CN112126593A - 一株产溶栓酶的中国根霉du-106及其在制备淡豆豉粉中的应用 - Google Patents

一株产溶栓酶的中国根霉du-106及其在制备淡豆豉粉中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产溶栓酶的中国根霉DU‑106及其在制备淡豆豉粉中的应用，该根霉于2019年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60888。该菌种从南方小药酒及其酒曲中分离，经250MPa超高压诱变处理5min，再经酪蛋白平板初筛，纤维蛋白板复筛得到。本发明的菌株发酵可产生较强溶栓活性的溶栓酶，应用该菌株纯种发酵制备淡豆豉，可以获得一种具有溶血栓功效淡豆豉粉，提高淡豆豉的功效性，对开发具有溶血栓功效的天然产品，具有广泛前景。

Description

一株产溶栓酶的中国根霉DU-106及其在制备淡豆豉粉中的 应用
技术领域
本发明属于食品发酵工程领域，具体涉及一株产溶栓酶的中国根霉DU-106的筛选及其在制备具有溶血栓功效淡豆豉粉的应用。
背景技术
血栓性疾病严重危害人类健康，尤其是心脑血管疾病已成为威胁人类健康的主要原因之一。目前治疗诸如脑血栓、急性心肌梗塞等血栓疾病的的疗法，采用注射溶栓剂使血管再通。临床上常用溶栓剂，如尿激酶、链激酶、纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)、蚓激酶(Lumbrukinase)等，由于其存在一定的毒性或较大的副作用，寻找天然的溶栓物质，开发具有溶血栓功效的产品受到人们关注。
研究表明，大豆在发酵过程中，由于曲霉、根霉、芽孢杆菌等微生物的作用，可产生一系列蛋白酶、纤溶酶，具有制备天然溶栓功效产品的潜能。其中纳豆及纳豆激酶产品由于其高溶栓功效而风靡全球。中国的豆豉及淡豆豉，其制备工艺与纳豆相似，但对其溶栓功效的开发利用相对落后。
淡豆豉作为一味传统中药，是由黑豆经过浸泡、蒸煮、摊凉、制曲、发酵等一系列工艺制成，克服了传统豆豉高油高盐的缺点，在中药中常作为解表剂。由于绝大多数淡豆豉的制作采用自然发酵方式，参与发酵菌种差异较大，获得的产品质量不稳定。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种中国根霉DU-106，该菌株发酵产生的溶栓酶活性高，运用该菌株纯种发酵制备淡豆豉，可获得高溶血栓活性的淡豆豉，开发一种具有溶血栓功效淡豆豉粉。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供的一株根霉菌是中国根霉(Rhizopus microsporus var.chinensis)DU-106，该菌株于2019年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60888，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明以从南方小药酒及其酒曲中筛选得的根霉菌为出发菌株，经过超高压诱变后，样品涂布于酪蛋白平板初筛，挑选透明圈直径与菌落直径比值大的菌株，在蛋白胨麸皮水中发酵，再经过纤维蛋白平板法复筛，通过比较溶解圈的直径大小筛选一株具有高效溶栓活性的菌株，命名为中国根霉DU-106。
本发明对上述中国根霉DU-106进行菌落形态的观察，初步鉴定出中国根霉DU-106属于毛霉科，根霉属。经18S rRNA检测分析，中国根霉DU-106与小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)相似度最高，为100％，经ITS检测分析，中国根霉DU-106与小孢根霉(Rhizopus microsporus)相似度最高，为100％，结合生理生化特征，鉴定其为小孢根霉菌。
本发明所获得的中国根霉DU-106，在麸皮蛋白胨培养基中可以产生高活性溶栓酶，将其运用于淡豆豉的发酵，可制备一种具有溶血栓功效淡豆豉粉。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过筛选得到一株产高活性溶栓酶的中国根霉DU-106，利用其发酵制备的淡豆豉粉具有较高溶血栓功效，拓宽淡豆豉的功效性，对开发具有溶血栓功效的天然产品，具有广泛前景。
