CN113365646A - 用于调节真皮和真皮下特性的基于孢子的益生菌组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调节受试者的真皮和真皮下特性的方法。本发明涉及包括向受试者施用基于孢子的益生菌组合物的方法。

Description

用于调节真皮和真皮下特性的基于孢子的益生菌组合物

技术领域

本披露涉及基于孢子的益生菌组合物的领域。提供了基于孢子的益生菌组合物，其包含至少一种对皮下组织、真皮和/或表皮具有生物或治疗活性的活益生菌微生物。还提供了生产基于孢子的益生菌组合物的方法。

背景技术

微生物组是生活在体表或人体内的所有微生物(细菌、真菌、原生动物和病毒)的遗传材料。微生物的数量以10:1的比率超过人细胞。大多数微生物生活在肠道中，特别是大肠。微生物组中所有微生物的基因数量是人基因组的200倍。微生物组可重达2kg。细菌有助于消化食物，调节免疫系统，防止引起疾病的其他细菌，并产生维生素(包括B族维生素B12、硫胺素和核黄素；以及凝血所需的维生素K)。在二十世纪九十年代后期，微生物组得到普遍认可。参见例如，Marilyn Hair和Jon Sharpe,Fast facts about the human microbiome[关于人微生物组的快报],Ctr.for Ecogenetics&Envtl.Health[生态遗传学和环境健康中心],华盛顿大学(2014)，将其通过引用以其整体并入本文。

微生物组是人体发育、免疫和营养所必需的。生活在人体内和体表的细菌不是入侵者，而是有益的定植者(colonizer)。自身免疫性疾病(包括糖尿病、类风湿性关节炎、肌肉萎缩症、多发性硬化和纤维肌痛)与微生物组的功能异常有关。致病微生物随时间累积并改变遗传活动和代谢过程，从而引发针对事实上是健康身体一部分的物质和组织的异常免疫应答。自身免疫性疾病似乎不是由于种系遗传而是通过家族性微生物组的遗传而在家族中发生。参见例如，Hair和Sharpe,2014。

在妊娠期间，人基本上无菌。然而，在出生期间和出生后，包括皮肤、口腔和肠道在内的每处体表均成为多种微生物的宿主：细菌、古细菌、真菌和病毒。在正常情况下，微生物有助于食物消化和免疫系统的维持；人微生物群的功能异常与范围从炎性肠病到抗生素抗性感染的病症有关。参见例如，X.C.Morgan和C.Huttenhower,Chapter 12:humanmicrobiome analysis[第12章：人微生物组分析],8PLoS Computational Biology[PLoS计算生物学]e1002808(2012)，将其通过引用以其整体并入本文。

肠道微生物群对人一生的健康至关重要。肠道微生物组是大量细菌、病毒、真菌和原生动物的集合，它们定植在胃肠道中并且其数量超过人细胞10倍。早年暴露[分娩方式(母体微生物)；婴儿饮食(选择性底物)；抗生素(选择性杀伤)；益生菌(选择性富集)；和物理环境(环境微生物)]导致肠道微生物群的定植，这有助于免疫系统的发展、肠道稳态和宿主代谢。肠道微生物群的破坏与越来越多的疾病有关。参见例如，M.B.Azad等人,Gutmicrobiota of healthy Canadian infants:profiles by mode of delivery andinfant diet at4months[加拿大健康婴儿的肠道微生物群：按分娩方式和4个月时婴儿饮食的概况],185Can.Med.Ass’n J.[加拿大医学协会杂志]385(2013)，将其通过引用以其整体并入本文。宏基因组学的最新进展增强了我们对肠道微生物组的理解，表明它可以为人提供重要的免疫和代谢益处。

