CN117965491A - 一种烟酰胺核糖激酶突变体、重组基因工程菌及其菌剂以及由其制得的桑叶康普茶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种烟酰胺核糖激酶突变体、重组基因工程菌及其菌剂以及由其制得的桑叶康普茶。本发明提供的烟酰胺核糖激酶突变体同时具有高热稳定性和高催化活性，能够高效催化烟酰胺核糖转化为烟酰胺单核苷酸。本发明提供的表达所述烟酰胺核糖激酶突变体的重组工程菌可用于桑叶康普茶制备，可显著提高桑叶康普茶中NMN的含量，有效提高了康普茶的功能性，具有良好的产业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种烟酰胺核糖激酶突变体、重组基因工程菌及其菌剂以及由其制得的桑叶康普茶。
背景技术
烟酰胺核糖激酶(Nicotinamide riboside kinase,NRK)是一种可以特异性催化烟酰胺核糖(nicotinamide nucleotide,NR)和ATP合成烟酰胺单核苷酸(nicotinamidenucleotide,NMN)的磷酸基团转移酶。NMN作为NAD+的前体之一，其功能通过NAD+体现。NAD+在人体中发挥着至关重要的生物作用，主要包括参与生物氧化还原反应、维持细胞氧化还原稳态及参与信号传导过程。近年来，临床研究发现NMN具有许多药理作用，如调节生物体内NMN的水平对心脏和脑缺血、急性肝肾损伤、阿尔茨海默病、视网膜变性、肥胖以及饮食和年龄引起的Ⅱ型糖尿病等具有较好的治疗和修复作用等。
直接从植物和食物中提取NMN的收率很低；而化学法合成又存在选择性低、生成非对映异构体α-NMN的混合物、反应条件不易控制、大量有机溶剂带来环境污染和安全性等诸多问题。因此，目前NMN主要通过酶法生产。相比之下，生物酶法合成具有底物专一性高、催化效率高、反应条件温和、过程简单且易控制和环境友好、安全性高等优点，成为合成NMN的首选方法。生物酶法以烟酰胺核糖和ATP为底物，借助烟酰胺核苷激酶的催化即可生成NMN。该路线反应速率快、底物转化率高，是目前比较常用的合成路线。但是，目前烟酰胺核苷激酶的热稳定性较差、催化活性较低，限制了NMN的工业化大规模生产。此外，体外的酶法合成NMN仍然需要添加昂贵的ATP，增加了生产的成本。
发明内容
本发明提供一种烟酰胺核糖激酶突变体、重组基因工程菌及其菌剂以及由其制得的桑叶康普茶。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种烟酰胺核糖激酶突变体，所述烟酰胺核糖激酶突变体与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烟酰胺核糖激酶1相比，含有第85位苏氨酸突变为酪氨酸、第134位天冬酰胺突变为半胱氨酸、第119位天冬氨酸突变为酪氨酸和第209位丝氨酸突变为丙氨酸的突变；
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烟酰胺核糖激酶1的GenBank登录号为AY611479.1。
本发明通过以催化活性比较高的酿酒酵母来源的烟酰胺核糖激酶1(ScNRK1，GenBank：AY611479.1)为亲本进行理性设计，经大量筛选得到一个同时具有高热稳定性和高催化活性的烟酰胺核糖激酶突变体，其发生了第85位苏氨酸突变为酪氨酸、第134位天冬酰胺突变为半胱氨酸、第119位天冬氨酸突变为酪氨酸和第209位丝氨酸突变为丙氨酸的突变。
优选地，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MTSKKVILVALSGCSSSGKTTIAKLTASLFTKATLIHEDDFYKHDNEVPVDAKYNIQNWDSPEALDFKLFGKELDVIKQTGKIAYKLIHNNNVDDPFTKFHIDRQVWDELKAKYDSINYDKYEVVIVDGFMIFCNTGISKKFDLKILVRAPYEVLKKRRASRKGYQTLDSFWVDPPYYFDEFVYESYRANHAQLFVNGDVEGLLDPRKAKNIKEFINDDDTPI AKPLSWVCQEILKLCKD。
以上所述的烟酰胺核糖激酶突变体具有高热稳定性和高催化活性，能够高效催化烟酰胺核糖转化为烟酰胺单核苷酸。
本发明提供编码以上所述的烟酰胺核糖激酶突变体的核酸分子。
根据以上所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码所述烟酰胺核糖激酶突变体的核酸分子的核苷酸序列。基于密码子的简并性，所述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码所述烟酰胺核糖激酶突变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
