CN105596397A - 一种发酵白术及其制备方法和用途 - Google Patents

一种发酵白术及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种发酵白术及其制备方法和用途，其特征在于采用黑曲霉发酵工艺制成。本发明还公开了制备方法，包含如下步骤：粉碎白术药材，高压灭菌，加入灭菌蒸馏水，将活化好的黑曲霉菌液按照在无菌条件下接入，振荡培养，然后烘干储存。可用于提高免疫力。

Description

一种发酵白术及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种发酵药材及其制备方法和用途，特别涉及一种发酵白术及其制备方法和用途。
背景技术
近年来，随着抗生素滥用给畜牧业带来的耐药性增强和药物残留等问题日渐加剧，开发研究新的饲料添加剂替代抗生素已成为畜牧业的重大课题。中药作为饲料添加剂具有无公害、无耐药性、低毒高效等特点，因此其作为功能饲料的主要添加剂逐渐引起了人们的重视，研究者也开展了广泛的应用研究。然而国内对中草药饲料添加剂的研究水平都非常低,大都停留在先粉碎再添加或以液体形式投入动物饮水中,这些方法的弊端就是用量大、效果不明显；与此同时中药成本攀升和资源匮乏等条件制约了中药饲料添加剂的使用和推广。发酵中药是将中药与优选的益生菌(乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉等)混合，利用发酵技术，对中药有效成分进行生物学转化，将中药的大分子物质经过微生物转化成为能够被肠道直接吸收的小分子成分。随着发酵中药技术的推广使用,在动物生产中使用发酵中药饲料添加剂也逐渐被认可。
白术为菊科植物白术的干燥根茎，是临床常用的重要中药之一，其性甘、苦、温，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效。白术的有效成分有挥发油、内酯类成分、苷类、多糖类成分以及氨基酸等。研究表明，白术具有利尿、抗肿瘤、抗菌、消炎、抗糖尿病、抗衰老等作用，对神经系统、消化道、子宫平滑肌也有一定的作用，还具有调节免疫功能。
黑曲霉为丝孢纲丝孢目丛梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种，能够合成和分泌多种酶类，如水解酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶，纤维素酶和丹宁酸酶，而其中的果胶酶、纤维素酶类都可用来降解植物细胞壁，从而利于植物细胞中有效成分的析出。
中药材的发酵炮制方法尚在探索阶段，鲜有报道。
发明内容
本发明涉及一种发酵药材及其制备方法和用途，特别涉及一种发酵白术及其制备方法和用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的一种发酵白术，其特征在于采用黑曲霉发酵工艺制成。
一种发酵白术的制备方法，包含如下步骤：粉碎白术药材，高压灭菌，加入灭菌蒸馏水，将黑曲霉菌液在无菌条件下接入，培养，然后烘干即得。
一种发酵白术的制备方法，可以包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌，加入灭菌蒸馏水，将活化好的黑曲霉菌液按照5％-10％(V/m)，的接种量在无菌条件下接入，振荡培养48～120h，然后50℃烘干即得
一种发酵白术的制备方法，还可以包含如下步骤：粉碎白术药材各，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到20～60％，将活化好的黑曲霉菌液按照5％-10％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养48～120h，然后于50℃烘干即得
优选的，一种发酵白术的制备方法，包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到40％，将活化好的黑曲霉菌液按照8％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养96h，然后于50℃烘干即得。
优选的，一种发酵白术的制备方法，包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到50％，将活化好的黑曲霉菌液按照9％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养108h，然后于50℃烘干即得
优选的，一种发酵白术的制备方法，包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到60％，将活化好的黑曲霉菌液按照10％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养120h，然后于50℃烘干即得。