有趣的是，肠道微生物群通过调节肠道屏障功能并且通过影响免疫应答的发展来影响宿主的免疫和/或炎性状态。肠道微生物组对人类免疫系统的影响经深远和复杂设计，以实现对饮食和环境抗原的免疫耐受性并提供针对潜在病原体和毒素的保护。已经鉴定了在屏障功能中起重要作用的几种肠道微生物结构。来自乳杆菌LGG的分泌蛋白p40改善细胞因子介导的细胞凋亡和肠道上皮屏障的破坏，并且来自尼氏大肠杆菌(Escherichia coliNissle)的鞭毛蛋白与上皮细胞中β-防御素2的诱导有关。参见例如，F.Yan等人,Colon-specific delivery of a probiotic-derived soluble protein amelioratesintestinal inflammation in mice through an EGFR-dependent mechanism[益生菌衍生的可溶性蛋白的结肠特异性递送通过EGFR依赖性机制改善小鼠中的肠道炎症],121J.Clinical Investigation[临床研究杂志]2242(2011)；M.Schlee等人,Induction ofhuman beta-defensin 2by the probiotic Escherichia coli Nissle 1917is mediatedthrough flagellin[益生菌尼氏大肠杆菌1917对人β防御素2的诱导是通过鞭毛蛋白介导的],75Infection&Immunity[感染与免疫]2399(2007)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。肠道微生物群已被证明可指导宿主免疫系统的成熟，在免疫球蛋白(“Ig”)A和生发中心的诱导中起关键作用，并驱动Th1、Th17和调节性T细胞(“Treg”)在肠道中的发育。参见例如，S.K.Mazmanian等人,An immunomodulatory molecule of symbioticbacteria directs maturation of the host immune system[共生细菌的免疫调节分子指导宿主免疫系统的成熟],122Cell[细胞]107(2005)；H.L.Klaasen等人,Intestinal,segmented,filamentous bacteria in a wide range of vertebrate species[多种脊椎动物物种中的肠道、分段、丝状细菌],27LabAnimal[实验室动物]141(1993)；G.L.Talham等人,Segmented filamentous bacteria are potent stimuli of aphysiologicallynormal state of the murine gut mucosal immune system[分段丝状细菌是生理正常状态的鼠肠道粘膜免疫系统的有效刺激物],67Infection&Immunity[感染与免疫]1992(1999)；H.Bauer等人,The response of the lymphatic tissue to the microbialflora.Studies on germfree mice[淋巴组织对微生物菌群的应答.对无菌小鼠的研究],42Am.J.Pathology[美国病理学杂志]471(1963)；K.Atarashi等人,Induction of colonicregulatory T cells by indigenous Clostridium species[本土梭菌属物种对结肠调节性T细胞的诱导],331Science[科学]337(2011)；V.Gaboriau-Routhiau等人,The key roleof segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helperT cell responses[分段丝状细菌在肠道辅助T细胞应答的协调成熟中的关键作用],31Immunity[免疫]677(2009)；I.I.Ivanov等人,Induction of intestinal Th17 cellsby segmented filamentous bacteria[分段丝状细菌对肠道Th17细胞的诱导],139Cell[细胞]485(2009)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。在大多数个体中，免疫应答的这些不同组分的共生介导的诱导有益于宿主健康。然而，肠道微生物群的组成可对各种免疫细胞群产生不同的影响，并对自身免疫性/炎性疾病易感宿主产生不利影响，例如，分段丝状细菌(“SFB”)的存在与强Th17应答和Th17介导的疾病的发展有关。参见例如，Y.K.Lee等人,Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promoteexperimental autoimmune encephalomyelitis[对肠道微生物群的促炎性T细胞应答促进实验性自身免疫性脑脊髓炎],108(增刊1)Proceedings Nat’l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]4615(2011)；R.Stepankova等人,Segmented filamentous bacteria in adefined bacterial cocktail induce intestinal inflammation in SCID micereconstituted with CD45RBhigh CD4+T cells[确定的细菌混合物中的分段丝状细菌诱导用CD45RB高CD4+T细胞重建的SCID小鼠中的肠道炎症],13Inflammatory BowelDiseases[炎性肠病]1202(2007)；H.J.Wu等人,Gut-residing segmented filamentousbacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17cells[寄居肠道的分段丝状菌通过T辅助17细胞驱动自身免疫性关节炎],32Immunity[免疫]815(2010)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。

有趣的是，肠道微生物组和皮肤在目的和功能上存在独特联系。作为与外部环境的主要接口，两个器官在维持整体稳态方面都是至关重要的。最近的研究已证明肠道和皮肤之间存在强双向联系，这表明消化健康在皮肤稳态和应变稳态中起关键作用。肠道细菌已被证明参与许多炎性障碍的病理生理学，包括皮肤障碍如痤疮、特应性皮炎(“AD”)、硬皮病、白癜风、酒渣鼻和银屑病。

