CN103255062A - 黑曲霉菌xl-1、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黑曲霉菌菌株XL-1及其菌剂制备方法，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.6316。所述微生物菌剂利用黑曲霉菌XL-1菌株液体和固体发酵产物。本发明从筛选多种与秸秆降解有关的菌株出发，通过分子生物学手段获得高效降解菌株，并对降解菌株发酵秸秆产酶的条件进行优化。进一步通过菌种联合降解秸秆作用的研究，与市售菌株降解菌株相比，获得效果更强的降解菌株，在温室表现很好的降解效果，且高效无毒、使用简单、不造成环境污染。

Description

黑曲霉菌XL-1、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用

技术领域

本发明涉及一种降解秸秆的微生物，具体涉及一种黑曲霉菌XL-1、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用。 

背景技术

近年来秸秆还田越来越受到重视，一方面大规模的农业生产使秸秆需要就近处理，以节约劳力；另一方面，长期单纯施用化肥不利于土壤肥力的发育。农作物秸秆中含有丰富的氮﹑磷﹑钾等有机养分，秸秆还田后将增加土壤有机质的含量，改善土壤结构﹑培肥地力，有大量研究表明秸秆还田后对土壤养分及有机质含量都有提高。但在自然条件下，秸秆腐解速度慢，如果大量还田则秸秆不能充分的腐解，会影响播种质量﹑出苗和苗期生长。秸秆覆盖后还会为病虫害提供越冬的场所对下茬作物产生影响。随着机械化的发展，秸秆还田已成为先进农业生产的重要部分，由于秸秆自然腐解速度过慢，秸秆还田带来了一系列的问题，深入研究秸秆降解，将从根本上解决土壤病害，秸秆焚烧，农产品污染等问题。秸秆快速降解是一种实现资源循环利用技术，在农业的可持续发展中有开发利用的潜力。微生物秸秆催腐剂是秸秆快速降解技术研究较多的方向，秸秆催腐剂主要是由强烈分泌秸秆降解酶的菌株组成。在微生物秸秆催腐剂的综合作用下使纤维素分子彻底解体，有机物矿质化分解后，继而腐质化形成有机质。随着不断的研究发展，人们所复配的降解菌株不仅能够促进秸秆的快速降解，同时还向抑制病虫害的方向发展。 

黑曲霉菌（Aspergillus niger），是一种常见的真菌，属于半知菌类曲霉属，黑曲霉对营养要求较低，只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好 。黑曲霉可以产生许多种酶，现已成为工业应用常见的菌种之一。主要商品酶制剂中如a-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、半乳糖苷糖、 葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、蛋白酶、单宁酶等都来源于黑曲霉。因此已成为酶制剂工业生产中重要的真菌。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用，例如，柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之，黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点，已愈来愈受到人们的重视，具有广阔的应用前景。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有更好的降解秸秆作用且安全性好、生产成本低的黑曲霉菌XL-1，及以其制备的微生物制剂，并给出了具体的制备和应用方法。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 

分离出了一种黑曲霉菌XL-1，其保藏编号为CGMCC NO.6316。

制备出一种微生物制剂，所含活性成分为上述黑曲霉菌XL-1或/和代谢产物。 

所述黑曲霉菌XL-1在降解秸秆中的应用，可以分为液态 和固态两种剂型，分别为： 

（1）液态菌剂制备方法：将保存的黑曲霉菌XL-1移入PDA培养基平板上，26℃光暗交替培养4 d，无菌条件下刮取分生孢子，用无菌水配置1×10⁷的分生孢子悬浮液，按1 ml孢子悬浮液/100 ml PDB培养基进行接种，置于26℃，150 rpm条件下振荡培养3 d，电动搅拌器以2000 rpm转速搅拌2 min，与1.9 L磷酸缓冲液混合（内含0.1 %的助剂吐温100和0.2%的防腐剂苯甲酸），即得到液态生防菌剂。

