CN104582712A - 益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于医疗方法或美容治疗方法中的益生菌及其溶菌产物。研究了在治疗包括皮肤感染的感染中的用途及包括皮肤屏障再生或修复的方法。

Description

益生菌
技术领域
本发明涉及益生菌，尤其是，当然也不排除，涉及益生菌及其溶菌产物的医疗应用和美容应用。
背景技术
人类生存与多种微生物息息相关。到目前为止，肠道中的定殖量是最大的且肠道微生物已示出在包括营养封存的正常生理(3)和正常免疫反应的发展(22)中具有多重作用。
正常肠道微生物中都是所谓的益生菌。这些益生菌的消化已示出防止或治疗如抗生素相关性腹泻(47)和炎症性肠病(42)的胃肠道紊乱。这些作用潜在的机理大部分是未知的。然而，研究已显示益生菌能够通过病原体抑制肠道的定殖。体外研究已显示益生菌利用多种机理抑制包括直接竞争上皮细胞上结合位点的(12)和与病原菌竞争营养物的病原体。益生菌微生物还能够产生抑制物，如可以杀死或限制病原体生长的如拟杆菌(13)和有机酸(25)。所选的如植物乳杆菌(L.plantarum)299v的益生菌已示出通过上皮细胞上调粘液分泌从而防止病原体攻击(33)。益生菌还可以产生允许益生菌附着的同时抑制病原菌附着到细胞的生物表面活性剂(43)。
与肠道相比，很少知道有关皮肤微生物群落和上皮之间的正常相互作用。近期研究显示皮肤共生体也能够通过病原菌限制皮肤的定殖(48)。研究还显示某些皮肤疾病(如痤疮和过敏性皮肤炎)可能与正常微生物群落的失调有关(4，6，8)。因此，皮肤微生物群落可以使用特定皮肤共生体调节以促进健康或抑制疾病的想法已经得到一些关注(30，31)。然而，所述皮肤共生菌在某些情况下还可以是病原菌(16)。相比之下，益生菌一般被视为是安全的(GRAS)，因此如果这些细菌具有治疗价值，就能够潜在地被局部使用(17)。目前为止，这一领域中有限数量的研究表明当传统益生菌使用在皮肤上时可具有重要价值。例如，长双歧杆菌(B.longum reuter)溶菌产物的局部应用已示出诱导“反应型皮肤”的临床改善。反应型皮肤对于如大气环境的物理变化及如与局部应用产物一起的化学变化更为敏感。长双歧杆菌(B.longum reuter)溶菌产物在志愿者皮肤上的应用已示出在胶带剥离(tapestripping)后，敏感降低，经表皮水分流失(TEWL)减少。附加地，溶菌产物在离体皮肤上的应用示出减少如血管舒张、水肿和α肿瘤坏死因子释放的炎症信号(20)。植物乳杆菌的局部应用也已证明在烧伤小鼠模型中提升组织修复及人体中慢性下肢溃疡和烧伤中的预防感染(40，41，46)。然而，一般来说，这些作用下的潜在机理是未知的。
金黄色葡萄球菌(staphyococcus aureus)是体内的潮湿、温暖区域皮肤，如腹股沟、腋下和鼻前孔中的主要瞬时定殖者。高达60％的人群为间歇性携带者，而20％的人群可能是稳定定殖的(28)。虽然正常携带是无症状的，但金黄色葡萄球菌可以入侵组织(例如，通过破损皮肤)，这会导致由相对较小的脓包病和烫伤样皮肤综合征至如败血症的危及生命的疾病(29)。此外，金黄色葡萄球菌感染通常是如过敏性皮肤炎的情形下的皮肤中的并发现象(27)。
紧密连接(TJ)是密封相邻上皮细胞之间的旁路空间并限制通过这一路径运输至小的、亲水分子和离子的多蛋白复合物(55)。跨上皮电阻(TEER)是TJ功能的衡量标准(56,57)。TJ功能经常表现为复合物中涉及的特定蛋白的表达水平。通过包括紧密连接蛋白1(claudin 1)、紧密连接蛋白4(claudin 4)、ZO-1和闭合蛋白的角质细胞表达主要的TJ蛋白。
尤其是紧密连接蛋白的表达水平中的变化之前已多次示出被链接至屏障作用中的变化。迄今为止，24种哺乳类紧密连接蛋白已被识别，且这些一般都落入两种分类-一类是增强屏障，一类是形成选择性孔(58)。很多证据都指出了紧密连接蛋白1和4作为屏障增强紧密连接蛋白的作用。在细胞系中，紧密连接蛋白1的过度表达增加了跨上皮电阻并减小了细胞至旁路标记的渗透性。紧密连接蛋白4密封针对离子通道的旁路空间，并且在这一动作中增加单层的跨上皮电阻(59，60)。ZO-1表达中的增加提高了A431细胞的跨上皮电阻(61)，并且激素GLP-1也通过增加ZO-1和闭合蛋白表达提高了caco-2细胞中的紧密连接功能(62)。皮肤中紧密连接的存在仅在最近被发现。因此，目前，特定的TJ蛋白种类对于皮肤屏障作用的贡献大部分是未知的。然而，已知紧密连接蛋白1的基因丢失在老鼠中是致命的(63)。
角质细胞通过如toll样受体(TLR)的模式识别受体感知细菌的存在。肠道中的很多证据已指出TLR激活与TJ屏障功能中的变化之间的关联。Yuki等人(53)的近期研究证明了角质细胞中TJ功能的TLR介导的增大响应于如肽聚糖的细菌配体。
WO2011/029784描述了皮肤上一株鼠李糖乳杆菌株(Lactobacillusrhamnosus strain)LMG P-25211的抗炎作用，及在预防或治疗炎症或过敏皮肤情形中的用途。
WO2010/056198描述了用于治疗葡萄球菌诱发感染的制剂，所述制剂包括一种或多种活的α-葡萄球菌菌株和一种或多种活的选自鼠李糖乳杆菌菌株LB21、植物乳杆菌菌株LB3和植物乳杆菌菌株LB7组的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus)菌株。
WO2006/000992描述了用于预防和/或治疗干燥或敏感性皮肤的美容治疗，其中，益生菌微生物、及其分离物或代谢物与至少一种二价无机阳离子相结合。
马尔塞利亚(Marsella)等人(兽医免疫学和免疫病理学，146(2012)185-289)描述了在过敏性/特应性皮肤炎的模型中口服给药鼠李糖乳杆菌GG的免疫调节作用。
EP2161329A1描述了乳酸菌中的提取物的免疫调节作用，并描述了其在治疗炎症失调中的用途。
黄(Hoang)等人(炎症&过敏症-药物靶标，2010,9,192-196)描述了在过敏性湿疹的治疗中口服给药鼠李糖乳杆菌细胞溶菌产物作为日常免疫补充的用途。
WO2011/045471描述了鼠李糖乳杆菌GG与鼠李糖乳杆菌LC705联合用于治疗呼吸感染，特别是用于抵抗例如流感病毒的病毒引起的呼吸感染的用途。
发明内容
本发明提供了一种用于医学治疗方法、美容治疗方法和作为抑菌剂使用的益生菌及其溶菌产物。公开了在治疗包括皮肤感染的感染中的用途和涉及皮肤屏障的再生或修复的方法。
本发明提供了用于治疗方法中的益生菌。所述益生菌可以以溶菌产物的形式提供。在优选实施中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌菌株、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)菌株或长双歧杆菌菌株。优选地，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。鼠李糖乳杆菌GG储藏于ATCC，编号为53103。所述治疗方法可以包括向患者给药鼠李糖乳杆菌GG。所述方法可以包括向患者的皮肤给药鼠李糖乳杆菌GG。所述本发明的方法对于经受治疗的患者的病情产生治疗或缓解。
在一些实施例中，所述医学治疗方法为治疗或预防感染的方法，所述感染例如为如葡萄球菌的细菌感染。所述感染可以是金黄色葡萄球菌感染。所述感染可以是皮肤感染。所述益生菌、溶菌产物或组合物可以与感染剂单独地、依次地或同时地给药，例如给药于皮肤屏障中的伤口或其他裂痕。
在一些实施例中(或其它实施例中)，所述医学治疗方法为涉及皮肤屏障修复或再生的方法。在涉及皮肤屏障修复或再生的方法中，所述益生菌可以是鼠李糖乳杆菌菌株、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)菌株或长双歧杆菌菌株。所述益生菌可以是鼠李糖乳杆菌GG。在这些方法中，两种不同的益生菌菌株可以在同一治疗方法中给药，例如罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌GG可以共同给药。所述益生菌可以以活的、灭活的或作为溶菌产物被给药。其中，两种或两种以上益生菌被给药的，一种或多种可以作为溶菌产物给药。
涉及皮肤屏障修复或再生的治疗方法可以涉及损伤后皮肤的修复或再生。
涉及皮肤屏障修复或再生的治疗方法可以用于治疗牛皮癣、鱼鳞癣、皮肤炎、伤口愈合、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、灼伤、尿布疹、内瑟顿综合征(Netherton’s Syndrome)、光化性角质病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良或与皮肤屏障的损伤或损坏有关的其他紊乱。其他类似的紊乱对本领域技术人员将是易于理解的。优选地，所述方法涉及将所述益生菌给药至皮肤。
本发明进一步提供了益生菌或其溶菌产物在制造用于治疗皮肤感染和/或皮肤屏障的修复或再生的药物中的用途。所述益生菌可以是鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或长双歧杆菌。可以是鼠李糖乳杆菌GG。所述药物可以包括两株或多株益生菌，或可以与另一益生菌菌株或其溶菌产物共同给药。所述药物可以用于损伤后皮肤的修复或再生，或牛皮癣、鱼鳞癣、皮肤炎、伤口愈合、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、灼伤、尿布疹、内瑟顿综合征、光化性角质病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良或与皮肤屏障的损伤或损坏有关的其他紊乱中的皮肤的治疗。其他类似的紊乱对于技术人员将是易于理解的。
本发明还提供一种包括益生菌的药用组合物。所述药用组合物可以包括如鼠李糖GG的鼠李糖乳杆菌益生菌或罗伊氏乳杆菌益生菌，或包括长双歧杆菌益生菌。所述药用组合物可以进一步包括另一如罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG、或长双歧杆菌之一的益生菌菌株。所述药物组合物可以包括一种或多种所述益生菌菌株的溶菌产物，或溶菌产物、活的、或灭活的益生菌的混合物。所述药物组合物可以被调配用于给药于需要这种治疗的患者的皮肤。
本发明进一步提供了涉及给药益生菌或其溶菌产物于受试者的美容治疗方法，或这类益生菌或其溶菌产物在美容治疗方法中的用途。这类实施例不涉及通过治疗或外科手术治疗人体或动物体。在这类美容方法中，所述益生菌优选包括例如鼠李糖乳杆菌GG的鼠李糖乳杆菌益生菌或其溶菌产物、或罗伊氏乳杆菌或其溶菌产物、或长双歧杆菌或其溶菌产物。所述方法可以涉及将所述益生菌给药于所述患者的皮肤。
本发明还提供了包括鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌或其溶菌产物的美容用组合物。所述美容用组合物可以包括一种或多种如鼠李糖乳杆菌GG的鼠李糖乳杆菌益生菌、罗伊氏乳杆菌益生菌、长双歧杆菌益生菌或它们的溶菌产物，或这些益生菌中的一种、两种或每一种。
本发明进一步提供了包括益生菌或其溶菌产物的抑菌组合物。所述益生菌可以是鼠李糖乳杆菌GG。这类组合物可以用于杀死或抑制细菌的行为或生长。所述组合物可以用于清洗或预处理在上面具有或疑似具有细菌、或可能暴露于细菌的表面。在一些实施例中，所述抑菌组合物可以被调配以免不适用给药至患者或受试者。
本发明还涉及例如适用于治疗和/或美容和/或抑菌用途的组合物的制备方法。所述方法可以包括将多种益生菌溶解并将所产生的溶菌产物调配成组合物。或者，所述方法可以包括将完整的细菌调配成组合物。所述方法可以包括处理所述细菌或溶菌产物的步骤以便除去或灭活完整的细菌，例如，通过将完整的细菌从所述溶菌产物中分隔开。所述溶菌产物经过纯化或过滤步骤，例如以除去完整的细菌、细菌生长培养基或污染物。
通过这一方法制备的所述组合物可以适用于例如在治疗细菌感染或用于修复细菌屏障的治疗中的使用。这些方法可以涉及额外的一种或多种药学上或美容上可接受的赋形剂。其他组合物可能不适用于例如在如洗涤的抑菌组合物的治疗中的使用。
下述编号的段落(paras.)包含在本文中公开的本发明技术特征的多种组合的说明：
1、一种在治疗方法中供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。
2、根据段落1所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述治疗方法涉及给药所述益生菌或其溶菌产物至治疗中的所述患者的皮肤。
