CN107125432A - 一种玉屏风药渣发酵的工艺方法 - Google Patents

一种玉屏风药渣发酵的工艺方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵。本发明利用固态发酵技术，采用黑曲霉发酵玉屏风口服液药渣实现降解粗纤维的目的，对药渣进行生物转化，技术简单，节约能源，保护环境。

Description

一种玉屏风药渣发酵的工艺方法
技术领域
本发明涉及药渣发酵技术领域，特别是涉及一种玉屏风药渣发酵的工艺方法。
背景技术
随着中医药事业的不断发展，中药制剂的需求量也越来越大，中药渣的排放量也随之增加。调查统计显示，目前我国约有1500家中医药企业，中药渣每年排放量已达1200万吨。中药渣主要来源于中药加工与炮制，中成药以及其他中药相关产品的加工过程，其中中成药所产生的药渣最多，约占药渣总量的70％。在过去的中药产业发展过程中剩余药渣大多数通过堆放，填埋焚烧等方式进行废弃处理，然而中药渣一般含水量较高，极易腐败，对周围的环境(尤其是水质或土壤)会造成严重污染，同时企业也会投入一定资金作为排污处理费，因此药渣排放和处理问题成为目前困扰广大中药制药企业的难题之一。
为了避免中药渣直接废弃造成的环境污染问题，同时有效利用中药渣资源，目前对中药渣直接利用主要有以下几种方式：(1)中药渣作为有机肥料用于果蔬种植；(2)利用一些中药渣的吸附能力进行污水处理和净化；(3)中药渣制成动物饲料应用于养殖中。其中将中药渣直接作为饲料添加剂使用也是目前较为广泛的利用方式。
由于中药渣被提取后虽然存在一定的营养价值和药用成分，但是含量不是很高，却富含粗纤维，目前有研究者也提出直接将药渣作为饲料添加剂可能会不利于动物吸收其有效成分，从而造成过大的添加量来达到药效目的，这将导致饲料配比不当，药渣质量方面也无法得到控制。
中药提取后会剩余很多药渣，而药渣处理不当会造成环境污染。在中药渣成分分析利用研究中表明，中药渣尚存在部分活性物质及营养物质。玉屏风药渣是中成药玉屏风口服液、颗粒、胶囊等提取后剩余的药渣，玉屏风口服液是1990版药典收载的新剂型，由于疗效好因此年产量大，然而产生的药渣尚未被有效利用。药渣粗纤维含量高，直接使用会使植物细胞壁阻碍机体对活性成分的吸收和利用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种玉屏风药渣发酵的工艺方法。
本发明的技术方案为：
一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵。
优选的，所述的菌种为黑曲霉。
优选的，所述的发酵为固态发酵。
所述的玉屏风药渣发酵工艺方法，所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱28—32℃培养2-4d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱28—32℃，120—170r/min振荡培养20-26h，即可用于接种发酵。
优选的，所述的玉屏风药渣发酵工艺方法，所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵。
优选的，所述的固定培养基为马铃薯固体培养基；所述的无菌水为无菌超纯水。
优选的，将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×107个/mL，转接于100mL液体培养基中。
菌液接种到药渣中的时间60—85h，接种量8—18％，含水量30—50％。
优选的，菌液接种到药渣中的时间68—75h，接种量10—15％，含水量35—45％。
优选的，菌液接种到药渣中的时间72h，接种量12％，含水量40％。
本发明的有益效果为：
1、本发明利用固态发酵技术，采用黑曲霉发酵玉屏风口服液药渣实现降解粗纤维的目的，对药渣进行生物转化，技术简单，节约能源，保护环境。
2、本发明以纤维素酶活为指标，采用单因素和正交试验研究黑曲霉发酵玉屏风口服液药渣的最佳发酵条件，结果显示最佳发酵条件为时间72h，接种量12％，含水量40％，纤维素酶活为3.94IU/g。
3、本发明采用高效液相色谱分析水提和醇提方式提取于最佳发酵条件下发酵玉屏风药渣前后成分的变化。结果显示未发酵药渣水提物和醇提物几乎没有含量高的成分。发酵药渣水提物出现了比未发酵含量高的相似保留时间峰，差异倍数约为5倍，但整体峰高低于口服液。发酵醇提物水溶后出现了两个含量较高的峰，峰面积约为未发酵相似保留时间两处峰的20倍和50倍。
4、本发明初步评价发酵玉屏风药渣醇提物对小鼠的免疫效果，即对免疫抑制小鼠免疫器官指数恢复作用和对H9N2灭活流感病毒免疫小鼠血清抗体效价的提高作用。另一方面考察发酵玉屏风药渣醇提物对小鼠的促生长作用。结果显示发酵药渣醇提物与未发酵对免疫器官指数和抗体效价均无影响。发酵玉屏风药渣醇提物与未发酵和空白组相比可显著提高小鼠增重，且料肉比低于未发酵和空白组，差值在1～2之间；发酵药渣醇提物对小鼠脏器没有毒性作用。
