CN1916160A

CN1916160A - 一种快速高效筛选嗜盐菌的方法

Info

Publication number: CN1916160A
Application number: CN 200610010486
Authority: CN
Inventors: 马放; 李维国; 苏俊峰; 王光玉
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2006-09-04
Filing date: 2006-09-04
Publication date: 2007-02-21

Abstract

一种快速高效筛选嗜盐菌的方法，涉及一种利用试管斜面培养法快速高效筛选嗜盐菌的方法。为了克服传统平板培养的嗜盐菌生长速度缓慢的弊端，本发明按照如下步骤筛选嗜盐菌：a.将采集的嗜盐菌样品置于盛液体培养基的三角瓶中，在光照条件下摇床培养，富集菌体；b.然后用接菌环取一环富集培养液在预先制备好的大试管固体培养基斜面上连续划曲线；c.然后在培养箱培养，获得斜面单菌落；d.仔细观察斜面，挑取具有嗜盐菌典型特征的菌落再次在大试管固体培养基斜面上连续划线，培养，如此反复三次进行分离纯化，得到纯培养嗜盐菌菌株。本方法自始至终采用大试管斜面培养技术，实现了快速、高效筛选嗜盐菌的目的，提高效率3－4倍。

Description

一种快速高效筛选嗜盐菌的方法

技术领域

本发明涉及一种利用试管斜面培养法快速高效筛选嗜盐菌的方法。

背景技术

近年来，在许多以前被认为是生命禁区的区域，发现了各种各样的新的生命形式。它们生存繁衍的场所恰恰是一些极端环境，如嗜盐菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜压菌等，这些统称为极端微生物。极端微生物具有独特的基因类型，特殊的生理机制和特殊的代谢产物，作为地球上的边缘生命现象，极端微生物颇为耐人寻味。它在生命起源、系统进化等方面将给人们许多重要的启示，在生命行为的原理上也将拓展人们的概念。目前，极端微生物已成为国际研究的热门领域，日本、美国及欧洲的许多国家都启动了极端微生物的研究计划，在揭示极端生命形式的奥秘，利用其特殊机制和特殊产物等方面共同努力并展开竞争，已形成了国际趋势。

嗜盐微生物通常生活在盐湖、盐碱地、海水、晒盐池和盐渍食物等高盐环境中，属于极端环境微生物。嗜盐微生物具有独特的基因类型，特殊的生理机制和特殊的代谢产物，因而嗜盐微生物的研究将在开发新的微生物资源，在微生物生理、遗传和分类乃至生命科学及其相关学科许多领域，如功能基因组学、生物电子器材等的研究、生物进化、生命起源研究等方面提供理论资料；嗜盐微生物又具有极大的应用价值，其特殊机制及特殊产物(如，视紫红质、相似性溶质、酶、多聚物、脂质体)，将使某些新的生物技术手段成为可能，它是奠定高效率低成本生物技术新工艺的基础，嗜盐微生物的应用将改变整个生物技术的面貌。嗜盐微生物在能源、食品、生物电子、制盐、医药、培育转基因植物以及环境整治等方面正显示出巨大的开发潜力。

我国具有广阔的盐域环境和比较丰富的嗜盐微生物资源，正等待我国科学工作者大力开发和探索，因此快速高效筛选嗜盐菌菌种意义十分重大。

以往人们筛选嗜盐菌都是采用平板分离法，但由于嗜盐菌在平板上生长非常缓慢，而且长时间培养中的平板水分过度蒸发，致使菌体周围盐度大增，渗透压增加，不利于菌体生长，进而使嗜盐菌生长更加缓慢，给嗜盐菌筛选造成困难，往往长时间得不到纯化的嗜盐菌菌株，筛选菌种的效率极低，使嗜盐菌这一宝贵的生物资源不能迅速得到开发。

