TW202115244A - 發酵乳桿菌tci275、其組合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種發酵乳桿菌TCI275(Lactobacillus fermentum TCI275),其具有分解乳糖的功能。此外該發酵乳桿菌TCI275及其代謝產物可進一步提供做為食品組合物或醫藥組合物。其中發酵乳桿菌TCI275寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910940)、以及寄存於德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM33289)。
Description
本發明關於一種發酵乳桿菌,特別是關於一種發酵乳桿菌TCI275(Lactobacillus fermentum TCI275),以及發酵乳桿菌TCI275及其代謝產物的用途。
益生菌(Probiotics)一般認為是指食入後對宿主(或稱個體,如動物或人類)有正面效益的食入性微生物。其命名源於希臘語「for life」(對生命有益),又稱為「原生保健性菌種」;並且,益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。
一般而言,「乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)」是指能利用碳水化合物進行發酵生產多量乳酸之細菌總稱,為一相當龐雜的菌群。在諸多乳酸菌的菌種中,部分乳酸菌菌種的菌株經研究發現其對於個體健康有益,故此些菌株被視為益生菌。換言之,益生菌大部分是乳酸菌,但乳酸菌中只有少數經研究證明對個體健康有益的菌株能被稱為益生菌。
舉例來說,常見的可作為益生菌的乳酸菌的菌種包括腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等,而可作為益生菌的酵母菌的菌種包括酵母菌屬(Saccharomyces)。
乳桿菌屬是一群具有發酵能力、兼性厭氧、不會產生孢子的革蘭氏陽性桿菌。乳桿菌因能夠將碳水化合物發酵成乳酸而得名,可用於製造液態優酪乳、固態奶酪等各種發酵食品。
本發明之一目的,在於提供一種發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum
)TCI275,其係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910940)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33289)。
在一些實施例中,發酵乳桿菌TCI275包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
在一些實施例中,發酵乳桿菌TCI275篩選自人類母乳。
在一些實施例中,發酵乳桿菌具有生成羥脯胺酸之功能。
在一些實施例中,發酵乳桿菌具有耐胃酸及耐膽鹽的能力。
在一些實施例中,發酵乳桿菌具有分解乳糖的能力。
本發明之另一目的,在於提供一種組合物,包含一發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum
)TCI275及/或其代謝產物,發酵乳桿菌係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910940)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33289)。
在一些實施例中,組合物為食品組合物。
在一些實施例中,組合物含有5X109
個菌數的發酵乳桿菌TCI275。
根據一些實施例,本發明提供一種將組合物用於製備改善乳糖不耐(lactose intolerance)的組合物的用途。
在一些實施例中,改善乳糖不耐為包括以下情況的任一者:改善大便稀淌、減少排氣頻率、減少脹氣、減少腹痛。
根據一些實施例,本發明提供一種將組合物用於製備改善便祕的組合物的用途。
在一些實施例中,改善便祕為提升排便頻率。
根據一些實施例,本發明提供一種將組合物用於製備提升一個體的腸胃中的柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)菌種比例的組合物的用途。
在一些實施例中,個體對為對乳糖不耐的個體。
根據一些實施例,本發明提供一種將組合物用於製備提升一個體的腸胃中的普雷沃氏菌屬(Prevotella)菌種比例的組合物的用途。
在一些實施例中,個體為對具有便秘情況的個體。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣,將描述於以下內容中,以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
為了使本領域具有通常知識者能瞭解本發明的特點,以下就說明書及申請專利範圍中提及術語及用語進行一般性之說明及定義。除非另有說明,否則文中使用的所有技術及科學上的字詞,皆具有本領域技術人員對於本發明所瞭解的通常意義,當有衝突情形時,應以本說明書之定義為準。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示,各組之間的差異以學生t
檢驗(student'st
-test)進行分析。
本文中所使用之濃度符號「wt %」通常是指重量百分濃度,而濃度符號「vol %」通常是指體積百分濃度。
本文中所使用數值為近似值,所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內,最佳為在正負5%的範圍內。