5、本发明采用高效液相色谱考察发酵药渣醇提物两个特征性成分色谱方法学可靠性，成分可能来源因素以及不同批次发酵物的稳定性。色谱方法学考察结果显示成分1和成分2线性关系，重复性，稳定性均良好；由成分来源的可能因素(黑曲霉菌液，纤维素酶以及黑曲霉常用发酵基质麦麸发酵产物)指纹图谱得知，通过保留时间对比发现三个因素均没有这两个成分；对不同批次的发酵药渣醇提物进行两个成分比较，发现两个成分保留时间基本一致，但是含量有所差异。
结论：黑曲霉固态发酵玉屏风口服液药渣醇提物与未发酵相比出现了两个含量较高的成分；发酵药渣醇提物可提高小鼠增重，降低料肉比，初步说明发酵药渣醇提物对小鼠有一定的促生长的作用。
附图说明：
图1：玉屏风口服液药渣固体发酵工艺路线；
图2：葡萄糖标准曲线；
图3：时间对产纤维素酶活的影响；
图4：接种量对产纤维素酶活的影响；
图5：初始含水量对产纤维素酶活的影响；
图6：为正交试验酶活变化趋势图；
具体实施方式
以下实施例和实验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱28—32℃培养2-4d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱28—32℃，120—170r/min振荡培养20-26h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间60—85h，接种量8—18％，含水量30—50％。
实施例2
一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×107个/mL，转接于100mL液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间60—85h，接种量8—18％，含水量30—50％；
固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；
马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用。
实施例3
一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×107个/mL，转接于100mL液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间68—75h，接种量10—15％，含水量35—45％；
固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；
马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用。
实施例4
一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×107个/mL，转接于100mL液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间72h，接种量12％，含水量40％；
固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；
马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用。
实施例5
一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×107个/mL，转接于100mL液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间72h，接种量12％，含水量40％；
固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；
马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用。
实验例1玉屏风口服液药渣发酵单因素的研究
1菌种及材料
1.1菌种
黑曲霉(ATCC16404)购于上海复祥生物有限公司。
1.2材料
玉屏风口服液药渣(Yupingfeng Oral Liquid residues，YOLRs)：保定冀中药业有限公司提供。
1.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用。
马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用。
1.3化学试剂
1.4仪器设备
2试验方法
2.1菌种活化和培养
将黑曲霉标准菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的黑曲霉用适量无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×107个/mL，转接于100mL液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养24h，即可用于接种发酵。
