CN103918874A - 一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：将原料和水以1∶2的质量比混合均匀后，再接种混菌液，混菌液和原料按1∶4（v/w）的比例接种，用灭菌玻璃棒搅拌均匀，在35℃条件下发酵4天。经过发酵处理，将原料中的低营养价值的蛋白转化为高营养价值的微生物源单细胞蛋白，此外通过微生物发酵可以分解原料中部分有害物质，降低其毒性，因此通过混菌发酵，可望提高木薯渣营养价值，变废为宝，有效开拓非常规饲料资源。
Description
技术领域
本发明涉及混菌发酵技术领域，具体涉及一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法。
背景技术
木薯渣是木薯提取淀粉或发酵酒精后的废料，经常被用来作为一种廉价的粗饲料，但木薯渣含水量较高，容易滋生微生物，不易保存，变质后含有较高的氢氰酸，容易引起动物中毒或者发病。新鲜木薯渣直接喂饲动物，其适口性差，同时其过高的粗纤维会降低动物肠胃内食物的消化，影响代谢。由于木薯渣自身的特性导致其利用率低下，于是木薯渣被大量的直接丢弃于环境中，这对环境也造成了极大的污染。我国是饲料原料资源贫乏的国家，通过微生物发酵技术提高木薯渣营养价值，对于开拓非常规饲料资源，缓解我国饲料原料短缺现状具有重要价值。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，经过发酵处理，有效降低了木薯渣粗纤维含量，提高了发酵产物粗蛋白含量，同时发酵后产物还伴随产生一些有益于提高动物饲料营养物质消化吸收的酶活性（如纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等），经过发酵后将原料中的低营养价值的蛋白转化为高营养价值的微生物源单细胞蛋白，此外通过微生物发酵可以分解原料中部分有害物质，降低其毒性，因此通过混菌发酵，可望提高木薯渣营养价值，变废为宝，有效开拓非常规饲料资源。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，该方法包括以下步骤：
1木薯渣混菌发酵菌种的选择。
本研究用到的菌种共13株。按菌种类别可分为曲霉类（黑曲霉、米曲霉）、木霉类（绿色木霉、里氏木霉）、芽孢杆菌类（枯草芽孢杆菌）和酵母类（产朊假丝酵母、面包酵母、酿酒酵母）四大类。
曲霉类和里氏木霉用PDA培养基30℃培养至菌丝铺满斜面，绿色木霉用察氏培养基30℃培养5-7天，用适量无菌水将孢子冲洗，4层擦镜纸过滤，用血球计数板计算孢子悬液的浓度，稀释至1×107 CFu/ml；酵母菌类用PDA液体培养基30℃、150 r/min摇瓶培养至浓度约为1×107 CFu/ml；芽孢杆菌类用LB液体培养基30℃、250 r/min摇瓶培养至浓度约为1×107 CFu/ml。
1.1 发酵菌株的筛选
木薯渣和菜籽粕按9∶1（w/w）的比例混合配成发酵原料，称取20 g于250 mL三角瓶中，料水比1∶1.75，121℃高压灭菌20 min。然后分别接种2mL（约2×107 CFu）以上8种供试菌种，每组3个重复，30℃发酵4天。发酵结束后，霉菌类发酵组取部分鲜样用来测定羧甲基纤维素酶（CMCase），剩余样品65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量。枯草芽孢杆菌和酵母类发酵组所有样品65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量，结果见表1。
表1 不同微生物对木薯渣营养价值的影响
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。表2-表9，表13同。
从表1可以看出，木霉类，绿色木霉的纤维素酶活、粗蛋白含量、还原糖含量均显著高于里氏木霉；曲霉类，黑曲霉产纤维素酶的能力、粗蛋白含量及还原糖含量都显著高于米曲霉；枯草芽孢杆菌粗蛋白含量及还原糖含量高；酵母类，酿酒酵母粗蛋白含量略高于产朊假丝酵母及面包酵母。因此，最终选择混菌发酵的四株菌为：绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母，编号分别为A、B、C、D。
1.2发酵菌种的组合试验
对筛选的A、B、C、D四株菌进行相应的组合，其中主要是按功能把降解纤维类的A和B与产蛋白类的C和D进行组合。菌液间按1∶1的比例添加，总菌液量为20%（v/w）。发酵结束后取部分鲜样用来测定CMCase活性，剩余部分65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量。具体结果见表2。