将本发明所述的淡豆豉粉与市售的纳豆激酶粉、纳豆激酶胶囊进行体外溶栓活性对比，利用纤维蛋白平板法，以尿激酶标准曲线计算样品的相对酶活力大小。结果显示，利用本发明所述的中国根霉DU-106发酵制备的淡豆豉粉具有较高的溶栓活性，为15530IU/g，高出市售某品牌纳豆激酶粉12％。
附图说明
图1为中国根霉DU-106的18S rRNA系统发育树；
图2为中国根霉DU-106的ITS系统发育树。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、达成目的与功效易于理解，以下结合具体实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1：中国根霉DU-106菌株的诱变与筛选
1.1培养基的制备
斜面培养基：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000m L，pH自然，121℃灭菌15min。
酪蛋白培养基(初筛培养基)：取20mL 0.1M Na2HP04溶液，2mL0.1 M KH2P04溶液，添加0.4％酪蛋白，4g琼脂，178mL水，pH值7.2，121℃高压灭菌30min。
麸皮蛋白胨培养基：取5g麸皮加入100mL的水，浸泡1小时，煮沸1小时，取汁，补水至100mL，再加1g蛋白胨，121℃高压灭菌15min。纤维蛋白平板(复筛培养基)：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，溶于900mL蒸馏水中，用盐酸调pH值至7.4，加蒸馏水定容至1L，制得PBS缓冲液，常温保存备用。取25mg牛纤维蛋白溶于10mL PBS溶液中，制得牛纤维蛋白溶液。取0.3g琼脂糖溶于20mL PBS溶液中，使用微波炉加热至其刚刚沸腾溶解，摇匀，制得1.5％的琼脂糖溶液，放在45℃水浴锅中备用。在平板中加入12μL的凝血酶溶液(100U/mL)，再加入5mL牛纤维蛋白溶液，轻轻转动平板使两种溶液混匀，混匀后立刻用移液枪加入5mL1.5％的琼脂糖溶液，继续转动平板混合均匀，直至平板成凝固状，停止转动，室温静置4h以上。
1.2菌株诱变及筛选
样品采集于南方小药酒及其酒曲，取适量样品于盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中稀释，将上述样品涂布于灭过菌的斜面培养基，37℃培养24h。培养后用无菌生理盐水将斜面上的孢子洗离，制得孢子悬液，浓度为1×106个/mL。
取4mL菌悬液分装于无菌袋中，排尽袋中空气并封口后，置于250MPa超高压诱变处理5min。超高压仪器型号：UHP900-2×2(Ⅱ)。
吸取诱变后的孢子悬液200μL涂布酪蛋白平板，37℃培养24h，挑选透明圈直径与菌落直径比值大的进行多次重复划线，分离纯化菌株，直至为单菌落。
把酪蛋白平板初筛得的菌株接种到在麸皮蛋白胨培养基中，30℃，165r/min振荡培养48h，发酵液离心。用打孔器在纤维蛋白上均匀打孔，每孔直径6毫米，取发酵上清液10μl点滴于小孔中，37℃培养18h，通过比较溶解圈的直径大小筛选高产溶栓酶的菌株。并将其命名为中国根霉DU-106。
实施例2：菌株鉴定
2.1形态观察
将筛选得的菌种在酪蛋白培养基上的培养特征的观察，中国根霉DU106气生菌丝强，呈蜘蛛网状，产孢子能力强，孢子数多，生长速度快，孢囊抱子较小。
将菌株以上形态及培养特征与《真菌分类学》中鉴定相关内容进行对照，初步鉴定，中国根霉DU106属于毛霉科，根霉属。
2.2分子鉴定
按照真菌基因组DNA提取试剂盒的说明对中国根霉DU-106菌株的DNA进行提取，对提取的细菌DNA进行PCR，PCR扩增后的序列，由广州艾基生物技术有限公司进行测序，获得完整的18S rRNA基因序列及ITS序列，将测序所得的序列结果于NCBI中GenBank数据库进行BLAST比对，采用MEGA 6构建进化树。结果如图1和图2所示。
综合18S rNA和ITS序列测序结果，中国根霉DU-106与Rhizopus microsporus相似度最高，因此其在分类学上应属于Rhizopus属，Rhizopus microsporus种，中文名：小孢根霉。建议英文文章中翻译为：Rhizopus microsporus var.chinensis DU-106.