3、根据段落1或2所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，用于治疗或预防感染的方法中。
4、根据段落3所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述感染包括细菌感染。
5、根据段落4所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述细菌感染为葡萄球菌感染，优选为金黄色葡萄球菌感染。
6、根据前述任一段落所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述治疗方法用于皮肤感染。
7、一种涉及皮肤屏障修复或再生的治疗方法中供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌或罗伊氏乳杆菌益生菌。
8、根据段落7所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述方法包括将所述益生菌或其溶菌产物给药至皮肤。
9、根据段落7所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。
10、根据段落7-9任一项所述的供使用的益生菌或其溶菌产物，其中，所述方法用于治疗牛皮癣、鱼鳞癣、皮炎、伤口愈合、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、烧伤、尿布疹、内瑟顿(Netherton’s)综合征、光化性角质病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良。
11、根据前述任一段落所述的供使用的益生菌，其中，所述益生菌与不同菌株的益生菌或其溶菌产物共同给药。
12、根据前述任一段落所述的益生菌或其溶菌产物，其中，所述治疗方法涉及罗伊氏杆菌或其溶菌产物的共同给药。
13、一种药用组合物，所述药用组合物包括鼠李糖乳杆菌GG或其溶菌产物。
14、根据段落13所述的药用组合物，所述药用组合物进一步包括不同于鼠李糖乳杆菌菌株或其溶菌产物的益生菌或其溶菌产物，其中，优选不同于鼠李糖乳杆菌的益生菌(probacterium)是罗伊氏杆菌。
15、一种美容方法，所述美容方法包括给药一种或多种如鼠李糖乳杆菌GG、罗伊氏乳杆菌或它们的溶菌产物的鼠李糖乳杆菌益生菌于受试者。
16、根据段落15所述的美容方法，其中，所述益生菌或溶菌产物被给药至受试者的皮肤。
17、一种美容组合物，所述美容组合物包括鼠李糖乳杆菌益生菌或其溶菌产物、和/或罗伊氏乳杆菌益生菌或其溶菌产物。
18、一种医疗方法，所述医疗方法包括给药鼠李糖乳杆菌GG或其溶菌产物至患者，从而治疗所述患者。
19、根据段落18所述的医疗方法，其中，将所述益生菌或其溶菌产物给药至患者的皮肤。
20、根据段落18或19所述的医疗方法，进一步包括将不同于鼠李糖乳杆菌GG或其溶菌产物的益生菌给药至患者，其中，所述不同于鼠李糖乳杆菌的益生菌优选为罗伊氏乳杆菌。
21、根据段落18所述的医疗方法，其中，所述医疗为感染的治疗或预防。
22、根据段落18至21任一项所述的医疗方法，其中，所述医疗为皮肤感染的治疗或预防，并且其中，所述皮肤感染在治疗后被治疗或减轻。
23、一种医疗方法，所述医疗方法包括给药鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG或罗伊氏乳杆菌至需要它们的患者，其中，所述治疗用于皮肤屏障的修复或再生，其中，所述皮肤屏障在治疗后被修复或再生。
24、根据段落23所述的医疗方法，其中，所述鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG或罗伊氏乳杆菌被给药至患者的皮肤。
25、根据段落22或段落23所述的方法，其中，所述治疗方法用于牛皮癣、鱼鳞癣、皮炎、伤口愈合、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、烧伤、尿布疹、内瑟顿(Netherton’s)综合征、光化性角质病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良。
26、一种益生菌或其溶菌产物在制作用于治疗感染的药物中的用途，其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。
27、一种益生菌或其溶菌产物在制作用于治疗的药物中的用途，其中，所述治疗包括皮肤屏障的修复或再生，并且其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌或罗伊氏乳杆菌。
28、根据段落26或段落27所述的用途，其中，所述药物被调配用于给药至皮肤。
29、根据段落28所述的用途，其中，所述方法用于治疗牛皮癣、鱼鳞癣、皮炎、伤口愈合、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、烧伤、尿布疹、内瑟顿(Netherton’s)综合征、光化性角质病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良。
30、根据段落26-29任一项所述的益生菌或其溶菌产物的用途，其中，所述治疗包括一种以上益生菌或其溶菌产物的共同给药。
31、一种鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物。
32、一种被调配用于给药至皮肤的组合物，所述组合物包括鼠李糖乳杆菌GG、鼠李糖乳杆菌和/或罗伊氏乳杆菌，或一种或多种所述菌的溶菌产物。
33、一种抑菌组合物，所述抑菌组合物包括鼠李糖乳杆菌GG或其溶菌产物。
优选实施例的说明
本发明包括所述各方面和所述优选特征的组合，除非这一组合是明显不允许的或明确要避开的。
本文使用的各部分标题仅用于组织的目的且并不是被构建为限制所描述的主旨。
本发明的各方面和各实施例都将通过举例并参照附图的方式被示出。进一步的方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文所提到的文件通过引用的方式并入本文。
皮肤是组织和外界之间的初级屏障。它必须在阻止病原体入侵的同时防止体内水分子和电解质的丢失。目前为止，皮肤的屏障功能已认为是角质层独有的作用。然而，已知的复合物作为紧密连接对皮肤的屏障作用也是至关重要的。偶然地，所述皮肤屏障由于创伤或抓伤被打破。在这些情形中，所述皮肤必须自我修复。然而，偶然地，修复不能足够快地产发，这会造成所述皮肤存有感染的可能性。我们依据它们的特性已经筛选了一系列益生菌以：
1)保护皮肤远离有害病原体、金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林耐药菌株)
2)刺激再生并增强皮肤细胞的屏障功能
我们已识别了具有皮肤细胞保护和再生特性的益生菌菌株(鼠李糖乳杆菌GG)。重要地是，这一菌株的溶菌产物提高了皮肤角质细胞抵抗由金黄色葡萄球菌(SA)引起的有害毒性的能力(图9A)。当与第二菌株溶菌产物(罗伊氏乳杆菌)组合使用时，所述组合在保护抵抗金黄色葡萄球菌方面比任一种菌株单独使用时更有效(图9B)。我们还证明了当角质细胞单层被刮掉除去细胞时(即创伤模型)，我们的适当益生菌溶菌产物的存在显著地且令人惊奇地提升了单层的恢复和所述屏障的重建(图10)。
增强和修复所述角质细胞的屏障功能的药物具有极大的潜能,不仅作为治疗用药物，还可以作为美容用皮肤改善药物。所述屏障功能的增强增加了皮肤水化水平，并已知提高了皮肤外观，产生了更健康的美容外观。
我们的观察结果扩展了益生菌的实用性和应用性。我们初步的观察结果表明益生菌能够应用至许多皮肤护理的应用中，所述应用包括：伤口愈合、伤口敷料涂层技术、改善皮肤护肤脂用于美容和治疗用(例如过敏性皮肤炎)；如洗手剂和肥皂的抑菌产品，和旨在皮肤屏障功能的维持/修复的美容准备和修复由于太阳暴晒和年龄化受损的屏障的治疗。
益生菌具有防止有害细菌的有害作用且同时积极地修复受损的皮肤屏障的潜力，其在皮肤护理中的商业应用是非常重要的。越来越多的人需求自然、安全且有效的用于常见的皮肤调整(alignment)的治疗，且我们的技术体现了满足这些市场需求的重要改进。
我们的技术不仅能提供一种用于建立/修复所述皮肤屏障的新的治疗用药物，还能潜在地规避目前对于例如抗生素的过激治疗的需求。目前的主流预防方法包括虽然有效但具有有害作用的抑菌药物。治疗依赖于抗生素的使用以杀死有害细菌感染。我们的方法不仅抑制有害皮肤病原体，还积极地在细胞水平促进屏障的修复。因为屏障功能/修复的下降与抵抗感染能力的下降密切相关，我们的溶菌产物体现了同时提高屏障和其防卫病原体能力的技术。
目前，市场上以活菌作为成份的产品(例如纯活性(Nude live)皮肤益生菌化妆品系列)非常少。我们的纯化溶菌产物方法通过在较低浓度提供可控的和可确定的存活率；提高生产的稳定性和简便性；和提高保存周期要比这些方法具有许多功能性和商业性优势。总之，这些使我们的技术对治疗使用和美容使用更易于接受，有别于难于制造和运输的活菌乳霜。
附图说明
现将参照附图讨论本发明实施例和实验所示出的原则，其中：
图1.图表显示金黄色葡萄球菌对角质细胞存活率具有剂量依赖效应。未感染的细胞具有81.2±4.1％的存活率。暴露于105cfu/mL金黄色葡萄球菌的细胞具有49.4±11.1％的存活率。暴露于106cfu/mL金黄色葡萄球菌的细胞具有30.5±9.8％的存活率。暴露于107cfu/mL金黄色葡萄球菌的细胞具有12.1±1.1％的存活率，而暴露于108cfu/mL金黄色葡萄球菌的细胞具有3.3±1.1％的存活率。线性回归分析证实浓度与存活率百分数之间的线性关系(p<0.001)。结果表示为平均值±平均标准偏差(SEM)。
图2.乳酸杆菌保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌的细胞毒性影响。(A)图表显示未感染的正常人类表皮角质细胞(NHEK)的存活率百分数(86.9％±5.1)和感染108cfu/mL金黄色葡萄球菌(SA)的NHEK的存活率百分数(8.8％±7.1)、感染罗伊氏乳杆菌(LR)的NHEK的存活率百分数(80.8％±4.5)、感染鼠李糖乳杆菌(LRH)的NHEK的存活率百分数(84.8％±2.1)、感染唾液乳杆菌(LS)的NHEK的存活率百分数(71.7％±2.9)、感染金黄色葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌(SA+LS)的NHEK的存活率百分数(53.1％±4.2)、感染金黄色葡萄球菌和鼠李糖乳杆菌(SA+LRH)的NHEK的存活率百分数(42.7％±7.4)和感染金黄色葡萄球菌和唾液乳杆菌(SA+LS)的NHEK的存活率百分数(31.1％±6.5)。(B)台盼蓝(trypan blue)染色的感染细胞的代表性照片(放大200倍)。A)未处理的、B)感染108cfu/mL金黄色葡萄球菌的、C)暴露于108cfu/mL罗伊氏乳杆菌的、或D)同时感染108cfu/mL金黄色葡萄球菌和108cfu/mL罗伊氏乳杆菌的。(C)图表显示感染106金黄色葡萄球菌(SA)(31.6±4.1％)、或金黄色葡萄球菌和106罗伊氏乳杆菌(A)(54.8±2.7％)、金黄色葡萄球菌和107罗伊氏乳杆菌(B)(55.4±4.3％)和金黄色葡萄球菌和108罗伊氏乳杆菌(C)(56.2±4.1％)的细胞的存活率。(D)图表显示暴露于金黄色葡萄球菌的角质细胞相对于对照组的存活率(92±1.9％)降低37.4±1.3％，而暴露于加热杀死的罗伊氏乳杆菌(HKLR)的角质细胞对于它们的存活率具有很小的改变(88.3±3.3％)。预暴露于加热杀死的罗伊氏乳杆菌的角质细胞(预-HKLR)具有与暴露于金黄色葡萄球菌的角质细胞类似的存活率(33±2.1％)。(E)图表显示罗伊氏乳杆菌溶菌产物(LR溶菌产物)能够保护角质细胞，P＝0.01。仅暴露于金黄色葡萄球菌(SA)的细胞的存活率(38.3±4.7log cfu)显著低于预暴露于罗伊氏乳杆菌的溶菌产物(预-溶菌产物)的细胞的存活率(57.7±2.4logcfu)。结果表示为平均值±平均标准偏差。