於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之 “個體”是指人類或非人的哺乳動物,較佳為人類。
於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之 “分解乳糖”是指將乳糖分解為葡萄糖及半乳糖或是指具有乳糖酶的能力。
本案發明人自人體母乳中篩選出一新穎菌株,經16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)序列分析,依親緣關係鑑定為Lactobacillus fermentum(中文名稱為發酵乳桿菌),且經命名為Lactobacillus fermentum TCI275(以下稱為發酵乳桿菌TCI275),其係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC910940)、及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM33289)。該發酵乳桿菌TCI275係具有如SEQ ID NO: 1所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。
根據本發明,所採用之發酵乳桿菌TCI275之代謝產物可以是透過在適於發酵乳桿菌TCI275生長的環境下進行培養所產生者。例如:先以適當之培養液對發酵乳桿菌TCI275進行培養,其後,視需要地去除前述培養液中之菌體等固體物,以獲得含有代謝產物之液體。或例如,先以適當之培養液對發酵乳桿菌TCI275進行培養,其後,以離心等方法使菌體沉降於底部,再直接吸取上清液所獲得含有代謝產物之液體。
可選用任意合宜之培養液以進行發酵乳桿菌TCI275之培養,以提供所欲之代謝產物,只要該培養液可提供發酵乳桿菌TCI275生長、代謝所需養分(如酵母菌萃取物、蛋白質及葡萄糖)與條件(如酸鹼值)即可。此外,發酵乳桿菌TCI275之培養時間亦無特殊限制,只要足以使發酵乳桿菌TCI275完成至少一次代謝循環即可。舉例言之,於本發明一具體實施態樣中,係以MRS培養液對發酵乳桿菌TCI275進行培養,歷時18小時,使菌株進行代謝作用並產生代謝產物。
於本發明中,係可直接使用經歷發酵乳桿菌TCI275之代謝循環的含發酵乳桿菌TCI275與代謝產物的培養液,或使用經移除發酵乳桿菌TCI275等固體物之含代謝產物的液體。可採用任何合宜之操作以移除固體物,只要對培養後所產生的代謝產物之所欲效益沒有不利的影響即可。一般而言,係採用物理手段以移除固體物,該物理手段包括,例如:離心分離、濾膜過濾、沉澱傾析等操作。視需要地,可重複或合併進行前述物理操作,以盡可能去除培養液中的菌體等固體物。
根據本發明所提供之食品組合物係可以為健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、或特殊營養食品,且可製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食類、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品,但不以此為限。
根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用,端視投予個體之年齡、體重、及健康狀況而異。亦可針對特定族群之需要,調整據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、及特殊營養食品中的發酵乳桿菌TCI275及/或其代謝產物的含量,例如,調整至每日應服用的量。
針對根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品及/或特殊營養食品,可於其外包裝上標示建議使用量、特定族群(例如高血脂患者、孕婦等)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項等,以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員的指導下自行服用而無安全虞慮。於根據本發明所提供之食品組合物中,有關該發酵乳桿菌TCI275及/或其代謝產物之態樣,係如上述之說明。
視需要地,可於根據本發明所提供之食品組合物、或飼料組合物中另外含有合宜用量之添加劑,例如可提高該醫藥組合物、食品組合物、或飼料組合物於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等,以及可改善該醫藥組合物、食品組合物、或飼料組合物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明,而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
例1:發酵乳桿菌TCI275之篩選與鑑定
(1-1)篩選
將各種取樣樣品(人類母乳、優酪乳、印度天貝(Tempeh)、牛糞)分別與MRS培養液(MRS broth)以體積比1:100的比例混合,並置於37℃下進行厭氧培養(氧氣濃度介於10%至1%,較佳為低於5%),歷時18小時。其後,將前述培養液塗佈於MRS固態培養基(MRS agar)上,並置於37℃下進行厭氧培養,以生成不同的菌落。接著,為確保菌株的單一性,使用無菌接種環挑選一菌落,於固態培養基上進行分區劃線,再置於37°C之厭氧培養箱中培養直到單一菌落(single colony)出現。
(1-2)鑑定