哺乳动物物种的皮肤和粘膜表面布满了数以百万计的细菌，这些细菌具有不同的代谢作用。参见例如，J.K.Nicolson等人,Host-gut microbiota metabolic interactions[宿主-肠道微生物群代谢相互作用],336Science[科学]1262(2012)，将其通过引用以其整体并入本文。这些宿主相关的微生物在胃肠(“GI”)道的稳态中起着明确的作用。参见例如，Y.K.Lee和S.K.Mazmanian,Has the microbiota played a critical role in theevolution of the adaptive immune system？[微生物群是否在适应性免疫系统的进化中起关键作用？],330Science[科学]1768(2010)；N.P.McNulty等人,The impact of aconsortium of fermented milk strains on the gut microbiome of gnotobioticmice and monozygotic twins[发酵乳菌株的组合对限菌小鼠和单卵双生小鼠的肠道微生物组的影响],3Sci.Translational Medicine[科学转化医学]106ra106；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。现在有大量证据将各种肠道微生物群和局部免疫网络与对免疫系统的系统性作用联系起来。参见例如，T.Chinen和A.Y.Rudensky,The effectsof commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses[共生微生物群对免疫细胞亚群和炎性应答的影响],245Immunological Reviews[免疫学综述]45(2012)；L.V.Hooper等人,Interactions between the microbiota and the immunesystem[微生物群与免疫系统之间的相互作用],336Science[科学]1268(2012)；C.L.Maynard等人,Reciprocal interactions of the intestinal microbiota andimmune system[肠道微生物群与免疫系统的交互作用],489Nature[自然]231(2012)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。肠道微生物群落之间正常平衡的破坏与GI道和其他远端组织中的过敏性、自身免疫性、代谢性和赘生性病理学有关。参见例如，K.E.Fujimura等人,Role of the gut microbiota in defining human health[肠道微生物群在定义人类健康中的作用],8Expert Review of Anti-infective Therapy[有关抗感染疗法的专家综述]435(2010)；A.S.Neish,Microbes in gastrointestinal health anddisease[胃肠道健康和疾病中的微生物],136Gastroenterology[胃肠病学]65(2009)；J.C.Clemente等人,The impact of the gut microbiota on human health:anintegrative view[肠道微生物群对人类健康的影响：综合观点],148Cell[细胞]1258(2012)；M.C.Noverr和G.B.Huffnagle,Does the microbiota regulate immuneresponses outside the gut？[微生物群是否调节肠道外的免疫应答？],12Trends inMicrobiology[微生物学趋势]562(2004)；H.Tlaskalova-Hogenova等人,The role of gutmicrobiota(commensal bacteria)and the mucosal barrier in the pathogenesis ofinflammatory and autoimmune diseases and cancer:contribution of germ-free andgnotobiotic animal models of human diseases[肠道微生物群(共生细菌)和粘膜屏障在炎性和自身免疫性疾病和癌症的发病机理中的作用：人类疾病的无菌和限菌动物模型的贡献],8Cellular&Molecular Immunology[细胞和分子免疫学]110(2011)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。根据这些线索，实验和临床研究已显示，富含某些“益生菌”生物体的膳食激活免疫和代谢途径，从而恢复组织稳态并促进整体健康。参见例如，J.Ravel等人,Vaginal microbiome of reproductive-age women[育龄妇女的阴道微生物组],108(增刊1)Proceedings Nat’l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]4680(2011)；A.A.Litonjua和S.T.Weiss,Is vitamin D deficiency to blame for theasthma epidemic？[维生素D缺乏是否会导致哮喘流行？]120J.Allergy&ClinicalImmunology[过敏与临床免疫学杂志]1031(2007)；M.H.Floch等人,Recommendations forprobiotic use-2011update[益生菌使用建议-2011年更新],45(增刊)J.ClinicalGastroenterology[临床胃肠病学杂志]S168(2011)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。