图3.罗伊氏乳杆菌只有在感染金黄色葡萄球菌之前被加入才能保护角质细胞。(A)图表显示相对于金黄色葡萄球菌感染的细胞的存活率(SA)(29.8±3.8)，共感染的(SA+LR)(57.1±2，P＝57.1)和预暴露于罗伊氏乳杆菌1小时的(1小时预)(63.6±5.6％，P＝0.0003)、2小时的(2小时预)(56.1±1.2％，P＝0.0022)和4小时的(4小时预)(52.4±4.1％，P＝0.0066)细胞的存活率百分数显著较高。(B)图表显示细胞的存活率在感染已经发生之后用罗伊氏乳杆菌处理1小时(后-1小时)(25.8±0.6％)、2小时(后-2小时)(29.3±2.6％)或4小时(后-4小时)(33.57±4.9％)的细胞的存活率和仅被金黄色葡萄球菌感染的细胞(SA)(29.9±3.4％)的存活率之间没有显著区别(P＞0.05)。结果表示为平均值±平均标准偏差。
图4a.罗伊氏乳杆菌没有抑制共培养中的金黄色葡萄球菌的生长。图表显示竞争分析试验的结果显示各组之间随时间的变化无显著差异(P＝0.146)。
图4b(表1).罗伊氏乳杆菌不影响细胞培养中葡萄球菌的存活率。在无细胞存在的情况下，金黄色葡萄球菌生长具有8.0(log cfu)的活菌数。在有角质细胞存在的情况下，金黄色葡萄球菌生长具有8.6±0.2的活菌数。在无细胞存在的情况下，金黄色葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌共培养具有8.4±0.4的活菌数，而在有角质细胞存在的情况下，金黄色葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌共培养具有8.0±0.2的活菌数。在各组之间没有发现显著差异(P＝0.34)。结果表示为平均值±平均标准偏差。
图5.罗伊氏乳杆菌抑制葡萄球菌对角质细胞的的粘附和入侵。图表显示：(A)金黄色葡萄球菌粘附大约5.5±0.3logcfu/mL和罗伊氏乳杆菌粘附大约6.2±0.1log cfu/mL。(B)排斥。相对于仅感染金黄色葡萄球菌的细胞(4.4±0.4log cfu)，在金黄色葡萄球菌感染之前预暴露于罗伊氏乳杆菌的细胞(预-LR)具有非常少的粘附至细胞的葡萄球菌数(5.7±0.2log cfu)。(C)竞争。相对于仅感染金黄色葡萄球菌的细胞(5.6±0.1log cfu)，与罗伊氏乳杆菌共感染的细胞(SA+LR)具有非常少的粘附至细胞的葡萄球菌数(4.4±0.4log cfu)。(D)转移。相对于仅感染金黄色葡萄球菌的细胞(5.7±0.3log cfu，P＝0.47)，感染金黄色葡萄球菌后暴露于罗伊氏乳杆菌的细胞(后-LR)(5.3±0.5log cfu)上粘附的葡萄球菌的数量没有显著差异。(E)与罗伊氏乳杆菌共感染的细胞(4.5±0.1log cfu)比仅有金黄色葡萄球菌感染的细胞(6.1±0.1log cfu)具有显著很少的葡萄球菌。结果表示为平均值±平均标准偏差。
图6.加热杀死的罗伊氏乳杆菌不能够抑制葡萄球菌粘附至角质细胞，但溶菌产物可以。图表示出了：(A)当单独应用(SA)(6.5±0.2logcfu)、当在NHEK被预暴露于活的罗伊氏乳杆菌(预-LR)之后被加入(5.3±0.1log cfu)，和当预暴露于加热杀死的罗伊氏乳杆菌(预-HKLR)(6.1±0.3log cfu)时粘附至NHEK的葡萄球菌的数量。暴露于未处理的罗伊氏乳杆菌的细胞具有显著较少的结合至细胞的葡萄球菌(P＝0.003)，但暴露于加热杀死的罗伊氏乳杆菌的细胞所粘附的葡萄球菌无显著差异(P＝0.09)。(B)当单独应用(SA)时粘附至NHEK的葡萄球菌的数量(6.3±0.1log cfu)显著多于当NHEK被预暴露于活的罗伊氏乳杆菌(预-LR)(5.6±0.2log cfu，P＝0.0002)后被加入时，及当预暴露于罗伊氏乳杆菌的溶菌产物(预-LYS)(6.0±0.2log cfu,P＝0.032)时。结果表示为平均值±平均标准偏差。
图7.金黄色葡萄球菌使用α5β1整合蛋白以结合至角质细胞且这一整合蛋白的封闭足以保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌的影响。图表示出：(A)对比于未处理的角质细胞(6.1±0.1，P＝0.007)，显著较少的葡萄球菌粘附至用60μg/mL封闭抗体处理的细胞(5.7±0.1logcfu)。结果表示为平均值±平均标准偏差。(B)相对于仅用金黄色葡萄球菌(SA)感染的角质细胞(19.3±2.0％,P＝0.03)，如果角质细胞在感染前预暴露于抗-α5β1整合蛋白(预-INT)抗体(47.9±6.0％)，则在用葡萄球菌感染24小时之后，显著更多的角质细胞是存活的。结果表示为平均值±平均标准偏差。
图8.唾液乳杆菌不能抑制葡萄球菌粘附至角质细胞。图表示出：(A)相对于细胞仅暴露于金黄色葡萄球菌(SA)的细胞(4.9±0.2logcfu)，预暴露于唾液乳杆菌(预-LS)的角质细胞具有相似数量的粘附的葡萄球菌(4.5±0.2log cfu)。(B)粘附的罗伊氏乳杆菌(LR)(6.7±0.1log cfu)显著多于唾液乳杆菌(LS)(5.6±0.1log cfu，P＝0.005)。结果表示为平均值±平均标准偏差。
图9.图表显示:(A)人原发性角质细胞暴露于病原体金黄色葡萄球菌(SA)24小时。这导致24小时后大约80％的细胞死亡，只有20％的角质细胞存活。在溶菌产物P1(LGG)或P2(罗伊氏乳杆菌)存在的情况下，暴露于病原体24小时后，显著较高数量的角质细胞仍旧存活(分别为50％和60％)，(B)当同时应用益生菌溶菌产物P1(LGG)和P2(罗伊氏乳杆菌)时，要比当单独应用任一菌株时更加有效且对角质细胞的存活率具有更大的保护性作用。
图10.伤口”擦伤实验的图片。在“伤口”擦伤实验中，溶菌产物P1(LGG)和P2(罗伊氏乳杆菌)都加速屏障修复。在18小时后的擦伤中，处理样本(P1和P2)的溶菌产物中的细胞几乎已修复好由擦伤引起的伤害，而在未处理的细胞(对照组)中该擦伤仍旧是明显的。
图11.孔扩散试验(well diffusion assay)的图片。孔扩散试验显示AC413不抑制金黄色葡萄球菌的生长。对于这个实验，金黄色葡萄球菌被接种作为细菌的菌苔(lawn)。随后将孔中的琼脂挖出并将AC413接种于孔中。通过AC413，金黄色葡萄球菌的任何杀死都将被视为孔周围的抑制区。
图12.图表显示LGG降低了金黄色葡萄球菌的生长速率。在这个实验中，金黄色葡萄球菌(SA)和LGG共同生长(SA+LGG)。另一实验还包括伴有LGG溶菌产物的金黄色葡萄球菌(SA+LGGLYS)的生长。图表表明，在存有活的LGG或溶菌产物的情况下，金黄色葡萄球菌的生长是较慢的。
图13.图表显示LGG及其溶菌产物杀死金黄色葡萄球菌。在这个实验中，在存有活的LGG或LGG溶菌产物的情况下，测量死亡的金黄色葡萄球菌的数量。死亡细菌的最高数量被见于LGG溶菌产物中。
图14.图表显示LGG或罗伊氏乳杆菌溶菌产物增加了角质细胞单层的上皮再生(re-epithelialisation)速率。在这个实验中，角质细胞单层被擦伤且在存在LGG、罗伊氏乳杆菌(LR)、植物乳杆菌(LP)、发酵乳杆菌(LF)、表皮葡萄球菌(S EPI)或长双歧杆菌(BIF)任一种的情况下，测量上皮再生速率。只有LGG或罗伊氏乳杆菌增加上皮再生速率。
图15.图表显示LGG和罗伊氏乳杆菌增加角质细胞迁移的速度。在这个实验中，测量角质细胞的迁移，因为这是通过单层上皮再生的重要机制。只有LGG或罗伊氏乳杆菌增加角质细胞的迁移。
图16.图表显示益生菌对角质细胞的存活率有菌株依赖作用。将人原发性表皮角质细胞与108CFU/mL细菌培养24小时。随后暴露，使用噻唑蓝(MTT)比色法测量角质细胞的存活率。在长双歧杆菌(BLR)、植物乳杆菌(LP)、罗伊氏乳杆菌(LR)或鼠李糖乳杆菌戈德温(Goldwin)及戈尔巴奇(Gorbach)(LGG)存在的情况下培养的角质细胞的存活率并未显著不同于未处理细胞(对照组)的存活率。然而，相对于对照组，用发酵乳杆菌(LF)处理的角质细胞培养降低了存活率(存活率降低-50％，p<0.005)。
图17.图表显示益生菌提高具有菌株特定效应的紧密连接屏障功能。诱导人原发性角质细胞形成紧密连接(TJ)并实时监测未处理的单层对比感染益生菌的单层的跨上皮电阻(TEER)。在对照单层中，随着时间延长、钙的变化形成了TEER，并达到大约255Ohms.cm2+/-50.4的峰值。除了发酵乳杆菌(相对于对照单层，其降低了跨上皮电阻)，所有的益生菌在菌株依赖模式中都增加跨上皮电阻超过了对照水平。鼠李糖乳杆菌GG和长双歧杆菌产生了最大的和最持久的影响。在图17中，开环是被处理的单层，闭环是未处理的单层，17(a)应答于钙浓度增加的未处理细胞中的跨上皮电阻的发展趋势(development)，相对于未处理的对照组，(b)发酵乳杆菌(c)罗伊氏乳杆菌(d)植物乳杆菌(e)长双歧杆菌reuter(f)鼠李糖乳杆菌GG对于跨上皮电阻的发展趋势的影响。
图18.图表显示益生菌在人角质细胞中对跨上皮电阻有剂量依赖效应。用浓度108、106、104和102CFU/mL的由长双歧杆菌(BLR)或鼠李糖乳杆菌GG(LGG)制成的溶菌产物处理人角质细胞，并随时间变化测量对跨上皮电阻的影响。长双歧杆菌(BLR)仅在108CFU/mL的浓度下有效。然而，鼠李糖乳杆菌GG在106和104CFU/mL的浓度下还有效。(a)长双歧杆菌对跨上皮电阻的影响，(b)鼠李糖乳杆菌GG对跨上皮电阻的影响。18(a)和(b)是对照组、未处理组，■是102个细菌的影响，▲是104个细菌的影响，O是106个细菌的影响，·是108个细菌的影响。
图19.免疫印迹和图表显示益生菌调节人类角质细胞中的紧密连接蛋白表达。用108CFU/mL的鼠李糖乳杆菌GG(LGG)或长双歧杆菌(BLR)的溶菌产物处理人类角质细胞24小时。随后，获取角质细胞并使用免疫印迹(a)和随后的光密度技术(b)研究紧密连接蛋白1(claudin 1)、紧密连接蛋白4(claudin 4)、ZO-1和闭合蛋白(occludin)的表达。相对于对照组，BLR增加了所有的四种紧密连接蛋白的表达(claudin 1(cld-1)3.7X+/-0.08(p<0.05),Claudin 4(cld-4)-2.15+/-0.01(p<0.05)，occludin(occ)，2.53X+/-0.14(p<0.005)，ZO-1,2X+/-0.024(p<0.05)。然而，LGG对claudin 4水平的影响没有变化，但增加了其他三种蛋白的表达(claudin 1-3.27X+/-0.36(p<0.05)，occludin2.65X+/-0.17(p<0.005)，ZO-1-2.22x+/-0.036(p<0.05)。
图20.免疫印迹和图表显示TLR2的中和废除了特定益生菌对TJ屏障功能和蛋白质表达的介导作用。在将角质细胞与长双歧杆菌(BLR)或鼠李糖乳杆菌GG(LGG)的溶菌产物培养孵化前用TLR2中和抗体处理角质细胞。(A)图表显示在用BLR而不用LGG处理的细胞中，益生菌诱导的跨上皮电阻增加通过与抗体培养被废除。(B)免疫印迹同样显示，在BLR而不是LGG处理的细胞中，TJ蛋白表达的增加通过TLR2的中和也被废除。
本发明的详细说明
本发明的一个或多个实施例的细节均以下述附带的说明被陈述，所述说明包括发明人以实施例的方式提出的用于执行本发明的最佳模型的具体细节。对本领域技术人员将是显而易见的是，本发明可以不受这些具体细节的限定被实施。
纵观说明书，包括下述权利要求书，除本文另有要求：词“包括”和如“包括”(comprises)和“包括”(compring)的变形将应理解为意味着包含规定的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或复数的组。
必须指出，如说明书和从属权利要求书中所使用的，单数形式“一”(“a”、an”和“the”)包括复数指代物，除非上下文明确规定。因此，例如，关于“一种药用载体”包括两个或两个以上这样的载体的混合物等等。
益生菌
本发明涉及益生菌的用途。益生菌通常定义为“当适量给药时在宿主上给予健康益处的活的微生物”。在肠道中的研究已证实了益生菌通过包括病原体粘附至宿主组织的排斥、竞争和转移机制抑制病原体定殖的能力。如本文所用，术语“益生菌”也指当其不再是活体的这种细菌，例如下述的用加热或辐射方式灭活。
鼠李糖乳杆菌