2.2玉屏风口服液药渣固体发酵工艺路线，见图1
2.2.1时间对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响的研究
将菌液按照药渣发酵工艺的流程接种到10g药渣中，接种量为10％，含水量为50％，置于电热恒温振荡培养箱中30℃，150r/min分别在24h、48h、72h、96h、120h、144h条件下进行发酵，按照设定条件取药渣测定纤维素酶活，研究时间对药渣发酵产纤维素酶活的影响。
2.2.2接种量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响的研究
将菌液按照药渣发酵工艺的流程接种到10g药渣中，发酵时间为2.2.1筛选出的最佳时间，含水量为50％，分别在接种量6％、8％、10％、12％、14％、16％条件下进行发酵，按照设定条件取药渣测定纤维素酶活，研究接种量对药渣发酵产纤维素酶活的影响。
2.2.3含水量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响的研究
将菌液按照药渣发酵工艺的流程接种到10g药渣中，发酵时间为2.2.1筛选出的最佳时间，接种量为2.2.3.2筛选的最佳接种量，分别在含水量30％、40％、50％、60％、70％、80％条件下进行发酵，按照设定条件取药渣测定纤维素酶活，研究含水量对药渣发酵产纤维素酶活的影响。
2.2.4发酵玉屏风口服液药渣最佳发酵条件的确定
根据单因素试验的结果，选取时间、接种量和含水量三个因素作为试验因子，每个因素三个水平作正交发酵试验，通过产纤维素酶活来确定药渣接种发酵的最佳工艺参数。
2.2.5粗酶液的制取
按上述设置的试验条件发酵结束后，取1g发酵物，溶于10mL醋酸缓冲溶液，置于摇床中，50℃，150r/min，2h提取，6000r/min离心10min，取上清液作为粗酶液备用。
2.2.6纤维素酶活检测方法
2.2.6.1溶液配制
(1)pH5.0醋酸缓冲溶液配制：50g NaCH3COOH.3H2O溶于适量水，6moL CH3COOH34mL，定容至500mL。
(2)葡萄糖标准溶液(10mg/mL):称取105℃烘干至恒重无水葡萄糖约200mg，加柠檬酸盐缓冲溶液溶解，定容至20mL
(3)柠檬酸盐缓冲溶液配置：称取柠檬酸1.05g，加入氢氧化钠0.5g，再加80mL水溶解，用柠檬酸溶液(0.1mol/L)调节pH至5.5，再用水定容至100mL。
(4)柠檬酸溶液配置：称取柠檬酸(C6H8O7·H2O)2.1g，加水溶解定容至100mL。
(5)NaOH溶液(200g/L)配制：10g，50mL水溶解。
(6)DNS试剂配置：称3，5-二硝基水杨酸1.575g，加水250mL，搅拌溶解，水浴至45℃，然后逐步加入NaOH(200g/L)50mL，不断搅拌，直至完全溶解，在逐步加入酒石酸钠钾45.5g，苯酚1.25g，亚硫酸钠1.25g，搅拌至溶解，冷却至室温后，定容至500mL，过滤，取滤液储存于棕色瓶中，避光保存，室温下存放7d，可以使用，有效期为6个月。
(7)0.5％的羧甲基纤维素钠溶液：0.5g，100mL醋酸缓冲溶液定容。
2.2.6.2葡萄糖标准曲线的绘制
称取105℃烘干至恒重无水葡萄糖约100mg，加柠檬酸盐缓冲溶液溶解，定容至10mL，利用柠檬酸盐缓冲液再稀释至1mg/mL。取1mg/mL葡萄糖溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，分别加柠檬酸缓冲溶液定容至2mL。取配制的不同浓度的葡萄糖溶液各1mL于试管中，分别加2mL水，2mLDNS试剂，沸水浴5min。冷却至室温，用水定容至10mL，在540nm波长下比色测定OD值，绘制标准曲线，如图2。
2.2.6.3纤维素酶活性的测定
取粗酶液1mL，加0.5％的羧甲基纤维素钠溶液(pH＝5的醋酸缓冲液配置)3mL，于50℃水浴30min，冷却加2mL DNS，再沸水浴5min，冷却至室温，加水定容至25mL，在540nm波长下测OD值。
公式：
C＝根据吸光度从标准曲线查得的葡萄糖浓度(mg/mL)
25＝加入的l mL粗酶液到总溶液25mL为稀释25倍(mL)
10＝总的粗酶液量(mL)
5.56＝l mg葡萄糖的摩尔质量为5.56(umoL)
m＝发酵物质量(g)
30＝反应时间(min)
3统计分析
数据分析采用SPSS17.0软件进行，用方差齐性检验和单因素方差分析(One WayANOVA)进行多组间比较分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
4结果
4.1时间对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响