综合形态特点及分子生物学鉴定结果，鉴定菌株为小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)的1个新种，命名为，于2019年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60888。
实施例3：利用本发明所述的菌株制备淡豆豉粉
a.挑选：挑选充分成熟，颗粒饱满均匀、无虫蚀、无霉烂变质的黑豆；
b.发芽：取300g黑豆以清水冲洗干净，加入2倍质量清水浸泡12h，取出黑豆沥干，平铺于泡沫箱中，盖上经润湿后的纱布，避光放置，每隔8h后再次润湿纱布，48h后可得发芽黑豆；
c.蒸煮灭菌：121℃高压灭菌蒸煮15min，冷却至35℃以下接种；
d.菌种的活化及扩大培养：将中国根霉DU-106菌种1～2环接入斜面活化(PDA)培养基中，32℃培养72h，挑取培养好的斜面菌种1-2环到扩大培养液体培养基中，32℃震荡培养72h；
e.接种发酵：取步骤d中所得的中国根霉DU-106液体培养基，按照15％接种量接种到蒸煮灭菌冷却后的发芽黑豆中，在32℃培养7d，得到黑豆淡豆豉；
f.预干燥：采用低温热泵干燥法对发酵好的发芽黑豆淡豆豉进行干燥，机器型号：DDC06TSL参数设置为50℃，干燥2h；
g.粉碎：采用低温液氮粉碎法进行粉碎，参数为：电压：220V；主轴转速：2800r/min；电机功率：1500W；通氮量：200～300mL/100g，粉碎后过60目筛，得到淡豆豉粉；
h.后干燥：采用低温热泵干燥法对粉碎后的淡豆豉粉进行干燥，机器型号：DDC06TSL参数设置为50℃，干燥4h使黑豆淡豆豉粉含水量在9％以下。
步骤d中所述的培养基制备方法如下：
菌种活化斜面培养基(PDA斜面培养基)：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000m L，pH自然，121℃灭菌15min。扩大培养液体培养基：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000m L，pH自然，121℃高压灭菌15min。
实施例4淡豆豉粉的溶栓活性评价
将实施例3所述的淡豆豉粉与市售的纳豆激酶粉、纳豆激酶胶囊进行体外溶栓活性对比，利用纤维蛋白平板法，以尿激酶标准曲线计算样品的相对酶活力大小。纤维蛋白平板的制备方法详见实施例1中“1.1培养基的制备”。
4.1尿激酶标准曲线绘制
用无菌PBS溶液将尿激酶(购自中检所，1240IU/支)配成1240IU/mL的尿激酶溶液，并梯度稀释配制尿激酶标准溶液。将打好圆孔的纤维蛋白平板放置在37℃培养箱中，用移液枪取10μL系列尿激酶标准溶液，点样到平板的圆孔内，37℃培养18h后，测量水溶圈的垂直直径(mm)，计算其平均值，以水溶圈面积A(cm)为横坐标，为溶栓活力效价C(IU/mL)纵坐标，在对数坐标纸上绘制得的标准曲线为：log C＝0.4809A+0.538，R2＝0.9971。
4.2样品体外溶栓活性测定
取50mg样品加入1.5mL PBS溶液充分溶解，在4℃冰箱中放置24h后，取出摇匀，10000r离心10min，取上清液10μL点样到纤维蛋白平板的圆孔内，37℃培养18h后，测量水溶圈的垂直直径(mm)并计算其平均值和水溶圈面积，将水溶圈面积与标准曲线比较，计算出样品溶栓活力效价C，根据所配样品溶液的浓度进行换算：溶栓酶活力(IU/g)＝样品溶栓活力效价C/(0.05/1.5)。结果见表1。
表1溶栓活性对比
Figure BDA0002739370460000081
结果显示，利用本发明所述的中国根霉DU-106发酵制备的淡豆豉粉具有较高的溶栓活性，为15530IU/g，高出市售某品牌纳豆激酶粉12％。

Claims (2)

1.一株产溶栓酶的中国根霉DU-106，于2019年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60888。
2.权利要求1所述中国根霉DU-106在制备淡豆豉粉中的应用。
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