本发明尤其涉及特定鼠李糖乳酸菌的益生菌。这种细菌最初被认为是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的亚种，但随后的遗传研究发现它自身是一个物种。许多鼠李糖乳杆菌菌株都是已知的。例如，菌株I-1720(巴斯德微生物保藏中心(Pasteur Collection Nationale de Culturesde Microorganismes))、AC413、GR-1(卡尔松(Karlsson)等，BMC微生物学杂志，2012,12:15)、JB-1(布拉沃(Bravo)等，美国科学院院报(PNAS)，2011,108(38)：16050-16055)、GG和Lc705(萨维优克(Savijok)等,蛋白质组研究期刊(J.Proteome Res),2011,10(8):3460-3473)。鼠李糖乳杆菌的其他菌株可易于被分离。可选地，本发明的一些实施例不包括鼠李糖乳杆菌菌株LB21的用途。
特别地，本发明涉及鼠李糖乳杆菌GG。鼠李糖乳杆菌GG(在这里也称为LGG)储藏于ATCC(美国组织培养收藏中心)，编号ATCC53103。鼠李糖乳杆菌GG由Gorbach和Goldin于1983年从健康人体的消化道分离得到。
罗伊氏乳杆菌
本发明还涉及罗伊氏乳杆菌菌株。罗伊氏乳杆菌为自然存在于哺乳类和鸟类肠道的革兰氏阳性菌。许多的罗伊氏乳杆菌菌株都是已知的，例如，DSM 17938及ATCC 23272、53608、53609、55148和55739。罗伊氏乳杆菌菌株在例如美国6,872,565和美国7,517,681中进行了描述。罗伊氏乳杆菌的其他菌株可易于被分离。
特别优选地，根据本发明的罗伊氏乳杆菌菌株收藏于ATCC，编号ATCC 55730，于美国5,837,238中被描述。
长双歧杆菌
本发明还涉及长双歧杆菌菌株。长双歧杆菌为发现于婴幼儿肠道中的一种革兰氏阳性菌。许多长双歧杆菌菌株都是已知的。例如，ATCC15708、55816、55818、15707、35183和51870。长双歧杆菌的其他菌株可易于被分离。
特别优选地，根据本发明的长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum reuter)。在一些实施例中，长双歧杆菌收藏于ATCC，编号ATCC 51870。
应用
根据本发明的益生菌或它们的溶菌产物可以被调配为用于临床使用的药用组合物，可以包括药学上可接受的载体、稀释剂或助剂。它们可以被调配用于局部给药。
给药优选地在“治疗有效量”中，这是足以示出对个体有益的量。实际的给药量和给药率和给药时间管理将取决于治疗中的疾病的性质和严重程度。治疗的处方，如确定剂量等，是全科医生和其他医生的责任，尤其考虑待处理的疾病、个体的状况、输送的位点、给药方法和其他从业者已知的因素。在威廉姆斯&威尔金斯著、2000年利平科特出版的第20版的雷明登氏(Remington’s)制药科学中可找到上述技术和原理的例子。本领域技术人员将会理解的是，活性化合物以及包括活性化合物的组合物的适当剂量能够因患者而异。
治疗应用
本发明所述化合物和组合物用于治疗各种各样的疾病和情况。特别地，本发明所述化合物和组合物用于治疗皮肤的紊乱、疾病和情况并发现在治疗纤维变性(包括术后纤维化)、组织粘连的形成和疤痕中的应用。本发明所述化合物和组合物用于治疗痤疮、湿疹、鱼鳞癣、牛皮癣。根据发明的所述益生菌及其溶菌产物用于伤口愈合。
用于治疗应用的益生菌及其溶菌产物可以被调配为药物，也就是被调配为药品。所述药物可以包括本领域技术人员已知的其他药学上可接受的成份，包括但不限于药学上可接受的载体、助剂、赋形剂、稀释剂、填料、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、溶解剂、表面活性剂(如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。所述配方可以进一步包括其他活性试剂、例如，其他治疗用试剂或预防用试剂。
感染
本发明涉及感染的治疗。本发明的所述益生菌及其溶菌产物展现了抗感染试药物的活性。例如，抗菌活性。因此，它们用于治疗包括细菌感染的感染。因此，它们用于治疗多重耐药细菌感染、院内细菌感染、抗生素耐药细菌感染、由革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌感染引起的感染。
本发明所述益生菌和溶菌产物还用于治疗由葡萄球菌属(Staphyloccus spp.)、假单胞菌属、腐生葡萄球菌(Staphyloccocussaprophyticus)、木糖葡萄球菌(Staphyloccocus xylosus)、路登葡萄球菌(Staphyloccocus lugdunensis)、施氏葡萄球菌(Staphyloccocusschleiferi)、产色葡萄球菌(Stapylococcus caprae)、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、沃氏葡萄球菌(Staphyloccocus warneri)、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、粪肠球菌、抗万古霉素肠球菌(VRE)、痤疮初油酸菌(proprionibacterium acnes)、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌(listerriamonocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、唾液链球菌、变形链球菌和肺炎链球菌引起的感染。
特别地，本发明所述益生菌和溶菌产物展现了抗葡萄球菌活性，并因此用于治疗或预防葡萄球菌感染。例如，本发明的所述益生菌和溶菌产物展现了抗金黄色葡萄球菌活性，并因此用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染。
感染发生在微生物侵袭身体组织产生的疾病中。这些微生物的增殖和它们产生的与身体组织反应的毒素，常常导致受感染宿主的免疫反应。感染可由细菌、病毒、类病毒、真菌和寄生虫引起。感染可以通过如皮肤、肠道或膜的身体任意组织发生。在本发明一些实施例中，所述益生菌或溶菌产物用于治疗组织而不是肠道的感染。例如在一些实施例中，根据本发明的所述益生菌或溶菌产物不适用于治疗消化道、食道、胃、小肠、直肠或肛门的感染。在特定方面中，本发明涉及治疗或预防身体的体表，特别是皮肤的感染。
根据本发明的所述益生菌、溶菌产物和组合物可以用于治疗或预防皮肤感染。所述感染可由细菌，如葡萄球菌引起。传染物可以是金黄色葡萄球菌。可以单独地、依次地或同时地应用所述益生菌、溶菌产物或组合物接触传染物。在某些情况下，所述益生菌、溶菌产物或组合物在接触传染物之后被应用。
屏障作用
本发明所述益生菌和溶菌产物具有屏障修复、强化和/或再生活性。皮肤由两层组成，深层(真皮)和表层(表皮)。这就构成了一个阻挡外部攻击的屏障，特别是化学、机械或传染性攻击，因此，大量的抵抗环境因素(气候、紫外线、烟草等)和/或例如微生物的异型生物质的防御反应在屏障中出现。这一属性被称为屏障功能，主要由表皮的最浅层，即被称为角质层的表皮角质层提供。屏障的有害改变可通过皮肤不适、过敏现象，特别是不愉快的现象，或通过不知不觉水损失判断的皮肤干燥反映。根据本发明的组合物用于防止屏障的减少和/或屏障功能的修复或再生。屏障功能的减少与许多如下面所列的疾病有关。如果屏障例如通过伤口或擦伤被攻破，则皮肤必须自我修复。然而，偶尔地，修复并不能足够快地发生，这导致皮肤留有感染的可能性。
与皮肤屏障的破坏有关的疾病包括牛皮癣、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、烧伤、尿布疹、内瑟顿综合征、光化性角质病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良、过敏性皮炎、接触性皮炎、皮炎、脂溢性皮炎、片层状鱼鳞癣或其他与皮肤屏障的损伤或破裂有关的疾病。
湿疹/皮炎
湿疹(过敏性皮炎)是一种皮肤炎症反应的特定类型，其中在第一阶段有典型的囊泡(小水泡状凸起区)，随后是红斑(脸红)、水肿(肿胀)、丘疹(疙瘩)、和皮肤结硬皮，最后为皮肤苔藓样硬化(增厚)和结垢。湿疹典型地引起皮肤瘙痒和灼热。
湿疹是很常见的，可以发生在任何年龄。它经常是慢性的且难以治疗，它易于消失和复发。瘙痒可以是极端的和严重的。有许多类型的湿疹。湿疹的发病率很高，估计仅在美国就有3300万人受到感染。
鱼鳞癣
片层状鱼鳞癣是一种遗传性皮肤病，其特征体现在由表皮分化或代谢异常引起的过量的干燥表面鳞片皮肤。它通常最严重的是腿，但也可能涉及到手臂、双手，在某些情况下也可能是躯干。也可能与过敏性皮肤炎、毛发角质病(手臂后面上的小囊泡)、或其他皮肤疾病有关。它通常在成年后就会消失，但年老时可能复发。
其他类型的鱼鳞癣包括X连锁隐性鱼鳞癣、层状鱼鳞癣、表皮松解性角质过度病、丑角状鱼鳞癣、内瑟顿综合症和舍格伦-拉松综合症(Sjogren-Larsson)，但片层状鱼鳞病占所有鱼鳞癣病例的95％。
遗传性(先天性)片层状鱼鳞病超过片层状鱼鳞病病例的95％。它首次出现在童年早期。片层状鱼鳞癣的基因责任已被映射到染色体带1q21。这一基因的产物是一种叫丝聚合蛋白(FLG)的物质，可作为角质层细胞中的“角蛋白基质蛋白”。其遗传模式是常染色体显性遗传。后天的片层状鱼鳞病，通常形成(develop)于成年期并由内部疾病或某些药物的使用造成。遗传性片层状鱼鳞病在美国是一种常见的疾病，患病率约每300人中有一例。由于症状随着年龄的增长而增加，所以真正的患病率可能更高。后天的鱼鳞癣是极其罕见的，其发病率在美国是未知的。在英国，据报道片层状鱼鳞病的发病率是每250人中有一例。在中国，片层状鱼鳞病的患病率为2.29％。
牛皮癣
牛皮癣是一种慢性、遗传性、不具有传染性的皮肤病，其特点是发痒或厚的溃疡斑块、具有银色鳞片的红皮肤。由牛皮癣引起的鳞片斑块被称为银屑病斑块，是炎症和皮肤过度生产的领域。这一疾病是一种慢性反复出现的疾病，具有从轻微的局部斑块到整个躯干覆盖的不同严重程度。牛皮癣也会导致关节的炎症，这被称为银屑病关节炎。有许多形式的所述疾病。
根据国家卫生研究院(NIH)，多达750万美国人(约占人口的2.2％)有牛皮癣，据估计全世界有1.25亿人受到影响。每年有15万至26万的新病例发生。牛皮癣的发病率往往受气候和种群的遗传基因的影响。在热带地区和深色皮肤人群中不太常见，在白种人中最常见。总体的直接和间接牛皮癣患者的医疗成本估计为每年112.5亿美元，工作损失占成本负担的40％16。平均约60％的牛皮癣患者由于他们的疾病错过了平均一年26天的工作7。
伤口愈合
这里所述的伤口愈合是指皮肤损伤后自我修复的过程。在正常皮肤中，表皮(最外层，主要由角质细胞构成)和真皮(内层或深层)存在形成抵抗外部环境的保护屏障的稳态平衡。一旦保护屏障被破坏，例如通过伤口(wounding)，伤口愈合的正常(生理)过程立即启动。本文所使用的术语“创伤(wound)”是指皮肤被撕裂、切割或刺穿，或者皮肤在钝力创伤或医疗状况后被损害，导致皮肤屏障破坏的损伤类型。根据本发明的所述益生菌或其溶菌产物可用于包括组织修复、再生和/或更换的体内伤口愈合。例如，它们可被用于治疗疤痕组织，加速伤口愈合，或如皮肤移植所用的组织移植。
在一些实施例中，所述皮肤屏障的修复或再生包括粘膜的修复或再生。粘膜包括口腔粘膜(包括脸颊粘膜、软腭粘膜、包括舌下表面和口底粘膜的舌粘膜)、鼻粘膜、喉粘膜(包括咽、喉、气管和食道粘膜)、支气管粘膜、肺粘膜、眼粘膜、耳粘膜、阴道粘膜、阴茎粘膜、尿道粘膜、膀胱粘膜和肛门粘膜。
待治疗的患者可以是任何动物或人类。患者优选非人类哺乳动物或人类患者。患者可以是男性或女性。
美容应用
在某些方面，本发明涉及包括给药根据本发明的益生菌或溶菌产物的美容治疗。本文所述的“美容”是指非治疗的。这些方法不涉及通过l疗法来治疗人体或动物。所述美容治疗可用于改善皮肤的外观和/或纹理。
本发明还提出了益生菌或其溶菌产物在美容治疗方法中，和使用所述益生菌或它们的溶菌产物的美容治疗方法中的用途。例如，在改善水化水平、或皮肤外观的方法中。本文所使用的术语“美容方法”并不涉及通过手术或疗法，或根据EPC 53(c)条在人体或动物体上实施的诊断方法来治疗人体或动物体的方法。
本发明还提供了包括益生菌的美容组合物。所述组合物可用来改善皮肤的外观。例如，所述组合物可增强皮肤的水化水平。增强的水化水平已知能改善皮肤的外观，并产生更健康的美容外观。美容组合物可类似于如下所述的药用组合物被调配。
待治疗的受试者可以是任何动物或人类。所述受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。所述受试者可以是男性或女性。所述受试者不需要修复他们的皮肤屏障。在某些情况下，所述受试者不需要治疗感染，如细菌感染。在某些情况下，所述受试者不需要在美容治疗被应用的地方接受治疗。