（2）固态菌剂制备方法：将保存的黑曲霉菌XL-1移入PDA培养基平板上，26℃光暗交替培养4d，无菌条件下刮取分生孢子，用无菌水配置1×10⁷的分生孢子悬浮液，按2ml孢子悬浮液/100g基质培养基进行接种，26℃光暗交替培养8～10d后，混匀即得固态生防菌剂。 

所述的基质培养基，物质配成为：麦麸，玉米粉，稻糠，水，质量比为：2:1:2:5，即100g基质培养基中含有20g麦麸，10g玉米粉，20g稻糠及50g水，混匀后高压湿热灭菌备用。 

本发明具有积极有益的效果： 

分离出了黑曲霉菌XL-1，其保藏号为：CGMCC NO.6316，从筛选多种与秸秆降解有关的菌株出发，通过分子生物学手段获得的高效降解菌株，并对降解菌株发酵秸秆产酶的条件进行优化。进一步通过菌种联合降解秸秆作用的研究，与市售菌株降解菌株相比，获得效果更强的降解菌株，在温室表现很好的降解小麦秸秆的效果，在秸秆降解领域有着广阔的应用前景。

本发明所述黑曲霉菌XL-1，已于2012年7月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该还黑曲霉菌XL-1的保藏编号为CGMCC NO.6316。 

附图说明

图1为菌株XL-1的菌落特征图； 

图2为菌株XL-1的降解秸秆特征图；

图3为菌株XL-1 的分子进化树图。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。 

实施例1  黑曲霉菌XL-1的分离、筛选 

样品采集：样品采集自河南省农科院原阳基地多个田间正在腐烂的玉米和小麦秸秆（采集时间：2010年6-2010年10月；具体采集地点：河南省农科院原阳基地，采集人：谢茂芳），用保鲜袋带回。

黑曲霉菌的分离与纯化：取采回来的腐烂秸秆，秤取1g放入含有100mL无菌水的三角瓶中，在28℃恒温振荡器上充分振荡2h。以稀释涂布平板法将10^-1-10^-7的样液涂布于LB 平板中，37℃培养一天，依据菌落形态分别在LB平板上进行纯化。并将培养基倒置于37℃恒温培养过夜, 最后挑取形态、色泽、大小与黑曲霉菌类似的单菌落转接到LB平板培养基上，于37℃培养2d后，记录其编号，再挑选单菌落接种到LB斜面培养基上保存。 

表1 具有较大透明圈菌株 

菌株编号	培养基	1d(mm)	2d(mm)	3d(mm)	4d(mm)	5d(mm)	6d(mm)
								XL-1	果胶降解筛选培养基	-	-	31	35	40	48
XP3	纤维素降解筛选培养基	-	-	33	38	42	45
								XP5	半纤维素降解筛选培养基	-	-	15	20	28	32

经过土壤样品微生物分离，共分离出20株类似真菌菌株，经过反复筛选比较共得效果较好的真菌3株，分别命名为XL-1、XP3和XP5。该3株菌均可在其相应筛选培养基上旺盛生长,如表1所示，XL-1菌株在果胶降解筛选培养基上，6天时产生48mm的透明质圈，表明XL-1富含降解果胶的酶类，具有很好的降解秸秆的潜力。

