CN109554304A - 一株胞外多糖产生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产胞外多糖的中度嗜盐菌Planococcus sp.LCB217，其保藏号为KCTC 33861。采用生理生化鉴定等多相分类手段，确定该新种为革兰氏阳性，好氧，呈球状，细胞直径大小为0.6–1.0μm，单菌落呈红橙色，形状呈圆形规则，边缘光滑。该菌株能在含有8%(w/v)NaCl的发酵培养基中产生并分泌胞外多糖，可应用于微生物胞外多糖相关领域。同时，该菌株具有氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、类脂酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶以及胰凝乳蛋白酶等酶活性，可广泛地应用于各类生物工程酶制剂的生产领域。

Description

一株胞外多糖产生菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体地说，本发明涉及一种能产生分泌胞外多糖的中度嗜盐动性球菌及其应用的技术领域。
背景技术
微生物胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。相较于动物多糖和植物多糖，微生物产生分泌的多糖具有生产周期短，受地理环境、气候、自然灾害等因素的影响较小，产量及质量都很稳定，性价比较高等优势；因其具有独特的物理学、流变学特性以及使用安全性，故而在食品和非食品工业倍受青睐，同时在医药领域所具有的巨大应用潜能正日益引起人们的广泛关注。
近年来，有关微生物胞外多糖的应用探索和新型多糖产生菌的选育从未间断，不断有新的微生物胞外多糖产品被发掘，其应用领域也扩展到石油开采、化工、制药、细菌诊断、免疫及癌症预防等方面。大量研究表明，微生物产生的EPS具有多样化结构多糖的潜在的特殊有益生物活性如抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、免疫调节以及生物絮凝等，已成为医学领域研究的焦点，同时越来越多的EPS被作为商业合成化学药物的替代品。
嗜盐微生物所处的高盐极端环境，赋予其独特的生化结构和生存机制。在高盐胁迫下，其物种长期进化过程中，为适应生存环境，经过不断演化，逐渐形成了独特的生物活性物质合成或代谢途径、新的调控机制以及与特异的生理生化相关的新的基因，进而能够产生普通生物没有的生物活性物质。研究表明，嗜极微生物生长在极端环境下，必定会就特殊条件产生应激反应，然后在其细胞表面形成一层胞外多糖“保护膜”，进而可降低低温、高盐、高压等极端环境条件对微生物自身造成的损害。而且，由于现阶段嗜盐菌的相关研究程度比较低，有大量新类型还没有被发行和认识，因而理论研究和应用实践上均具有很大的潜力，尤其是嗜盐新物种，作为新的未被开发的物种类群，其新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的新颖性和多样性，这为合成分泌具有独特生物活性的胞外多糖提供无限的可能。
新的微生物多糖产品的开发、市场拓展以及应用领域的扩大，有赖于微生物多糖产生菌菌种选育、对多糖结构性能和多糖代谢途径的认识以及发酵工艺的优化。为提高微生物多糖产量和加快其产业化进程，我们可以从以下几个方面去努力：（1）继续从自然界中筛选更好的适合发酵的原始出发菌株或者通过诱变育种等手段来获得性能优良的发酵菌种；（2）加强对胞外多糖生物合成途径关键酶的研究，强化表达关键酶的基因或者改变代谢流，从而对现有产生菌进行遗传改造； （3）进一步优化菌种发酵过程工艺参数，以最大力度地提高胞外多糖的产量和质量。
发明内容
针对国内外有关微生物胞外多糖的研究现状，本发明提供一种新的胞外多糖产生菌。所述的胞外多糖产生菌具有氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)以及亮氨酸芳胺酶等酶活活性，同时与动性球菌属中已有效发表菌种的16S rRNA基因序列相似度最高，且最高相似度为98.2 %，这可明显区别于已公开报道的其它有效菌种。
本发明提供一株中度嗜盐的动性球菌Planococcus sp. LCB217。
本发明以含有高盐浓度培养基为筛选条件，采用稀释涂布平板法对甘肃省敦煌玉门关的盐碱土中的嗜盐耐盐微生物进行富集培养、分离及纯化，经多级筛选获得一株能分泌胞外多糖的嗜盐菌，即动性球菌Planococcus sp. LCB217。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，保藏时间为2016年11月28日，保藏号是KCTC 33861，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和生物技术研究所，邮编是305-806。