根据本发明的所述美容方法优选涉及给药“美容有效量”。这涉及给药有效量的化合物、原料、材料、成分、剂型等以产生美容效果。这在相关从业者的合理判断的范围内。本领域技术人员应当理解的是，适当剂量的活性化合物和包括所述活性物质的组合物可以因受试者而异。
根据本发明的益生菌、其溶菌产物和组合物具有屏障维护和修复活性。同样地，它们可用于预防屏障功能的减少和/或加固屏障功能。这可用于提高皮肤的水化和/或改善皮肤的外观。
可选地未权要声明的用途
下述独立的可选实施例和单独实施例在某些情况下可能不会形成本发明的一部分。
可选地，本发明的一些实施例不包括益生菌或其溶菌产物与链球菌菌株的组合物，例如α-链球菌菌株。
可选地，本发明的一些实施例不包括鼠李糖乳杆菌GG(或其溶菌产物)与鼠李糖乳杆菌LC705(或其溶菌产物)的组合物。
可选地，本发明的一些实施例不包括干燥和/或敏感皮肤的美容治疗和皮肤治疗。
可选地，在一些实施例中，涉及所述皮肤屏障的修复或再生的治疗方法不适用于过敏疾病/病况或炎症疾病/病况的治疗。例如，这些实施例可选地不包括一种或多种过敏性皮肤炎、脂溢性皮炎、湿疹、特应性湿疹、鱼鳞癣、牛皮癣、痤疮或过敏性疾病、或炎症病况的治疗。
可选地，本发明的一些实施例不包括所述益生菌或其溶菌产物的抗炎或抗病毒用途。
可选地，本发明的一些实施例不包括呼吸道感染的治疗。
溶菌产物
根据本发明的益生菌可以以活的细菌、灭活的或杀死的细菌，或以它们的溶菌产物给药。本文所用的“溶菌产物”是指已被溶解的所述益生菌的样本。溶菌产物可包含一个或多个用于本文所述方法中的益生菌的可溶性代谢物。溶解作用可通过化学性破坏或物理性破坏而发生，例如通过向细菌添加渗透剂或酶、或通过施加例如通过声波破坏的物理压迫。例如，Gueniche等通过超声制备溶菌产物(20)。
细菌可在溶解前被洗涤。所述溶菌产物可在溶解后过滤和/或灭菌以除去任何剩余的整个细菌。所述溶菌产物可包括无细胞上清液。溶菌产物可以是包括所述益生菌细胞性内容物的混合物。例如，一个或多个细胞壁的片段、或细胞膜、蛋白质、核酸、碳水化合物、和细胞器(断裂的或完整的)。溶菌产物可以是悬浮的，例如在水介质中。
溶解的细胞可允许许多物质从可产生生物活性的细菌细胞膜内部释放，例如可溶性代谢物。因此，在一些情况下，细胞溶菌产物的使用可以优于整个细菌的使用。
在一些实施例中，无细胞上清液是细胞已被除去的细胞培养的上清液。可以通过离心除去细胞，随后过滤上清液。同样地，上清液(作为溶菌产物的形式)可被直接用于本发明的调配中。无细胞上清液可包含一个或多个可溶性代谢物。
组合物
组合物可以单独给药或与其他治疗结合，根据待治疗的病况同时给药或循序给药。
所述益生菌或其溶菌产物可以溶解在、悬浮在、或混合在一种或多种其他药学上可接受的成分中。所述益生菌或其溶菌产物可以存在于脂质体或其他微粒体。
在一些实施例中，益生菌可被提供作为药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的上清液。在一些实施例中，益生菌可被提供作为冻干剂。
在特别优选地实施例中，根据本发明的所述益生菌或其溶菌产物被调配用于局部给药，特别地，用于或应用至、或应用在皮肤。
适用于透皮给药的制剂包括凝胶、糊剂、软膏剂、乳霜、洗液，和油、以及片剂、橡皮膏、绷带、敷料剂、植入剂、粘合剂、黏合剂和锁水剂(reservoirs)。
软膏剂通常由所述益生菌或其溶菌产物和石蜡族或水溶性软膏基质制备。
乳霜通常由所述益生菌或溶菌产物和水包油乳霜基质制备。如果需要，乳霜基质的水相可以包括，例如至少约30％w/w的多元醇，即有两个或两个以上羟基的醇类，如丙二醇、1,3-丁二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇和其混合物。局部配方可能最佳地包括增强通过皮肤或其他受影响位置的吸附或渗透的活性化合物。这些皮肤渗透促进剂的例子包括二甲亚砜和相关的类似物。
乳剂通常由所述益生菌或溶菌产物和油相制备，所述油相可以可选地包括仅仅一种乳化剂(emulsifer)(也称为乳化剂)，或者它可能包含至少一种乳化剂与脂肪或油或脂肪和油的混合物。优选地，亲水性乳化剂同时包括充当稳定剂的亲脂性乳化剂。还优选地，包括油和脂肪。同时，乳化剂与或不与稳定剂一起构成了所谓的乳化蜡，且蜡和油和/或脂肪构成了所谓的乳化膏基质，其形成了乳霜的油性分散相。
适用的乳化剂和乳液稳定剂包括吐温60、司盘80、十八醇十六醇混合物、十四烷基醇、丙三单硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。基于实现所需的美容属性，选择合适的油或脂肪用于调配配方，因为活性化合物在可能用于制药乳液配方的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，所述乳霜应该是优选不油腻的、不着色的并具有适宜的相容性的可清洗的产品，以避免从管或其他容器中泄漏。可以使用直或支链、单-或二烷基酯，如二-异己二酸、月桂酸异鲸蜡硬脂酸、丙二醇椰子脂肪酸二元酸酯、十四烷酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己酯棕榈酸酯、或被认为是鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯(CrodamolCAP)的支链酯的混合物，最后三种为优选酯类。这些可以单独使用或根据所需的属性结合使用。另外，可以使用如白色软石蜡和/或液体石蜡的高熔点脂质或其它矿物油。
其他制剂包括口腔喷雾剂、漱口水、牙膏、含片、抗菌洗涤剂、饮料(如牛奶、酸奶)、食品(如酸奶、冰淇淋、糖果)、或粉状食品(如奶粉)。
配方可以适当地被提供为眼罩、橡皮膏、绷带、敷料、或浸渍有、涂覆有一种或多种根据发明的益生菌或其溶菌产物和可选地一种或多种其他药学上可接受的成分的类似物，包括，例如穿透促进剂、渗透促进剂和吸收促进剂。所述益生菌或溶菌产物可以以涂层形式被提供用于医疗器械，如植入器、假肢、手术器械、手套、导管、阀门、起搏器等。
配方可以包含一个(单位)剂量的益生菌或其溶菌产物。益生菌(完整的或溶解的)的适用剂量可以在104至1012菌落数(cfu)的范围内，例如，104至1010、104至108、106至1012、106至1010、或106至108cfu。在一些实施例中，每天可以给药剂量一次或两次。
在一些实施例中，根据本发明使用的配方可包括重量百分比为至少约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％、约11.0％、约12.0％、约13.0％、约14.0％、约15.0％、约16.0％、约17.0％、约18.0％、约19.0％、约20.0％、约25.0％、约30.0％、约35.0％、约40.0％、约45.0％、约50.0％的益生菌或其溶菌产物。
在一些实施例中，所述配方可包括至少约0.01％至约30％、约0.01％至约20％、约0.01％至约5％、约0.1％至约30％、约0.1％至约20％、约0.1％至约15％、约0.1％至约10％、约0.1％至约5％、约0.2％至约5％、约0.3％至约5％、约0.4％至约5％、约0.5％至约5％、约1％至10约5％中的一种重量百分比的益生菌或其溶菌产物。
抑菌组合物
本发明还提供了清洁产品、洗涤物、清洗、表面涂层形式的抑菌组合物或其他不用于人体或动物体的医学治疗的组合物。
这些试剂可用于除去、杀死、或预防表面细菌的累积、或抑制所述细菌的行为或生长。
根据本发明的抑菌组合物可用于处理生物材料、植入物、和假体(包括支架、瓣膜、眼睛、助听器、胃束带、假牙、人工关节置换等)、手术器械或其他在给药、或治疗、或用于患者或受试者前的医疗设备。抑菌组合物可用于处理易于细菌定殖或暴露于细菌的表面，如扶手、食物准备表面、厨房表面或设备、桌子、水槽、洗手间或其他浴室设施。
抑菌组合物可以包括添加至溶菌产物的试剂，例如清洁剂、稳定剂、阴离子表面活性剂、香水、螯合剂、酸、碱、缓冲液或洗涤剂。这些试剂可以促进或增强试剂的抗菌性能，如杀死或抑制细菌、或预防洁净表面的再定殖。
制备组合物的方法
本发明还涉及制备组合物的方法。所述方法可以包括将益生菌种群溶解并将产生的溶菌产物调配成组合物。所述方法可以包括处理所述溶菌产物的步骤以便除去或灭活溶菌产物中的完整细菌，例如，通过将完整的细菌从溶菌产物中分离出来。所述溶菌产物可以经过过滤步骤或纯化步骤以除去其他成份，例如细菌生长培养基或污染物。
在另一组合物中，完整的细菌被调配为组合物。所述细菌可以在调配成组合物之前或之后被灭活。所述细菌可以经受过滤步骤或纯化步骤以便除去其他成份，例如细菌生长培养基或污染物。
通过这一方法制备的所述组合物由可适用于在治疗中使用，例如，用于治疗细菌感染、或用于修复皮肤屏障。这种方法可涉及添加一种或多种药学上或美容上可接受的赋形剂。
其他组合物可能不适用于在治疗中使用，例如，如洗涤剂的抑菌组合物。用于制备抑菌组合物的方法可涉及将一种或多种试剂添加至溶菌产物或细菌。
实施例1：材料和方法
细菌生长
益生菌在马克3(Mark 3)厌氧工作站(英国惠特利科学，希普利，英国(Don Whitley Scientific,Shipley,UK))中的37℃的威尔金斯-达尔格伦(Wilkins-Chalgren)液体培养基(WCB)(胰蛋白胨)中常规地生长至稳定期。金黄色葡萄球菌在营养液体培养基(胰蛋白胨)中37℃下有氧生长。用分光光度法调整培养密度为含有所需的细菌数量。对于使用角质细胞的实验，将细菌在0.85％NaCl溶液中清洗两次、离心并重组在角质细胞中。在一些实验中使用选择性琼脂。对于金黄色葡萄球菌或乳酸杆分别是甘露醇盐琼脂-MSA(胰蛋白胨)或曼-热格萨-夏普(Man-Rogosa-Sharpe)琼脂(MRS)。对于使用加热杀死的细菌的实验，将罗伊氏乳杆菌离心并重悬于0.4％葡萄糖中，并通过置于85℃热水浴中45分钟加热灭活。样本被革兰氏染色以确保没有发生细菌细胞溶解，并接种在生长培养基上以确保他们被杀死。对于使用益生菌溶菌产物的实验，10mL 108cfu/mL的罗伊氏乳杆菌被离心、清洗，浓缩于1mL角质细胞培养基中并使用珠形搅拌器(FastPrepTMFP120，热电子公司(Thermo Electron Corporation))溶解。样本被过滤灭菌以除去任何残留的完整细菌。大约100μl的这一溶菌产物被用于治疗角质细胞。
哺乳动物细胞培养
将正常人类上皮角质细胞(NHEK)(原代细胞(Promocell)、海德堡、德国)保存在含有补充混合物(牛脑垂体提取物0.004mg/ml、表皮生长因子(重组体人)0.125ng/ml、胰岛素(重组体人)5μg/mL、氢化可的松0.33μg/mL、肾上腺素0.39μg/mL和转铁蛋白，整体(holo)(人类)10μg/mL)和0.06mMCaCl2(Promocell、海德堡、德国)的角质细胞基础培养基(Promocell、海德堡、德国)中。培养基每周更新两次，且细胞在37℃的5％CO2的湿润条件下培养。细胞一旦生长融汇(confluency)至80％就被分离并再接种大约5×103细胞/cm2。对于使用不同分化细胞的实验，将培养基中的氯化钙增加至1.8mM，且在实验前，细胞在这一培养基中生长24小时。
细菌竞争分析试验
等份的(100μl)的罗伊氏乳杆菌和金黄色葡萄球菌的过夜培养物被接种到新的10mL液体培养基(作为纯培养和共培养)中。在0和48小时处测量pH和培养物的光学密度。每隔一段时间(3、6、24、30和48小时)，细菌通过使用选择性和非选择性琼脂的连续稀释平板计数法计数。在48小时，根据制造说明书(英杰公司(Invitrogen))计数百克力克(BacLiteTM)活的/死亡菌株。
罗伊氏乳杆菌的抑制性物质的生成
使用孔扩散试验确定通过罗伊氏乳杆菌抑制的金黄色葡萄球菌生长，如霍尔德(Holder)和博伊斯(Boyce)所述(23)。对于抑制研究，罗伊氏乳杆菌在37℃的曼-热格萨-夏普(Man-Rogosa-Sharpe)琼脂(MRS)培养基(胰蛋白胨)或Wilkins-Chalgren液体培养基(WCB)(胰蛋白胨)中生长至稳定期。使用在WCB(1g/L葡萄糖)或MRS(20g/L葡萄糖)中生长的罗伊氏乳杆菌的整个细胞(WC)培养物。在其他实验中，细胞在微型离心机中以15,000×g离心沉淀5分钟，并提取供使用的无细胞上清液(CFS)。随后将平板在37℃培养48小时并计算抑制区。为了测量罗伊氏乳杆菌的有机酸的生成，测量WC和CFS的pH。在一确定罗伊氏乳杆菌是否生成任何其他抑制性物质的单独实验中，在采用孔扩散试验之前，使用1M NaOH中和无细胞上清液。为了确定罗伊氏乳杆菌是否在细胞培养中生成有机酸，测量感染的细胞培养的pH。