实施例2 黑曲霉菌XL-1的鉴定 

（1）形态学分类鉴定  采用菌落形态观察及显微观测法鉴定黑曲霉，并检索文献确定其种类。

（2）分子鉴定  基因组DNA提取参考吴发红等真菌DNA提取方法进行提取，并用ddH₂O溶解DNA至500 ng/μl。用于扩增ITS序列的上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分别为ITS4: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS6: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。以基因组DNA为模板，利用引物ITS4及ITS6进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μl：10×PCR Buffer 2.5 μl，模板1μl，dNTP (10 mM each) 0.5 μl，引物ITS4 (10 mM)1μl，ITS6 (10 mM)1μl，DNA聚合酶(5 U/μl) 0.25 μl，加入去离子水至25μl。PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 1 min；55℃ 30 sec；72℃ 1 min；33个循环；72℃10 min。PCR反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。600 bp大小目的条带采用DNA回收试剂盒（AXYGEN公司）回收纯化后，与T-载体（Takara PMD-19T）连接，转化感受态细胞，然后在含有Amp、IPTG、X-Gal的平板上进行蓝白斑筛选，并进行菌落PCR筛选出重组质粒。经验证为目的片段的阳性克隆送至上海生工生物有限公司进行测序。测序结果通过检索Genbank (http://www.nebi.nlm.nih.gov/Blast/)，采用BLAST进行序列一致性比较。同时，下载黑曲霉属其它种及其它属真菌的模式菌株rDNA ITS序列，并运用CLUSTAL X (Version 1.8)软件进行对位排列，辅以人工校对，得到的序列使用MEGA3.1分子进化遗传分析软件分析。在Kimura 2-parameter法计算遗传距离的基础上，采用邻接法构建NJ系统发生树，系统树各分支的置信度用自举检验法（bootstrap）检验，共进行1000次循环。 

（3）结果  形态学观察结果表明，分离纯化后的XL-1菌落在PDA培养平板上圆形或近圆形，菌丝生长初期为乳白色绒状，后期呈现菌丝上密生一层黑色粉粒，好似粗地毯状。显微镜下观察，其顶囊近球形，双层小梗，小梗上长有成串球性分生孢子，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙，菌丝发达多分枝，有隔多核的多细胞真菌。分生孢子梗由特化了的厚  黑曲霉壁而膨大的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出；分生孢子头状如“菊花。检索文献初步判断为黑曲霉菌(Aspergillus niger)。为进一步确定菌株XL-1分类地位，以该菌株基因组DNA为模板，用ITS序列通用引物扩增出1条长度为600 bp左右的预期片段，符合ITS在所有真菌中都高度保守且长度恒定的报道。经上海生工生物技术有限公司进行DNA测序，测得XL-1的ITS基因全序列，包括ITS1区、5.8S区及ITS2区，可读序列长度全长为526 bp。将可读的526 bp序列提交GenBank，应用BLAST同源性搜索，与数据库中各菌株序列进行相似性分析，与黑曲霉菌（序列登陆号：8HBKWS63016）的菌株一致性达99%。由菌株XL-1及其他模式菌株rDNA ITS序列构建的系统进化树分析可以看出，菌株XL-1的序列与A. niger聚成一类，单独构成一个分支，遗传距离最短，树支可靠性达到88%，结合其生物学特性及形态学特征，鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。 

实施例3  XL-1微生物菌剂制备方法 

（1）  液态菌剂的制备  将保存的菌株XL-1移入PDA培养基平板上，25℃光暗交替培养4 d，无菌条件下刮取分生孢子，用无菌水配置1×10⁷的分生孢子悬浮液，按1 ml孢子悬浮液/100 ml PDB培养基进行接种，置于25℃，150 rpm条件下振荡培养3 d，电动搅拌器以2000 rpm转速搅拌2 min，与1.9 L磷酸缓冲液混合（内含0.1 %的助剂吐温100和0.2%的防腐剂苯甲酸），即得到液态生防菌剂。

（2）  固态菌剂的制备  将保存的菌株XL-1菌株移入PDA培养基平板上，25℃光暗交替培养4 d，无菌条件下刮取分生孢子，用无菌水配置1×10⁷的分生孢子悬浮液，按2 ml孢子悬浮液/100 g基质培养基进行接种，26℃光暗交替培养8～10 d后，混匀即得固态生防菌剂（基质培养基为：麦麸，玉米粉，稻糠，水，其质量比为：2:1:2:5，即100 g基质培养基中含有20 g麦麸，10 g玉米粉，20 g稻糠及50 g水，混匀后高压湿热灭菌备用）。 