取(1-1)人類母乳取樣樣品所分離出之單一菌落的菌株後,進行基因族譜分析(phylogenetic analysis),確認該菌株具有如SEQ ID NO:1所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO:1所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌TCI275(後文以TCI275表示)。在此,將此發酵乳桿菌TCI275以寄存編號BCRC910940寄存於財團法人食品工業發展研究所,以及以寄存編號DSM33289寄存於德國國家菌種保藏中心(DSMZ)。
取(1-1)優酪乳取樣樣品所分離出之一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:2所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 2所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16S rDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。在此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌L206(後文以L206表示)。
其中,取(1-1)優酪乳取樣樣品所分離出之再另一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:3所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 3所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。在此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌L235(後文以L235表示)。
其中,取(1-1)優酪乳取樣樣品所分離出之再另一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:4所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 4所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌L270(後文以L270表示)。
其中,取(1-1)優酪乳取樣樣品所分離出之再另一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:5所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 5所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌L786(後文以L786表示)。
其中,取(1-1)印度天貝取樣樣品所分離出之一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:6所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 6所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌L849(後文以L849表示)。
其中,取(1-1)牛糞取樣樣品所分離出之一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:7所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 7所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌L1265(後文以L1275表示)。
其中,取(1-1)牛糞取樣樣品所分離出之另一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:8所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 8所示的基因序列分別與其他發酵乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為發酵乳桿菌L1275(後文以L1275表示)。
表一
菌株編號 | 菌種名稱 | 菌種之序列 | 比較亞種(以亞種編號標示) | 相似度 |
TCI275 | Lactobacillus fermentum TCI275 | SEQ NO:1 | GERU1 | 98.79% |
2-4 | 98.07% | |||
L7 | 98.07% | |||
LG1 | 97.88% | |||
CAU:237 | 98.06% | |||
CAU:216 | 98.06% | |||
NWAFU1435 | 97.98% | |||
L206 | Lactobacillus fermentum | SEQ NO:2 | GERU1 | 97.33% |
6587 | 96.97% | |||
2-4 | 96.96% | |||
2871 | 96.89% | |||
6452 | 96.96% | |||
L235 | Lactobacillus fermentum | SEQ NO:3 | 7013 | 95.82% |
9-4 | 95.89% | |||
6588 | 95.75% | |||
6587 | 95.81% | |||
L270 | Lactobacillus fermentum | SEQ NO:4 | GERU1 | 95.66% |
4797 | 94.62% | |||
SRUM | 94.69% | |||
6402 | 94.75% | |||
4901 | 94.62% | |||
