用盐以及药学上可接受的载体。
本发明的第六个方面提供了一种所述药物组合物在制备抗老年痴呆药物中的应用。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的化合物BS11134-1、BS11134-2和BS11134-3属于新的helminthosporol型倍半萜类化合物，制备方法成熟，工艺简便，所得产物产率高，经核磁共振、质谱检测，其结构正确，化合物BS11134-1、BS11134-2和BS11134-3具有一定的抗老年痴呆活性。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
保藏日期：2019年04月30日
保藏编号：CGMCC NO.17767
分类命名：麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)
附图说明
图1为本发明化合物BS11134-1的紫外谱图。
图2为本发明化合物BS11134-2的紫外谱图。
图3为本发明化合物BS11134-3的紫外谱图。
图4为本发明化合物BS11134-4的紫外谱图。
图5为本发明化合物BS11134-5的紫外谱图。
图6为本发明化合物BS11134-6的紫外谱图。
图7为本发明化合物BS11134-1的质谱图。
图8为本发明化合物BS11134-2的质谱图。
图9为本发明化合物BS11134-3的质谱图。
图10为本发明化合物BS11134-4的质谱图。
图11为本发明化合物BS11134-5的质谱图。
图12为本发明化合物BS11134-6的质谱图。
图13为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的1H-NMR谱图。
图14为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图15为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图16为本发明化合物BS11134-4溶于CDCl3中的1H-NMR谱图。
图17为本发明化合物BS11134-5溶于CDCl3中的1H-NMR谱图。
图18为本发明化合物BS11134-6溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图19为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的13C-NMR谱图。
图20为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
图21为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
图22为本发明化合物BS11134-4溶于CDCl3中的13C-NMR谱图。
图23为本发明化合物BS11134-5溶于CDCl3中的13C-NMR谱图。
图24为本发明化合物BS11134-6溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
图25为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的1H-1HCOSY谱。
图26为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的1H-1HCOSY谱。
图27为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的1H-1HCOSY谱。
图28为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的HSQC谱图。
图29为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的HSQC谱图。
图30为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的HSQC谱图。
图31为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的HMBC谱图。
图32为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的HMBC谱图。
图33为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的HMBC谱图。
图34为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的ROSEY谱图。
图35为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的ROSEY谱图。
图36为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的ROSEY谱图。
图37为小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134基于ITS基因序列的系统进化树。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用的小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134，已于2019年04月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNO.17767。
实施例1
制备一类来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物
土豆提取物购自美国BD公司，产品目录号为2022-01-31；葡萄糖购自上海泰坦科技有限公司，产品目录号为G61055A；琼脂购自青岛华东化玻仪器公司。
制备一类来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物的方法如下：
一、发酵制备helminthosporol型倍半萜类化合物
1、种子培养
(1)将平板培养基在121℃下灭菌20min，制成平板，于37℃恒温培养3d。至表面水分稍干，无杂菌生长时，将小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养7d，外观为墨绿至黑色，气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到平板菌种。
所述平板培养基是由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖、琼脂和水；
以上成分在所述平板培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L；
所述平板培养基的pH值自然。