ATGACATCAAAAAAAGTAATCTTAGTGGCCTTATCTGGATGCTCATCAAGCGGTAAAACAACTATTGCCAAGTTGACTGCTTCATTATTCACCAAGGCGACCTTAATTCATGAAGACGATTTCTATAAGCACGATAATGAAGTTCCTGTCGATGCCAAATACAATATCCAAAACTGGGACAGCCCAGAGGCCTTGGATTTTAAACTATTTGGTAAAGAATTAGATGTCATTAAGCAAACCGGTAAGATTGCATATAAGTTGATTCATAATAATAATGTTGACGACCCTTTTACCAAGTTCCACATTGATCGACAAGTTTGGGACGAGTTAAAGGCCAAATATGATTCTATTAACTACGATAAATACGAGGTGGTGATTGTCGACGGGTTTATGATCTTTTGTAACACGGGGATAAGTAAAAAATTTGATTTGAAAATTCTTGTACGTGCTCCATATGAAGTGTTAAAAAAACGTCGTGCCTCACGTAAAGGTTATCAGACATTAGATTCTTTTTGGGTTGATCCTCCTTATTACTTTGATGAATTCGTTTATGAATCATACCGAGCAAATCATGCACAACTTTTTGTAAATGGTGATGTTGAAGGCTTGTTAGATCCTCGAAAAGCAAAGAATATCAAAGAATTTATAAATGACGATGATAC CCCTATAGCCAAACCACTTTCTTGGGTTTGCCAAGAAATTCTAAAGTTATGTAAAGAC。
上述核酸分子可在食品级乳酸菌——乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中高效表达所述烟酰胺核糖激酶突变体。
本发明还提供包含以上所述的核酸分子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
其中，所述表达盒为将所述核酸分子与转录和/或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子等。所述质粒载体包括表达载体、克隆载体。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为含有编码所述烟酰胺核糖激酶突变体的核酸分子的表达载体pNZ8149-ScNRK1M。
所述宿主细胞包括微生物细胞，优选为埃希氏菌属细菌或乳球菌属细菌，更优选为大肠杆菌或乳酸乳球菌。
在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为含有表达载体pNZ8149-ScNRK1M的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000。
本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌表达以上所述的烟酰胺核糖激酶突变体，或者包含以上所述的核酸分子，或者携带以上所述的核酸分子的载体。
本发明通过将含有编码所述烟酰胺核糖激酶突变体的核酸分子的表达载体转入细菌中，成功构建了能够表达烟酰胺核糖激酶突变体的重组基因工程菌。
优选地，所述重组基因工程菌为重组乳酸乳球菌基因工程菌。
在本发明的一些实施方式中，所述重组乳酸乳球菌基因工程菌携带包含编码所述烟酰胺核糖激酶突变体的核酸分子的表达载体。
在本发明的一些实施方式中，所述重组乳酸乳球菌基因工程菌为含有表达载体pNZ8149-ScNRK1M的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000。
本发明提供一种菌剂，所述菌剂包含以上所述的重组基因工程菌。
以上所述的菌剂可为固体菌剂或液体菌剂。除含有以上所述的重组基因工程菌外，还可包含其他微生物和/或微生物领域允许的辅料。
本发明提供以上所述的烟酰胺核糖激酶突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述重组基因工程菌或所述菌剂的以下任意一种应用：
(1)在构建用于生产烟酰胺单核苷酸的工程菌中的应用；
(2)在构建用于转化烟酰胺核糖生产烟酰胺单核苷酸的工程菌中的应用；
(3)在烟酰胺单核苷酸生产中的应用；
(4)在生物催化烟酰胺核糖转化为烟酰胺单核苷酸中的应用；
(5)在生产含烟酰胺单核苷酸产品中的应用。
上述(1)和(2)中，所述工程菌优选为乳酸乳球菌。
进一步地，本发明利用上述重组基因工程菌与其他发酵菌种复配，实现了富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶的制备。
本发明提供一种发酵生产富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶的菌剂，所述菌剂包含以上所述的重组基因工程菌，还包含发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
优选地，所述菌剂包含以上所述的重组基因工程菌以及发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)CICC 20442、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)CICC 20056、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 24234和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CICC23488。