L786 | Lactobacillus fermentum | SEQ NO:5 | 8204 | 98.89% |
2625 | 98.82% | |||
6573 | 98.90% | |||
6451 | 98.90% | |||
L849 | Lactobacillus fermentum | SEQ NO:6 | 6042 | 97.86% |
5589 | 97.77% | |||
4797 | 97.77% | |||
6567 | 97.77% | |||
6506 | 97.76% | |||
L1265 | Lactobacillus fermentum | SEQ NO:7 | 5136 | 97.85% |
5634 | 97.85% | |||
5129 | 97.76% | |||
2634 | 97.84% | |||
6032 | 97.68% | |||
6500 | 97.68% | |||
L1275 | Lactobacillus fermentum | SEQ NO:8 | E4 | 96.81% |
綜合以上,本發明自取樣樣品(人類母乳、優酪乳、印度天貝(Tempeh)、牛糞)共篩選出八種發酵乳桿菌,分別命名為TCI275、L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275。
(1-3)保存
使用液態培養的方式將(1-1)所獲得之具單一性之八種發酵乳桿菌菌株培養於MRS培養液(BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth,型號DF0881-17-5)中,以提供菌液,接著於菌液中添加25%之甘油,將所得混合液移至冷凍保存管中後,置於-80℃保存。
例2:發酵乳桿菌TCI275耐胃酸膽鹽試驗
於此,將發酵乳桿菌TCI275以緩衝液、人工胃液(pH 3)及人工腸液(pH 7)進行測試,以確認發酵乳桿菌TCI275於生物體腸胃消化道中的酸鹼耐受性。其中,緩衝液為0.2莫爾濃度(M)氯化鉀(KCL, 品牌Sigma-Aldrich)且pH值為7。人工胃液為0.2 M氯化鉀且pH值為3。人工腸液為0.2 M氯化鉀及0.3重量%的牛膽鹽(品牌Difco™ Oxgall)且pH值為7。
進行一活化程序將發酵乳桿菌TCI275活化。首先,將發酵乳桿菌TCI275凍菌以10體積%的菌量培養於液態乳桿菌MRS培養基(BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth)中,並於37下培養16小時,以活化發酵乳桿菌TCI275。
接著,將活化後的發酵乳桿菌TCI275菌液取1體積%的濃度接種至20毫升的待測溶液中,然後以轉速50rpm於37℃下震盪培養3小時。其中,三個組別的待測溶液分別為人工胃液(實驗組)、人工腸液(實驗組)及氯化鉀緩衝液(控制組)。從培養後的菌液取100微升(μL)的菌液塗盤,並於28℃下靜置培養3天,並於3天後以肉眼計數各組別的活菌數(計算固態乳桿菌MRS培養基上的菌落數)。
請參閱圖1。圖式中發酵乳桿菌TCI275的存活率為計數後的活菌數,並以log CFU/mL表示。其中,log CFU/mL代表每毫升菌液含有的菌落形成單位(CFU,colony-forming unit)並以對數(log10
)表示。由圖1可知,控制組的發酵乳桿菌TCI275的存活菌數為9.7 log CFU/mL、人工胃液實驗組的發酵乳桿菌TCI275的存活菌數為9.1 log CFU/mL,及人工腸液實驗組的發酵乳桿菌TCI275的存活菌數為9.2 log CFU/mL。由此可知,人工胃液實驗組的活菌數為控制組的93.8%,且人工腸液實驗組的活菌數為控制組的94.8%。
基於此實驗數據,得知發酵乳桿菌TCI275可耐pH值為3的模擬胃酸環境並可耐膽鹽模擬環境(人工腸液),因此,得知發酵乳桿菌TCI275具有耐胃酸膽鹽之功能,代表發酵乳桿菌TCI275可通過宿主腸胃道的酸鹼值壓力,定殖於宿主腸道中。
例3:發酵乳桿菌TCI275及其他發酵乳桿菌的乳糖分解能力比較
在此實施例中,將TCI275及其他發酵乳桿菌培養於含有乳糖的培養基中,以測試發酵乳桿菌分解乳糖的能力。
首先,進行一活化程序將發酵乳桿菌TCI275及其他發酵乳桿菌(L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275)活化。首先,將發酵乳桿菌TCI275及其他發酵乳桿菌凍菌以10體積%的菌量培養於液態乳桿菌MRS培養基(BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth)中,並於37度下培養16小時,以活化發酵乳桿菌TCI275及其他發酵乳桿菌。
接著,將活化後的發酵乳桿菌TCI275及其他發酵乳桿菌的菌液取1體積%的濃度接種至含有5g/L(等於0.5%)濃度乳糖的20毫升的液態乳桿菌MRS培養基(BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth)中,然後於37℃下培養16小時,並進行取樣程序,取樣程序包括:取1ml菌液(共八組),以離心(10000至20000rpm,較佳為10000至15000rpm,更佳為 13000rpm)1分鐘後取上清液(不含菌體,即為發酵乳桿菌TCI275的代謝產物),以乳糖比色法測定試劑套組(廠牌:BioVision,檢測套組名稱BioVision® Lactose Colorimetric/Fluorometric Assay Kit,產品編號K624-100)進行乳糖含量檢測。