益生菌最常被定义为“当以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活微生物”，例如恢复或改善肠道微生物菌群的组成。参见例如，FAO/WHO,Guidelines for the evaluationof probiotics in food[食品中益生菌的评价指南],加拿大安大略省伦敦市(2002)，将其通过引用以其整体并入本文。益生菌通常作为含有潜在有益的细菌或酵母的膳食补充剂提供，并且广泛地用于食品中，包括乳制品和益生菌强化食品，以及用于胶囊、片剂和粉末中。参见例如，C.Stanton等人,Market potential of probiotics[益生菌的市场潜力],73(增刊)Am.J.Clinical Nutrition[美国临床营养学杂志]476S(2001)，将其通过引用以其整体并入本文。许多专家认为，理想的益生菌应当在肠道水平保持存活力并且应当粘附到肠道上皮以赋予显著的健康益处。有一些证据支持存活力在人体研究中的重要性，活细菌比非活细菌具有更大的免疫学效应。参见例如，M.Kaila等人,Viable versus inactivatedlactobacillus strain GG in acute rotavirus diarrhea[急性轮状病毒腹泻中的活乳杆菌菌株GG相对于灭活乳杆菌菌株GG],72Archives of Disease in Childhood[儿童疾病档案]51(1995)；P.V.Kirjavainen等人,Probiotic bacteria in the management ofatopic disease:underscoring the importance of viability[特应性疾病管理中的益生细菌：强调存活力的重要性],36J.Pediatric Gastroenterology&Nutrition[小儿胃肠病学与营养学杂志]223(2003)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。在体外和体内研究两者中，一些最佳表征的益生菌也被证明能顽固地粘附于肠道上皮。参见例如，M.Alander等人,Persistence of colonization of human colonic mucosa by aprobiotic strain,Lactobacillus rhamnosus GG,after oral consumption[口服消耗后益生菌菌株鼠李糖乳杆菌GG对人结肠粘膜的定殖持久性],65Applied&EnvironmentalMicrobiology[应用与环境微生物学]351(1999)，将其通过引用以其整体并入本文。益生菌还必须耐受胃酸消化和胆汁盐以完整地到达肠道，并且它们应该是非致病的。大多数益生菌是乳酸细菌菌株，包括乳杆菌属和双歧杆菌属物种。一些已经从健康人体的肠道微生物群中分离出来；其他已经从发酵乳制品中分离出来。来自其他细菌属如链球菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、酵母属和埃希氏菌属的物种和菌株也已被用作益生菌或已被报道具有益生菌特性，但存在关于这些益生菌中的一些的安全性的担忧，因为它们含有许多致病物种，特别是在肠球菌属内。非细菌微生物(如来自酵母属的酵母)也已被用作益生菌多年。

可从益生菌消耗中受益的肠道远端器官的夸大范例是皮肤。有趣的是，来自小鼠和人类两者的研究数据表明，含有益生菌乳酸细菌的膳食补充对皮肤具有有益作用。参见例如，M.H.Floch等人,2011；P.Arck等人,Is there a‘gut-brain-skin axis’？[是否存在“肠道-脑-皮肤轴”？],19Experimental Dermatology[实验皮肤病学]401(2010)；L.Chapat等人,Lactobacillus casei reduces CD8+Tcell-mediated skin inflammation[干酪乳杆菌减少CD8+T细胞介导的皮肤炎症],34Eur.J.Immunology[欧洲免疫学杂志]2520(2004)；A.Gueniche等人,Supplementation with oral probiotic bacteria maintainscutaneous immune homeostasis after UV exposure[补充口服益生细菌维持UV暴露后的皮肤免疫稳态],16Eur.J.Dermatology[欧洲皮肤病学杂志]511(2006)；J.Krutmann,Pre-and probiotics for human skin[用于人皮肤的益生元和益生菌],54J.DermatologicalSci.[皮肤科学杂志]1(2009)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。益生菌对皮肤的作用的重要性超出了明显的美容方面，扩展到了更广泛的宿主健康方面。实际上，皮肤及其附件的外观已被全世界的医学传统视为身体健康的临床体征。

