CN112831436A - 一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株极地杆菌属1,3/1,4‑木聚糖降解菌及其培养方法与应用。本发明中极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13，2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：CCTCC NO：M 2020985。极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13可以将多个不同家族的木聚糖降解酶分泌至细胞外，从而降解利用1,3/1,4‑木聚糖产生木寡糖，在医药、化妆品以及食品行业等都具有较好的应用潜力。

Description

一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
木聚糖是植物半纤维素的主要成分，其含量仅次于纤维素。高等植物细胞壁中的木聚糖是复杂的多聚五碳糖，其骨架是由木糖基团通过β-1,4-糖苷键连接而成，一些取代基通过O2或O3原子与骨架相连，常见的取代基团包括阿拉伯糖基、半乳糖基、葡萄糖醛酸基等。因此，完全水解此类木聚糖需要多种酶的共同参与，其中内切型1,4-木聚糖酶起主要作用。
海洋环境中的木聚糖主要来源于红藻和绿藻的细胞壁，与高等植物中的木聚糖在结构上存在明显差异。海洋藻类来源的木聚糖均为直链同型木聚糖，只由木糖基团通过β-1,3-糖苷键或β-1,4-糖苷键连接而成，其类型包括1,3-木聚糖、1,4-木聚糖以及混合糖苷键的1,3/1,4-木聚糖。在红藻中，掌形藻目(Palmariales)和海索面目(Nemaliales)藻类细胞壁中的多糖主要为1,3/1,4-木聚糖。其中，掌形藻目中的掌状红皮藻Palmaria palmata是一种著名的冷水性经济海藻，富含膳食纤维、蛋白质及维生素等，其藻体内某些化合物具有抗炎、抗氧化活性功能，作为海洋食品备受人们青睐。从掌状红皮藻Palmaria palmata中提取的水溶性1,3/1,4-木聚糖的结构为：1,4-木聚糖骨架中无序地分布着不连续的β-1,3-木糖苷键，β-1,3-木糖苷键与β-1,4-木糖苷键的比例约为1:4。目前，掌状红皮藻Palmariapalmata来源的1,3/1,4-木聚糖已经商品化。
由于红藻巨大的初级生产力，海洋中孕育着巨大的具有独特结构的1,3/1,4-木聚糖资源，这些1,3/1,4-木聚糖及其降解产物可能具有多种生理活性，在医药、化妆品以及食品行业等都具有重要的应用价值，但是目前并没有1,3/1,4-木聚糖降解菌的相关报道，红藻中的1,3/1,4-木聚糖资源未得到有效的开发与利用。因此，寻找并鉴定1,3/1,4-木聚糖降解菌，对于研究与开发海洋生物资源具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用。
本发明技术方案如下：
一株极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13，2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：CCTCC NO：M 2020985。
上述极地杆菌Q13源于南极纳尔逊岛红藻表面，革兰氏染色呈阴性，在固体培养基上观察，菌落呈圆形凸起状，湿润、光滑，产生黄色色素；通过原子力显微镜和透射电镜观察，极地杆菌Q13呈圆杆状，具有荚膜多糖。
上述极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
上述极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13菌株的培养方法，步骤如下：
(1)取极地杆菌Q13划线接种于TYS固体培养基平板，在18～22℃下倒置培养3～4天；
(2)从TYS固体培养基平板上挑取极地杆菌Q13单菌落，接种至TYS液体培养基，在18～22℃、转速160～200rpm条件下摇床培养至对数中期，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按1～2％的体积百分比接种至1,3/1,4-木聚糖液体培养基，在18～22℃、转速160～200rpm条件下摇床培养，得到扩繁后的极地杆菌Q13。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述的TYS固体培养基配方为：0.5wt％蛋白胨，0.1wt％酵母粉，1.5wt％琼脂粉，3wt％人工海水配制，pH 7.8。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的TYS液体培养基配方为：0.5wt％蛋白胨，0.1wt％酵母粉，3wt％人工海水配制，pH 7.8。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述的1,3/1,4-木聚糖液体培养基配方为：0.01wt％蛋白胨，0.01wt％酵母粉，3wt％NaCl，0.05wt％NH4Cl，0.3wt％MgCl2·6H2O，0.2wt％K2SO4，0.02wt％K2HPO4，0.001wt％CaCl2，0.0006wt％FeCl3·6H2O，0.0005wt％Na2MoO2·7H2O，0.0004wt％CuCl2·2H2O，0.6wt％Tris，0.2wt％1,3/1,4-木聚糖，pH 7.8。
本发明还提供极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13在降解1,3/1,4-木聚糖中的应用。
有益效果：
本发明中的极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13可以在1,3/1,4-木聚糖培养基中生长，生长过程中，极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13可以将多个不同家族的木聚糖降解酶(包括木聚糖酶及木糖苷酶)分泌至细胞外，从而降解1,3/1,4-木聚糖产生木寡糖，产生的木寡糖主要以木二糖、木三糖及木四糖的形式存在。该菌株及其所分泌的木聚糖酶可以应用于海洋红藻降解及功能性低聚木糖的制备，在医药、化妆品以及食品行业等都具有较好的应用潜力。