小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134的分离和鉴定方法如下：
菌株来源样品：分离自草地早熟禾(Poa pratensis)叶片部位，采集地点为中国北京市(GPS坐标为：40.21432，116.53574)，每年9月份采集。
菌株分离方法：
组织分离法，具体操作方法如下：
将新鲜草地早熟禾(Poa pratensis)叶片部位植物样品用无菌水清洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小片做表面消毒处理：75％酒精漂洗3min，无菌水冲洗4-5次，5％次氯酸钠溶液漂洗3min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸干水分。将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm2小块，放入含有菌株分离培养基的平板中28℃恒温培养3-15d。培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养。
菌株分离培养基的配制方法如下：
土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L，高温灭菌，在制备平板时加入青霉素100mg/L和链霉素200mg/L的混合液20mL。
菌株保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。
菌株ITS区域序列号(GenBank/EMBL/DDBJ accession number)：KU297882。
菌株ITS区域序列测定及其系统发育分析方法如下：用天根植物基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明提取BS11134基因组DNA，用通用引物(ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)对其进行ITS区域扩序。ITS区域的PCR扩增反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler上进行【25μL扩增体系：0.4μL20μM引物，2.5μL 10×缓冲液(TaKaRa，中国大连)，2.5μL 2.5nM dNTP(TaKaRa，中国大连)，2U rTap聚合酶(TaKaRa，中国大连)，1μL DNA模板】，94℃初次变性5min，然后94℃变性1min，循环30次，55℃退火1min，72℃延伸75sec，最后72℃延伸10min。利用CLSSTALW序列分析软件对将获得的ITS区域序列进行多序列比对分析。并利用MEGA6.0软件中的邻接法生成系统发育树，如图37所示，图37为小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)BS11134基于ITS基因序列的系统进化树；步缺值设定：1000。
结果：根据菌落形态特征及ITS基因序列结果表明BS11134为小麦根腐平脐蠕孢菌，与菌株Bipolaris sorokiniana在ITS基因序列相似性达99.80％。
(2)在多个250mL玻璃瓶中分别装入40mL种子培养基，于121℃下灭菌20min，由平板挖块(使用第(1)步获得的平板菌种)接种。于28℃在旋转摇床旋转培养(转速为220rpm)48h，得到种子液。
所述种子培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L；
所述种子培养基的pH值自然。
2、发酵培养
配制固体发酵培养基(固体发酵培养基成份：大米：水(W:V)＝2:3，pH值自然)，在1000mL的三角瓶中分装160g大米和240mL水，灭菌(于121℃下灭菌20min)后按照5％(体积百分比)的接种量将上述步骤1得到的种子液接种于固体发酵培养基，于28℃静置培养，40d后收获固体发酵物，固体发酵物为容器内的所有物质。
二、分离纯化helminthosporol型倍半萜类化合物并鉴定
1、分离纯化helminthosporol型倍半萜类化合物
将上述得到的固体发酵物经乙酸乙酯提取三遍，提取液经纱布过滤去除固体发酵物，收集上清液。将上清液用旋转蒸发仪浓缩蒸干，称重。通过硅胶色谱(50×80mm柱)分离(硅胶的型号为Greagent，AR级，300-400目)，用正己烷：乙酸乙酯：甲醇按如下比例3:1:0、1:1:0、0:1:0、0:0:1，对乙酸乙酯提取物进行梯度洗脱，共得到六个组份(E1-E6)。组分E1和E6进一步用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，用50％二氯甲烷和甲醇溶液等梯度洗脱，E1得到4个子组分(E1A-E1D)，E6得到2个子部分(E6A-E6B)。亚组分E1C用ODS-MPLC进行分离，用60％-100％甲醇水溶液梯度洗脱100分钟，得到11个组分(E1C1-E1C11)。E1C7和E1C8组分分别进一步用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，经甲醇溶液洗脱，E1C7得到6个亚组分(E1C7A-E1C7F)，E1C8得到4个亚组分(E1C8A-E1C8D)。亚组分E6B用ODS-MPLC进行分离，用5％-50％、50％-80％、80％-100％甲醇水溶液分别梯度洗脱100分钟、50分钟、20分钟，得到亚组分E6B1-E6B11，E6B7硅胶色谱(20×80mm柱)进行CH2Cl2-CH3OH梯度分离(100％-0％到0％-100％)得到亚组分E6B7-1～E6B7-13。
采用反相高效液相色谱法通过Eclipse XDB-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E1C7D组分(89mg)，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，50％乙腈水溶液；30min，50％乙腈水溶液；60min，70％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-4(1.5mg，tR＝13.9min)。
采用反相高效液相色谱法通过Eclipse XDB-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E6B7-2组分(100mg)，流速为3.0mL/min，梯度洗脱：0min，20％乙腈水溶液；30min，20％乙腈水溶液；42min，23％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-1(9.5mg，tR＝40.1min)。