表2 多菌组合对木薯渣营养价值的影响
由表2可知，三菌组合BCD，即黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母三菌组合发酵效果最好。CMCase活性为5.44U，粗蛋白含量为9.52%，还原糖含量为10.60%，均高于其它发酵菌种组合。因此，确定混菌发酵的菌种组合为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母。
1.3混菌发酵菌种比例的选择试验
微生物间存在共生与对立的关系，某种微生物接种量过大，生长迅速，可能会抑制其它微生物的生长。因此，在最佳发酵菌种组合的基础上，把黑曲霉∶枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母的添加比例设置为：1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶3、2∶1∶2、2∶2∶3、2∶3∶1、3∶1∶3、3∶2∶1、3∶3∶2等9个实验组，每组3个重复。菌液总添加量为20%，料水比1∶1.75，30℃发酵4天。发酵结束后取部分鲜样用来测定CMCase活性，剩余部分65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量。测定结果见表3。
表3 黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母混菌不同接种比例对木薯渣营养价值的影响
由表3可知，当黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母间的比例为3∶2∶1时，CMCase活性、粗蛋白含量均最高，分别为6.77U，9.58%。因此，混菌发酵黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母接种比例为3∶2∶1。
1.4混菌发酵总菌液接种量的优化试验
设置5个处理组，每个处理组分别按最佳接种比例接种10%、15%、20%、25%、30%的菌液，每个处理3个重复，料水比1∶1.75，30℃发酵4天。发酵结束后取部分鲜样用来测定CMCase活性，剩余部分65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量。测定结果见表4。
表4 混菌添加量对木薯渣营养价值的影响
由表4可知，当接种量为25%时，CMCase活、粗蛋白、还原糖含量达到最高，分别为4.34U、8.91%、8.93%。因此，混菌发酵接种量选为25%。
2 单因素试验优化发酵条件
对发酵时间、菜籽粕添加量、发酵温度、料水比、pH等5个因素依次进行单因素实验优化，根据发酵后木薯渣中的CMCase活性、粗蛋白质、还原糖含量，筛选出最佳的发酵条件。上一轮筛选的最佳因素，作为下一轮因素筛选时的发酵条件。每一次发酵结束后，取部分鲜样测定CMCase活性，剩余样品65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量。
2.1 发酵时间的优化
设置9个发酵时间点，分别为36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h，每个处理3个重复。接种量为1.4筛选的接种量，其余发酵条件1.4，测定结果见表5。
表5 发酵时间对木薯渣营养价值的影响
由表5可知，发酵96h时CMCase活性最高，为5.27U；粗蛋白含量随着发酵时间的延长而逐渐升高，120h时含量最高，为9.35%，随后又逐渐降低；还原糖含量随着发酵时间的延长不断变化，但都不显著。因此，混菌发酵的时间选择在4-5教好，本试验后续单因素条件优化均选4天。
2.2 菜籽粕添加量的优化
设置5个不同比例的菜籽粕添加量（w/w）分别为0%、5%、10%、15%、20%，每个处理3个重复，其余发酵条件同2.1，测定结果见表6。
表6 菜籽粕添加量对木薯渣营养价值的影响
由表6可知，当菜籽粕添加量为20%时，CMCase活性最高达到8.59U；还原糖的则随着菜籽粕添加量的增加而逐渐降低；与对照组相比，添加20%菜籽粕组蛋白质提高37.02%，仅次于添加15%菜籽粕组的41.93%高。因此，混菌发酵时菜籽粕添加量选择20%。