檢測原理是先依套組內試劑配置不同濃度的半乳糖(galactose),以繪製標準曲線,接著將欲測的每種菌液樣品(發酵乳桿菌TCI275及其他發酵乳桿菌(L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275))分為兩孔(96孔盤)。由於乳糖是由半乳糖及葡萄糖所組成,因此乳糖的含量可透過將某樣品中的總半乳糖減去游離半乳糖(free galactose)所求得,因此在上述兩孔中的其中一孔添加適量乳糖酶(Lactase)使欲測菌液中的所有乳糖轉換為游離半乳糖(free galactose)(因此可求得總半乳糖),另一孔不添加乳糖酶(因此可求得游離半乳糖),透過偵測570nm的吸光值以及公式:乳糖=總半乳糖-游離半乳糖,求得菌液中的乳糖濃度,若乳糖濃度相較於原乳糖濃度(5g/L(等於0.5%))減少一半,則換算該菌的乳糖消耗率(百分比)為50%。
詳細的檢測方式及樣品配置方式可依照檢測套組所附的使用說明書(Data sheet)所進行,詳細步驟可見網址:https://www.biovision.com/documentation/datasheets/K617.pdf,本發明在此不再贅述。
以下表二為發酵乳桿菌的乳糖消耗率(百分比),數值越高代表其分解乳糖的能力越佳。
表二
測試菌種 | 乳糖消耗率(百分比) |
發酵乳桿菌TCI275 | 59.21 |
發酵乳桿菌L206 | 1.8 |
發酵乳桿菌L235 | 0 |
發酵乳桿菌L270 | 0 |
發酵乳桿菌L786 | 0 |
發酵乳桿菌L849 | 0 |
發酵乳桿菌L1265 | 0 |
發酵乳桿菌L1275 | 0 |
如表二所示,發酵乳桿菌TCI275的乳糖消耗率為59.21%,代表將發酵乳桿菌TCI275培養於含有5g/L(重量濃度,等於0.5%)濃度乳糖的培養基中16小時,培養基中乳糖濃度降為2.04 g/L(等於0.204%),表示有59.21%的乳糖經發酵乳桿菌TCI275所分解;同理可知,發酵乳桿菌L206能分解培養基中1.8%的乳糖,其他發酵乳桿菌(L235、L270、L786、L849、L1265、L1275)的乳糖消耗率為0%,代表是不具有分解乳糖的能力。
例4:發酵乳桿菌TCI275對乳糖不耐症狀及調節菌相的人體實驗
乳糖不耐症(Lactose intolerance)就是身體無法完全消化乳糖,因此在食用乳製品後,乳糖會進入大腸成為微生物的食物,接著乳糖被發酵後產生氣體及酸,使個體產生會有腹瀉(大便稀淌)、排氣、脹氣和腹痛、絞痛感的情況。這種情況也稱作乳糖吸收不良,雖然對人體沒有大礙,但這些症狀常令人不舒服。
為進一步確認發酵乳桿菌TCI275對於乳糖不耐症狀及腸道菌相的影響。以每顆膠囊為50毫克TCI275菌粉,含有5X109
cells(即5X109
cells/cap,等於5X109
個菌數)的TCI275的活菌,提供給4位受試者(乳糖不耐症者,即喝牛奶後會出現腹脹、排氣、腹痛或腹瀉等症狀的受試者),每人在每日睡前服用一顆,並持續2周,以問卷方式分析受試者腸胃症狀等情況,以及分析受試者的腸胃道菌相變化,詳細分析方法如下所述。
(4-1) 發酵乳桿菌TCI275對乳糖不耐情況的問卷調查(針對乳糖不耐症的受試者)
首先對上述受試者於第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)、第1週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後)及第2週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後)進行腸胃狀態的問卷調查。詳細來說,在每周測試前,受試者服用牛奶(牛奶體積依個人食用量做為標準,但每次測試前服用的體積均相同),自身觀察服用牛奶後6小時內的乳糖不耐症狀後,再填寫問卷,其調查及計分方式如下表三。其中,第一部分的各分數代表各種症狀的嚴重程度,0分為無困擾,1分為輕微,2分為有些嚴重,3分為嚴重。
表三
第一部分:情況/分數 | 0 | 1 | 2 | 3 |
1.大便稀淌(拉肚子、腹瀉) | ||||
2.排氣頻率 | ||||
3.脹氣 | ||||
4.腹痛、絞痛感 |
第一部分之問卷結果如下表四所示
表四
第0週數據 (受試者平均分數) | 第1週 (受試者平均分數) | 第2週 (受試者平均分數) | |
1.大便稀淌 | 2.0 | 1.25 | 1.25 |
2.排氣頻率 | 1.75 | 1.5 | 1.25 |
3.脹氣 | 2.0 | 1.0 | 1.0 |
4.腹痛、絞痛感 | 1.25 | 0.75 | 0.75 |
由以上表四的問卷結果可看出,4位受試者在第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)對大便稀淌的自身評估為2.0分(有些嚴重),在服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊1周後,受試者對於大便稀淌的自身評估降為1.25分(約為輕微),服用2周後,對於大便稀淌的自身評估也維持1.25分(約為輕微),代表持續服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後一周即可改善大便稀淌的情況,且持續服用能維持改善大便稀淌的情況。
此外,4位受試者在第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)對脹氣的自身評估為2.0分(有些嚴重),在服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊1周後,受試者對於脹氣的自身評估降為1.0分(輕微),服用2周後,對於脹氣的自身評估也維持1.0分(輕微),代表持續服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後一周即可改善脹氣的情況,且持續服用能維持改善脹氣的情況。
