CN111303310A - 一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法和其在抗阿尔兹海默病药物制备中的应用 - Google Patents

一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法和其在抗阿尔兹海默病药物制备中的应用 Download PDF

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Abstract

一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法和其在抗阿尔兹海默病药物制备中的应用，属于生化领域。本发明通过发酵改造的工程菌株，获取重组卡拉胶降解酶，发酵后取发酵液离心去沉淀取上清液为粗酶液，向粗酶液中加入卡拉胶进行降解，降解结束后调节pH值静置干燥得到硫酸半乳六糖纯品。本发明所使用重组的卡拉胶降解酶为外切酶，酶专一识别单位仅为六糖，降解过程中每次从卡拉胶末端切下一个六糖，因此本发明提供的硫酸半乳六糖制备方法制备出的硫酸半乳六糖结构均一，减缓阿尔兹海默病的病症，提高学习能力和记忆力，表现出抗阿尔兹海默病的活性。

Description

一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法和其在抗阿尔兹海默病药 物制备中的应用
技术领域
本发明属于生化领域，具体涉及一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法和其在抗阿尔兹海默病药物制备中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)又称老年痴呆，是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主要病症的中枢神经系统退行性疾病。
据流行病调查，我国65岁以上老人发病率约5.6％，85岁以上老人发病率约25％，目前约有患者800余万，每年新增患者30余万，占全世界患者的四分之一，是阿尔兹海默病患者最多的国家，但是由于该病的发病机理复杂，目前还没有治疗老年痴呆的特效药物和化合物。
海洋生物多糖由于结构独特，例如带有氨基或硫酸基等基团，具有很多生理活性，在神经退行性疾病尤其阿尔兹海默病方面具有应用前景。但是海洋生物多糖，分子量较大，活性基团不易暴露，难以吸收和利用，限制了其在生物医药领域的应用。目前普遍的做法是对海洋多糖进行降解，获取具有活性的海洋生物寡糖，或以此作为中间体进行修饰，降解的方法包括化学法、物理法和生物酶解法等。但是物理、化学方法由于降解产物不专一、成分复杂等缺点不适合制备有活性的生物寡糖，生物酶法专一性虽好，但制备的寡糖又不一定具有活性，因此制备和筛选具有某种特定生物活性的海洋生物寡糖就显得异常困难。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法，该方法制备的硫酸半乳六糖的含量高和活性高。
本发明涉及的硫酸半乳六糖的结构式如下：
Figure BDA0002408379520000011
或
Figure BDA0002408379520000021
m＝OH或-OSO3-。
本发明解决技术问题制备海洋硫酸半乳六糖的步骤如下：
(1)采用专利《以海洋细菌为来源获取的k-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法》(ZL201610503827.3)的方法，发酵改造的工程菌株，获取重组卡拉胶降解酶。发酵后取发酵液于4℃条件下800-4000r/min离心10-20min，去掉沉淀，取上清液即为粗酶液；
(2)向粗酶液中加入卡拉胶，使卡拉胶在粗酶液中的质量浓度在0.2％-1.0％之间，于30--35℃孵育、震荡8-48小时；
(3)降解结束后，采用质量浓度为0.5-2％的氢氧化钠溶液将降解液pH调整为6.5-7.5，常温下1000-3000r/min离心10-30min，取上清去除杂质；采用质量浓度40-60％的硫酸铵沉淀上清中的蛋白、酶和大分子化合物，静置时间12-24小时；常温下采用2000-4000r/min离心15-30min，去除沉淀，取上清；采用喷雾干燥的方法获得硫酸半乳六糖干粉，喷雾干燥条件：进风温度120-140℃，出风温度为60-80℃，进风压力为30-50Mpa；采用分子筛口径800-1000的透析膜对硫酸半乳六糖过滤除盐，获得硫酸半乳六糖纯品。
进一步的，卡拉胶为κ型卡拉胶、ι型卡拉胶、λ型卡拉胶、混合型卡拉胶中的一种。
本发明同时保护上述方法制备的海洋硫酸半乳六糖及其在抗阿尔兹海默病药物制备中的应用，可制成口服液、胶囊或添加食品中用于预防阿尔兹海默病，或可作为药物延缓阿尔兹海默病的进展。该化合物以(1→3)-β-D半乳糖和(1→4)-3,6内醚(或不内醚化)-α-D半乳糖交替连接形成，在(1→3)-β-D半乳糖C2或C4上有硫酸基取代，在(1→4)-α-D半乳糖硫的C2和C6上有硫酸基取代，硫含量大于2.17％。
原理：本发明采用基因工程改造获得的卡拉胶降解酶作为工具，以卡拉胶作为底物，通过酶解制备获取一种具有抗阿尔兹海默病的硫酸半乳六糖。
有益效果；目前卡拉胶降解酶识别单位多同时为二糖、四糖或八糖，因此降解产物二糖、四糖、八糖等混合物，成分较多，结构不均一，六糖含量微乎其微。本发明所使用重组的卡拉胶降解酶为外切酶，酶专一识别单位仅为六糖，降解过程中每次从卡拉胶末端切下一个六糖，因此本发明提供的硫酸半乳六糖制备方法制备出的硫酸半乳六糖结构均一，含量达到90％以上，该化合物能够降低脑内炎症反应、抑制APP和Aβ1-42沉积，下调iNOS、Neurofilament-L、Tau和ApoE等与阿尔兹海默病相关基因的表达，减缓阿尔兹海默病的病症，提高学习能力和记忆力，表现出抗阿尔兹海默病的活性，可将硫酸半乳六糖制成口服液、胶囊或以粉状形式添加食品中用于预防阿尔兹海默病，或作为药物延缓阿尔兹海默病的进展。
附图说明