所述的发酵白术可以应用在制备具有提高免疫力作用的药物中。
所述的发酵白术也可以应用在制备具有提高免疫力作用的饲料中。
本发明的有益效果为：
白术在该条件发酵后，白术内酯I含量是未发酵白术的1.4倍。
实验证明：白术经发酵后可提高免疫抑制小鼠的免疫功能。
附图说明
图1为黑曲霉发酵白术与未发酵白术的HPLC色谱图之A：白术内酯I标准品HPLC色谱图；
图2为黑曲霉发酵白术与未发酵白术的HPLC色谱图之B：白术HPLC色谱图；
图3为黑曲霉发酵白术与未发酵白术的HPLC色谱图之C：发酵白术HPLC色谱图；
图4为对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响(D:胸腺指数)
*P<0.05；**p<0.01vs对照组，#P<0.05vs模型组
图5为对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响(E:脾脏指数)
*P<0.05；**p<0.01vs对照组，#P<0.05vs模型组
图6为对各组小鼠T淋巴细胞增殖能力的影响(F:OD值)
*P<0.05；**p<0.01vs对照组，#P<0.05vs模型组
具体实施方式
以下实验例和实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验例1：发酵条件的正交设计
以白术主要有效成分白术内酯Ⅰ的含量为指标，选取时间、含水量和接菌量3个条件进行三因素三水平的正交实验，以此来优化发酵条件。称取60℃条件下烘干的白术药材粉末1g(粉碎后过40目筛)，分别放入50mL的三角锥形瓶中，121℃高压灭菌20min。采用L9(33)正交设计表，按表1所示的条件下，接入活化好的黑曲霉菌进行发酵。同时，设置一个未发酵白术的处理作为比较。
表1因素水平表
1.HPLC测定白术中白术内酯I含量
选择Waterse2695色谱柱250×4.6mm，5μm；流动相水(A)-乙腈(B)梯度洗(0-16min，60％-76％A)，流速1.0mL·min-1；柱温25℃；检测波长250nm；进样量20μL。釆用外标法定量。在此条件下所得对照品和供试品溶液的色谱图相(见图1-3)。
1.1对照品溶液制备
精密称取白术内酯I1mg，加甲醇制成含白术内酯I0.05mg/mL的对照品溶液。
1.2供试品溶液制备
精密称量黑曲霉发酵样品1g，置于磨口锥形瓶中，加甲醇5mL，超声提取45min，离心(3000r·min-1)10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液，备用。未发酵的样品同法制备。
1.3方法学考察
1.3.1线性关系考察
精确吸取对照品溶液5μL，10μL，20μL，30μL，40μL分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进样，测定峰面积，以白术内酯I为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，得线性回归方程。
1.3.2精密度考察对同一对照品白术内酯I溶液，浓度为0.05mg/mL，连续6次进样，以峰面积计算白术内酯I的精密度，计算RSD。
1.3.3稳定性试验同一样品溶液，分别在0h、3h、6h、9h、12h进样，计算RSD。
1.3.4重现性试验取同一白术样品粉末，精密称取5份约0.5g，按照“供试品溶液制备”项下的规定操作，计算RSD。
1.3.5加样回收率试验精密称取已知含量的白术粉末0.5g，共6份，按“供试品溶液的制备”项下进行处理，每份各取1.1mL分别加入浓度为0.5mg/mL的标准品白术内酯I10μL，计算回收率。
2、结果与分析
2.1HPLC测定白术中白术内酯I含量
2.1.1方法学考察结果
2.1.1.1线性关系考察结果按1.6.3.1中所描述的方法，得线性回归方程为：y＝2421038x-20208，r＝0.9999。结果表明白术内酯I线性范围在0.25～2μg。
2.1.1.2精密度考察结果按1.6.3.2中所描述的方法，以峰面积计算白术内酯I的精密度，得RSD为0.11％，结果表明精密度良好。
2.1.1.3稳定性试验结果按1.6.3.3中所描述的方法，得RSD为1.02％，结果表明样品在12h内稳定。
2.1.1.4重现性试验按1.6.3.4中所描述的方法，得RSD为2.5％，表明重现性良好。
2.1.1.5加样回收率试验按1.6.3.5中所描述的方法，得白术内酯I平均回收率为99.46％，RSD为0.56％。
表2白术内酯I加样回收率测定结果
2.2正交试验优选发酵白术工艺结果与分析