在先前的GI免疫相关研究中，已经记录了用益生菌处理的小鼠的皮毛外观的变化。类似的“益生菌”生物体在许多动物物种的婴儿期和生育期在自然条件下占优势。参见例如，K.E.Fujimura等人,2010；A.S.Neish,2009；J.C.Clemente等人,2012。据发现，每日消耗添加到饮用水中的罗伊氏乳杆菌(一种被证明可有效抑制结肠炎的人微生物分离物)导致与在食用益生菌酸奶的小鼠中所观察到的类似的光泽皮毛。参见例如，D.M.Saulnier等人,Exploring metabolic pathway reconstruction and genome-wide expressionprofiling in Lactobacillus reuteri to define functional probiotic features[探索罗伊氏乳杆菌的代谢途径重建和全基因组表达谱以定义功能性益生菌特征],6PLoS One[科学公共图书馆综合]e18783(2011)，将其通过引用以其整体并入本文。已假设益生细菌通过如先前在GI道粘膜和皮肤中表征的抗炎机制赋予外皮健康益处。参见例如，C.DiGiacinto等人,Probiotics ameliorate recurrent Th1-mediated murine colitis byinducing IL-10and IL-10-dependent TGF-beta-bearing regulatory cells[益生菌通过诱导携带IL-10和IL-10依赖性TGF-β的调节性细胞来改善复发性Th1介导的鼠结肠炎],174J.Immunology[免疫学杂志]3237(2005)；D.H.Suh等人,Changes of comedonalcytokines and sebum secretion after UV irradiation in acne patients[UV照射后痤疮患者的粉刺性细胞因子和皮脂分泌的变化],12Eur.J.Dermatology[欧洲皮肤病学杂志]139(2002)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。

喂食酸奶或纯化细菌后，雌性小鼠中益生菌诱导的毛发光泽差异迅速出现，从而导致假定对毛发光泽度的直接影响可能是由于上皮皮脂分泌增加。参见例如，J.A.Eurell和B.Frappier,405Dellman’s Textbook of Physical Histology[德尔曼生理组织学教科书](Shigeto Yamashiro编辑,Blackwell Publ’g[布莱克威尔出版公司]2006)，将其通过引用以其整体并入本文。皮脂由包括蜡酯的脂肪酸组成，蜡酯可同时改变pH并填充毛发角质层中的缺陷，从而增强光反射。参见例如，J.B.Cheng和D.W.Russell,Mammalian waxbiosynthesis.II.Expression cloning of wax synthase cDNAs encoding amember ofthe acyltransferase enzyme family[哺乳动物的蜡生物合成.II.编码酰基转移酶家族成员的蜡合酶cDNA的表达克隆],279J.Biological Chemistry[生物化学杂志]37798(2004)；A.J.Thody和S.Shuster,Control and function of sebaceous glands[皮脂腺的控制和功能],69Physiological Reviews[生理学综述]383(1989)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。已知过量的皮脂排泄会增加发生痤疮的风险，并且许多痤疮药物旨在降低使用者的皮脂排泄率(“SER”)。例如，羊毛脂(一种绵羊的蜡质皮脂分泌物)经常用于化妆品中以保护人体皮肤，并且还以这种方式赋予健康光泽。在两种性别的小鼠中均观察到益生菌后皮脂腺细胞计数增加；然而，仅在雌性动物中观察到显著的酸度和更亮的皮毛。在喂食益生菌后，小鼠体内催产素水平升高引起的更频繁的梳理毛发活动可有助于在益生菌喂养的动物中分布皮脂并加速容光焕发。参见例如，J.A.Amico等人,Centrallyadministered oxytocin elicits exaggerated grooming in oxytocin null mice[中枢施用催产素在催产素无效小鼠中引起过度梳理毛发],78Pharmacology Biochemistry&Behavior[药理学生物化学与行为学]333(2004)，将其通过引用以其整体并入本文。与野生型动物(wt)相比，缺乏IL-10的雌性小鼠表现出碱性皮肤和粘膜，并且未能在临床上受益于益生菌补充。这与先前的研究相匹配，这些研究显示益生菌消耗后抗炎免疫细胞的IL-10依赖性募集，并支持微生物诱导的炎症与健康的相关性。在这些研究中，野生型和IL-10缺陷型C57BL/6动物之间的表型差异直到喂食益生菌酸奶或罗伊氏乳杆菌后才出现，从而得出结论，IL-10是从益生细菌中获益所明确需要的。准确地说，罗伊氏乳杆菌和炎症如何在毛囊皮脂腺单位内的这一过程中在机制上重合仍有待确定。益生菌可对许多炎性细胞和细胞因子(包括IL-10、TGF-β1、IL-17、IL-22、IL-1、TNF-α等)具有系统性作用，它们也已被证明在皮肤健康和疾病以及毛囊循环中具有重要作用。参见例如，F.Hacini-Rachinel等人,Oral probiotic control skin inflammation by acting on both effector andregulatory T cells[口服益生菌通过作用于效应细胞和调节性T细胞两者来控制皮肤炎症],4PLoS One[科学公共图书馆综合]e4903(2009)；A.Cavani等人,Th1 and Th22 inskin allergy[皮肤过敏中的Th1和Th22],96ChemicalImmunology&Allergy[化学免疫学与过敏]39(2012)；K.S.Stenn和R.Paus,Controls of hair follicle cycling[毛囊循环的控制],81Physiological Reviews[生理学综述]449(2001)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。