图1为实施例1制备的硫酸半乳六糖的13C-NMR光谱图。
图2为Morris水迷宫实验中小鼠找到平台位置的潜伏期。
图3为Morris水迷宫实验中小鼠经过平台位置的次数。
图4为小鼠脑内Aβ1-42沉积情况。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。本发明实施例中发酵培养的工程菌采用中国专利《以海洋细菌为来源获取的k-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法》(ZL201610503827.3)中记载的方法获得。
实施例1
发酵培养工程菌，培养条件为：发酵培养，培养基中蛋白胨含量(质量比)为1％、酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH值为7.0，培养条件37℃，转速150r/min，发酵培养48小时。发酵后取发酵液于4℃条件下1500r/min离心15min，去掉沉淀，取上清液即为粗酶液；向粗酶液中加入κ-卡拉胶，使卡拉胶在粗酶液中的质量浓度在0.5％之间，于35℃孵育、震荡24小时；降解结束后，采用2％的氢氧化钠溶液将降解液pH调整为7.0，常温下3000r/min离心30min，取上清去除杂质；采用质量浓度50％的硫酸铵沉淀上清中的蛋白、酶和大分子化合物，静置24小时；常温下采用2000r/min离心15min，去除沉淀，取上清；采用喷雾干燥的方法获得硫酸半乳六糖干粉，喷雾干燥条件：进风温度140℃，出风温度为80℃，进风压力为40Mpa；采用分子筛口径1000的透析膜对硫酸半乳六糖过滤除盐，获得硫酸半乳六糖纯品。经鉴定该化合物以(1→3)-4-硫酸基-β-D半乳糖和(1→4)-3,6内醚-α-D半乳糖交替连接形成，还原端为(1→3)--4-硫酸基β-D半乳糖，分子量为1475，硫含量为2.17％。核磁图谱见图1。图1中G1α和G1β：还原性末端单位的α和β异头碳；G：非还原性末端的D－半乳糖残基；Ar：还原性末端的3,6-内醚-D-半乳糖残基；Anr：非还原性末端的3,6-内醚-D-半乳糖残基。
实施例2
发酵培养工程菌，培养条件为：发酵培养，培养基中蛋白胨含量(质量比)为1％、酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH值为7.0，培养条件37℃，转速150r/min，发酵培养48小时。发酵后取发酵液于4℃条件下800r/min离心20min，去掉沉淀，取上清液即为粗酶液；向粗酶液中加入ι-卡拉胶，使卡拉胶在粗酶液中的质量浓度在0.2％之间，于30℃孵育、震荡8小时；降解结束后，采用0.5％的氢氧化钠溶液将降解液pH调整为6.5，常温下1000r/min离心10min，取上清去除杂质；采用质量浓度40％的硫酸铵沉淀上清中的蛋白、酶和大分子化合物，静置12小时；常温下采用4000r/min离心30min，去除沉淀，取上清；采用喷雾干燥的方法获得硫酸半乳六糖干粉，喷雾干燥条件：进风温度120℃，出风温度为60℃，进风压力为30Mpa；采用分子筛口径800的透析膜对硫酸半乳六糖过滤除盐，获得硫酸半乳六糖纯品。
实施例3
发酵培养工程菌，培养条件为：发酵培养，培养基中蛋白胨含量(质量比)为1％、酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH值为7.0，培养条件37℃，转速150r/min，发酵培养48小时。发酵后取发酵液于4℃条件下4000r/min离心10min，去掉沉淀，取上清液即为粗酶液；向粗酶液中加入λ-卡拉胶，使卡拉胶在粗酶液中的质量浓度在1.0％之间，于35℃孵育、震荡48小时；降解结束后，采用2％的氢氧化钠溶液将降解液pH调整为7.5，常温下3000r/min离心30min，取上清去除杂质；采用质量浓度60％的硫酸铵沉淀上清中的蛋白、酶和大分子化合物，静置24小时；常温下采用2000r/min离心15min，去除沉淀，取上清；采用喷雾干燥的方法获得硫酸半乳六糖干粉，喷雾干燥条件：进风温度140℃，出风温度为80℃，进风压力为50Mpa；采用分子筛口径1000的透析膜对硫酸半乳六糖过滤除盐，获得硫酸半乳六糖纯品。
实施例4
硫酸半乳六糖对老年痴呆转基因小鼠的影响作用：使用实施例1制备的硫酸半乳六糖纯品，以生理盐水为溶液配置浓度为50mg/ml的硫酸半乳六糖口服液，以100mg/Kg剂量的硫酸半乳六糖灌胃APP/PS1转基因小鼠(Tg2576)，以C57B6正常鼠和APP/PS1转基因小鼠两组小鼠作为对照(灌胃生理盐水)，每周三次，连续灌胃四周。以Morris水迷宫实验检测硫酸半乳六糖对转基因小鼠记忆力的影响，小鼠找到平台位置的潜伏期训练的图如图2所示，小鼠经过平台位置的次数的图如图3所示。
将小鼠1-3天放置平台训练，第4天取走平台，记录小鼠达到平台位置的时间，时间越短，说明小鼠记忆力越好，由图2可以看出硫酸半乳六糖(LSBL)可以降低小鼠进入平台位置的时间，提高APP/PS1小鼠的记忆力。结果发现硫酸半乳六糖可以降低小鼠找到平台位置的潜伏期。
将小鼠经训练3天后去掉平台，观察小鼠经过平台位置的次数，次数越多说明小鼠记忆力越好，由图可以看出硫酸半乳六糖(LSBL)可以显著提高APP/PS1小鼠经过平台的次数(见图3)，具有提高小鼠记忆力的作用，提高进入平台的次数，具有提高APP/PS1转基因小鼠记忆力的作用。
对小鼠大脑组织进行免疫荧光染色，发现硫酸半乳六糖可以降低Aβ1-42的沉积(图4)。Aβ1-42沉积是阿尔兹海默病的主要特征之一，沉积越多说明病情越严重，图4是各组小鼠灌胃4周后脑内Aβ1-42沉积情况，图片黄褐色代表Aβ1-42被染色情况，由图可以看出APP/PS1小鼠脑内Aβ1-42沉积情况严重，灌胃硫酸半乳六糖(LSBL)四周后，发现小鼠脑内Aβ1-42沉积情况减轻，说明硫酸半乳六糖(LSBL)能够降低动物脑内Aβ1-42的沉积，减轻阿尔兹海默病的症状。综上结果表明硫酸半乳六糖具有抗阿尔兹海默病的作用。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。