为了获得黑曲霉发酵白术的最佳发酵工艺，采用正交试验法研究各因素及其水平组合对其白术内酯I含量的影响。按照白术发酵工艺，以表3对应的因素水平进行发酵，并利用HPLC测定白术内酯I含量。由表3正交结果表明，以白术内酯1含量为评价指标，最终确定白术发酵条件为A2B1C2，,即最佳发酵工艺为：接种量8％，含水量40％，时间96h，白术内酯1含量最高。经极差分析RB＝0.07>RC＝0.027>RA＝0.025，影响因素大小顺序为B>C>A。同时测得的未经发酵处理的白术其白术内酯I含量为0.122mg/g，由最佳发酵条件处理的发酵白术其白术内酯I含量为0.172mg/g，可见白术在该条件发酵后，白术内酯I含量是未发酵白术的1.4倍。
表3正交试验结果
实验例2：发酵白术对小鼠免疫功能的影响
1.材料与方法
1.1试验动物
昆明小鼠，雌性，18-22g，购于北京市兴隆动物养殖场。
1.2主要仪器和器材
精密电子天平(德国哥根廷赛多利斯，型号：BS124S)，高压灭菌锅(中国淄博新华公司，2540型)，超净工作台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司，型号：DL-CF-IND)，全温振荡培养箱(上海上登实验设备有限公司，型号：HZQ160)，CO2培养箱(SNAYO，型号：MC0217AC)，高压液相色谱仪(美国瓦里安公司，型号：Waterse2695)，KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，恒温干燥箱(上海一恒科技有限公司，型号：DK-8D)。
1.3主要试剂
白术内酯I购于中国食品药品检定研究院(纯度≥99.99％，批号：111975-201501)，白术药材购于北京同仁堂。甲醇、乙腈为色谱纯，购于上海赛默飞世尔科技有限公司，其余试剂均为分析纯。黑曲霉(ATCC16404)购于上海复祥生物有限公司。MTT,购于Sigma公司。ConA购于stantacruz。发酵白术采用实施例1制备而得。
1.4动物分组处理与给药
18-22g昆明小鼠随机分成6组，每组10只动物，分别为生理盐水对照组、环磷酰胺(50mg/kg)组、白术对照(1g/kg)组、发酵白术小剂量组(0.5g/kg)、中剂量组(1g/kg)和高剂量组(2g/kg)。每组灌胃不同种类和剂量的受试物，以蒸馏水溶解，每只0.4mL，对照组灌服等量生理盐水。中药连续灌服1周，随后环磷酰胺组腹腔注射给药连续3d造模。造模结束后，各组颈椎脱臼处死小鼠，无菌取胸腺、脾测定。
1.5脏器/体重比值测定实验结束后,称质量、胸腺重、脾重，取小鼠脾脏和胸腺称重，计算脏器指数(％)＝脏器重量(mg)/动物质量(g)×100％。
1.6小鼠脾细胞悬液的制备及脾T淋巴细胞增殖测定采用MTT法，小鼠分组与喂饲方法同上。无菌取脾,经过研磨200目细胞筛网过滤、经常规裂解红细胞，PBS洗涤，离心2次，制得单细胞悬液，最后用含10％小牛血清RPMI-1640调细胞浓度5×106个/mL，接种于96孔板(100μL/孔)，每孔细胞100μL，并于每孔加入10uLConA刺激(终浓度为5μg/mL)，置于5％CO2，37℃培养箱培养48h后,每孔加MTT10μL，继续培养4h后，每孔加入DMSO150μL，振荡5min,紫色结晶完全溶解后于酶标仪570nm测定A值。
1.7统计学分析
实验数据采用均数±标准差(x±s)表示，组间差异性比较采用单因素方差分析，所用分析软件为SPSS17.0，P＜0.05认为有显著性差异。
2.发酵白术对小鼠免疫功能的影响
2.1发酵白术对小鼠免疫器官指数的影响
免疫抑制剂可以降低免疫器官，如胸腺、脾脏等器官的质量，但免疫兴奋剂则可以通过增强免疫功能而使免疫器官质量得到增加，因此可以用这个原理观察药物对已知免疫抑制剂(本实验采用环磷酰胺)所导致免疫器官质量减少的对抗作用和免疫恢复能力。从图4,5中看出模型组小鼠脾脏指数、胸腺指数均显著低于对照组(P<0.05)，表明免疫抑制模型制备成功。其中，与模型组相比，中剂量发酵白术可以显著提高脾脏指数(P<0.05)，而未发酵白术、低、高剂量的发酵白术与模型组相比差异不显著(P>0.05)；发酵中药三个低、中、高剂量均可以显著提高胸腺指数(P<0.05)，而未发酵白术与其相比没有差异；此结果说明发酵白术可以提高免疫抑制小鼠免疫器官指数。
2.2发酵白术对小鼠T淋巴细胞增殖的影响
由图6可见，免疫抑制模型组小鼠T淋巴细胞增殖显著低于空白组(P<0.05)，表明免疫抑制模型制备成功。与模型组相比，中剂量的发酵白术和未发酵白术可明显提高T淋巴细胞增殖，且与空白组相比无差异。说明一定剂量下，白术可以恢复免疫抑制小鼠造成的免疫功能低下的影响。
实施例1
1、菌种培养与发酵
1.1培养基的制备将马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤，用蒸馏水补足蒸发部分水分，再加入葡萄糖20g。固体培养基再加琼脂15g，于121℃高压灭菌20min，分装冷却后即得。