附图说明
图1为极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的原子力显微镜(AFM)图和透射电子显微镜(TEM)图。
图中：A、极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的AFM图，B、极地杆菌(Polaribactersp.)Q13的TEM图。
图2为基于16S rDNA序列构建的极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13与相关菌种的系统进化树。
图3为极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13在1,3/1,4-木聚糖培养基中的生长曲线。
图4为极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13发酵上清液中的寡糖成分分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：CCTCC NO：M 2020985。
1,3/1,4-木聚糖：来源于掌状红藻，1,3-/1,4-≈1/4，Elicityl公司有售。
TYS固体培养基：0.5wt％蛋白胨，0.1wt％酵母粉，1.5wt％琼脂粉，3wt％人工海水配制，pH 7.8。
TYS液体培养基：0.5wt％蛋白胨，0.1wt％酵母粉，3wt％人工海水配制，pH 7.8。
1,3/1,4-木聚糖固体培养基：0.01wt％蛋白胨，0.01wt％酵母粉，3wt％NaCl，0.05wt％NH4Cl，0.3wt％MgCl2·6H2O，0.2wt％K2SO4，0.02wt％K2HPO4，0.001wt％CaCl2，0.0006wt％FeCl3·6H2O，0.0005wt％Na2MoO2·7H2O，0.0004wt％CuCl2·2H2O，0.6wt％Tris，0.2wt％1,3/1,4-木聚糖，1.5wt％琼脂粉，pH 7.8。
1,3/1,4-木聚糖液体培养基：0.01wt％蛋白胨，0.01wt％酵母粉，3wt％NaCl，0.05wt％NH4Cl，0.3wt％MgCl2·6H2O，0.2wt％K2SO4，0.02wt％K2HPO4，0.001wt％CaCl2，0.0006wt％FeCl3·6H2O，0.0005wt％Na2MoO2·7H2O，0.0004wt％CuCl2·2H2O，0.6wt％Tris，0.2wt％1,3/1,4-木聚糖，pH 7.8。
实施例1：菌株的获得
(1)菌株初筛
将3g南极纳尔逊岛采集的红藻样品置于无菌平皿中，用20mL无菌海水冲洗表面附着细菌，并梯度稀释10～105倍；将稀释后的样品通过常规的稀释法或划线法均匀接种涂布于TYS固体培养基，于20℃恒温培养，直到TYS固体培养基上生长出形态各异的单菌落，将各个单菌落重复划线接种于TYS固体培养基，直至纯化得到单菌落，使用60％(v/v)甘油(3:7；甘油:菌液)将各个单菌落保存在-80℃。
(2)菌株复筛
将上述保种的单菌落划线接种至1,3/1,4-木聚糖固体培养基，于20℃恒温培养，分离能够降解利用1,3/1,4-木聚糖的菌株，保种记为Q13。
经过初筛和复筛，筛选到菌株Q13可以在1,3/1,4-木聚糖固体培养基上生长。
实施例2：极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的鉴定
(1)菌株特性
菌株Q13为革兰氏阴性细菌，在TYS固体培养基平板培养3～4天后，形成黄色、湿润、表面光滑、边缘规则的圆形菌落。
如图1A所示，在原子力显微镜下观察菌株Q13菌体呈圆杆状，具有荚膜多糖。
如图1B所示，在透射电镜下观察，菌株Q13菌体亦呈圆杆状。
(2)菌株鉴定
经DNA提取、PCR扩增和测序获得实施例1分离筛选所得菌株Q13的16S rDNA基因序列，如SEQ ID NO.1所示，长度为1506bp，在GenBank上进行BLAST比对分析并使用MEGA X软件构建系统进化树，系统进化树如图2所示。
由图2可知，菌株Q13与极地杆菌属细菌成簇，并与Polaribacter butkevichiiKMM 3938、Polaribacter staleyi 10Alg 139、Polaribacter sejongensis KOPRI 21160及Polaribacter undariae W-BA7相似度最高(相似度为97.48-98.26％)。
根据16S rDNA序列比对结果并结合该菌株的生物学特性，将该菌株鉴定为极地杆菌(Polaribacter sp.)，命名为极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13。
实施例3：极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的培养及生长曲线的测定
上述极地杆菌Q13的培养方法，步骤如下：
(1)取极地杆菌Q13保藏管划线接种于TYS固体培养基平板，20℃倒置培养3～4天；
(2)从TYS固体培养基平板上挑取极地杆菌Q13单菌落，接种至TYS液体培养基，在20℃、180rpm条件下摇床培养至对数中期，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按1％的体积百分比接种至1,3/1,4-木聚糖液体培养基，在20℃、180rpm条件下摇床培养，得到扩繁后的极地杆菌Q13。
同时设置培养对照组，对照组的培养方法与上述方法相同，不同之处在于步骤(3)中采用未添加1,3/1,4-木聚糖的液体培养基。
每隔12h测定一次两组菌液的OD600nm，绘制生长曲线，极地杆菌(Polaribactersp.)Q13生长曲线如图3所示。