在许多文化中，毛发密度还与人类的峰值健康和活力有关。参见例如，P.E.Wheeler,The loss of functional body hair in man:the influence of thermalenvironment,body form and bipedality[人体功能性体毛的丧失：热环境、体型和双足性的影响],14J.Human Evolution[人类进化杂志]23(1985)；F.Muscarella和M.R.Cunningham,The evolutionary significance and social perception of malepattern baldness and facial hair[男性型秃发和面部毛发的进化意义和社会认知],17Ethology&Sociobiology[行为学和社会生物学]99(1996)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。毛发生长和皮脂腺细胞形成的增加均受到激素的强烈调节；特别地，雄激素睾酮通常在年轻男性中引起旺盛的毛发生长。参见例如，S.Fimmel等人,Inhibition of the androgen receptor by antisense oligonucleotides regulatesthe biological activity of androgens in SZ95 sebocytes[反义寡核苷酸对雄激素受体的抑制调节SZ95皮脂腺细胞中雄激素的生物活性],39Hormone&Metabolic Research[激素与代谢研究]149(2007)；M.Schneiders和R.Pausb,Sebocytes,multifacetedepithelial cells:Lipid production and holocrine secretion[皮脂腺细胞，多面上皮细胞：脂质产生和全浆分泌],42Int’l J.Biochemistry&Cell Biology[国际生物化学与细胞生物学杂志]181(2010)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。喂食益生菌后雄性小鼠中雄激素水平升高可用于刺激我们喂食益生菌的动物中的皮脂腺细胞和相关毛囊。参见例如，S.M.Liva和R.R.Voskuhl,Testosterone acts directly on CD4+Tlymphocytes to increase IL-10production[睾酮直接作用于CD4+T淋巴细胞以增加IL-10产生],167J.Immunology[免疫学杂志]2060(2001)，将其通过引用以其整体并入本文。在人的正常衰老过程中，睾酮代谢物会导致休止期脱发，使得静止休止期头皮毛发占优势，造成毛发稀疏。参见例如，J.H.Barth,Should men still go bald gracefully？[男性是否仍能“优雅地”秃顶？],355Lancet[柳叶刀]161(2000)，将其通过引用以其整体并入本文。男性型秃发尚不完全清楚，但归因于遗传学、激素和炎症之间的复杂相互作用。参见例如，A.Rebora,Pathogenesis of androgenetic alopecia[雄激素性脱发的发病机制],50J.Am.Academy Dermatology[美国皮肤病学会杂志]777(2004)，将其通过引用以其整体并入本文。从小鼠到人的数据外推表明，呈不受控制的IL-17A形式的过度炎症破坏头皮毛发生长，并且这可以通过食用益生细菌如罗伊氏乳杆菌来补救，但由于这些物种的头皮上的毛发与其他身体部位的毛发不一致而使解释变得复杂。