本发明发现，在发酵生产桑叶康普茶的过程中，以上所述的重组基因工程菌能够与发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)CICC 20442、巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)CICC 20056、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 24234和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CICC 23488较好地配合作用，不仅能够显著提高桑叶康普茶中NMN的含量，而且能够有效缩短发酵周期、提高生产效率、降低染菌风险。
优选地，所述菌剂中，以上所述的重组基因工程菌、发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的有效活菌数之比为(105～107)：(105～107)：(105～107)：(105～107)：(105～107)。
本发明提供一种发酵生产富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶的方法，所述方法包括：将包含桑叶、糖类物质和烟酰胺核糖的原料与水混合，煮沸后过滤，得到发酵基液A；
将所述发酵基液A与乳酸链球菌肽混合得到发酵基液B；
将所述发酵基液B与以上所述的发酵生产富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶的菌剂混合后进行发酵。
优选地，所述发酵的条件为：湿度：40～60％、温度：20～30℃；发酵时间：7～10d。
优选地，所述原料包含如下重量份的组分：桑叶1-3份，脱脂奶粉0.5-2份，烟酰胺核糖0.05-0.5份，糖类物质10-30份。
上述糖类物质为选自蔗糖、葡萄糖中的一种或多种。
优选地，所述原料和水的重量份如下：桑叶1.5-2.5份，脱脂奶粉0.8-1.2份，烟酰胺核糖0.1-0.3份，糖类物质15-25份，水150-250份。
在本发明的一些实施方式中，桑叶、脱脂奶粉、烟酰胺核糖、糖类物质和水的质量比为2:1:0.1:20:200。
优选地，所述发酵基液B中，乳酸链球菌肽的终浓度为0.5-1.5ng/mL。
优选地，所述菌剂中，各菌种的浓度为105～107CFU/mL。优选所述菌剂采用发酵基液B稀释各菌种制备得到。
优选地，所述菌剂的接种量为体积百分比3％-5％。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)将包含桑叶、脱脂奶粉、糖类物质和烟酰胺核糖的原料与水混合，煮沸5-15min；过滤，得到发酵基液A；
(2)向步骤(1)所得发酵基液A中加入乳酸链球菌肽，得到发酵基液B；
(3)向步骤(2)所得发酵基液B中接种以上所述的发酵生产富含烟酰胺单核苷酸桑叶康普茶的菌剂，在湿度40～60％、温度20～30℃条件下，静置发酵7～10d，即得发酵原液。
本发明提供一种富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶，其由以上所述的方法制备得到。
优选地，所述桑叶康普茶中，NMN的浓度不低于0.05g/L。更优选不低于0.1g/L。更优选不低于0.2g/L。
本发明的有益效果在于：本发明提供的烟酰胺核糖激酶突变体同时具有高热稳定性和高催化活性，能够高效催化烟酰胺核糖转化为烟酰胺单核苷酸，在催化反应过程中具有较高的稳定性。
本发明提供的表达所述烟酰胺核糖激酶突变体的重组工程菌可用于桑叶康普茶制备，可显著提高桑叶康普茶中NMN的含量，且能够缩短发酵周期、提高生产效率、降低染菌风险。利用上述重组工程菌制备桑叶康普茶的方法的生产周期短、生产效率高，制得康普茶中NMN的浓度最高可达0.3g/L，有效提高了康普茶的功能性，具有良好的产业化前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中烟酰胺核糖激酶突变体(ScNRK1M)的SDS-PAGE图谱；其中，M：PageRuler预染蛋白分子量标准，1：Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8149，2：Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8149-ScNRK1M裂解上清液，3：Lactococcus lactisNZ9000/pNZ8149-ScNRK1M裂解上清液纯化后蛋白。
具体实施方式
本发明借助基因工程技术手段，基于来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的烟酰胺核糖激酶1(ScNRK1，GenBank:AY611479.1)，通过理性设计手段对B-因子波动较大的氨基酸残基进行突变，从而降低该酶的整体能量值，提高其热稳定性，经不断筛选得到一个具有高热稳定性和高催化活性的烟酰胺核糖激酶突变体。