（3）施用方法  准确称取2g在60℃干燥至恒重的新鲜小麦秸秆放入培养皿内，进行XL-1菌株降解小麦秸秆，向放有2g秸秆的培养皿内加入1mL菌悬液并补水至10mL；20d后，通过表观特征，及秸秆的变化情况来评价秸秆的降解效果。 

正在腐烂的秸秆，可根据颜色（黄﹑微黄﹑褐黄﹑黑黄）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，根据秸秆的气味（霉味﹑氨味﹑酒味﹑腐烂味）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，根据手感软化程度（硬﹑微软﹑软﹑腐烂）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，将三种特征的级数进行加和即为秸秆的腐烂程度，级数越大，腐烂程度越大。每5天观察一次秸秆降解情况，记录秸秆降解的级数。 

将秸秆表面的菌丝体用蒸馏水冲洗干净，60℃干燥至恒重称量剩余秸秆的重量，计算秸秆降解率，并将剩余秸秆进行纤维素含量测定。纤维素含量测定方法：称取0.1g秸秆于试管中，加入醋酸和硝酸混合液（体积比为1/1）5mL，盖上盖子于沸水浴中加热30min，转移至大离心管中加蒸馏水稀释至45mL，冷却后离心去上清，60℃烘干。取烘干后的样品加入混合液中(质量分数为10%的硫酸，浓度为0.1mol/L的重铬酸钾)10mL，摇匀后沸水浴15min，全部转移至干净的三角瓶中滴定，加入质量分数为20%的KI溶液5mL，用0.2mol/L的硫代硫酸钠滴定至溶液刚显蓝色且半分钟内不变色，另作一未加秸秆的空白。纤维素含量计算公式：X=k(a-b)/(n×24)，式中：k为硫代硫酸钠的浓度，a为空白滴定所用硫酸钠的体积，b为溶液滴定所耗硫代硫酸钠的体积，n为稻壳的质量。 

实施例4: XL-1菌株的酶活测定 

种子液的制备：取XL-1菌株接种于PDA试管斜面上，28℃恒温培养至试管斜面长满孢子。加入10mL无菌水充分震荡，所得菌悬液即为种子液。

粗酶液：将种子液接种于液体产酶培养基中,37℃，180r/min进行发酵。分别在1d、2d、3d、4d和5d取发酵液，5000r/min离心10min，所得上清即为粗酶液。 

果胶酶酶活测定方法：参照文献（王占勇，苏婷婷.产纤维素酶黑曲霉LN0401液体发酵条件的分析[J] .辽宁石油化工大学学报，2006.6，26（2）：28-29），取0.5%果胶溶液0.5mL加入到0.5mL的粗酶液中摇匀，在50℃水浴中反应0.5h。取出后迅速在沸水浴中加热5min，冷却，然后向试管中加入1mL DNS和8mL蒸馏水，摇匀。在沸水浴中加热5min，迅速冷却。550nm处测定其吸光值，对照标准曲线计算酶活。 

结果：将具有较大透明圈的菌株进行发酵产酶，酶活测定结果见表2。在5天培养过程中，果胶酶的活性在第3d达到最高峰，活性峰值为103.49u，随后逐渐下降，最低值为第一天的30.25u，这为后续的发酵优化和应用提供了科学依据。 

表2 菌株的酶活

菌株编号

酶类型

1d（u/mL）

2d（u/mL）

3d（u/mL）

4d（u/mL）

5d（u/mL）

XL-1

果胶酶

30.25

53.84

103.49

80.07

65.92

实施例5：XL-1降解菌液体发酵产酶条件优化

秸秆降解过程主要是各种菌所产生的酶对秸秆的消化利用过程，因此常用产酶能力来衡量降解菌株对秸秆的利用能力，产酶能力的大小一般用发酵液中的单位酶活大小来衡量。本发明中黑曲霉XL-1菌株在液体条件下的发酵秸秆产酶能力，为该菌在降解秸秆中的进一步应用起到参考价值。主要条件优化有：

