CN108102974B - 一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法 - Google Patents

一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls‑1001菌株培养方法，包括以下步骤：将冻藏的旧金山乳杆菌斜面菌种用灭过菌的生理盐水进行稀释，直至测得在600nm处的吸光度值A=0.5为止，然后按体积分数为2%接种到100mL添加有生长促进因子的液体培养基中进行厌氧培养，培养基pH为5.0‑5.4，培养温度是30‑32℃，培养34‑36小时。本发明使旧金山乳杆菌Ls‑1001的菌种产量、胞外多糖产量与之前相比分别提高了4.6倍、1.4倍，培养时间缩短了10‑12h，具有明显的增产效果，也为今后工业化生产奠定了基础。

Description

一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法
技术领域
本发明涉及一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法，属于食品微生物
领域。
背景技术
酸面团，在我国一般被称为“老面”、“酵子”、“面肥”等，具有悠久的使用历史。上世纪80 年代，即发活性干酵母被引入我国，因其使用便捷，传统面食发酵剂逐渐被取代，但直到现在仍有很多地区尤其农村地区，仍然使用其制备馒头等主食，因使用传统面食发酵剂制备的馒头品质更优。究其原因，是其中复杂的微生物体系使得发酵的馒头风味香气最佳，对感官品质有较好的影响。而旧金山乳杆菌的应用对发酵面制品的风味、色泽、保存期等具有良好的效果。
旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis），一种专性异型发酵乳酸菌，是面制品发酵过程中重要的乳酸菌，在酸面团的发酵过程中起着重要的作用。旧金山乳杆菌可水解麦芽糖释放葡萄糖。此外，旧金山乳杆菌产生的胞外多糖（EPS）对改善面包的比容、结构品质、硬度、稳定性和保存期限均有很好的作用。据文献报道，乳酸菌产生的胞外多糖还具有抗肿瘤作用。Antonio Alfonzo等人的研究表明从面粉中分离出的旧金山乳杆菌菌株表现出抗李斯特菌活性。
目前，以活性干酵母为发酵剂蒸制的馒头口感单一、风味略显不足，而旧金山乳杆菌的添加能使面包具有更好的风味和质地，且效果显著。因此，该菌具有良好的研究价值和发展前景。但目前针对旧金山乳杆菌菌种的工业化生产尚未成熟，究其原因主要是对菌种的特性和培养条件尚未清晰认识。本实验以实验室保藏菌株高产胞外多糖的旧金山乳杆菌Ls-1001，对其培养条件进行了研究，获得了旧金山乳杆菌Ls-1001的培养方法，为旧金山菌种的工业化生产提供理论参考依据。
发明内容
本发明旨在提供一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法，以实验室保藏菌株高产胞外多糖的旧金山乳杆菌Ls-1001，对其培养条件进行了研究，获得了旧金山乳杆菌Ls-1001的培养方法，为旧金山菌种的工业化生产提供理论参考依据；该方法能够有效提高菌种产量。
本发明采用的菌株为旧金山乳杆菌，其菌株为旧金山乳杆菌Ls-1001，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年6月12日，保藏编号：CGMCC No.14232，分类命名：旧金山乳杆菌Lactobacillus sanfrancisco。
本发明提供了一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法，包括以下步骤：
旧金山乳杆菌Ls-1001的富集培养：将冻藏的斜面菌种用灭过菌的生理盐水进行稀释，直至测得在600nm处的吸光度值A=0.5为止，然后按体积分数为2%接种到100mL添加有生长促进因子的液体培养基中进行厌氧培养，培养基pH为5.0-5.4，培养温度为30-32℃，培养时间为34-36h。
上述培养方法中，旧金山乳杆菌为保藏编号：CGMCC No.14232的旧金山乳杆菌菌株。
上述培养方法中，所述的液体培养基mMRS培养基。培养基的组成成分为：
mMRS培养基：9.8-10.2g/L蛋白胨，4.8-5.2g/L酵母粉，9.8-10.2g/L牛肉浸粉，19.5-20.5g/L麦芽糖，4.8-5.2g/L乙酸钠，1.8-2.2g/L磷酸氢二钾，1.8-2.2g/L柠檬酸铵，0.18-0.22g/L硫酸镁，0.03-0.07g/L硫酸锰，0.8-1.2mL/L吐温80，pH5.0-5.4。
上述培养方法中，所述的的生长促进因子为复合B族维生素。
复合B族维生素的组成为：维生素B1：8.0-8.5mg/L；维生素B2：8.0-8.5mg/L；维生素B6：8.0-8.5mg/L；维生素B12：10-12μg/L；生物素：55-60μg/L。