此外,4位受試者在第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)對排氣頻率的自身評估為1.75分(接近有些嚴重),在服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊1周後,受試者對於排氣頻率的自身評估約略降為1.5分(介於輕微及有些嚴重之間的程度),服用2周後,對於排氣頻率的自身評估降為維持1.25分(約輕微),代表持續服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後二周可改善排氣頻率過多的情況。
此外,至於腹痛、絞痛感的問卷結果,由於4位受試者在第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)對腹痛、絞痛感的自身評估僅有為1.25分(約為輕微),因此服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後的改善情況意義不大,本文不做討論。
綜合以上,對乳糖不耐症者,即喝牛奶後會出現腹脹、排氣、腹痛或腹瀉等症狀的受試者來說,服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後,對於一般常見的乳糖不耐症症狀皆有明顯改善,特別是針對大便稀淌、脹氣及排氣頻率達到改善效果。
(4-2) 發酵乳桿菌TCI275調節菌相的人體實驗(針對乳糖不耐症的受試者)
在上述受試者於第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)及第2週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後)進行受試者腸道菌相檢測。
檢測方式可以是採集受試者糞便檢體後,對糞便進行DNA萃取,並進行16S核糖體基因(16S ribosomal gene)的定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR),透過以知菌的引子序列來檢測常見腸內菌的菌數比例。檢測方式也可以將糞便進行DNA萃取後,對檢體進行微生物體16S擴增子定序 (16S Amplicon Sequencing),其中特別是針對16S DNA其中的 V3-V4 區域進行放大,接著以次世代定序(Next Generation Sequencing (NGS))的方式,並進行後續的定序分析。
本實施例是以次世代定序方式進行,由圖爾思生物科技股份有限公司進行微生物體16S擴增子定序 (16S Amplicon Sequencing),將糞便樣本行DNA萃取後,使用由Illumina (Illumina, San Diego, USA)開發之16S宏基因組測序文庫製備方案進行16S rRNA基因擴增子測序。簡言之,將糞便萃取的DNA採用靶向16S rRNA基因之V3/V4可變區之引子擴增:16S擴增子PCR正向引子(V3區域) TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG (SEQUENCE ID NO:9);16S擴增子PCR反向引子(V4區域) GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC (SEQUENCE ID NO:10) 進行PCR擴增16S rRNA基因的可變區V3-V4(rRNA基因中的第341 至805位)(參考Herlemann等人,2000年;其中W=A/T、H=A/C/T、V=G/C/A、N=G/A/T/C)。完成擴增DNA之序列及建庫,依據MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina, Wilmington, DE, USA)建雙端庫(pair-end library),並於Illumina系統進行高通量定序。定序完成後得到的原始數據(Raw Data),會經由成對序列拼接(Raw Tags)、過濾得到 Clean Tags,再進行去除嵌合體得到可用於後續分析的有效數據(Effective Tags)。接著基於有效數據進行相似度(大於97%)OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。根據 OTUs 聚類結果對代表序列做物種注釋,得到對應的物種資訊和基於物種的豐度分佈情況,分析檢體內的微生物種類及比例。
參照圖2,相服用前(第0週),持續2週服用發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後可使柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)菌種比例(相對豐富度)增加約19%。
柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)是一種能夠促使短鏈脂肪酸(丁酸)生成的腸內益生菌,丁酸的生成可促進腸道健康。可參見例如:微生態製劑調節便秘, 腹瀉人群腸道菌群結構與産短鏈脂肪酸關鍵菌屬的相關性,食品科學 9.5 (2018): 155-165,該文獻之全文併於此處以供參考。
透過受試者糞便檢體之定序檢測,分析TCI275對於人體菌相調節的能力,特別是對於具有乳糖不耐症症狀的受試者的腸胃道菌相的能力,由以上結果可知,於服用TCI275膠囊後,受試者腸胃道內的柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)明顯增加,代表TCI275具有促進腸內益生菌比例以及促進腸胃道健康的功效。