选择同源关系最近的3株模式菌Planococcus plakortidis AS/ASP6 (II)T,Planococcus maitriensis S1T 和Planococcus salinarum ISL-16T 作为参考菌株，按照《放线菌系统学》和《常见细菌系统鉴定手册》对动性球菌Planococcus sp. LCB217进行多相分类鉴定的研究，主要包括形态学特征、生长特性、生理生化特征、极性脂组成、细胞壁肽聚糖类型、呼吸醌醌型、脂肪酸成分以及DNA(G+C)含量等分类鉴定指标分析，同时分别采用API ZYM系统和Biolog系统来测试其酶活特性及碳源利用情况。
本发明通过提取细菌基因组DNA，经PCR扩增其16S rRNA基因后送样测序，然后将序列上传至EzBioCloud进行在线比对分析。根据分析结果，将与其相似性度较高的相关模式菌株的16S rRNA基因序列从EzBioCloud数据库调出，再利用Clustal W进行多序列匹配排列，并通过软件MEGA5.2以邻近连接法（Neighbor-Joining method, N-J）和最大似然法（Maximum Likelihood method, ML）其构建系统发育树以进一步确定其分类地位。
采用Sanger法测定Planococcus sp. LCB217的16S rRNA基因序列，测序结果表明其序列全长约为1521bp（GenBank登录号：KX008965）。基于16S rRNA基因的系统发育分析表明Planococcus sp. LCB217与动性球菌属的所有模式菌聚集在一起且单独呈一支，且与之相邻分支上亲缘性最近的3株模式菌Planococcus plakortidis AS/ASP6 (II)T,Planococcus maitriensis S1T 和Planococcus salinarum ISL-16T的16S rRNA基因序列相似度分别为98.2 %、97.7 %和97.2 %，结合表型、生理生化、化学分类及DNA-DNA杂交等比较数据分析可知Planococcus sp. LCB217为动性球菌属的一个新种。
通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。
本发明的动性球菌Planococcus sp. LCB217为中度嗜盐的好氧菌，革兰氏阳性，运动性，细胞呈直径大小为0.6–1.0 μm的球状，单菌落呈红橙色，形状呈圆形规则，边缘光滑。NaCl浓度的生长范围为3–15 %（最佳NaCl浓度生长范围为3–5 %），生长温度范围为10–45 ℃（最佳生长温度为30 ℃），pH生长范围为7.0–9.0（最佳生长pH为9.0）。该菌株能在含有8 % (w/v) NaCl 的发酵培养基中产生并分泌胞外多糖，同时该菌株还具有氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、类脂酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、 胱氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶以及胰凝乳蛋白酶等酶活性，可广泛地应用于各类生物工程酶制剂及微生物胞外多糖的生产领域。
附图说明：图1是菌株Planococcus sp. LCB217于扫描电子显微镜20000倍下所观察的形状特征照片。
下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。
具体实施方法
实施例一：动性球菌Planococcus sp. LCB217的筛选和分离
样品采自采自甘肃省敦煌玉门关的盐碱土。将1 g土样加入装有9 mL无菌水的试管中，涡旋振荡，然后用移液枪移取1 mL悬液至装有9 mL无菌水的试管，依次配制成10-1~10-6倍数的土壤稀释悬液，分别移取100 μL涂布于筛选培养基平板上，倒置于37 ℃下培养72 h后，观察菌落的生长状况及形态特点，用无菌竹签挑取单菌落转移至新鲜的LB+10 % (w/v)NaCl (pH=8.0)固体培养基进行划线纯化，于相同条件下培养，挑选出单菌落再次纯化，重复多次，最后挑取单菌落转接至LB斜面培养基，置于4 ℃短期保藏，同时取新鲜培养物加入灭菌的20 % (w/v)甘油，置于-80 ℃作长期保藏。将纯化后编号为LCB217的单菌落进行多相分类鉴定。所用培养基配方如下：