厌氧条件中各气体的组成为N2、CO2、 O2，其体积百分比为79:20:1。
优选的培养方法为：将冻藏的旧金山乳杆菌斜面菌种用灭过菌的生理盐水进行稀释，直至测得在600nm处的吸光度值A=0.5为止，然后按体积分数为2%接种到100mL添加有复合B族维生素的mMRS培养基中进行厌氧培养，mMRS培养基的组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L牛肉浸粉，20g/L麦芽糖，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，2g/L柠檬酸铵，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，1mL/L吐温80，pH5.4；培养温度是30℃，培养39小时。
旧金山乳杆菌菌种广泛存在于发酵面制品中，但是同种不同株的旧金山乳杆菌具有不同的特性，例如不同菌株对乙醇耐受性不同，胞外多糖产量有差异。针对这株高产胞外多糖的旧金山菌株Ls-1001，需要对其培养条件进行系统优化，获得最佳培养方法，为其工业化培养奠定基础。
旧金山乳杆菌是自然发酵谷物制品中的常见的菌种，谷物制品中富含B族维生素，对其生长有促进作用，因此，本专利在添加复合B族维生素进行优化后，对旧金山乳杆菌的生长具有促进作用。目前关于旧金山菌种的国内报道较少，而国外Christiane B等人在研究中曾报道了培养基中添加包含叶酸、烟酸酰胺、泛酸、磷酸吡哆醛复合B族维生素，其中添加量均为0.2g/L，且培养时间为48h。本试验通过优化不仅确定了B族维生素的含量分别为：维生素B1：8.0-8.5mg/L、维生素B2：8.0-8.5mg/L、维生素B6：8.0-8.5mg/L、维生素B12：10-12μg/L、生物素：55-60μg/L，而且将菌种的培养时间缩短了10-12h，这个试验组合对旧金山乳杆菌Ls-1001菌株具有促进生长的作用。
本发明的有益效果：经过优化后，旧金山乳杆菌Ls-1001的菌种产量、胞外多糖产量与之前相比分别提高了4.6倍、1.4倍，培养时间缩短了10-12h左右，具有明显的增产效果，也为今后工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1 为不同培养基对旧金山乳杆菌Ls-1001生长的影响；
图2 为生长因子对旧金山乳杆菌Ls-1001菌种产量的影响；
图3 为不同时间对旧金山乳杆菌Ls-1001菌种产量的影响；
图4 为培养条件优化前后胞外多糖产量的比较。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。
下述实施例分别提供了高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法，包括以下步骤：将冻藏的斜面菌种用灭过菌的生理盐水进行稀释，直至测得在600nm处的吸光度值A=0.5为止，然后按体积分数为2%接种到100mL添加有生长促进因子的液体培养基中进行厌氧培养，培养基pH为5.0-5.4，培养温度为30-32℃，培养时间为34-36h。每个实施例通过改变不同的参数来进行实验，同时给出了每组实验的效果比较图。
实施例1：
本实施例选取了五种培养基分别进行实验：
①SDB培养基：6g/L蛋白胨，3g/L酵母粉，20g/L麦芽糖，0.03%吐温80（3mL10%吐温/L），1.5%鲜酵母提取液，pH5.6；
进一步地，鲜酵母提取液的配制方法为：20%市售高活性干酵母溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌30min，冷却后于4℃过夜放置，离心分装，-80℃保存。
②MRS培养基：10g/L蛋白胨，4g/L酵母粉，5g/L牛肉浸粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，2g/L柠檬酸铵，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，1mL/L吐温80，pH5.4。
③mMRS培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L牛肉浸粉，20g/L麦芽糖，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，2g/L柠檬酸铵，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，1mL/L吐温80，pH5.4。
④SFM培养基：10g/L蛋白胨，7g/L酵母粉，2g/L牛肉浸粉，7g/L葡萄糖，7g/L麦芽糖，7g/L果糖，5g/L乙酸钠，2.5g/L磷酸二氢钾，5g/L柠檬酸铵，2g/L葡萄糖酸钠，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，0.5g/L半胱氨酸盐酸，0.01g/LFeSO4，1.5%鲜酵母提取液，pH5.4。