角质细胞存活率的测量
NHEK细胞在24孔组织培养平板中生长至融汇。细胞培养基被替换为含有细菌指示浓度的培养基。对于预接触和接触后实验，NHEK在添加金黄色葡萄球菌之前/之后1和4小时之间的期间内用罗伊氏乳杆菌处理。在所有的实验中，细胞在37℃的5％CO2的湿润条件中培养24小时。培养基随后被除去且用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞。使用胰蛋白酶(0.4％)/EDTA(0.3％)(Promocell)分离细胞，并用台盼蓝排除试验确定细胞存活率(45)。
金黄色葡萄球菌存活率的测量
为了确定罗伊氏乳杆菌或NHEK是否能够抑制金黄色葡萄球菌在细胞培养中的生长，细胞在24孔平板中生长至融汇。用金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌共同感染这些细胞。并行的，没有任何细胞的孔也被加入这些组合以确定角质细胞本身对葡萄球菌存活率的影响。24小时接触之后，培养基被除去并离心分离将细胞外细菌细碎成颗粒(pellet)。所述细胞随后被转染(trypsinise)并在PBS中加入500μl的0.25％吐温-X-100(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))大约30分钟以溶解细胞。孔内容物随后与细胞颗粒结合，并使用甘露醇盐琼脂(MSA)执行连续稀释平板计数以确定葡萄球菌的存活总数。
罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌和金黄色葡萄球菌的粘附试验
融汇分化的NHEK接触益生菌或金黄色葡萄球菌1小时。在培养后，细胞在PBS中清洗3次以除去不粘附的细菌。细胞被转染并执行连续稀释平板计数以分析粘附细菌的数量。选择性琼脂被用于葡萄球菌的生长。在单独实验中，细胞在添加金黄色葡萄球菌前(排斥)、同时(竞争)或金黄色葡萄球菌感染已开始后30分钟(转移)接触罗伊氏乳杆菌1小时以确定罗伊氏乳杆菌是否能抑制金黄色葡萄球菌粘附于角质细胞。为了确定罗伊氏乳杆菌是否能抑制葡萄球菌入侵角质细胞，将细胞暴露于金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌1小时。细胞在无菌PBS中清洗3次以除去不粘附的细菌，且将生长培养基替换为含有100μg/mL庆大霉素(Sigma-Aldrich)的培养基2小时。细胞随后用无菌PBS清洗3次、转染、并在0.25％吐温-X-100溶解30分钟以释放里面的细菌。使用连续稀释计数法计数溶菌产物中的细菌。在使用条件培养基(CM)的实验中，NHEK被暴露于罗伊氏乳杆菌并在37℃的5％CO2中培养1小时。除去暴露于细胞的CM，并以15000×g离心3分钟以将细菌细胞细碎成颗粒并通过0.22μm孔径滤膜(密理博(Millipore)，美国)过滤。在研究金黄色葡萄球菌粘附中α5β1整合蛋白的作用的实验中，NHEK在细胞感染之前预暴露至60μg/mL的抗-α5β1整合蛋白抗体(密理博，美国)1小时。用于评估粘附的细菌数的另一方法被用于死亡的罗伊氏乳杆菌准备物。细胞生长在LabTek腔室的侧壁(赛默飞科技(Thermo-Scientific))。使用校正的细菌数如常进行粘附试验。细胞暴露于细菌后，细胞在PBS中清洗2次并在进行革兰氏染色前固定在甲醇中20分钟。随后使用日本基恩士(Keyence)多合一型荧光显微镜评估每100个细胞的粘附细菌数。
统计分析
所有实验进行至少三次，每次重复三组。对于比较两种治疗方法的实验，使用样本(student)t检验。对于比较两种或多种治疗的实验，使用通过实验阻断(blocking)的单因素方差分析和事后图基(Tukey)检验。剂量响应和竞争分析试验分别用线性回归和双因素方差分析进行分析。如果P<0.05则结果被认为是显著的。
实施例2
金黄色葡萄球菌诱导原发性人体角质细胞的细胞死亡
我们最初通过在不同剂量下将NHEK与金黄色葡萄球菌一起培养进行台盼蓝排除试验证明金黄色葡萄球菌对角质细胞存活率的影响。金黄色葡萄球菌的浓度为105cfu/mL，在24小时感染后只有49.4％的角质细胞是存活的(图1)。在剂量依赖方式中角质细胞的存活数是减少的，这样金黄色葡萄球菌的浓度在108cfu/mL时，只有3.3％的角质细胞是存活的(图1)。
大约106个微生物是可能例如在皮肤伤口感染中被发现的生理有关浓度(7)。在这一浓度，在感染24小时后，有30.5％的角质细胞是存活的。这一浓度用于粘附试验。
罗伊氏乳杆菌保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌诱导的细胞死亡
研究了3株乳酸杆菌(罗伊氏乳杆菌ATCC 55730、鼠李糖乳杆菌AC413和唾液乳杆菌UCC118)保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌影响的能力(图2a)。用金黄色葡萄球菌感染的NHEK的存活率减少至8.8％。与金黄色葡萄球菌相比，与乳酸杆菌培养的NHEK不会导致细胞存活率的显著减少(图2a)。用金黄色葡萄球菌和鼠李糖乳杆菌或金黄色葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌共感染的导致在24小时角质细胞的存活率分别增加42.7％和53.1％(P＝0.0012，P<0.0001)。无论细胞在钙中是分化24小时还是未分化，这一保护水平都被观察到(结果未示出)。然而，与金黄色葡萄球菌和唾液乳杆菌共感染的角质细胞相比用金黄色葡萄球菌感染的NHEK并没有导致存活率的显著提高(P＝0.052，图2a)。由于罗伊氏乳杆菌比其他两种菌株更具有保护性，我们通过提问罗伊氏乳杆菌的保护作用是否与剂量有关来进一步研究了罗伊氏乳杆菌的作用。然而，使用105、106、107或108cfu/mL的罗伊氏乳杆菌，角质细胞存活率并没有进一步显著增加(P>0.05)(图2c)。我们还研究了益生菌的保护作用是否依赖于活的细菌。尽管加热杀死的罗伊氏乳杆菌不保护NHEK免受金黄色葡萄球菌，但罗伊氏乳杆菌溶菌产物提供了显著的保护作用(P＝0.01)(分别为图2d和e)。进一实验使用108cfu/mL的活的罗伊氏乳杆菌(1000MOI)。
罗伊氏乳杆菌的保护效果与时间依赖性
我们接着研究了相对于金黄色葡萄球菌感染的罗伊氏乳杆菌应用的时间关系是否对益生菌的保护作用至关重要。我们评估了在用金黄色葡萄球菌感染24小时之前预暴露或后暴露至罗伊氏乳杆菌1、2或4小时的角质细胞的存活率。预暴露的角质细胞具有与共感染的细胞相似的存活率(P>0.05)(图3)。然而，在金黄色葡萄球菌感染已开始后1、2或4小时，暴露于罗伊氏乳杆菌的角质细胞与暴露于金黄色葡萄球菌的细胞具有相似的存活率(P>0.05)(图3b)。
罗伊氏乳杆菌不能抑制金黄色葡萄球菌的生长
我们认为金黄色葡萄球菌保护性作用下的机制可能是由于益生菌对病原体的直接作用。然而，相对于纯培养，在共培养48小时期间，竞争分析试验示出罗伊氏乳杆菌或金黄色葡萄球菌存活率没有显著减小(P>0.05)(图4a)。此外，角质细胞培养试验中，活的葡萄球菌总数也不受益生菌存在的影响(图4b；表1)。共培养48小时的存活-死亡计数也证明了细菌细胞存活率中没有显著减小(数据未示出)。此外，尽管我们证实了罗伊氏乳杆菌能够生成抑制病原体在琼脂平板上生长的有机酸(数据未示出)，但当我们测量用金黄色葡萄球菌感染、罗伊氏乳杆菌感染和二者共同感染24小时的角质细胞培养基的pH时，在治疗之间的pH中没有显著差异。
罗伊氏乳杆菌抑制金黄色葡萄球菌对角质细胞的粘附和侵害
已知益生菌保护肠道上皮的机制之一是通过抑制病原体粘附于上皮细胞。因此，我们探索了罗伊氏乳杆菌能否抑制金黄色葡萄球菌对NHEK的粘附。
图5a中的图表表明罗伊氏乳杆菌和金黄色葡萄球菌均粘附至NHEK。接着我们通过将在病原体之前或与病原体同时加入益生菌来确定罗伊氏乳杆菌能否排斥或与金黄色葡萄球菌竞争结合位点。图5b和5c中的图表表明当罗伊氏乳杆菌在添加病原体之前或同时被添加时，金黄色葡萄球菌对NHEK的粘附减小(分别P＝0.026，P＝0.0078)。然而，如果罗伊氏乳杆菌在金黄色葡萄球菌之后被添加，所述益生菌不能预防病原体粘附(P>0.05，图5d)。
此外，庆大霉素保护试验证明了益生菌抑制金黄色葡萄球菌对NHEK的侵害(P＝0.009，图5e)。我们的结果示出，加热杀死的罗伊氏乳杆菌不能显著抑制葡萄球菌的粘附(P>0.05，图6)。然而，益生菌溶菌产物能够抑制葡萄球菌的粘附(P＝0.032)，尽管与存活的罗伊氏乳杆菌(P＝0.0002)的程度不同。相对于当NHEK暴露于溶菌产物时6.0±0.2log cfu葡萄球菌的粘附，当NHEK暴露于存活的罗伊氏乳杆菌时，具有大约5.6±0.2log cfu葡萄球菌的粘附(图6b)。
唾液乳杆菌UCC118不能预防金黄色葡萄球菌粘附于角质细胞
我们认为罗伊氏乳杆菌的保护作用可能与其抑制病原体粘附至NHEK的能力有关。为了进一步探索这一原因，我们询问了抑制金黄色葡萄球菌结合至NHEK是否导致其毒性的降低。
已知金黄色葡萄球菌通过与胞外纤连蛋白相互作用的纤连蛋白结合蛋白的方式粘附至细胞(26，36)。纤连蛋白本身结合至角质细胞受体，α5β1整合蛋白。如前述研究所示出(27)，用α5β1整合蛋白的封闭抗体预处理细胞导致金黄色葡萄球菌粘附减少。因此，我们用α5β1封闭抗体处理NHEK并研究其对于抑制NHEK的粘附和毒性的能力(图7a和b)。封闭抗体显著抑制金黄色葡萄球菌至NHEK的粘附(P＝0.007)，同时封闭抗体似乎也抑制金黄色葡萄球菌诱导NHEK细胞死亡(P＝0.03)。接着，我们研究了唾液乳杆菌的能力，唾液乳杆菌不能保护NHEK以抑制葡萄球菌粘附(图2a)。暴露于唾液乳杆菌和金黄色葡萄球菌的角质细胞被发现与仅暴露于金黄色葡萄球菌的角质细胞(4.9±0.2log cfu)具有类似的粘附的葡萄球菌数(4.5±0.2log cfu)(P>0.05，图8a)。此外，唾液乳杆菌不能同罗伊氏乳杆菌(6.7±0.1log cfu)一样有效地粘附至NHEK(5.6±0.1log cfu)(P＝0.005,图8b)。
讨论
在这一研究中，我们对于表征局部使用的益生菌的效用已经制定了初步步骤。我们在肠道和口腔中已经研究了具有已知益生菌潜力的3株乳酸杆菌保护角质细胞免受常见皮肤病原体作用的能力，如金黄色葡萄球菌(9，38，44)。
金黄色葡萄球菌在24小时内杀死69.5％的NHEK的生理相关浓度的应用。相比之下，在同样的条件下，没有一株乳酸杆菌显著影响NHEK的存活率，表明益生菌对角质细胞耐受良好。当NHEK暴露于病原体和罗伊氏乳杆菌时，益生菌保护细胞免受病原体的影响，正如存在罗伊氏乳杆菌对比缺乏罗伊氏乳杆菌时，金黄色葡萄球菌感染的NHEK的显著较高比例的存活率所表明的(图2a和b)。罗伊氏乳杆菌的溶菌产物也观察到所述保护作用，但加热-杀死的罗伊氏乳杆菌并没有观察到(图2d和e)。此外，益生菌的保护作用在不同菌种之间是不同的，因为由罗伊氏乳杆菌提供的保护作用要大于由鼠李糖乳杆菌提供的保护作用。相比之下，唾液乳杆菌没有提供给角质细胞任何明显的免受金黄色葡萄球菌的保护作用(图2a)。
然而，据我们所知，这是示出益生菌在体外保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌的病原体影响的第一个证据，酵母乳杆菌已被证实能抑制外科植入物和大鼠中脓肿形成的金黄色葡萄球菌感染(18)。益生菌曾被示出在其他上皮中对病原体诱发的细胞死亡发挥保护作用。例如，鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和口乳杆菌都被示出抑制链球菌诱导的咽上皮细胞的细胞死亡(34)。无益生菌细胞的上清液也被示出具有保护性。德氏乳杆菌(L delbruekii)上清液保护肠上皮细胞免受梭状芽孢杆菌致病性(5)。
罗伊氏乳杆菌抵制金黄色葡萄球菌诱导的角质细胞的细胞死亡的保护作用能够由若干不同的机制造成。乳酸杆菌已知生成对病原体可具有直接抗菌作用的有机酸和细菌素。尽管我们在扩散试验中能够证明罗伊氏乳杆菌能够生成酸，但这似乎不是形成观察到的保护作用的原因，因为在乳酸杆菌的存在下角质细胞培养基的pH没有改变。类似地，由于在竞争试验中我们没有检测到任何其他抗微生物活性，在罗伊氏乳杆菌的存在下的金黄色葡萄球菌的生长速率和产率等同于纯培养的金黄色葡萄球菌的生长速率和产率(图4)。