发明内容

为了克服传统平板培养的嗜盐菌生长速度缓慢的弊端，本发明的目的是提供一种快速高效筛选嗜盐菌的方法。

本发明按照如下步骤筛选嗜盐菌：a、将采集的嗜盐菌固体样品1g或液体样品1ml置于盛100mL液体培养基的300mL三角瓶中，在光照条件下33-37℃、120r/min摇床培养3-5d，富集菌体；b、然后用接菌环取一环富集培养液在制备好的大试管固体培养基斜面上连续划曲线；c、然后在培养箱33-37℃下培养2-4d，获得斜面单菌落；d、仔细观察斜面，挑取具有嗜盐菌典型特征的菌落再次在固体培养基试管斜面上连续划线，培养，选取斜面单菌落再次在无菌斜面上连续划线，如此反复三次进行分离纯化，得到纯培养嗜盐菌菌株。

本发明采用大试管固体培养基斜面培养法进行分离纯化及保藏，并非传统的平板培养法进行分离纯化。采用试管斜面分离纯化和培养是因为斜面表面水分散失的速度非常缓慢，菌体生长的环境改变不大，因此菌体生长较快。一般比平板培养要快3-4倍。因此筛选嗜盐菌菌株的效率也就大大提高。

本方法自始至终采用试管斜面培养技术，大大加快了嗜盐菌的生长速度，提高效率3-4倍，克服了传统平板培养的嗜盐菌生长速度缓慢的弊端；另外，自菌株分离到菌株保藏无需改变培养基的组成，可一次性大量制备斜面供多次分离纯化使用，减少了多次制备培养基的麻烦，由此也提高了嗜盐菌筛选的效率。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式按照下述方法筛选嗜盐菌菌株：

(1)采样：嗜盐菌主要生长在盐湖、盐碱湖、盐沼、死海、死谷、盐场、晒盐池、盐碱地、海洋、沙漠、盐渍物(如腌鱼、腌菜、盐兽皮等盐制品上)以及企业(如制革、造纸、制奶酪、肉类、海产品加工、石油开采和加工、食品罐装、石油发酵、染料、农药、医药中间体、氯丁橡胶、石油和天然气的回收、印染、沿海地区海水利用后渗入城市下水道等)排放的高盐废水等高盐环境中。根据嗜盐菌研究的目的选择采样地点，然后按无菌操作采集水样、泥样或土样等。

(2)培养基的配方(g/l)：酸水解酪素：5、酵母膏：12、细菌蛋白胨：6、柠檬酸三钠：3、KCl：3、MgSO₄·7H₂O：18、CaCl₂：0.2、FeSO₄：0.001，NaCl的量视需要添加(因为中度嗜盐菌最适生长盐浓度29～146g/l NaCl，极端嗜盐菌最适生长盐浓度146～304g/l，因此，分离中度嗜盐菌时添加130g NaCl，分离极端嗜盐菌时添加200g NaCl)，固体培养基加琼脂18-20，PH调至7.5。

(3)步骤：将采集的固体样品1g(液体样1ml)置于盛100mL液体培养基的300mL三角瓶中，在光照条件下33-35℃(分离极端嗜盐菌35-37℃)120r/min摇床培养3-5d，富集菌体。然后用接菌环取一环富集培养液在预先制备好的大试管(30mm×200mm)固体培养基斜面上连续划曲线，每环菌液连续划5个斜面。斜面培养基的盐度根据分离不同嗜盐菌确定(分离极端嗜盐菌时200g/l，中度嗜盐菌时130g/l)。然后在培养箱33-37℃下培养2-4d，获得斜面单菌落。仔细观察，挑取具有典型特征的菌落再次在无菌斜面上连续划线，培养，选取斜面单菌落，如此反复三次进行分离纯化，便可得到纯培养嗜盐菌菌株。保存纯菌株于斜面，低温保藏。

具体实施方式二：按照本发明的快速高效筛选嗜盐菌的方法，从威海市的高盐环境，仅用16d分离了68株菌，对这些菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化以及核酸特征的鉴定，所鉴定的菌株100％为嗜盐菌株。传统的方法分离纯化一株嗜盐菌一般需要40-70d(不同菌株有所不同)，此法则需12-20d，提高效率3-4倍。具体步骤如下：