采用反相高效液相色谱法通过Zorbax RX-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E6B7-10组分(145mg)，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，25％乙腈水溶液；26min，34％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-2(22.0mg，tR＝21.4min)。
用反相高效液相色谱法通过Zorbax RX-C8(9.4×250mm)柱制备纯化E6B7-8组分(142mg)，用梯度洗脱以3.0mL/min的流速洗脱：0min，20％乙腈水溶液；24min，36％乙腈水溶液，获得化合物BS11134-3(26.2mg，tR＝16.6min)。
E3组分用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，经二氯甲烷与甲醇1:1混合溶剂洗脱，分离得到33个部分(1-33)。亚组分E3-24(150mg)通过反相高效液相色谱法制备纯化，使用Zorbax RX-C8(9.4×250mm)柱，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，35％乙腈水溶液；50min，45％乙腈水溶液，获得化合物BS11134-5(9.9mg，tR＝30.1min)和化合物BS11134-6(4.4mg，tR＝40.0min)。
2.helminthosporol型倍半萜类化合物神经保护活性测试
(1)化合物对神经细胞SH-SY5Y细胞H2O2法损伤的保护作用
实验组：神经细胞SH-SY5Y以1×105密度均匀接种于96孔板，常氧箱中培养24h，弃旧培养基，加入100μL预先配好的10μM的不同化合物预保护2h，加入11μL过氧化氢溶液孵育24h。
损伤组：神经细胞SH-SY5Y以1×105密度均匀接种于96孔板，弃旧培养基，常氧箱中培养24h，加入11μL过氧化氢溶液孵育24h。
对照组：神经细胞SH-SY5Y以1×105密度均匀接种于96孔板，常氧箱中培养24h。
检测方法：向每孔中加入10μL终浓度为5mg/mL的MTT溶液。37℃下孵育4h后，移出96孔板中的液体并加入150μL的DMSO，震荡均匀后，用酶标仪测定490nm处的OD值。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
实验结果如表1所示：
表1
在H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型中，分别添加10μm化合物BS11134-1至BS11134-3和BS11134-5预保护2h，与损伤组相比，实验组均表现出明显的神经保护作用，其中化合物BS11134-1神经保护活性最好。
(2)化合物对神经细胞SH-SY5Y细胞OGD损伤的保护作用
实验组：神经细胞SH-SY5Y以1×105密度均匀接种于96孔板，过夜后，用高糖无血清培养基配制10μM化合物溶液100μL，替换原来的培养基，于培养箱中孵育24小时。用预温PBS轻柔洗涤培养板1次，用去氧无糖无血清DMEM配制10μM化合物溶液100μL，替换原来的培养基。置于三气培养箱(37℃、94％N2、5％CO2、1％O2)进行OGD培养3.5h。
损伤组：神经细胞SH-SY5Y以1×105密度均匀接种于96孔板，常氧箱中培养24h。用高糖无血清培养基替换原来的培养基，于培养箱中孵育24小时。用预温PBS轻柔洗涤培养板1次，用去氧无糖无血清DMEM替换原来的培养基。置于三气培养箱(37℃、94％N2、5％CO2、1％O2)进行OGD培养3.5h。
对照组：神经细胞SH-SY5Y以1×105密度均匀接种于96孔板，常氧箱中培养24h。
检测方法：向每孔中加入10μL终浓度为5mg/mL的MTT溶液。37℃下孵育4h后，移出96孔板中的液体并加入150μL的DMSO，震荡均匀后，用酶标仪测定490nm处的OD值。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
实验结果如表2所示：
表2
对照组 损伤组 BS11134-1 BS11134-2 BS11134-3 BS11134-5
1 0.75 0.493 0.483 0.55 0.556 0.366
2 0.756 0.513 0.442 0.542 0.502 0.622
3 0.733 0.601 0.7 0.524 0.487 0.492
Average 0.746 0.536 0.542 0.539 0.515 0.493
损伤组在暴露于OGD下3.5h后，SH-SY5Y神经细胞活力均下降至71.8％。在OGD诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型中，分别添加10μm化合物BS11134-1至BS11134-3和BS11134-5的预保护2h，与损伤组相比化合物BS11134-1和BS11134-2表现出一定的神经保护作用。
3、鉴定helminthosporol型倍半萜类化合物BS11134-1、BS11134-2、BS11134-3、BS11134-4、BS11134-5和BS11134-6。
将上述得到的化合物BS11134-1至BS11134-6进行鉴定：
(1)外观：均为无定形白色粉末。
(2)溶解性：均易溶于甲醇、氯仿，难溶于水。
(3)紫外光谱：化合物BS11134-1和BS11134-4甲醇溶液的紫外光谱在271.0nm处有最大吸收峰。化合物BS11134-2甲醇溶液的紫外光谱在253.0nm处有最大吸收峰。化合物BS11134-3甲醇溶液的紫外光谱在220.0和261.0nm处有最大吸收峰。化合物BS11134-5甲醇溶液的紫外光谱在241.0nm处有最大吸收峰。化合物BS11134-6甲醇溶液的紫外光谱在243.0和333.0nm处有最大吸收峰。6个化合物的紫外光谱分别见图1-6(紫外光谱测定的溶液浓度：化合物1、3、4、6为0.1mg/mL，化合物2为0.2mg/mL，化合物5为0.5mg/mL)，图1为本发明化合物BS11134-1的紫外谱图，图2为本发明化合物BS11134-2的紫外谱图，图3为本发明化合物BS11134-3的紫外谱图，图4为本发明化合物BS11134-4的紫外谱图，图5为本发明化合物BS11134-5的紫外谱图，图6为本发明化合物BS11134-6的紫外谱图。紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304instrument。