⑤MRS5培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L牛肉浸粉，5g/L葡萄糖，10g/L麦芽糖，5g/L果糖，5g/L乙酸钠，2.6g/L磷酸氢二钾，4g/L磷酸二氢钾，0.1g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，0.5g/L半胱氨酸盐酸，1mL/L吐温80，3g/LNH4Cl，1g/L复合B族维生素，pH5.8。
采用不同的培养基进行实验时，其他参数为：培养温度30℃，培养时间36h。
图1示出了不同培养基对旧金山乳杆菌Ls-1001生长的影响，由图1可知，在不同的培养基条件下，旧金山乳杆菌的富集程度具有明显的差异。当选用mMRS作为培养基时，旧金山乳杆菌表现出了很好的富集性，活菌数可达到5.65×109 CFU/mL；MRS5培养基和MRS培养基与mMRS培养基相比，表现出一定的抑制性，活菌数较少。因此，mMRS培养基适宜旧金山乳杆菌Ls-1001的生长。
实施例2生长因子的筛选
在最佳培养基mMRS的基础上，研究两种生长因子复合B族维生素、鲜酵母提取液，添加量分别1.0g/L、15mL/L。发酵培养基中种子液的接种量为1%，培养温度为30℃，初始pH为5.4，置于厌氧培养箱中静止培养36h，测定培养液的菌落数。
图2 示出了生长因子对旧金山乳杆菌Ls-1001菌种产量的影响，由图2可知，复合B族维生素相对于鲜酵母提取液对菌株的生长影响更为显著，活菌数高达2.77×108CFU/mL。因此选择复合B族维生素作为旧金山乳杆菌Ls-1001的生长促进因子。
实施例3不同时间下菌种的产量
图3 示出了不同时间下旧金山乳杆菌Ls-1001菌种产量的变化，由图3可知，当培养时间到达36h后菌落数趋于稳定。由此可得出，旧金山乳杆菌Ls-1001的最佳培养时间为36h，与之前Christiane B等人报道的时间48h有了明显的缩短。
实施例4最佳培养条件下菌种胞外多糖产量
图4 给出了培养条件优化前后胞外多糖产量的比较，根据图4可知，培养条件优化后，各菌种的胞外多糖产量有了明显的提高，说明此优化方案有利于菌株生产胞外多糖。由图还可知，Ls-1001菌株在培养条件优化前后均为胞外多糖产量最高的菌株。
序列表
<110> 山西大学
<120> 一种高产胞外多糖旧金山乳杆菌Ls-1001菌株培养方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> DNA
<213> 旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)
<220>
<221> gene
<223> GGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTCGCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAGCCGTGAGAGCAACTGCTCATGGTATGACGGTATCTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAAGGGCAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGT
<400> 1

Claims (1)

1.一种产 胞外多糖旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）Ls-1001菌株培养方法，其特征在于包括以下步骤：将冻藏的保藏编号为CGMCC No.14232的旧金山乳杆菌斜面菌种用灭过菌的生理盐水进行稀释，直至测得在600nm处的吸光度值A=0.5为止，然后按体积分数为2%接种到100mL添加有生长促进因子的液体培养基中进行厌氧培养，培养基pH为5.0-5.4，培养温度是30℃，培养36小时；
所述液体培养基为mMRS培养基；培养基的组成成分为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L牛肉浸粉，20g/ L麦芽糖，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，2g/L柠檬酸铵，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰， 1mL/L吐温80，pH5.4；
所述生长促进因子为复合B族维生素；复合B族维生素的组成为：维生素B1：8.0-8.5mg；维生素B2：8.0-8.5mg；维生素B6：8.0- 8.5mg；维生素B12：10-12μg；生物素：55-60μg；
厌氧培养中各气体的组成为N2、CO2、O2，其体积百分比为79:20:1。
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