在温度为30℃条件下恒温发酵，接种量10％，含水量50％，时间范围从24h至144h，每隔24h设一检测点测定纤维素酶活，筛选出最佳发酵时间点。由图3可见，随发酵时间的增加，发酵后纤维素酶活先升高后降低，且发酵时间在72h时，药渣发酵后纤维素酶活最高。
4.2接种量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响
在温度为30℃条件下恒温发酵，时间72h，含水量50％，接种量在6％至16％范围内测定酶活，选取最佳接种量。由图4可知，随接种量的增加，发酵后纤维素酶活先升高后降低，且接种量在12％时，药渣发酵后纤维素酶活最高。
4.3含水量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响
在温度为30℃条件下恒温发酵，时间72h，接种量12％，含水量在30％至80％范围内测定酶活，选取最佳含水量。由图5可知，随含水量的增加，发酵后纤维素酶活先升高后降低，且含水量在50％时，药渣发酵后纤维素酶活最高。
4.4正交优选玉屏风口服液药渣的最佳发酵条件
为了得到药渣发酵后纤维素酶活最高的的发酵条件，以单因素试验为基础，选取每个因素下纤维素酶活高的三个水平作为正交试验条件组合，研究各因素及其水平组合对纤维素酶活的影响。按照药渣发酵条件，以表1对应的因素水平进行发酵，表2正交结果表明，确定药渣发酵后纤维素酶活最优发酵条件为A2B3C1，即时间72h，接种量12％，含水量40％，此条件下酶活最高。经极差分析，RA＝1.22>RB＝0.74>RC＝0.35，影响因素大小顺序为C(发酵时间)>B(接菌量)>A(含水量)。且由最佳发酵条件处理的纤维素酶活为3.94IU/g。图6为正交试验酶活变化趋势图。
表1正交因素水平表
表2正交试验直观分析表
采用正交试验目的在于以较少的试验，找到试验因素的最佳水平，以得到试验所需量的目标产物。本试验为了得到药渣发酵后纤维素酶活最高的的发酵条件，以单因素试验为基础，选取每个因素下纤维素酶活高的三个水平作为正交试验条件组合，研究各因素及其水平组合对纤维素酶活的影响。确定药渣发酵后纤维素酶活最优发酵条件为A2B3C1，即时间72h，接种量12％，含水量40％，此条件下酶活最高，为3.94IU/g。经极差分析，影响因素大小顺序为C(发酵时间)>B(接菌量)>A(含水量)。
不同发酵时间、接种量、含水量影响黑曲霉作用药渣产纤维素酶活的高低，通过筛选最佳发酵条件，使黑曲霉作用药渣降解细胞壁纤维素能力达到最佳，从而有助于药渣成分的析出和改变。同时，优化发酵工艺也利于得到安全有效的产物，对发酵产物在质量方面的评价具有重要意义。

Claims (10)

1.一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，其特征在于：先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵。
2.如权利要求1所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：所述的菌种为黑曲霉。
3.如权利要求1所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：所述的发酵为固态发酵。
4.如权利要求1或2所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱28—32℃培养2-4d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱28—32℃，120—170r/min振荡培养20-26h，即可用于接种发酵。
5.如权利要求4所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵。
6.如权利要求4或5所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：所述的固定培养基为马铃薯固体培养基；所述的无菌水为无菌超纯水。
7.如权利要求4所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×107个/mL，转接于100mL液体培养基中。
8.如权利要求1所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：菌液接种到药渣中的时间60—85h，接种量8—18％，含水量30—50％。
9.如权利要求1所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：菌液接种到药渣中的时间68—75h，接种量10—15％，含水量35—45％。
10.如权利要求1所述的药渣发酵工艺方法，其特征在于：菌液接种到药渣中的时间72h，接种量12％，含水量40％。
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