(4)质谱：图7为本发明化合物BS11134-1的HRESIMS质谱图，显示其[M+H]+峰为m/z253.1799，并提供其最可能的分子式为C15H24O3。图8为本发明化合物BS11134-2的HRESIMS质谱图，显示其[M+Na]+峰为m/z 291.1567，并提供其最可能的分子式为C15H24O4。图9为本发明化合物BS11134-3的HRESIMS质谱图，显示其[M+Na]+峰为m/z 291.1567，并提供其最可能的分子式为C15H24O4。图10为本发明化合物BS11134-4的HRESIMS质谱图，显示其[M+H]+峰为m/z237.1855，并提供其最可能的分子式为C15H24O2。图11为本发明化合物BS11134-5的HRESIMS质谱图，显示其[M+Na]+峰为m/z 275.1616，并提供其最可能的分子式为C15H24O3。图12为本发明化合物BS11134-6的HRESIMS质谱图，显示其[M+H]+峰为m/z 309.2058，并提供其最可能的分子式为C18H28O4。
(5)核磁共振谱：图13-18分别是化合物BS11134-1至BS11134-6的1H-NMR谱图。图13为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的1H-NMR谱图，图14为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图，图15为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图，图16为本发明化合物BS11134-4溶于CDCl3中的1H-NMR谱图，图17为本发明化合物BS11134-5溶于CDCl3中的1H-NMR谱图，图18为本发明化合物BS11134-6溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图19-24分别是化合物BS11134-1至BS11134-6的13C-NMR谱图，图19为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的13C-NMR谱图，图20为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图，图21为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图，图22为本发明化合物BS11134-4溶于CDCl3中的13C-NMR谱图，图23为本发明化合物BS11134-5溶于CDCl3中的13C-NMR谱图，图24为本发明化合物BS11134-6溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
根据化合物BS11134-1至BS11134-3的1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY(如图25-27所示，图25为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的1H-1HCOSY谱，图26为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的1H-1HCOSY谱，图27为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的1H-1HCOSY谱。)、HSQC(如图28-30所示，图28为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的HSQC谱图，图29为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的HSQC谱图，图30为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的HSQC谱图。)和HMBC(如图31-33所示，图31为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的HMBC谱图，图32为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的HMBC谱图，图33为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的HMBC谱图。)对13C信号进行了归属，见表1-3。化合物BS11134-1至BS11134-3的相对构型由各自的NOSEY谱图(如图34-36所示，图34为本发明化合物BS11134-1溶于CDCl3中的ROSEY谱图，图35为本发明化合物BS11134-2溶于DMSO-d6中的ROSEY谱图，图36为本发明化合物BS11134-3溶于DMSO-d6中的ROSEY谱图。)确定。
已知化合物BS11134-4至BS11134-6的核磁信号归属见表4，最终确定化合物BS11134-1至BS11134-6的结构式如下：
表1化合物BS11134-113C-NMR谱各峰归属
表2化合物BS11134-213C-NMR谱各峰归属
表3化合物BS11134-313C-NMR谱各峰归属
表4已知化合物BS11134-4、BS11134-5、BS11134-6的13C-NMR谱各峰归属
化合物BS11134-1至BS11134-6的NMR测试采用Bruker 500MHz(1H 500MHz；13C125MHz)，溶剂为CDCl3(溶剂峰校正δH 7.26/δC 77.00)。化合物BS11134-1、BS11134-4和BS11134-5的溶剂为CDCl3(溶剂峰校正δH 7.26/δC 77.00)；化合物BS11134-2、BS11134-3和BS11134-6的溶剂为DMSO-d6(溶剂峰校正δH 2.50/δC 39.52)。
(6)旋光值：化合物BS11134-1至BS11134-6的[α]24 D值分别为-12.00、-37.99、-45.99、-4.00、-20.00和-63.99。测试仪器为Perkin-Elmer Model 343polarimeter。采用钠光谱D线(589.3nm)测定，测定管长度1dm，溶剂为甲醇，浓度0.05g/mL。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (11)

1.一种小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134，已于2019年04月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.17767。
2.根据权利要求1所述的小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134，其特征在于：所述小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134的培养方法为：
将平板培养基灭菌制成平板，于37℃恒温培养3d，至表面水分稍干，无杂菌生长时，将小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养7d，外观为墨绿至黑色，气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到平板菌种。