本发明的大致研发过程如下：本发明借助计算机辅助理性设计技术，以催化活性比较高的酿酒酵母来源的烟酰胺核糖激酶1(ScNRK1)为亲本进行理性设计。首先通过AlphaFold 2预测出亲本烟酰胺核糖激酶1(ScNRK1)的三维结构，通过Gromacs 4.5.4软件包对该蛋白进行分子动力学模拟分析，找出该酶中B-因子波动较大的氨基酸残基，并将其中第85位苏氨酸突变为酪氨酸、第134位天冬酰胺突变为半胱氨酸、第119位天冬氨酸突变为酪氨酸和第209位丝氨酸突变为丙氨酸，对突变体的编码基因以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363的密码子使用频率表为参考进行密码子优化，进行全基因合成后，借助食品级的乳酸菌表达质粒pNZ8149成功构建了能够高产NMN的乳酸乳球菌工程菌。其中，烟酰胺核糖激酶突变体的，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示密码子优化后的编码烟酰胺核糖激酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基于上述乳酸乳球菌工程菌，本发明进一步制备了富含NMN的功能性桑叶康普茶。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC24234、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CICC23488、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)CICC 20442和巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)CICC 20056为从中国工业微生物菌种保藏中心购买得到的菌种。
实施例1：烟酰胺核糖激酶的理性改造以及烟酰胺核糖激酶突变体重组载体的构建
以活性较高的酿酒酵母来源的烟酰胺核糖激酶1(ScNRK1)为亲本进行计算机辅助的理性设计。首先通过AlphaFold 2预测出亲本ScNRK1的三维结构，通过Gromacs 4.5.4软件包对该蛋白进行分子动力学模拟分析，找出该酶中B-因子波动较大的氨基酸残基，并将其中第85位苏氨酸突变为酪氨酸、第134位天冬酰胺突变为半胱氨酸、第119位天冬氨酸突变为酪氨酸和第209位丝氨酸突变为丙氨酸，得到烟酰胺核糖激酶突变体ScNRK1M。对突变体的编码基因以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363的密码子使用频率表为参考进行密码子优化，进行全基因合成后，连接至食品级的乳酸菌表达质粒pNZ8149，得到重组载体pNZ8149-ScNRK1M。其中，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的编码烟酰胺核糖激酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：表达烟酰胺核糖激酶突变体的重组基因工程菌的构建
1、重组载体pNZ8149-ScNRK1M转化入宿主细胞：将上述重组质粒利用2000V、5ms电击转化至乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000感受态细胞，加入1mL G/L M17B培养基，冰浴5min后于30℃孵育1h，分别取10、100和900μL菌液涂于含乳糖的M17平板上，30℃培养1～2天得到单克隆菌落；
2、重组菌的筛选与鉴定：挑取单克隆菌落至4mL含有乳糖的M17液体培养基中，在30℃下培养过夜，次日菌液PCR鉴定，并提取质粒利用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，根据电泳结果判断含有与目的基因大小一致的基因片段，初步鉴定该克隆为阳性克隆；然后将阳性克隆送至上海生工进行序列测定，测序结果进一步表明该克隆菌落即是目的基因工程菌。
实施例3：烟酰胺核糖激酶突变体的诱导表达及分析
1、诱导表达：挑选实施例2获得的经鉴定的表达烟酰胺核糖激酶突变体的重组基因工程菌的单菌落接种至5mL M17液体培养基中，在30℃静置培养48h；将静置培养的产物用移液器按2％的接种量接种到100mL的M17液体培养基中，添加乳酸链球菌肽(nisin)母液至终浓度为1ng/mL，在30℃静置培养48h得到经诱导表达的菌液。
将上述经诱导表达的菌液分装入50mL的离心管中，于8000rpm、4℃离心5min，收集菌体，各用50mL去离子水水洗两次，同样条件下收集菌体。将上述每种菌体用100mL裂解缓冲液(PBS缓冲液，pH 7.0)悬浮，使用高压均质机4℃、900bar下破碎细胞3分钟。12000rpm、4℃离心15min，收集裂解上清液，上清液经过Ni-Agarose介质亲和层析纯化，SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形态(图1)。
2、酶性能测定：