(1)样品来源

样品采自：威海市路道口盐场晒盐池盐水、盐泥；威海市金泓化工有限公司排放的高盐废水、污泥；威海市金海滩海岸海水、海泥。

(2)培养基的配方(g/l)：

酸水解酪素：5、酵母膏：12、细菌蛋白胨：6、柠檬酸三钠：3、KCl：3、MgSO₄·7H₂O：18、CaCl₂：0.2、FeSO₄：0.001，NaCl的量视需要添加(分离中度嗜盐菌时添加130g NaCl，分离极端嗜盐菌时添加200g NaCl)，固体培养基加琼脂18-20，PH值调至7.5。

(3)富集培养

将采集的固体样品1g(液体样1ml)置于盛100mL液体培养基的300mL三角瓶中，其中分离中度嗜盐菌的三角瓶中添加130g/l NaCl，33-35℃120r/min摇床培养3d，富集菌体。分离极端嗜盐菌的三角瓶中添加200g/l NaCl，在光照条件下35-37℃120r/min摇床培养5d，富集菌体。

(4)分离和纯化

用接菌环分别从两种盐度(130g/l NaCl；200g/l NaCl)的三角瓶取一环富集培养液在预先制备好的大试管(30mm×200mm)固体培养基斜面(分离极端嗜盐菌的斜面含NaCl 200g/l，分离中度嗜盐菌的斜面含NaCl130g/l)上划曲线，每环菌液连续划5个斜面。每个三角瓶共取10环。然后将划线的斜面在培养箱培养。其中分离中度嗜盐菌的斜面在35℃下培养2-3d，分离极端嗜盐菌的斜面37℃下光照培养3-4d，获得斜面单菌落。仔细观察斜面，用接菌环挑取具有典型特征的菌落再次在无菌斜面上划线，培养，选取斜面单菌落，如此反复三次进行分离纯化，获得纯培养嗜盐菌菌株。低温保藏纯菌株于斜面。

(5)初步鉴定

通过富集培养与大试管斜面分离纯化，挑取具有典型特征的单菌落，总共获得68株细菌，对它们进行了形态特征、培养特征及耐盐特性等的初步鉴定，确定这些菌株均为嗜盐菌菌株。又通过生理生化和核酸特征的鉴定确定了18个菌株的种或属。

Claims

1、一种快速高效筛选嗜盐菌的方法，其特征在于所述方法采用大试管固体培养基斜面培养法进行分离纯化，具体步骤为：a、将采集的嗜盐菌固体样品1g或液体样品1ml置于盛100mL液体培养基的300mL三角瓶中，在光照条件下33-37℃、120r/min摇床培养3-5d，富集菌体；b、然后用接菌环取一环富集培养液在预先制备好的试管固体培养基斜面上连续划曲线；c、然后在培养箱33-37℃下培养2-4天，获得斜面单菌落；d、仔细观察，挑取具有嗜盐菌典型特征的菌落再次在固体培养基斜面上连续划线，培养，选取斜面单菌落再次在无菌斜面上连续划线，如此反复三次进行分离纯化，得到纯培养嗜盐菌菌株。

2、根据权利要求1所述的一种快速高效筛选嗜盐菌的方法，其特征在于所述嗜盐菌筛选为极端嗜盐菌的筛选或中度嗜盐菌的筛选。

3、根据权利要求1所述的一种快速高效筛选嗜盐菌的方法，其特征在于分离极端嗜盐菌时，液体培养基的配方为：酸水解酪素：5g/l、酵母膏：12g/l、细菌蛋白胨：6g/l、柠檬酸三钠：3g/l、KCl：3g/l、MgSO₄·7H₂O：18g/l、CaCl₂：0.2g/l、FeSO₄：0.001g/l，NaCl：200g/l。

4、根据权利要求1所述的一种快速高效筛选嗜盐菌的方法，其特征在于分离中度嗜盐菌时，液体培养基的配方为：酸水解酪素：5g/l、酵母膏：12g/l、细菌蛋白胨：6g/l、柠檬酸三钠：3g/l、KCl：3g/l、MgSO₄·7H₂O：18g/l、CaCl₂：0.2g/l、FeSO₄：0.001g/l，NaCl：130g/l。

5、根据权利要求1所述的快速高效筛选嗜盐菌的方法，其特征在于所述大试管的规格为30mm×200mm。