（1）发酵时间对降解菌株产酶能力的影响：发酵时间是影响菌株产酶的因素之一，发酵初期随着时间的延长发酵液的酶活一般呈上升趋势；随着营养物质的耗尽以及酶蛋白的降解作用，发酵液的酶活将出现下降。按1%的接种量，pH自然，摇床转速180r/min，真菌28℃发酵培养。 每24h小时取样一次，连续测定5d，研究降解菌株所产酶活随时间的变化关系。

（2）pH对降解菌株产酶能力的影响：不同微生物对pH有不同的耐受性，因此其产酶过程受pH的影响较大。真菌一般适应在酸性环境下生长和产酶，细菌一般适应在碱性环境下生长和产酶。将真菌产酶培养基的pH值设定5个水平（4﹑4.5﹑5﹑5.5﹑6）。按照1%的接种量，摇床转速真菌28℃，180r/min进行发酵培养。真菌取发酵72h的发酵液进行酶活测定，研究发酵液的酶活与pH的变化关系。 

（3）温度对降解菌株产酶能力的影响：温度也是影响自然界中微生物产酶的指标之一，大多说真菌的产酶温度一般在30℃左右。真菌产酶培养基分别设定为（24﹑26﹑28﹑32﹑34 ）5个温度水平，按照1%的接种量，pH自然，180r/min进行发酵培养。发酵72h后测定酶活，研究发酵液的酶活与发酵温度的关系。 

（4）接种量对降解菌株产酶能力的影响：接种量的大小影响菌种群体的多少，从而影响酶产量，但并非接种量越大越好。受到溶氧及营养物质的影响，研究合适的接种量才能使发酵液具有最高的酶活。在pH自然， 28℃、180r/min条件下，将接种量设定（0.5%﹑1%﹑1.5%﹑2%﹑2.5%）5个水平，测定发酵72h，后的酶活，研究发酵液酶活与接种量的关系。 

（5）氮源对降解菌株产酶能力的影响：氮源是微生物生长所必须的，秸秆的C/N为50:1远远大于微生物生长的最适C/N，因此发酵培养液中要有一定的氮源，不同的氮源物质对产酶能力也有不同的影响。本发明真菌发酵时无机盐培养液中的氮源为NaNO₃ ，将无机盐培养液中的氮源分别用KNO₃﹑NH₄CL﹑NH₄SO₄﹑NH₄NO₃进行替换研究产酶能力随氮源的变化趋势。按1%的接种量，在pH自然，28℃，180r/min条件下进行发酵。测定发酵72h后的酶活，分析发酵液酶活与碳源添加量的关系。 

（6）碳源对降解菌株产酶能力的影响：降解菌株虽然可以以秸秆作为碳源，但是由于秸秆成分的复杂性，需要在发酵液中加入适当的容易利用的碳源来促进菌种的而快速生长，从而更好的利用秸秆进行发酵。但在真菌产酶过程中，有些容易利用的碳源不仅不会促进产酶，甚至会抑制产酶的进行。本研究分别向真菌发酵培养液中加入0.5%的葡糖糖﹑蔗糖﹑阿拉伯糖﹑木糖，以空白为对照研究所加碳源对产酶的影响。发酵条件为：接种量为1%﹑pH自然﹑28℃﹑180r/min发酵72h后的测定酶活。 