例5:發酵乳桿菌TCI275對便祕相關症狀及調節菌相的人體實驗
為進一步確認發酵乳桿菌TCI275對於便祕及腸道菌相的影響。以每顆膠囊為50毫克TCI275菌粉,共含有5X109
cells(即5X109
cells/cap)的TCI275的活菌,提供給4位受試者(有便秘情況、排便排不乾淨等症狀的受試者),每人每日睡前服用一顆,並持續2周,以問卷方式分析受試者腸胃狀況、排便頻率等情況,以及分析受試者的腸胃道菌相變化,詳細分析方法如下所述。
(5-1) 發酵乳桿菌TCI275對腸胃狀況及排便頻率的問卷調查(針對有便秘情況、排便排不乾淨等症狀的受試者)
首先對上述受試者於第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)、第1週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後)及第2週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後)進行腸胃狀態及排便頻率的問卷調查。詳細來說,其調查及計分方式如下表五。其中,第一部分的各分數代表各種症狀的嚴重程度,0分為無困擾,1分為輕微,2分為有些嚴重,3分為嚴重,4分為非常嚴重;第二部分為調查排便頻率,調查方式如下表六,其中,四天一次代表受試者平均四天排便一次,為便祕程度最嚴重;一天兩次以上代表受試者平均一天排便兩次,為輕微便祕程度。
表五
第一部分:症狀/分數 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
1.脹氣 | |||||
2.腹鳴、腹部蠕動感 | |||||
3.排氣頻率 |
表六
第二部分:症狀/頻率 | 一天兩次以上 | 一天一次 | 兩天一次 | 四天一次 |
平均排便頻率 |
第一部分之問卷結果如下表七所示
表七
第0週數據 (受試者平均分數) | 第1週 (受試者平均分數) | 第2週 (受試者平均分數) | |
1.脹氣 | 3.25 | 1.25 | 1.0 |
2.腹鳴、腹部蠕動感 | 2.0 | 1.25 | 1.0 |
3.排氣頻率 | 2.25 | 1.75 | 1.5 |
由以上表七的問卷結果可看出,4位受試者在第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)對脹氣的自身評估為3.25分(嚴重程度),在服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊1周後,受試者對於脹氣的自身評估降為1.25分(約為輕微),服用2周後,對於脹氣的自身評估也維持1.0分(輕微),代表持續服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後一周即可明顯改善脹氣的情況,且持續服用能維持改善脹氣的情況。
此外,4位受試者在第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)對腹鳴、腹部蠕動感的自身評估為2.0分(有些嚴重),在服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊1周後,受試者對於腹鳴、腹部蠕動感的自身評估降為1.25分(輕微),服用2周後,對於腹鳴、腹部蠕動感的自身評估再降為1.0分(輕微),代表持續服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後一周即可改善腹鳴、腹部蠕動感的情況,且持續服用能維持改善腹鳴、腹部蠕動感的情況。
此外,4位受試者在第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)對排氣頻率的自身評估為2.25分(有些嚴重的程度),在服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊1周後,受試者對於排氣頻率的自身評估約略降為1.75分(介於輕微及有些嚴重之間的程度),服用2周後,對於排氣頻率的自身評估降為維持1.5分(約輕微),代表持續服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後約二周可改善排氣頻率過多的情況。
第二部分之問卷結果如下表八所示
表八
第0週(人數) | 第1週(人數) | 第2週(人數) | |
一天兩次以上 | 0人 | 0人 | 1人 |
一天一次 | 2人 | 3人 | 3人 |
兩天一次 | 1人 | 1人 | 0人 |
四天一次 | 1人 | 0人 | 0人 |
由上述表八可知,對於有便秘情況的受試者在服用發酵乳桿菌TCI275之前有50%的受試者的排便頻率屬於兩天或四天一次排便,而服用發酵乳桿菌TCI275之後一周,有75%的受試者的排便頻率為一天一次排便,而服用發酵乳桿菌TCI275之後兩周,已沒有受試者的排便頻率為兩天或四天一次排便,100%的受試者的排便頻率為一天一次或一天兩次以上。即各受試者平均而言,對於排便狀態有明顯的改善,整體提升了排便頻率,改善了便祕情況。
綜合以上,對有便秘情況、排便排不乾淨等症狀的受試者來說,服用發酵乳桿菌TCI275的活菌後,對於一般常見的腸胃不適情況皆有明顯改善,特別是針對脹氣及腹鳴、腹部蠕動感達到改善效果,此外,對於排便狀態有明顯的改善,整體提升了排便頻率,改善了便祕情況。
(5-2) 發酵乳桿菌TCI275調節菌相的人體實驗(針對有便秘情況、排便排不乾淨等症狀的受試者)