Claims (8)

1.一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法，其特征在于，该制备方法的步骤如下：
S1.将重组卡拉胶降解酶发酵后取发酵液离心，去掉沉淀，取上清液即为粗酶液；
S2.向粗酶液中加入卡拉胶，使卡拉胶在粗酶液中的质量浓度在0.2％-1.0％之间，于30-35℃孵育、震荡8-48小时；
S3.降解结束后，采用质量浓度为0.5-2％的氢氧化钠溶液将调节降解液pH值，常温下1000-3000r/min离心10-30min，取上清去除杂质；采用质量浓度40-60％的硫酸铵沉淀上清中的蛋白、酶和大分子化合物，静置；常温下采用2000-4000r/min离心15-30min，去除沉淀，取上清；采用喷雾干燥的方法获得硫酸半乳六糖干粉。
2.根据权利要求1所述的一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法，其特征在于，步骤S1中发酵液的离心条件为4℃条件下800-4000r/min离心10-20min。
3.根据权利要求1所述的一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法，其特征在于，步骤S2中的卡拉胶为κ型卡拉胶、ι型卡拉胶、λ型卡拉胶、混合型卡拉胶中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种海洋硫酸半乳六糖的制备方法，其特征在于，步骤S3中的降解液pH的范围为6.5-7.5；喷雾干燥条件：进风温度120-140℃，出风温度为60-80℃，进风压力为30-50Mpa；采用分子筛口径800-1000的透析膜对硫酸半乳六糖过滤除盐，获得硫酸半乳六糖纯品。
5.一种海洋硫酸半乳六糖在抗阿尔兹海默病药物制备中的应用，其特征在于，采用权利要求1中所述方法制备海洋硫酸半乳六糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，抗阿尔兹海默病药物包括以海洋硫酸半乳六糖作为的活性成分及药剂学上能接受的载体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗阿尔兹海默病药物为口服液、胶囊或粉状形式。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以生理盐水为溶液配置浓度为50mg/ml的硫酸半乳六糖口服液。
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