（7）结果：对XL-1株菌的发酵液进行酶活、pH、温度、接种量、碳源、氮源利用等方面的单因素优化实验，可以看出XL-1菌株发酵3d后单位酶活达到最大值94.5 U/ml，且酶活与其它天内的酶活有明显差异，因此发酵3d为XL-1菌株最佳发酵时间。随着pH的变化，发酵液的单位酶活不断改变，可见pH值会影响到菌株的产酶过程。XL-1菌株在pH4.5时达到最高酶活,为106.66U/mL，经过单因素方差分析发现XL-1菌株在pH4.5时与其它水平有显著差异，因此发酵的最适pH为4.5；不同温度条件下，发酵液的酶活有明显的变化，最适温度的确定也是发酵条件优化的重要因素。28℃时XL-1菌株发酵液具有最高的酶活，为111.73U/mL，经过方差分析得出，XL-1菌株在28℃和30℃时的差异性不显著，基于经济条件考虑，XL-1菌株的最优发酵条件确定为28℃；随着接种量的增加发酵液的酶活呈上升趋势，但是当接种量达到一定量时酶活又开始下降。XL-1菌株的种量为1.5%时酶活最高，为117.81U/mL，经过方差分析得出XL-1菌株在1.5%接种量条件下与其它水平有明显差异；当以硝酸铵为碳源时XL-1菌株发酵液酶活最高，达到119.68 U/mL，经过方差分析知以硝酸铵为氮源时XL-1菌株的发酵液酶与其它因素有显著差异；加入葡萄糖﹑蔗糖﹑阿拉伯糖﹑木糖后，由XL-1菌株酶活数值可知对照酶活最高为107.9 U/mL，葡糖糖与蔗糖对XL-1发酵产酶抑制作用较强，阿拉伯糖与木糖对其抑制作用较轻。根据实验结果分析得出外加碳源基本不利于产酶的进行，因此不再添加额外碳源。因此，通过对降解菌株液体发酵条件的研究得出，XL-1的最佳发酵条件为：pH4.5，28℃，1.5%的接种量，以硝酸铵为氮源，不加额外碳源，发酵2天酶活最高，即可用于后期降解制剂制备。 

实施例6: 菌种组合降解小麦秸秆 

（1）降解菌的共培养实验:生态系统的微生物之间关系十分复杂，相互依存又相互竞争。通过将两种或两种以上菌株接种于同一平板上，观察它们之间是否存在拮抗作用，才能确定多个菌株是否能共同培养。本实验将筛选得到的菌株两两接种于PDA平板上，通过菌落直径的观察，分析两种菌之间是否会产生拮抗作用。

（2）所用菌株：XL-1为本发明菌株黑曲霉菌，XP3为米曲霉（AspergiLLus oryzae）菌株，XP5为黄青霉(Penicillium chrysogenum)菌株，L1为枯草芽孢杆菌(BaciLLus  stbtiLis)菌株，L8为解淀粉芽孢杆菌（BaciLLus amyLaLiquefaiens）菌株，均由本实验室分离自腐烂秸秆中。菌剂1和菌剂2分别购自郑州某生物公司和鹤壁百惠生物科技有限公司。 

（3）降解秸秆试验: 准确称取2g在60℃干燥至恒重的新鲜小麦秸秆放入培养皿内，进行菌种降解小麦秸秆的效果研究，菌悬液的制作方法同上。单一菌种降解为：向放有2g秸秆的培养皿内加入1mL菌悬液并补水至10mL；联合降解为：放有秸秆的平皿中加入菌液，每种菌液为1mL，补水至10mL。 

（4）降解效果分析: 降解试验完后，通过表观特征，及秸秆的重量变化情况来评价秸秆的降解效果。正在腐烂的秸秆，可根据颜色（黄﹑微黄﹑褐黄﹑黑黄）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，根据秸秆的气味（霉味﹑氨味﹑酒味﹑腐烂味）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，根据手感软化程度（硬﹑微软﹑软﹑腐烂）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，将三种特征的级数进行加和即为秸秆的腐烂程度，级说越大，腐烂程度越大。每5天观察一次秸秆降解情况，记录秸秆降解的级数。 

将秸秆表面的菌丝体用蒸馏水冲洗干净，60℃干燥至恒重称量剩余秸秆的重量，计算秸秆降解率，并将剩余秸秆进行纤维素含量测定。纤维素含量测定方法：称取0.1g秸秆于试管中，加入醋酸和硝酸混合液（体积比为1/1）5mL，盖上盖子于沸水浴中加热30min，转移至大离心管中加蒸馏水稀释至45 mL，冷却后离心去上清，60℃烘干。取烘干后的样品加入混合液中(质量分数为10%的硫酸，浓度为0.1mol/L的重铬酸钾)10 mL，摇匀后沸水浴15min，全部转移至干净的三角瓶中滴定，加入质量分数为20%的KI溶液5 mL，用0.2mol/L的硫代硫酸钠滴定至溶液刚显蓝色2且半分钟内不变色，另作一未加秸秆的空白。 