罗伊氏乳杆菌保护角质细胞的至少部分机制似乎与罗伊氏乳杆菌防止金黄色葡萄球菌粘附的能力有关。若干条证据指出了这一点：首先，当使用整合蛋白封闭抗体抑制金黄色葡萄球菌的粘附时，其对细胞是低毒性的(图8a和b)。其次，抑制粘附的罗伊氏乳杆菌的溶菌产物也是保护性的(Fig.2e和6b)。另一方面，加热杀死的罗伊氏乳杆菌不保护角质细胞(图2d)。再次，不抑制金黄色葡萄球菌粘附的乳酸杆菌菌株(唾液乳酸杆菌)(图8a)不保护角质细胞(图2a)。
罗伊氏乳杆菌加入至细胞的时间似乎对于它的保护性作用是至关重要的。当罗伊氏乳杆菌在金黄色葡萄球菌之前或与金黄色葡萄球菌同时被加入时，NHEK被保护免受病原体的影响(分别为图3a和2a)。然而，如果益生菌在病原体之后被加入，角质细胞的细胞死亡水平与未用益生菌处理的培养基中见到的水平类似(图3b)。综上所述，我们的数据指出，罗伊氏乳杆菌的保护机制包括在角质细胞结合位点竞争性排斥金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌诱导角质细胞的细胞死亡是一个复杂的过程。一般来说，金黄色葡萄球菌致病的第一步被认为是金黄色葡萄球菌在入侵前对角质细胞的粘附(27)。金黄色葡萄球菌利用许多粘附素(adhesins)进行这一粘附，统称为识别粘附性基质分子的微生物表面成分(MSCRAMMS)(11)。已知涉及粘附至角质细胞的葡萄球菌粘附素包括纤连蛋白结合蛋白(FnBPs)(27，36)、蛋白A、凝集因子和凝固酶(35)。磷壁酸介导金黄色葡萄球菌至鼻上皮细胞的结合，尽管这对角质细胞是否属实还是未知的(1)。然而，整合蛋白封闭没有完全抑制金黄色葡萄球菌至NHEK的结合，表明多个粘附素被使用(图8a)。
我们的研究和其他研究(27)已经示出，角质细胞上的封闭纤连蛋白受体抑制金黄色葡萄球菌的粘附(图8a)。有趣的是，在单独的实验中(数据未示出)，我们不能示出这一整合蛋白参与罗伊氏乳杆菌至NHEK的结合。事实上，角质细胞的蛋白酶和糖苷酶治疗不能够预防罗伊氏乳杆菌结合至细胞(数据未示出)。然而，无论益生菌结合至细胞的机制是怎样的，它都涉及一种热不稳定分子，如加热杀死的罗伊氏乳杆菌不能有效地粘附至角质细胞(数据未示出)，也不能保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌(图2d)。
目前为止，还没有公开关于益生菌粘附至表皮角质细胞的能力的报道。益生菌粘附至表皮其他地方已表明通过胶原结合蛋白(21)、粘液结合蛋白(37)、脂磷壁酸(19)和s-层蛋白(10、14)发生。相关的粘附素可以是酸化蛋白(proteinacious)、碳水化合物或两者的混合物，及可以使用多个粘附素。当细胞预暴露于益生菌(结合位点的排斥)(图5b)及与金黄色葡萄球菌共感染时(结合位点的竞争)(图5c)，罗伊氏乳杆菌能够抑制葡萄球菌粘附至角质细胞，而不是当在金黄色葡萄球菌的感染已开始后应用(从结合位点转移)(图5d)。其他研究已经示出，竞争性抑制/排斥通常取决于菌株，而转移一般不会同样有效或者可能需要更长时间才能发生(32,49)。我们的研究结果表明罗伊氏乳杆菌不会从角质细胞取代现有的金黄色葡萄球菌，并支持这一发现，即如果在感染已开始后加入罗伊氏乳杆菌，则不能保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌的细胞毒性。一些证据已显现表明益生菌对于每一种其他的粘附可具有协同效应，表明对益生菌联合作用的研究在未来可能是有益的(39)。
看起来罗伊氏乳杆菌可能是采用多重机制以粘附至宿主上皮细胞并可能使用若干策略以阻止金黄色葡萄球菌的粘附。可能的是，罗伊氏乳杆菌可能影响角质细胞表面上的粘附结构的表达、还有待探索的区域。先前的工作表明，益生菌鼠李糖乳杆菌GG和植物乳杆菌299v可诱导肠粘蛋白表达中涉及的基因的上调，从而抑制致肠病的大肠杆菌的粘附(33)。在1999年的研究中，乳酸细菌嗜热乳链球菌对于角质细胞的体外应用和对于皮肤的体内应用导致神经酰胺生成的增加(15)。2006年的另一项研究，在NHEK上使用益生菌发酵乳清产品并发现分化的标记物角蛋白-10和外皮蛋白的mRNA表达的增加(2)，表明“后益生菌(postbiotics)”或益生菌的代谢物也可用于皮肤疾病。另一益生菌的代谢产物的积极作用的例子在最近的论文中得到证明，其中，研制了用于皮肤的益生菌片段(patch)。将冻干的酵母乳杆菌悬浮于具有葡萄糖和亚硝酸盐的藻酸盐中能够产生一氧化氮气体，一种能抑制病原菌生长的物质(24)。
我们提供了益生菌在体外具有保护角质细胞存活率抵抗金黄色葡萄球菌致病效应的作用的证据。这些结果表明，用于皮肤的局部益生菌能够排斥致病菌，并因此预防感染，且与他人的研究一致。植物乳杆菌至灼伤小鼠的局部给药已经示出抑制了灼伤的铜绿假单胞菌定殖，促进愈合并改善炎症反应(46)。这一微生物也被对比并发现与传统磺胺嘧啶银盐治疗灼伤一样有效用于限制体内伤口的细菌负荷和愈合(41)。此外，益生菌也可用于增加滋润和皮肤屏障的健康皮肤的治疗中。2010年，双歧杆菌溶菌产物局部应用至志愿者的皮肤并发现通过减小跨上皮的水分丢失测量增加皮肤的屏障功能(20)。然而需要进一步的研究以确定益生菌在皮肤上具有的全面影响，我们的研究结果表明，罗伊氏乳杆菌可以通过对结合位点的排斥和竞争保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌的致病效应。我们建议，护肤脂和肥皂中的益生菌或其溶菌产物的预防性使用可有助于对抗葡萄球菌皮肤的定殖和继发感染。
实施例3
如上所述，我们证明了罗伊氏乳杆菌能够部分地保护原发性人类角质细胞免受如金黄色葡萄球菌的皮肤病原体的影响。在这项研究中，我们为了进一步了解益生菌的潜力，我们已经评估了在抑制角质细胞的金黄色葡萄球菌感染的作用中的第二种益生菌，鼠李糖乳杆菌GG以及乳酸杆菌和细菌溶菌产物的组合物。鼠李糖乳杆菌GG从人类粪便中分离出来(见美国专利4839281和美国专利5032399)，并以编号ATCC53103被保藏。
罗伊氏乳杆菌保护角质细胞免受金黄色葡萄球菌诱发的细胞死亡
在存在或不存在鼠李糖乳杆菌GG，罗伊氏乳杆菌单独或联合使用(所有都在108/mL)时，正常人类原发性角质细胞(KC)都暴露于金黄色葡萄球菌(106/mL)。使用台盼蓝排除试验在24小时后测量KC的存活率。
当只用金黄色葡萄球菌处理KC时，感染后24小时只有39％的KC仍是活的(p<0.001)。然而，在存在罗伊氏乳杆菌或鼠李糖乳杆菌GG时，病原体感染的KC的存活率分别增加至60％和59％(分别为p＝0.008和0.009)。此外，当我们对金黄色葡萄球菌感染的细胞联合使用两株菌株时,KC的存活率增加至75％(p＝0.0025)。
有趣的是，鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物也对KC提供了显著保护，其中，在益生菌溶菌产物的存在下，在与金黄色葡萄球菌培养24小时后有70％的细胞是存活的。
鼠李糖乳杆菌抑制金黄色葡萄球菌的生长
在鼠李糖乳杆菌GG或鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物存在下，金黄色葡萄球菌生长。如图12所示，在活的鼠李糖乳杆菌GG或鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物存在下，金黄色葡萄球菌的生长要慢于只有金黄色葡萄球菌时。
这种抑制作用在鼠李糖AC413中没有观察到。如图11所示，在孔扩散试验中金黄色葡萄球菌的生长没有被抑制，因为在24小时之后在孔周围没有可见的抑制区。
鼠李糖乳杆菌杀死金黄色葡萄球菌
为了进一步阐明鼠李糖乳杆菌GG对金黄色葡萄球菌的影响，我们研究了鼠李糖乳杆菌或其溶菌产物对金黄色葡萄球菌存活率的影响。如图13所示，相对于不存在鼠李糖乳杆菌GG(LGG)时，在存在活的鼠李糖乳杆菌GG时，测量了大量的死亡的金黄色葡萄球菌细胞。当金黄色葡萄球菌被培养在存在有LGG溶菌产物时，死亡细胞的数量急剧增加。
因此，我们已经识别了具有皮肤细胞保护和再生性能的益生菌。明显地，这一菌株的溶菌产物提升了皮肤角质细胞抵抗金黄色葡萄球菌(SA)诱导的有害毒性的能力(图9a)。当与第二株溶菌产物联合使用时，该联合对保护抵抗SA比当任一菌株单独使用时更有效(图9b)。
鼠李糖乳杆菌GG和罗伊氏乳杆菌加速受损的角质细胞单层的恢复并增加角质细胞迁移
增加和修复角质细胞屏障功能的试剂具有不仅作为治疗用试剂而且作为美容皮肤提升试剂的重大潜力。屏障功能的增加会提升皮肤水化水平及熟知为改善皮肤的外观并产生更健康的美容外观。
我们还证明了当角质细胞单层被损伤以除去细胞(即伤口模型)时，我们适当的益生菌溶菌产物的存在显著地且惊人地加速单层的恢复和屏障的重建(图10)。如图14所示，鼠李糖乳杆菌GG或罗伊乳杆菌溶菌产物增加角质细胞单层的上皮再生速率。当植入乳杆菌、酵母乳杆菌、表皮葡萄球菌、或长双歧杆菌提取物的溶菌产物被应用至受伤的角质细胞单层时，这一作用没有被观察到。
LGG和罗伊氏乳杆菌溶菌产物也能够增加角质细胞迁移的速度。如图15所示，相对于对照组，只有LGG和罗伊氏乳杆菌提取物能增加角质细胞迁移速率。角质细胞迁移是单层上皮再生的重要机制。
这些数据证明无论是单独还是联合使用益生菌乳酸杆菌的不同菌株均能够保护人角质细胞免受如金黄色葡萄球菌的皮肤病原体的影响。我们的数据表明，益生菌可潜在地具有例如在局部配方中保护皮肤免受外来病原体的应用。
实施例4
材料和方法
益生菌溶菌产物的制备
所有的益生菌菌株(长双歧杆菌ATCC-51870、植物乳杆菌ATCC-10241、发酵乳杆菌ATCC-14932、鼠李糖乳杆菌戈德温(Goldwin)及戈尔巴奇(Gorbach)ATCC-53103、酵母菌ATCC-14932)均购自艾吉析(LGC)有限公司(英国)，并按照惯例的在马克3厌氧工作站(惠特利科学，英国)中在37℃的Wilkins-Chalgren液体培养基或Wilkins-Chalgran琼脂中生长至稳定期。采用分光光度法将培养物调整至含有108cfu/ml。10mL的这些培养物经过离心分离、洗涤并随后浓缩在1mL的角质细胞基础培养基(Procell，海德堡，德国)中。所述样品随后使用珠被细胞溶解搅拌器(FastPrep FP120，热电子公司，英国)被溶解，然后过滤灭菌以除去任何残留的完整细菌。100μl的这一溶菌产物被用于处理角质细胞培养基。
原发性角质化细胞培养和TEER的测量
如普林斯(Prince)等人所述获得并培养NHEK(50)。对于测量TJ功能的实验，细胞被接种于12孔、插入有0.4微米孔隙的透水聚碳酸酯ThincertTM细胞培养基(葛来纳(Greiner Bio-one)有限公司，英国)中。NHEK在角质细胞基础培养基(Promocell，海德堡，德国)中生长直至融汇。此时，培养基被替换为诱导TJ形成的CNT-02-3DP5高钙培养基(CELLnTEC先进细胞技术系统，瑞士)。使用配有探针电极(chopstick electrode)的上皮电压表(世界精密仪器有限公司，英国)测量TJ功能。所有实验重复至少三次，每个实验重复三组。在一些实施例中，益生菌的溶菌产物被加入至插入的顶端一侧并在指示后处理的时刻测量所述TEER。
使用噻唑蓝(MTT)比色法测量NHEK的存活率
3-{4,5-二甲基噻唑-2-基}二苯基四唑溴(MTT，购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)有限公司，普尔(Poole)，英国)，被准备为磷酸缓冲盐中的5mg/ml原液。NHEK在96孔孔板中生长至融汇，并随后用细菌溶菌产物处理24小时。培养基随后替换为含有10％MTT的新鲜培养基。该孔板在37℃培养4小时，然后所述培养基被替换为二甲亚砜。每个孔的吸光度随后在孔板阅读仪的570nm下读数。
从NHEK中的蛋白提取及免疫印迹