另一方面，皮肤水合作用赋予皮肤新鲜弹性，让我们联想到看起来年轻的皮肤。皮肤水合作用增加似乎可减少皱纹的出现，平衡皮肤微生物群，并且还可以改善瑕疵。

抗生素疗法在皮肤病学中是常见的，特别是在诸如寻常痤疮、酒渣鼻和化脓性汗腺炎的病症的治疗中。然而，随着抗生素变得越来越普遍，痤疮棒状杆菌(C.acnes)中抗生素抗性的可能性也越来越大(Dessinioti C.,Katsambas A.,“Propionibacterium acnesand antimicrobial resistance in acne[痤疮丙酸杆菌和痤疮中的抗微生物剂抗性],”Clin.Dermatol.[临床皮肤病学](2017)35:163-7)。长期使用抗生素可具有其他后果，例如肠道功能异常的风险增加和致病细菌的抗生素抗性(Garrett J.,Margolis D.,“Impactof Long-Term Antibiotic Use for Acne on Bacterial Ecology and HealthOutcomes:A Review of Observational Studies[长期使用抗生素治疗痤疮对细菌生态学和健康结果的影响：观察性研究综述]”Curr.Derm.Rep.[当前皮肤病学报告](2012)1:23-8)。

肠道微生物组已经成为与皮肤相关的越来越受关注的领域。具体地，据认为可以更好地了解肠道细菌，以便通过操纵肠道-皮肤轴来控制皮肤状况(Salem I.,Ramser A.,Isham N.等人,“The Gut Microbiome as a Major Regulator of the Gut-Skin Axis[肠道微生物组作为肠道-皮肤轴的主要调节剂],”Front.Microbiol.[微生物学前沿](2018)9:1459)。先前的研究表明，肠道微生物组可以调节皮肤病症中的免疫系统和炎症，这些皮肤病症是例如银屑病(Zakostelska Z.,Malkova J.,Klimesova K.等人,“IntestinalMicrobiota Promotes Psoriasis-Like Skin Inflammation by Enhancing Th17Response[肠道微生物群通过增强Th17应答促进银屑病样皮肤炎症],”PLoS One[科学公共图书馆综合](2016)11:e0159539；Thio H.B.,“The Microbiome in Psoriasis andPsoriatic Arthritis:The Skin Perspective[银屑病和银屑病性关节炎中的微生物组：皮肤视角]”J.Rheumatol.Suppl.[风湿病学杂志增刊](2018)94:30-1；Scher J.,UbedaC.,Artacho A.等人,“Decreased bacterial diversity characterizes the alteredgut microbiota in patients with psoriatic arthritis,resembling dysbiosis ininflammatory bowel disease[细菌多样性减少是银屑病性关节炎患者的肠道微生物群发生改变的特征，类似于炎性肠病中的生态失调]”Arthritis Rheumatol.[关节炎和风湿病](2015)67:128-39)、痤疮(Yan H.-M.,Zhao H.-J.,Guo D.-Y等人,“Gut microbiotaalterations in moderate to severe acne vulgaris patients[中重度寻常痤疮患者中的肠道微生物群改变]”J.Dermatol.[皮肤病学杂志](2018)45:1166-71；Deng Y.,WangH.,Zhou J.等人,“Patients with Acne Vulgaris Have aDistinct Gut Microbiota inComparison with Healthy Controls[寻常痤疮患者与健康对照相比具有独特的肠道微生物群]”Acta Derm.Venereol.[皮肤性病学报](2018)98:783-90)、酒渣鼻(Nam J.H.,YunY.,Kim H.S.等人,“Rosacea and its association with enteral microbiota inKorean females[韩国女性酒渣鼻及其与肠道微生物群的关联],”Exp.Dermatol.[实验皮肤病学](2018)27:37-42)、和特应性皮炎(Lee S.Y.,Lee E.,Park Y.M.等人,“Microbiomein the Gut-Skin Axis in Atopic Dermatitis[特应性皮炎中肠道-皮肤轴中的微生物组],”Allergy Asthma Immunol.Res.[过敏、哮喘和免疫学研究](2018)10:354-62)。因此，越来越关注益生菌调节皮肤的作用。益生菌作为调节肠道微生物组的替代方法已经引起关注，并且似乎在肠道局部和远端均具有抗炎作用(Plaza-Diaz J.,Ruiz-Ojeda F.J.,Vilchez-Padial L.M.等人,“Evidence of the Anti-Inflammatory Effects ofProbiotics and Synbiotics in Intestinal Chronic Diseases[益生菌和合生素在肠道慢性疾病中的抗炎作用的证据],”Nutrients[营养物](2017)9:555；Liu Y.,AlookaranJ.J.,Rhoads J.M.,“Probiotics in Autoimmune and Inflammatory Disorders[自身免疫性障碍和炎性障碍中的益生菌],”Nutrients[营养物](2018)10:1537；Hacini-RachinelF.,Gheit H.,Le Luduec J.B.等人,“Oral probiotic control skin inflammation byacting on both effector and regulatory T cells[口服益生菌通过作用于效应细胞和调节性T细胞两者来控制皮肤炎症],”PLoS One[科学公共图书馆综合](2009)4:e4903)。