2.3 发酵温度的优化
设置24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、39℃等6个不同的发酵温度，每个处理3个重复，其余发酵条件同2.2，测定结果见表7。
表7 温度对木薯渣营养价值的影响
由表7可知，当温度为36℃时，CMCase活性最高，为8.61U；同时在36℃时，粗蛋白质含量也最高，达到16.08%，显著高于其它组；还原糖含量总体变化趋势是随着温度的升高而降低。因此，发酵温度选为36℃。
2.4 料水比的优化
调节起始料水比分别为1∶0.75、1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶1.75、1∶2，每个处理3个重复，其余发酵条件同2.3，测定结果见表8。
表8 料水比对木薯渣营养价值的影响
从表8中可以看出，当料水比为1∶2时，CMCase活性最高，为9.58U；料水比为1∶1.75时，蛋白含量最高，为16.10%；还原糖含量随着水分的增加迅速降低。综合考虑，料水比选择为1∶1.75。
2.5 初始pH的优化
调节发酵原料初始pH值分别为3、4、5、6、7、8，每个处理3个重复，其余发酵条件同2.4，测定结果见表9。
表9 初始PH对木薯渣营养价值的影响
由表9可知，pH 4时，CMCase活性最高，达到8.15U，显著高于其它组；pH 6时，粗蛋白含量达到最高，为16.04%；pH 7时，还原糖含量显著高于其它组，pH 3、4、5、6、8组差异不显著。因此，综合考虑木薯渣初始pH控制在4-6。
3 正交试验优化发酵条件
在单因素试验的基础上，选择发酵时间、发酵温度、料水比、初始pH四个因素进行4因素3水平的正交设计，进一步优化发酵条件，每组3个重复。正交试验因素水平表见表10。发酵结束后，取部分鲜样测CMCase活性，剩余部分65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质含量。正交实验分析结果见表11，12。
表10 正交试验因素水平表
表11 混菌发酵正交试验极差分析表
表12 混菌发酵正交试验方差分析表
由极差分析（表11）CMCase的R值可知，影响实验结果因素的先后顺序为：A>D>B>C，即影响木薯渣发酵产纤维素酶的因素依次为发酵时间、初始pH、发酵温度、料水比。由CMCase的K值可得最佳组合为A3B2C3D1，即发酵时间4天，发酵温度35℃，料水比1∶2，初始pH 4。由粗蛋白质R值可知，影响实验结果因素的先后顺序为：B>A>D>C，即影响木薯渣粗蛋白质含量的因素依次为发酵温度、发酵时间、初始pH、料水比。由粗蛋白质K值可得最佳发酵组合A3B2C3D3，即发酵时间4天，发酵温度35℃，料水比1∶2，初始pH 6。
由方差分析的F值可以看出，影响CMCase活性的因素依次为：发酵时间、初始pH、发酵温度、料水比。影响粗蛋白含量的因素依次为发酵温度、发酵时间、初始pH、料水比，且四个因素对木薯渣混菌发酵的影响都显著。
结合单因素试验得到木薯渣混菌发酵的最佳条件：黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母接种比例为3∶2∶1，接种量为25%，菜籽粕添加量20%，料水比为1∶2，发酵时间4天，发酵温度35℃，初始pH 4。
4 确定最优发酵条件
结合单因素实验设计及正交试验设计确定黑曲霉固态发酵木薯渣的最优条件，以此最优条件混菌发酵木薯渣，设置一个对照组（不接种菌液），其他条件与实验组一致，每组设3个重复。发酵结束后，取部分湿样测定纤维素酶活：滤纸酶活（FPA）、CMCase活性、β-葡萄糖苷酶活性，剩余部分65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定干物质、粗灰分、粗纤维、粗脂肪、粗蛋白、还原糖含量，测定结果见表13。
表13 混菌发酵前后木薯渣营养成分的变化
由表13可知，以最优条件发酵后，CMCase酶活，FPA酶活，β-葡萄糖苷酶分别达到12.31U，3.92U，3.95U。与对照组相比，在干物质基础上，粗灰分由6.13%提高到8.62%，粗蛋白质由10.77%提高到17.92%，粗脂肪由8.17%提高到12.60%，还原糖由1.14%提高到2.20%，粗纤维由21.50%降低到16.54%。
综上所述，本发明利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法包括以下步骤：将原料和水以1∶2的质量比混合均匀后，再接种混菌液，混菌液和原料按1∶4（v/w）的比例接种，用灭菌玻璃棒搅拌均匀，在35℃条件下发酵4天。