富集及筛选培养基：分别称取7.5 g酪蛋白胨、10 g酵母粉、100 g NaCl 和1.5 mLMS混合液[浓度为0.05g/L相容性物质(甜菜碱，脯氨酸，甘氨酸，D-山梨醇，谷氨酸盐)混合液]，加入1000 mL蒸馏水，调节pH至8.0，再加入20 g 琼脂粉搅拌加热溶解后，分装，置于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。纯化及基础培养基：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、50 gNaCl，加入1000 mL蒸馏水搅拌至溶解，调节pH至8.0，再加入20 g 琼脂粉搅拌加热溶解后，分装，置于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。
菌种描述：
细胞为革兰氏阳性，好氧，运动性球菌0.6–1.0 μm。在LB+5 % (w/v) NaCl的固体平板上于30 ℃培养3 d后，菌落为不透明的圆形状，呈红橙色，表面光滑且略有凸起，边缘规则，单菌落直径约1–2 mm。氧化酶和过氧化氢酶均为阳性。NaCl的耐受范围为3-15 %（最佳盐浓度为3-5 %），生长温度范围为10-52 ℃（最佳生长温度为30 ℃），pH生长范围为7.0–9.0（最佳生长pH为9.0）。吲哚产生和硝酸盐还原实验均为阳性，但MR实验、V-P实验及H2S产生实验均为阴性。同时，可水解吐温20、吐温40和吐温60，不能水解淀粉、纤维素、尿素、明胶和吐温80。细胞壁肽聚糖类型为A4α (L-Lys–D-Glu)，细胞膜主要的甲基萘醌为MK-7和MK-8。全细胞的极性脂由双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、一种未知结构的磷脂(PL)、一种未知结构的氨磷脂(APL)和一种未知结构的脂质(L)组成，其主要脂肪酸为anteiso-C15:0, iso-C14:0 和iso-C16:0。基因组DNA (G+C)含量为49.4mol%。
实施例二：动性球菌Planococcus sp. LCB217的生长特性
分别配制NaCl浓度为0 %、3 %、5 %、7 %、10 %、12 %、15 %、17 %和20 % (w/v)的LB液体培养基(pH=8.0)，每个梯度设置三个平行，将新鲜种子液定量接种于每支试管中，置于30℃、180 rpm下摇床培养48 h，取出测定其OD600值，从而确定其NaCl浓度的耐受范围及最佳生长浓度；同理，分别用缓冲体系（pH 4.0–5.0: 0.1 M citric acid/0.1 M sodiumcitrate; pH 6.0–8.0: 0.1 M KH2PO4 /0.1 M NaOH; pH 9.0–10.0: 0.1 M NaHCO3/0.1 MNa2CO3; pH 11.0: 0.05 M Na2HPO4 /0.1 M NaOH）配制成pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的LB+5 % (w/v) NaCl的液体培养基，接种培养后分析其pH耐受范围及最佳生长pH；结合本实验现有条件以及综合考虑测定结果的可靠性及准确性，在测定实验菌株温度生长范围过程中，配制LB+5 %（w/v）NaCl液体培养基及固体培养基（pH=8.0），将新鲜种子液定量接种于每支试管中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、52℃和60℃下，以180rpm摇床培养48h后，取出测定其OD600值；同时将固体平板划线接种后置于4℃和10℃培养两周，观察其生长状况；最后确定实验菌株的生长温度范围及最佳生长温度。结果表明，该动性球菌Planococcus sp. LCB217的NaCl耐受范围为3-15 %（最佳盐浓度为3-5%），生长温度范围为10-52 ℃（最佳生长温度为25–30 ℃），pH生长范围为7.0–9.0（最佳生长pH为9.0）。
实施例三：动性球菌Planococcus sp. LCB217的酶学特性
采用API ZYM系统检测该菌株酶活，试验条是由20个小管所组成，每个反应管底部含有特殊设计的酶底物及其缓冲液支持物，将细菌悬液接种于反应管后，底物会被溶解，再经过37℃孵育4h后加入显色剂进行反应，待反应5min后，置于1000瓦灯泡下照射10s以消除多余坚牢蓝的影响，判断实验结果并记录颜色深度，若生色则为阳性，颜色越深则阳性反应越强；反之，若为无色则为假阳性即阴性。测试结果表明，该菌株碱性磷酸酶等酶活性。