根据麦克劳林(Mclaughlin)等人所描述的方法从NHEK细胞中提取蛋白(51)。简要地，取自单一ThincertTM细胞被刮到100μl提取缓冲液(NaCl(120mM))、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、pH7.5(25mM)、曲拉通X-100(Triton X-100)(1％)、乙二胺四乙酸(EDTA)(2mM)、NaF(25mM)、NaVO4(1mM)、十二烷基磺酸钠(SDS)(0.2％)、抑肽酶(10μg/ml)、亮抑肽酶(10μg/mL)和抑肽素A(10μg/mL)中，并随后在冰上培养30分钟。接着微量离心，上清液被回收至新管并用于TJ蛋白表达的分析。根据莱姆莉(Laemmli)等人的方法进行了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(52)并将蛋白电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。这些蛋白随后被洗涤、封闭在5％(w/v)脱脂牛奶中并与初级抗体培养过夜。这些初级抗体是兔子抗紧密连接蛋白1，4(anti-claudin 1，4)、老鼠抗闭合蛋白、老鼠抗ZO-1或老鼠抗β-肌动蛋白(所有的均购自英杰公司)。膜随后被清洗并与辣根过氧化物酶共轭次级抗体培养。使用Mclaughlin等人，2004所述的增强化学荧光法(Amersham、雄鹿、英国)和密度测定法进行免疫印迹(51)。
TLR-2的抑制
对于TLR-2的抑制，在用益生菌溶菌产物刺激前1小时用10Mg/ml重组人体抗-TLR2抗体(德硕(Abeam)，英国)预处理角质细胞。
统计分析
所有实验进行至少三次并使用SPSS软件版本20分析。对于比较两组治疗的实验，使用独立样本t检验统计分析所有数据。对于比较两组或多组治疗的实验，使用单因素方差分析检验统计分析所有数据。当p<0.05，结果被认为具有统计学意义。每一实验至少n＝3的数据都表示为平均值±平均标准偏差(SEM)。
结果
溶菌产物对NHEK具有良好的耐受性
首先，我们研究了是否调查研究的任意益生菌溶菌产物均影响NHEK的存活率。为此，我们对已与菌性溶菌产物培养24小时的NHEK进行了MTT比色法分析。图16中的数据说明，除了鼠李糖酵母菌的溶菌产物，没有一株检测的溶菌产物显著影响NHEK的存活率。鼠李糖酵母菌溶菌产物在24小时培养后诱导NHEK存活率降低为32％(±1.3％，p＝<0.01，n＝3)。
益生菌增加NHEK中的TJ功能
当正常人类表皮角质细胞从含有低浓度钙(～0.2nM)的培养基转移至含有高钙(～1.8mM)的培养基时产生TJ。这种“钙转换”诱导TJ的聚集(assembly)，所述TJ可作为随时间变化在细胞的TEER中的上升被检测到。TEER在钙转换后48小时达到峰值并随后在72小时后略微下降达到稳定状态(图17a)。当100μl的108cfu/mL益生菌的溶菌产物被加到ThincertTM的顶端腔室时，我们观察到形成在未处理的NHEK与处理的NHEK之间的TEER的显著差异。这些差异是菌株依赖性的。与观察结果-酵母乳酸杆菌的溶菌产物降低细胞存活率是一致的，我们观察到，相对于未处理的细胞，用这一溶菌产物处理的NHEK中的TEER显著减小(图17b，p<0.005)。相比之下，罗伊氏乳杆菌的溶菌产物在钙转换后24小时TEER首先增加，但这随后下降回落至与对照组、未处理细胞的TEER无显著差异的水平(图17c)。植物乳酸杆菌产生的TEER的增加也超过对照细胞的TEER。这一增加在钙转换后48小时被保持。然而，在72小时，TEER与未处理的NHEK的TEER无显著差异(图17d)。TEER的最大增加在用长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌GG溶菌产物处理的NHEK中被观察到。来自这些菌株的溶菌产物产生的TEER的增加高于对照细胞中的约～300ohms./cm2(图17e和f，p<0.05)。此外，这些增加被保持且处理的细胞中的TEER在钙转换后72小时，在处理的NHEK中的TEER仍旧显著大于未处理的NHEK中的。由于这些原因，长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物被采用用于进一步研究。
长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌GG在角质细胞中对TEER产生剂量依赖效应
为了进一步限定双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌GG在角质细胞中对紧密连接功能的作用，我们在存在100μl由106、104和102cfu/mL的细菌制成的溶菌产物时测量跨上皮电阻。在106CFU/mL时，两株菌株的溶菌产物都仍旧能产生显著高于未处理细胞的跨上皮电阻(图18a和b，p<0.005)。此外，由104CFU/mL产生的鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物也能够引起并增加TEER(图18b)。然而，低浓度的任意菌株导致溶菌产物不能产生显著不同于对照组细胞的TEER(图18a和b)。
益生菌溶菌产物调节特定TJ蛋白的表达
证据表明，TJ功能通常反映为复合物中涉及的特定蛋白的表达水平。通过包括紧密连接蛋白1、紧密连接蛋白4、ZO-1和闭合蛋白的角质细胞表达主要的TJ蛋白。因此，我们使用免疫印迹法研究这些蛋白在未处理的NHEK对比用益生菌溶菌产物处理72小时的NHEK中的表达。
用长双歧杆菌的溶菌产物处理的NHEK在所有四种TJ蛋白中的生成显著增加(图19a和b)。然而，鼠李糖乳杆菌GG仅诱导在紧密连接蛋白1、闭合蛋白和ZO-1的蛋白水平中的增加(图19a和b)。对比于对照组细胞，用鼠李糖乳杆菌GG处理的NHEK中的紧密连接蛋白4的水平没有显著改变。然而，在一般情况下，由鼠李糖乳杆菌GG引发的蛋白表达高于由长双歧杆菌诱导的蛋白表达(图19b)。
长双歧杆菌诱导的紧密连接功能的调节通过TLR2被介导
角质细胞通过如Toll样受体(TLR)的模式识别受体感应细菌的存在。肠道中若干证据指出了TLR激活和TJ屏障功能中的变换之间的关联。此外，Yuki等最近的研究(53)证明了角质细胞中TLR-调解的TJ功能的增大响应于如肽聚糖的细菌配体。因此，我们自然想知道益生菌诱导的TJ功能的增加是否由TLR调解。特别感兴趣的是TLR2，因为这是革兰氏阳性微生物的主要受体(54)。
为了研究这一点，我们在加入益生菌溶菌产物之前1小时在TLR2中和抗体存在下培养NHEK。图20a中的数据表明，TLR2的中和废除了由肽聚糖(良好特性的TLR2受体激动剂)和长双歧杆菌引发的TEER的上升。然而，鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物还能够诱导TJ功能的增加(图20a)。同样地，由长双歧杆菌而不是鼠李糖乳杆菌GG诱导的TJ蛋白表达增加通过TLR2的中和被阻止(图20b)。
讨论
测试了五种不同的乳酸杆菌菌株对TJ功能的影响。其中，所有菌株，但不包括这些菌株之一的酵母乳杆菌的溶菌产物能够增加角质细胞的TEER。酵母乳杆菌实际上减小了TEER，这可能与我们的观察-这一菌株也减少了角质细胞的存活率有关。其他4株乳酸杆菌均增强TJ功能，但具有不同的效果。在这一点，鼠李糖乳杆菌GG和长双歧杆菌比植物乳杆菌或罗伊氏乳杆菌生成更大的、和更持续增加的TEER。
这些菌株依赖效应可能是由于单独的乳酸杆菌菌株的不同的蛋白表达和碳水化合物。事实上，由鼠李糖乳杆菌GG和长双歧杆菌诱导的TEER的增加表现出剂量依赖效应，表明涉及特定的分子(多个分子)和可接受的机制(多种机制)。
鼠李糖乳杆菌GG和长双歧杆菌均增加角质细胞中紧密连接TJ蛋白的表达。然而，特定的分子集在每种情况下都是不同的。蛋白表达的调整通过这些溶菌产物增加角质细胞的TJ屏障功能的机制几乎是可以肯定的。尤其是紧密连接蛋白的表达水平中的变化先前已被多次示出与屏障功能的变化有关。
通过长双歧杆菌而不是鼠李糖乳杆菌GG机制增加了TJ接蛋白表达且TEER几乎肯定与通过TLR2的信号输送有关。
这点通过两条证据得到证明：1)TLR2的中和废除了长双歧杆菌诱导的TEER的增加，和2)紧密连接蛋白表达中的增加也通过阻断TLR2被废除。这或许并不令人意外的得知TLR2是革兰氏阳性菌的主要模式识别受体。
先天免疫系统与屏障管理之间的关联仅在最近才在肠道中建立。这里，TLR的激活可以增加或减少上皮紧密连接功能依赖于激活的特定TLR。
鼠李糖乳杆菌GG溶菌产物似乎通过TLR2的独立机制引发其作用，因为这一受体的中和不能废除鼠李糖乳杆菌GG诱导的TJ功能或蛋白表达的增加。TLR2是革兰氏阳性物种的主要受体，并通过多种不同的来自如磷壁酸的这些细菌的配体被激活。鼠李糖乳杆菌GG诱导的TJ功能的增加似乎没有经由TLR2被介导的观察结果可能表明这一乳杆菌拥有通过替代受体传导(signal)的分子。
我们的数据表明特定的乳酸杆菌菌株增强人原发性角质细胞中的TJ功能。该上皮细胞的屏障功能对于陆生生物的生活至关重要，且近期数据已经凸显了在表皮对水的渗透屏障中TJ功能的重要作用。我们的数据表明，由益生菌的溶菌产物诱导的TJ屏障的增大能够在提高整体皮肤屏障功能中发挥作用。
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Claims (22)

1.一种用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌菌株、罗伊氏乳杆菌菌株或长双歧杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述治疗方法涉及皮肤屏障的修复和再生。
3.根据权利要求1或2所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述益生菌用于皮肤在损伤后的修复或再生。
5.根据权利要求1-3任一项所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述方法用于治疗伤口愈合、烧伤、牛皮癣、鱼鳞癣、皮肤炎、粉刺(包括化脓性汗腺炎)、尿布疹、阿瑟顿氏综合征、光化性角质病、真菌性皮肤病、皮肤真菌病或外胚层发育不良。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述治疗方法涉及将所述益生菌或其溶菌产物给药至治疗中的患者皮肤。
7.根据权利要求1所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG，且所述治疗方法涉及感染的治疗或预防。
8.根据权利要求7所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述感染包括细菌感染。
9.根据权利要求7或8所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述细菌感染为葡萄球菌感染，优选为金黄色葡萄球菌感染。
10.根据权利要求7至9任一项所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述感染为皮肤感染。
11.根据前述任一项权利要求所述的供使用的益生菌，其中，所述益生菌与不同菌株的益生菌或它们的溶菌产物共同给药。
12.根据前述任一项权利要求所述的用于治疗方法中的益生菌或其溶菌产物，其中，所述治疗方法涉及鼠李糖乳杆菌菌株或其溶菌产物中的一种、罗伊氏乳杆菌菌株或其溶菌产物中的一种、或长双歧杆菌菌株或其溶菌产物中的一种与至少另一种所述菌株或溶菌产物的共同给药。
13.一种美容方法，所述美容方法包括将鼠李糖乳杆菌益生菌菌株或其溶菌产物、和/或罗伊氏乳杆菌益生菌菌株或其溶菌产物、和/或长双歧杆菌益生菌菌株或其溶菌产物给药至受试者。
14.根据权利要求13所述的美容方法，其中，所述鼠李糖乳杆菌益生菌菌株为鼠李糖乳杆菌GG。
15.根据权利要求13或14所述的美容方法，其中，将所述益生菌或其溶菌产物给药至所述受试者的皮肤。
16.一种美容组合物，所述美容组合物包括鼠李糖乳杆菌益生菌菌株或其溶菌产物、和/或罗伊氏乳杆菌益生菌菌株或其溶菌产物、和/或长双歧杆菌益生菌菌株或其溶菌产物。
17.根据权利要求16所述的美容组合物，其中，所述鼠李糖乳杆菌益生菌菌株为鼠李糖乳杆菌GG。
18.一种药用组合物，所述药用组合物包括鼠李糖乳杆菌GG或其溶菌产物。
19.根据权利要求18所述的药用组合物，进一步包括非鼠李糖乳杆菌菌株的益生菌或其溶菌产物，其中，优选地，所述非鼠李糖乳杆菌菌株的益生菌为罗伊氏乳杆菌菌株。
20.一种鼠李糖乳杆菌GG的溶菌产物。
21.一种组合物，所述组合物被调配用于给药至皮肤，并且所述组合物包括鼠李糖乳杆菌GG和/或鼠李糖乳杆菌菌株和/或罗伊氏乳杆菌菌株、和/或长双歧杆菌菌株，或至少一种或多种所述菌株的溶菌产物。
22.一种抑菌组合物，所述抑菌组合物包括鼠李糖乳杆菌GG或其溶菌产物。
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