进一步的，所述原料由木薯渣和菜籽粕按4∶1的质量比组成。
最优的，所述混菌液由黑曲霉种子液∶枯草芽孢杆菌种子液∶酿酒酵母种子液按3∶2∶1的体积比组成。
所述发酵初始pH值为4。
所述黑曲霉种子液由以下制备方法制得：将黑曲霉用PDA培养基30℃培养至菌丝铺满斜面，用无菌水将孢子冲洗，4层擦镜纸过滤，采用血球计数板计算孢子悬液的浓度，稀释至l×107 CFu/ml，得黑曲霉种子液备用。
所述酿酒酵母种子液由以下制备方法制得：将酿酒酵母用YPD液体培养基30℃、150 r/min摇瓶培养至浓度约为l×107 CFu/ml，得酿酒酵母种子液备用。
所述枯草芽孢杆菌种子液由以下制备方法制得：将枯草芽孢杆菌用LB液体培养基30℃、250 r/min摇瓶培养至浓度约为l×107 CFu/ml，得枯草芽孢杆菌种子液备用。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
制备黑曲霉种子液：将黑曲霉用PDA培养基30℃培养至菌丝铺满斜面，用无菌水冲洗孢子，4层擦镜纸过滤，采用血球计数板计算孢子悬液的浓度，稀释至l×107 CFu/ml，得黑曲霉种子液备用。
制备枯草芽孢杆菌种子液：将酿酒酵母用YPD液体培养基30℃、150 r/min摇瓶培养至浓度约为l×107 CFu/ml，得酿酒酵母种子液备用。
制备酿酒酵母种子液：将枯草芽孢杆菌用LB液体培养基30℃、250 r/min摇瓶培养至浓度约为l×107 CFu/ml，得枯草芽孢杆菌种子液备用。
利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法如下：
取24 g木薯渣及6 g菜籽粕混合均匀，添加60 mL的水，灭菌冷却后接种3.75 mL黑曲霉种子液，2.5 mL枯草芽孢杆菌种子液及1.25 mL酿酒酵母种子液，用灭菌玻璃棒搅拌均匀，在35℃条件下发酵4天，使其发酵初始pH值为4。最终，得到木薯渣发酵产物粗蛋白含量由10.77%提高到17.92%，粗纤维含量由21.50%降低到16.54%，CMCase酶活，FPA酶活，β-葡萄糖苷酶分别达到12.31U，3.92U，3.95U。
Claims (8)
1.一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：将原料和水以1∶2的质量比混合均匀后，再接种混菌液，混菌液和原料按1∶4（v/w）的比例接种，用灭菌玻璃棒搅拌均匀，在35℃条件下发酵4天。
2.根据权利要求1所述的利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：所述原料由木薯渣和菜籽粕按4∶1的质量比组成。
3.根据权利要求1所述的利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：所述混菌液由黑曲霉种子液∶枯草芽孢杆菌种子液∶酿酒酵母种子液按3∶2∶1的体积比组成。
4.根据权利要求1所述的利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：所述发酵的初始pH值为4。
5.根据权利要求3所述的利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：所述黑曲霉种子液由以下制备方法制得：
将黑曲霉用PDA培养基30℃培养至菌丝铺满斜面，用无菌水冲洗孢子，4层擦镜纸过滤，采用血球计数板计算孢子悬液的浓度，稀释至1×107 CFu/ml，得黑曲霉种子液备用。
6.根据权利要求3所述的利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌种子液由以下制备方法制得：
将枯草芽孢杆菌用LB液体培养基30℃、250 r/min摇瓶培养至浓度约为1×107 CFu/ml，得枯草芽孢杆菌种子液备用。
7.根据权利要求3所述的利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法，其特征在于：所述酿酒酵母种子液由以下制备方法制得：
将酿酒酵母用PDA液体培养基30℃、150 r/min摇瓶培养至浓度约为1×107 CFu/ml，得酿酒酵母种子液备用。
8.如权利要求1-4任意一项所述的方法所制得的木薯渣发酵物。
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