实施例四：动性球菌Planococcus sp. LCB217的系统发育分析
采用酶解法提取Planococcus sp. LCB217的基因组DNA， PCR扩增其16S rRNA基因，经电泳检测合格后送样于上海生工完成测序，再将获得16S rRNA基因序列提交至NCBI 的GenBank，同时将其16S rRNA基因序列上传至EzBioCloud进行在线比对分析。将16S rRNA基因序列和与其同源性关系较近的相关模式菌株的16S rRNA基因序列从数据库中调出，然后利用Clustal W进行多序列比对，并通过软件MEGA5.2以邻近连接法（Neighbor-Joiningmethod, N-J）和最大似然法（Maximum Likelihood method,ML）其构建系统发育树。PCR所使用的引物、反应体系和条件详细如下：细菌通用引物27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 1492R: 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT；25 μL反应体系：1 μL DNA模板，2.5 mM Mg2+ ，2.5 μL 27F，2.5 μL 1492R，0.75 μL dNTPs，13 μL ddH2O，0.25μL Taq DNA polymerase，2.5 μL Taq Buffer；反应条件设定为：94 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30s；72 ℃延伸1 min 45 s，循环35次，最后再72 ℃保温10 min。
实施例五：动性球菌Planococcus sp. LCB217的产胞外多糖能力筛查
配制含有8 % NaCl的产胞外多糖发酵培养基，接种后置于30 ℃、180 rpm下摇床培养72 h后，取一定量的发酵液加入终浓度为4 %三氯乙酸后，于35 ℃下振荡30 min以灭活并沉淀胞外多糖水解酶，然后以10000 r/min离心20 min，取上清，加入3倍体积的预冷无水乙醇沉淀多糖，4℃放置过夜，若产生絮状沉淀，即可确定该菌株能够产胞外多糖。筛查结果表明，该动性球菌Planococcus sp. LCB217具备有大量产生并分泌胞外多糖的能力，因此有望被广泛应用于微生物胞外多糖及相关生产领域。
实施例六：动性球菌Planococcus sp. LCB217的应用
配制LB+ 8 % (w/v) NaCl+1 % Tween 20/ Tween 40/Tween 60/Tween 80 的培养基平板，划线接种后倒置于30℃培养一周，注意每天观察，若生长的菌落周围现模糊的晕圈即为阳性；反之，如没有显示晕圈，则为阴性。试验结果显示，该动性球菌Planococcus sp.LCB217可分别在含有Tween 20、Tween 40和Tween 60的酯酶试验培养基上产生水解晕圈，表明其在酯酶相关生产领域具有广泛开发应用前景。

Claims (2)

1.一株产胞外多糖嗜盐菌Planococcus sp. LCB217，其保藏编号为KCTC 33861。
2.如权利1所述的动性球菌Planococcus sp. LCB217，其特征为中度嗜盐的好氧菌，革兰氏阳性，运动性，呈球状，细胞直径大小为0.6–1.0 μm，单菌落呈红橙色，形状呈圆形规则，边缘光滑；NaCl浓度的生长范围为3–15 %（最佳NaCl浓度生长范围为3–5 %），生长温度范围为10–45 ℃（最佳生长温度为30 ℃），pH生长范围为7.0–9.0（最佳生长pH为9.0）；吲哚产生和硝酸盐还原实验均为阳性，但MR实验、V-P实验及H2S产生实验均为阴性；同时，可水解吐温20、吐温40和吐温60，不能水解淀粉、纤维素、尿素、明胶和吐温80，细胞壁肽聚糖类型为A4α (L-Lys–D-Glu)，细胞膜主要的甲基萘醌为MK-7和MK-8；全细胞的极性脂由双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、一种未知结构的磷脂(PL)、一种未知结构的氨磷脂(APL)和一种未知结构的脂质(L)组成，其主要脂肪酸为anteiso-C15:0, iso-C14:0 和iso-C16:0，基因组DNA (G+C)含量为49.4 mol%。
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