1.2菌种的培养将黑曲霉标准菌种接种在马铃薯固体培养基上，于28℃培养3d，然后将活化后的黑曲霉用适量无菌蒸馏水溶解菌落，制成孢子悬液，取一定量转接于液体培养基中，于28℃，140r·min-1振荡培养48h，即可用于接种发酵。
2、发酵白术的制备：粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到40％，将活化好的黑曲霉菌液按照8％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养96h，然后于50℃烘干即得。
实施例2
1、菌种培养与发酵
1.1培养基的制备将马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤，用蒸馏水补足蒸发部分水分，再加入葡萄糖20g。固体培养基再加琼脂15g，于121℃高压灭菌20min，分装冷却后即得。
1.2菌种的培养将黑曲霉标准菌种接种在马铃薯固体培养基上，于28℃培养3d，然后将活化后的黑曲霉用适量无菌蒸馏水溶解菌落，制成孢子悬液，取一定量转接于液体培养基中，于28℃，140r·min-1振荡培养48h，即可用于接种发酵。
2、发酵白术的制备：粉碎白术药材各，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到50％，将活化好的黑曲霉菌液按照9％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养108h，然后于50℃烘干即得。
实施例3
1、菌种培养与发酵
1.1培养基的制备将马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤，用蒸馏水补足蒸发部分水分，再加入葡萄糖20g。固体培养基再加琼脂15g，于121℃高压灭菌20min，分装冷却后即得。
1.2菌种的培养将黑曲霉标准菌种接种在马铃薯固体培养基上，于28℃培养3d，然后将活化后的黑曲霉用适量无菌蒸馏水溶解菌落，制成孢子悬液，取一定量转接于液体培养基中，于28℃，140r·min-1振荡培养48h，即可用于接种发酵。
2、粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到60％，将活化好的黑曲霉菌液按照10％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养120h，然后于50℃烘干即得。

Claims (9)

1.一种发酵白术，其特征在于采用黑曲霉发酵工艺制成。
2.一种发酵白术的制备方法，其特征在于包含如下步骤：粉碎白术药材，高压灭菌，加入灭菌蒸馏水，将黑曲霉菌液在无菌条件下接入，培养，然后烘干即得。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌，加入灭菌蒸馏水，将活化好的黑曲霉菌液按照5％-10％(V/m)，的接种量在无菌条件下接入，振荡培养48～120h，然后50℃烘干即得。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于包含如下步骤：粉碎白术药材各，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到20～60％，将活化好的黑曲霉菌液按照5％-10％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养48～120h，然后于50℃烘干即得。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到40％，将活化好的黑曲霉菌液按照8％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养96h，然后于50℃烘干即得。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到50％，将活化好的黑曲霉菌液按照9％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养108h，然后于50℃烘干即得。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于包含如下步骤：粉碎白术药材，121℃高压灭菌20～30min，加入灭菌蒸馏水，使含水量达到60％，将活化好的黑曲霉菌液按照10％(V/m)的接种量在无菌条件下接入，于28℃，140r·min-1振荡培养120h，然后于50℃烘干即得。
8.如权利要求1至7任一所述的发酵白术在制备具有提高免疫力作用的药物中的应用。
9.如权利要求1至7任一所述的发酵白术在制备具有提高免疫力作用的饲料中的应用。
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