(1)酶活测定：对裂解液测定酰胺核糖激酶的活性，酶活测定的方法如下：以烟酰胺核糖(NR)为底物，NMN的生成量为标准计算酶活。酶活测定的反应体系为1mL，包含20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)、10mmol/L MgCl2、2mmol/L ATP、10mmol/L NR，以及稀释适当倍数的100μL酶液，配制完成后混匀，放置在40℃的金属浴中反应20min，沸水中煮5min终止反应，0.22μm的滤膜对反应液进行过滤，用HPLC法(高效液相色谱)测定酶活。液相色谱条件：HPLC色谱柱为Thermo Hypersil C18柱，流动相为甲醇-磷酸缓冲液(5:95，V/V)，在260nm波长下检测，流速1mL/min，柱温30℃，进样体积10μL。在测定条件下每分钟生成1μmol NMN所需的酶量定义为1个单位(IU)。
(2)酶的纯化：利用镍柱将重组烟酰胺核糖激酶突变体进行亲和层析，然后测定纯酶的比活及热稳定性。
结果显示，烟酰胺核糖激酶突变体ScNRK1M纯酶的比活达到4.5IU/mg，在35℃下的半衰期达到160min。同时以突变前的烟酰胺核糖激酶ScNRK1作为对照，结果显示，突变前的烟酰胺核糖激酶ScNRK1纯酶的比活为2.2IU/mg，在35℃下的半衰期仅为65min。结果表明，烟酰胺核糖激酶突变体ScNRK1M的比活及热稳定性较突变前的烟酰胺核糖激酶ScNRK1均有显著提高。
实施例4：富含NMN的桑叶康普茶的制备
1、发酵基液的制备：取10g干桑叶、5g脱脂奶粉、0.5g烟酰胺核糖和100g蔗糖与1000mL的自来水充分混匀，煮沸10min，用8层医用纱布过滤得到发酵基液A，并迅速冷却至室温，然后加入乳酸链球菌肽(nisin)母液至终浓度为1ng/mL，得到发酵基液B，置于无菌的玻璃瓶中，用8层纱布和牛皮纸包扎瓶口防止染菌，保存备用。
2、菌种处理：
(1)表达烟酰胺核糖激酶突变体的Lactococcus lactis工程菌(实施例2制备得到)种子液的制备
将Lactococcus lactis工程菌接种至M17固体培养基，30℃培养48h获得单菌落，挑取单菌落接种至100mL M17液体培养基中，30℃、静置培养48h，离心收集菌体，用1mL发酵基液A洗涤2次，离心收集菌体后再用发酵基液B稀释至105～107CFU/mL；
(2)Lactobacillus plantarum CICC 24234和Lactobacillus casei CICC 23488种子液的制备
将Lactobacillus plantarum CICC 24234和Lactobacillus casei CICC 23488分别接种至M17固体培养基，30℃培养48h获得单菌落，分别挑取单菌落接种至100mL M17液体培养基中，30℃、静置培养48h，离心收集菌体，分别用1mL发酵基液A洗涤2次，离心收集菌体后再用发酵基液B稀释至105～107CFU/mL；
(3)Pichia fermentans CICC 20442种子液的制备
将Pichia fermentans CICC 20442接种在YPD平板上，30℃培养48h获得单菌落，挑取单菌落接种至100mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养48h，离心收集菌体，用1mL发酵基液A洗涤2次，离心收集菌体后再用发酵基液B稀释至105～107CFU/mL；
(4)Acetobacter pasteurianus CICC 20056种子液的制备
将Acetobacter pasteurianus CICC 20056接种在醋酸杆菌琼脂培养基上，30℃培养48h获得单菌落，挑取单菌落接种至100mL醋酸杆菌琼脂培养基中，30℃、200rpm培养48h，离心收集菌体，用1mL发酵基液A洗涤2次，离心收集菌体后再用发酵基液B稀释至105～107CFU/mL。
3、接种及发酵：
分别取1mL步骤2制得的各菌种的种子液混匀，制得康普茶发酵菌剂，将发酵菌剂与发酵基液B按照1:19的体积比混匀，用8层医用纱布包扎瓶口，置于湿度40～60％、温度20～30℃条件下静置发酵10d，所得液体即为桑叶康普茶发酵原液，用HPLC法检测原液中NMN的含量，原液中的NMN含量可达0.3g/L发酵液。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶突变体与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烟酰胺核糖激酶1相比，含有第85位苏氨酸突变为酪氨酸、第134位天冬酰胺突变为半胱氨酸、第119位天冬氨酸突变为酪氨酸和第209位丝氨酸突变为丙氨酸的突变；
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烟酰胺核糖激酶1的GenBank登录号为AY611479.1。
2.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的烟酰胺核糖激酶突变体。
4.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3所述的核酸分子；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
5.一种重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌表达权利要求1或2所述的烟酰胺核糖激酶突变体，或者包含权利要求3所述的核酸分子，或者携带包含权利要求3所述的核酸分子的载体；