由图3可知，极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13可以在1,3/1,4-木聚糖液体培养基中快速生长，36h即进入对数生长期，说明该菌株可以降解利用1,3/1,4-木聚糖，是一株1,3/1,4-木聚糖降解菌。
实施例4：极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13发酵上清中的寡糖成分分析
按照实施例3中的培养方法，在1,3/1,4-木聚糖液体培养基中培养极地杆菌Q13至对数中期(OD600nm约0.4)。取发酵上清沸水浴5min，用0.22μm滤膜过滤。通过高效液相色谱(HPLC)检测发酵上清中的寡糖成分，HPLC分析柱为Superdex 30Increase 10/300GL(购自GE Healthcare公司)，检测器为蒸发光检测器(ELSD)，流动相为三蒸水，以1,4-木寡糖(1,4X1-X6)为标准品粗略地标定保留时间，结果如图4所示。
由图4可知，极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13发酵上清中的木寡糖主要是木二糖、木三糖、木四糖，其中木二糖与木三糖含量最为显著，说明该菌株可以分泌木聚糖酶至细胞外，并将1,3/1,4-木聚糖降解产生木寡糖。
实施例5：极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13胞外蛋白谱分析
极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的胞外蛋白谱的分析方法，步骤如下：
(1)胞外蛋白的收集：按照实施例3中的培养方法，在1,3/1,4-木聚糖液体培养基中培养极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13至对数中期(OD600nm约0.4)，4℃、3,700rpm离心30min收集上清。0.22μm滤膜过滤后，发酵上清中加入10倍体积的丙酮溶液(含10％TCA)，-20℃过夜；
(2)将步骤(1)中的混合液于4℃、8,000rpm离心20min，收集沉淀；沉淀使用80％丙酮溶液洗涤两次、100％丙酮洗涤一次；收集沉淀，室温干燥2h；
(3)变性：将沉淀重悬于50μL变性缓冲液(0.5M Tris-HCl，2.75mM EDTA，6M盐酸胍，pH 8.0)；
(4)还原：向步骤(3)中加入30μL二硫苏糖醇(DTT，1M)，37℃静置2h；
(5)烷基化：向步骤(4)中加入50μL碘乙酰胺(IA，1M)，于暗处、室温静置1h；
(6)缓冲液置换：使用Microcon YM-10超滤管(截留分子量为3,000Da)将(5)中蛋白样品置换至NH4HCO3(25mM)溶液中，并调整样品体积为50μL；
(7)酶解：取2μL胰蛋白酶(0.5mg/mL)与步骤(6)样品充分混匀，37℃反应12h；
(8)脱盐：使用Ziptip C18微量脱盐柱对步骤(7)样品进行脱盐，脱盐后的样品真空冻干后，重溶于10μL三蒸水中。
对上述样品进行纳升级质谱分析，使用Proteome Discoverer 1.4在极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13蛋白序列中匹配肽段，匹配到肽段的质谱图谱总数(PSMs)如表1所示；极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13基因组中的木聚糖酶编码基因分析如表2所示。
表1极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的胞外蛋白谱
Figure BDA0002907004910000051
表2极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13基因组中的木聚糖酶编码基因
Figure BDA0002907004910000052
由表1可知，来自糖苷水解酶第10、26及43家族的木聚糖降解酶(ORF1034、1035、1037)存在于极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的发酵上清中，说明该菌株在1,3/1,4-木聚糖的降解过程中，需要多个木聚糖降解酶的协同作用。
由表2可知，除ORF1034、1035、1037外，在极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的基因组中还存在5个潜在的木聚糖降解酶编码基因(ORF1017、1019、1027、1036、1041)，这些木聚糖酶在1,3/1,4-木聚糖的降解过程中也可能发挥重要作用。
胞外蛋白谱及基因组分析结果表明，极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13具备表达分泌多个木聚糖降解酶的能力及潜力，这些木聚糖降解酶分布于不同的糖苷水解酶家族，对于菌株降解利用1,3/1,4-木聚糖以及后续开发与利用具有重要的意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> 极地杆菌（Polaribacter sp.）Q13
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcggcaggc ttaacacatg caagtcgagg 60
ggtaacattg tgcttgcaca gatgacgacc ggcgcacggg tgcgtaacgc gtatagaacc 120
taccttttac tggagaatag cctttagaaa tgaagattaa tgctccatag tattgagttc 180
cggcatcggg atttaattaa agatttattg gtaaaagatg gctatgcgtc ctattagtta 240
gatggtaagg taacggctta ccatgacatc gataggtagg ggtcctgaga gggagatccc 300