纤维素含量计算公式：X=k(a-b)/(n×24) 

式中：k为硫代硫酸钠的浓度，a为空白滴定所用硫酸钠的体积，b为溶液滴定所耗硫代硫酸钠的体积，n为稻壳的质量。

（5）共培养试验结果 

将两种不同的菌株接种于平板上，以单一菌种培养为对照，菌株在平板上的菌落大小见表3。

表3 共培养试验菌株生长速率 

    表4 共培养试验菌株与单独培养菌株生长速率差异性分析

    将菌株共同培养时的生长速率与单独培养时的速率进行差异性分析，分析结果表明共同培养与单独培养的生长速率不存在差异性，因此表明菌株之间不存在拮抗作用，可以共同培养。

（6）秸秆降解结果 

将分离得到的5株菌组合进行秸秆的降解研究，组合方案见表5，秸秆降解过程中的降解级数如表6所示。由表6可知，试验结束时，菌种两两组合降解的秸秆与单一降解的秸秆达到了相同的腐烂级数，但是菌种组合时秸秆的降解速度大于单一菌种是的速度。并且当有芽孢杆菌加入时，秸秆的降解速度比没有加入芽孢杆菌的实验组降解速度快，腐烂程度深。试验中3株真菌与2株芽孢组合使秸秆的腐烂级数达到12级，两种市售菌剂的腐烂级数分别达到8﹑9级，可见XL-1+XP3+ XP5+（L1+L8）对秸秆降解效果良好。

表5 菌株组合降解秸秆方案

试验编号	菌液	补水（mL）	总加液量（mL）	秸秆量（g）
					1	空白对照（CK）	10	10	2
2	XL-1	9	10	2
					3	XP3	9	10	2
4	XP5	9	10	2
					5	L1+L8	8	10	2
6	XP3+L1+L8	7	10	2
					7	XL-1+L1+L8	7	10	2
8	XP5+L1+L8	7	10	2
					9	XL-1+XP3	8	10	2
10	XL-1+XP5	8	10	2
					11	XP3+ XP5	8	10	2
12	XL-1+XP3+ L1+L8	6	10	2
					13	XL-1+ XP5+L1+L8	6	10	2
14	XP3+ XP5 +L1+L8	6	10	2
					15	XL-1+XP3+ XP5	7	10	2
16	XL-1+XP3+ XP5+L1+L8	5	10	2
					17	菌剂1	1	10	2
18	菌剂2	1	10	2

表6秸秆降解级数

注：级数越大说明腐烂程度越明显

秸秆降解试验腐烂的秸秆见图2，可知当只有真菌（XP3、XL-1、XP5）作用与秸秆时，秸秆表面虽然附着大量的菌丝体，但是秸秆表面较干燥，腐败现象不明显，当加入细菌（LI、L8）后秸秆表面较湿润腐败现象较明显。真菌（XL-1、XP3、XP5）混合作用于秸秆后，秸秆的利用明显大于单一真菌作用于秸秆，加入细菌的试验批次秸秆也出现了明显的变黑等腐败现象。可以观察到该两种菌剂对秸秆的降解效果不如研究中混合复配的效果好。

降解完成后，秸秆的降解率与纤维素含量分析见表7和表8。可知，真菌与细菌混合作用于秸秆后，秸秆的降解率明显高于真菌单独作用于秸秆的降解率，当5种菌混合作用于秸秆时，秸秆的降解率达到了最大值59%，与市售菌剂的降解率比较可知，实验组合的降解作用远远优于市售菌剂的降解作用。将讲解后的秸秆进行纤维素含量测定，发现各试验组的纤维素含量均有所下降，3种真菌组合降解后的秸秆中纤维素含量变为44.7%，5种菌全部混合实验组纤维素含量变为42.9%，可见秸秆中的纤维素被大量降解，秸秆的整体结构被打乱，从而秸秆得到良好的降解。 