优选地，所述重组基因工程菌为重组乳酸乳球菌基因工程菌。
6.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求5所述的重组基因工程菌。
7.权利要求1或2所述的烟酰胺核糖激酶突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的重组基因工程菌或权利要求6所述的菌剂的以下任意一种应用：
(1)在构建用于生产烟酰胺单核苷酸的工程菌中的应用；
(2)在构建用于转化烟酰胺核糖生产烟酰胺单核苷酸的工程菌中的应用；
(3)在烟酰胺单核苷酸生产中的应用；
(4)在生物催化烟酰胺核糖转化为烟酰胺单核苷酸中的应用；
(5)在生产含烟酰胺单核苷酸产品中的应用。
8.一种发酵生产富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶的菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求5所述的重组基因工程菌，还包含发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)；
优选地，所述菌剂包含权利要求5所述的重组基因工程菌以及发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)CICC 20442、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)CICC 20056、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 24234和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CICC23488；
更优选地，所述菌剂中，权利要求5所述的重组基因工程菌、发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的有效活菌数之比为(105～107)：(105～107)：(105～107)：(105～107)：(105～107)。
9.一种发酵生产富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶的方法，其特征在于，所述方法包括：将包含桑叶、糖类物质和烟酰胺核糖的原料与水混合，煮沸后过滤，得到发酵基液A；
将所述发酵基液A与乳酸链球菌肽混合得到发酵基液B；
将所述发酵基液B与权利要求8所述的发酵生产富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶的菌剂混合后进行发酵；
优选地，所述发酵的条件为：湿度：40～60％、温度：20～30℃；发酵时间：7～10d；
和/或，所述原料包含如下重量份的组分：桑叶1-3份，脱脂奶粉0.5-2份，烟酰胺核糖0.05-0.5份，糖类物质10-30份。
10.一种富含烟酰胺单核苷酸的桑叶康普茶，其特征在于，其由权利要求9所述的方法制备得到。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410112070.XA CN117965491A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 一种烟酰胺核糖激酶突变体、重组基因工程菌及其菌剂以及由其制得的桑叶康普茶 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410112070.XA CN117965491A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 一种烟酰胺核糖激酶突变体、重组基因工程菌及其菌剂以及由其制得的桑叶康普茶 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN117965491A true CN117965491A (zh) | 2024-05-03 |
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ID=90859062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202410112070.XA Pending CN117965491A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 一种烟酰胺核糖激酶突变体、重组基因工程菌及其菌剂以及由其制得的桑叶康普茶 |
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| CN (1) | CN117965491A (zh) |
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2024
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