ccacactggt actgagacac ggaccagact cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg 360
gcaatggagg caactctgac ccagccatgc cgcgtgcagg aagactgccc tatgggttgt 420
aaactgcttt tatacaggaa gaaacactgg tatgtatacc agcttgacgg tactgtaaga 480
ataaggaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtcc gagcgttatc 540
cggaatcatt gggtttaaag ggtccgcagg cggtcaatta agtcagaggt gaaatcccat 600
agctcaacta tggaactgcc tttgatactg gttgacttga gtcatttgga agtagataga 660
atgtgtagtg tagcggtgaa atgcatagat attacacaga ataccgattg cgaaggcagt 720
ctactacgaa tgtactgacg ctgagggacg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatggata ctagttgttg ggtgtatgct cagtgactaa 840
gcgaaagtga taagtatccc acctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 900
tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc 960
ttaccagggc ttaaatgtag tatgacagga ctagagatag tttttccttc gggcatatta 1020
caaggtgctg catggttgtc gtcagctcgt gccgtgaggt gtcaggttaa gtcctataac 1080
gagcgcaacc cctgtcgtta gttgccagca agtaaagttg gggactctaa cgagactgcc 1140
tacgcaagta gtgaggaagg tggggatgac gtcaaatcat cacggccctt acgtcctggg 1200
ccacacacgt gctacaatgg tatggacaat gagcagccat ctggcaacag agagcgaatc 1260
tataaaccat atcacagttc ggatcggagt ctgcaactcg actccgtgaa gctggaatcg 1320
ctagtaatcg gatatcagcc atgatccggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcaagcc atggaagctg ggagtgcctg aagtcggtca ccgtgaggag ccgcctaggg 1440
taaaactggt aactagggct aagtcgtaac aaggtagccg taccggaagg tgcggctgga 1500
acacct 1506

Claims (7)

1.一株极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13，2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：CCTCC NO：M 2020985。
2.如权利要求1所述的极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13，其特征在于，所述极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13菌株的培养方法，步骤如下：
(1)取极地杆菌Q13划线接种于TYS固体培养基平板，在18～22℃下倒置培养3～4天；
(2)从TYS固体培养基平板上挑取极地杆菌Q13单菌落，接种至TYS液体培养基，在18～22℃、转速160～200rpm条件下摇床培养至对数中期，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按1～2％的体积百分比接种至1,3/1,4-木聚糖液体培养基，在18～22℃、转速160～200rpm条件下摇床培养，得到扩繁后的极地杆菌Q13。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的TYS固体培养基配方为：0.5wt％蛋白胨，0.1wt％酵母粉，1.5wt％琼脂粉，3wt％人工海水配制，pH 7.8。
5.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述的TYS液体培养基配方为：0.5wt％蛋白胨，0.1wt％酵母粉，3wt％人工海水配制，pH 7.8。
6.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述的1,3/1,4-木聚糖液体培养基配方为：0.01wt％蛋白胨，0.01wt％酵母粉，3wt％NaCl，0.05wt％NH4Cl，0.3wt％MgCl2·6H2O，0.2wt％K2SO4，0.02wt％K2HPO4，0.001wt％CaCl2，0.0006wt％FeCl3·6H2O，0.0005wt％Na2MoO2·7H2O，0.0004wt％CuCl2·2H2O，0.6wt％Tris，0.2wt％1,3/1,4-木聚糖，pH7.8。
7.权利要求1所述的极地杆菌(Polaribacter sp.)Q13在降解利用1,3/1,4-木聚糖中的应用。
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