表7秸秆降解率

试验编号	秸秆降解后重	秸秆降解率（%）
			CK	2.00	0h
XL-1	1.01	49.5de
			XP3	0.90	55abc
XP5	1.28	36f
			L1+L8	1.90	5g
XP3+（L1+L8）	0.89	55.5abc
			XL-1+（L1+L8）	0.93	53.5bcd
XP5+（L1+L8）	1.20	40f
			XL-1+XP3	0.89	55.5abc
XP3+ XP5	0.90	55abc
			XL-1+ XP5	0.97	51.5cd
XL-1+XP3+（L1+L8）	0.87	56.5ab
			XP3+ XP5+（L1+L8）	0.89	55.5abc
XL-1+ XP5+（L1+L8）	0.92	54abc
			XP3+XL-1+XP5	0.87	56.5ab
XL-1+XP3+ XP5+（L1+L8）	0.82	59a
			菌剂1	1.35	32.5f
菌剂2	1.10	45e

表8纤维素含量的变化

试验编号	降解前纤维素含量（%）	降解后纤维素含量（%）
			CK	51.16	51.16a
XL-1	51.16	50.2c
			XP3	51.16	47.2f
XP5	51.16	50.3c
			L1+L8	51.16	51.10a
XP3+（L1+L8）	51.16	47.3e
			XL-1+（L1+L8）	51.16	50.5c
XP5+（L1+L8）	51.16	50.8bc
			XL-1+XP3	51.16	45.6g
XP3+ XP5	51.16	45.7g
			XL-1+ XP5	51.16	50.1d
XL-1+XP3+（L1+L8）	51.16	46.4b
			XP3+ XP5+（L1+L8）	51.16	48.4e
XL-1+ XP5+（L1+L8）	51.16	50.9ab
			XL-1+XP3+ XP5	51.16	44.7h
XL-1+XP3+ XP5+（L1+L8）	51.16	42.9i
			菌剂1	51.16	50.5bc
菌剂2	51.16	48.6d

Claims (6)

1.一种黑曲霉菌XL-1，其保藏编号为CGMCC NO.6316。

2.一种微生物制剂，其特征在于，所含活性成分为权利要求1所述黑曲霉菌XL-1和/或其代谢产物。

3.权利要求2所述微生物菌剂制备方法，包括如下步骤：

将权利要求1所述的黑曲霉菌XL-1移入PDA培养基平板上，26℃光暗交替培养4 d，无菌条件下刮取分生孢子，用无菌水配置1×10⁷的分生孢子悬浮液，按1 ml孢子悬浮液/100 ml PDB培养基进行接种，置于26℃，150 rpm条件下振荡培养3 d，电动搅拌器以2000 rpm转速搅拌2 min，与1.9 L磷酸缓冲液混合，即得到液态生防菌剂；或

将权利要求1所述的黑曲霉菌XL-1移入PDA培养基平板上，26℃光暗交替培养4 d，无菌条件下刮取分生孢子，用无菌水配置1×10⁷的分生孢子悬浮液，按2 ml孢子悬浮液/100 g基质培养基进行接种，26℃光暗交替培养8～10 d后，混匀得固态生防菌剂。

4.根据权利要求3所述微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述基质培养基由麦麸、玉米粉、稻糠、水按2:1:2:5的质量比混匀后经高压湿热灭菌而制成。

5.权利要求1所述黑曲霉菌或权利要求2所述微生物制剂在秸秆降解中的应用。

6.根据权利要求5所述的在秸秆降解中应用，其特征在于，XL-1的发酵条件为：pH4.5，28℃，1.5%的接种量，以硝酸铵为氮源，不加额外碳源，发酵2天。

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