3.根据权利要求2所述的小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134，其特征在于：所述平板培养基是由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为：土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L；
所述小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134的分离方法如下：
将新鲜草地早熟禾叶片部位植物样品用无菌水清洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小片做表面消毒处理，将上述表面消毒后的材料剪切成小块，放入含有菌株分离培养基的平板中28℃恒温培养3-15d，培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养。
4.根据权利要求3所述的小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134，其特征在于：所述菌株分离培养基的配制方法如下：土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L，高温灭菌，在制备平板时加入青霉素100mg/L和链霉素200mg/L的混合液20mL。
5.一类来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物，其特征在于，结构式如下所示：
所述helminthosporol型倍半萜类化合物是从权利要求1至4任一项所述的小麦根腐平脐蠕孢菌BS11134经过发酵培养分离获得。
6.一种权利要求5所述的来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将固体发酵培养基灭菌，然后将体积百分比为5％的种子液接种于固体发酵培养基，于28℃静置培养，40d后收获固体发酵物，固体发酵物为容器内的所有物质，将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述helminthosporol型倍半萜类化合物。
7.根据权利要求6所述的来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述固体发酵培养基为大米：水(W:V)＝2:3；
所述种子液的制备方法如下：在多个玻璃瓶中分别装入种子培养基，灭菌后使用含有小麦根腐平脐蠕孢菌的平板菌种由平板挖块接种，于28℃在旋转摇床旋转培养48h，得到种子液。
8.根据权利要求7所述的来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述种子培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为：土豆提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂20g/L；
所述将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述helminthosporol型倍半萜类化合物，包括以下步骤：
将上述得到的固体发酵物经乙酸乙酯提取三遍，提取液过滤去除固体发酵物，收集上清液，将上清液浓缩蒸干，称重，通过硅胶色谱分离，用正己烷：乙酸乙酯：甲醇按如下比例3:1:0、1:1:0、0:1:0、0:0:1，对乙酸乙酯提取物进行梯度洗脱，共得到六个组份E1-E6，组分E1和E6用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，用50％二氯甲烷和甲醇溶液等梯度洗脱，E1得到4个子组分E1A-E1D，E6得到2个子部分E6A-E6B，亚组分E1C用ODS-MPLC进行分离，用60％-100％甲醇水溶液梯度洗脱100分钟，得到11个组分E1C1-E1C11，E1C7和E1C8组分分别用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，经甲醇溶液洗脱，E1C7得到6个亚组分E1C7A-E1C7F，E1C8得到4个亚组分E1C8A-E1C8D，亚组分E6B用ODS-MPLC进行分离，用5％-50％、50％-80％、80％-100％甲醇水溶液分别梯度洗脱100分钟、50分钟、20分钟，得到亚组分E6B1-E6B11，E6B7硅胶色谱进行CH2Cl2-CH3OH梯度分离得到亚组分E6B7-1～E6B7-13；
采用反相高效液相色谱法通过Eclipse XDB-C8柱制备纯化E1C7D组分，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，50％乙腈水溶液；30min，50％乙腈水溶液；60min，70％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-4；
采用反相高效液相色谱法通过Eclipse XDB-C8柱制备纯化E6B7-2组分，流速为3.0mL/min，梯度洗脱：0min，20％乙腈水溶液；30min，20％乙腈水溶液；42min，23％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-1；
采用反相高效液相色谱法通过Zorbax RX-C8柱制备纯化E6B7-10组分，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，25％乙腈水溶液；26min，34％乙腈水溶液，得到化合物BS11134-2；
用反相高效液相色谱法通过Zorbax RX-C8柱制备纯化E6B7-8组分，用梯度洗脱以3.0mL/min的流速洗脱：0min，20％乙腈水溶液；24min，36％乙腈水溶液，获得化合物BS11134-3；
E3组分用Sephadex LH-20凝胶树脂分离，经二氯甲烷与甲醇1:1混合溶剂洗脱，分离得到33个部分，亚组分E3-24通过反相高效液相色谱法制备纯化，使用Zorbax RX-C8柱，以3.0mL/min的流速梯度洗脱：0min，35％乙腈水溶液；50min，45％乙腈水溶液，获得化合物BS11134-5和化合物BS11134-6。
9.一种权利要求5所述的来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物在制备抗老年痴呆药物中的应用。
10.一种药物组合物，包括权利要求5所述的来源于植物病原真菌的helminthosporol型倍半萜类化合物、其顺反异构体、溶剂化物或其药用盐以及药学上可接受的载体。
11.一种权利要求10所述的药物组合物在制备抗老年痴呆药物中的应用。
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