在上述受試者於第0週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊前)及第2週(服用上述的發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後)進行受試者腸道菌相檢測。
本實施例是以次世代定序方式進行,採取的步驟及方式與例(4-2)相同,本段落不再贅述。
參照圖3,相服用前(第0週),持續2週服用發酵乳桿菌TCI275的活菌膠囊後可使普雷沃氏菌屬(Prevotella)菌種比例(相對豐富度)增加約42%。
普雷沃氏菌屬(Prevotella)具有植物聚醣降解能力,飲食中富含蔬果或是素食者腸道中比例較高;由於此菌可利用纖維代謝出較多短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acid,SCFA),因此研究顯示與健康人群相比,便秘人群缺乏普雷沃氏菌屬腸道菌。可參見例如:European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases
37.3 (2018): 555-563,該文獻之全文併於此處以供參考。
透過受試者糞便檢體之定序檢測,分析TCI275對於人體菌相調節的能力,特別是對於具有便秘情況的受試者的腸胃道菌相調節的能力,由以上結果可知,於服用TCI275膠囊後,受試者腸胃道內的普雷沃氏菌屬明顯增加,代表TCI275具有促進腸胃道健康的潛力。
於此,透過例2可知,發酵乳桿菌TCI275可適應於人體腸胃環境。透過例3可知,發酵乳桿菌TCI275有分解乳糖的能力,且能力明顯優於其他發酵乳桿菌(L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275),明顯具有與同種習知菌株不同之微生物學性質。透過例4可知,發酵乳桿菌TCI275能改善乳糖不耐相關症狀(特別是針對大便稀淌、脹氣及排氣頻率)以及提升柔嫩梭菌屬的能力,特別是在乳糖不耐症的受試者中有此效果。透過例5可知,發酵乳桿菌TCI275能改善經常便祕便祕的受試者的腸胃相關不適症狀(特別是針對脹氣及腹鳴、腹部蠕動)以及提升普雷沃氏菌屬的能力。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾,皆應涵蓋於本發明的範疇內,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
[圖1] 為發酵乳桿菌TCI275抗胃液及腸液的測試結果數據圖。
[圖2] 為發酵乳桿菌TCI275提升柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)菌種比例的結果數據圖。
[圖3] 為發酵乳桿菌TCI275提升普雷沃氏菌屬(Prevotella)菌種比例的結果數據圖。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所 2019/09/17 BCRC 910940
DE德國 德國國家菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) 2019/09/19 DSM33289
Claims (16)
- 一種發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum )TCI275,其係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910940)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33289)。
- 如請求項1所述之發酵乳桿菌TCI275,其包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
- 如請求項1所述之發酵乳桿菌TCI275,其篩選自人類母乳。
- 如請求項1所述之發酵乳桿菌TCI275,其具有耐胃酸及耐膽鹽的能力。
- 如請求項1所述之發酵乳桿菌TCI275,其具有分解乳糖的能力。
- 一種組合物,其包含一發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum )TCI275及/或其代謝產物,所述發酵乳桿菌係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910940)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33289)。
- 如請求項6所述之組合物,其為一食品組合物。
- 如請求項6所述之組合物,其中該組合物含有5X109 個菌數的發酵乳桿菌TCI275。
- 一種如請求項6所述之組合物的用途,其係用於製備改善乳糖不耐(lactose intolerance)的組合物。
- 如請求項9所述之用途,其中該改善乳糖不耐為包括以下情況的任一者:改善大便稀淌、減少排氣頻率、減少脹氣、減少腹痛。
- 一種如請求項6所述之組合物的用途,其係用於製備改善便祕的組合物。
- 如請求項11所述之用途,其中該改善便祕為提升排便頻率。
- 一種如請求項6所述之組合物的用途,其係用於製備提升一個體的腸胃中的柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)菌種比例的組合物。
- 如請求項13所述之用途,其中該個體為對乳糖不耐的個體。
- 一種如請求項6所述之組合物的用途,其係用於製備提升一個體的腸胃中的普雷沃氏菌屬(Prevotella)菌種比例的組合物。
- 如請求項15所述之用途,其中該個體為具有便秘情況的個體。
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