先前的研究支持口服益生菌可有助于皮肤病。几项研究已经表明，对特应性皮炎的研究可能显示出益处(Notay M.,Foolad N.,Vaughn A.R.等人,“Probiotics,Prebiotics,and Synbiotics for the Treatment and Prevention of AdultDermatological Diseases[用于治疗和预防成人皮肤疾病的益生菌、益生元和合生素],”Am.J.Clin.Dermatol.[美国临床皮肤病学杂志](2017)18:721-32)。对痤疮的研究表明，由嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和两歧双歧杆菌的混合物组成的益生菌在痤疮的治疗中显示出与每日100mg米诺环素一样有效(Jung G.W.,Tse J.E.,Guiha I.等人,“Prospective,randomized,open-label trial comparing the safety,efficacy,andtolerability of an acne treatment regimen with and without a probioticsupplement and minocycline in subjects with mild to moderate acne[比较在轻度至中度痤疮受试者中使用和不使用益生菌补充剂和米诺环素的痤疮治疗方案的安全性、有效性和耐受性的前瞻性、随机、开放标签试验],”J.Cutan.Med.Surg.[皮肤医学与外科杂志](2013)17:114-22)。对小鼠的几项研究表明，口服补充短双歧杆菌通过降低UV诱导的经表皮水分损失(TEWL)的增加和皮肤水合作用的减少来减弱UV诱导的皮肤生物物理变化(Satoh T.,Murata M.,Iwabuchi N.等人,“Effect of Bifidobacterium breve B-3onskin photoaging induced by chronic UV irradiation in mice[短双歧杆菌B-3对慢性UV照射诱导的小鼠皮肤光老化的影响],”Benef.Microbes[有益微生物](2015)6:497-504；Ishii Y.,Sugimoto S.,Izawa N.等人,“Oral administration of Bifidobacteriumbreve attenuates UV-induced barrier perturbation and oxidative stress inhairless mice skin[短双歧杆菌的口服施用减弱无毛小鼠皮肤中UV诱导的屏障扰乱和氧化应激],”Arch.Dermatol.Res.[皮肤病研究档案](2014)306:467-73)。对人志愿者中短双歧杆菌发酵乳进行的研究表明，发酵乳摄入改善了皮肤水合作用(Mori N.,Kano M.,Masuoka N.等人,“Effect of probiotic and prebiotic fermented milk on skin andintestinal conditions in healthy young female students[益生菌和益生元发酵乳对健康年轻女学生的皮肤和肠道状况的影响],”Biosci.Microbiota Food Health[微生物群食品与健康的生物科学](2016)35:105-112)。

然而，尚不清楚益生菌如何在机制上影响皮肤以及它们可如何全面影响皮肤的生物力学特性，如皮脂产生、经表皮水分损失和皮肤水合作用。尽管先前研究着眼于发酵食品如何改变皮肤水合作用(Mori等人,2016)，但没有一项研究利用益生菌补充剂来评估皮脂和皮肤屏障特性如何受到影响。

因此，需要对表皮具有生物或治疗活性的益生菌组合物。如果可以发现对表皮具有生物或治疗活性的新的益生菌组合物，这将代表对本领域做出的有用贡献。

发明内容

在一个实施例中，本披露涉及一种施用基于孢子的益生菌组合物以调节受试者的真皮和真皮下特性的方法。

该方法包括向人受试者施用有效量的基于孢子的益生菌组合物，其包含菌株印度芽孢杆菌(HU36)、枯草芽孢杆菌(HU58)、凝结芽孢杆菌SC-208、克劳氏芽孢杆菌SC-109和地衣芽孢杆菌，每种菌株包含芽孢杆菌属孢子。

附图说明

图1描述皮脂排泄。在总体群体中进行皮脂测量，然后细分为痤疮组和无痤疮组，并且给予这两个组安慰剂持续四周，随后给予四周益生菌。在每次治疗结束时测量前额的皮脂排泄。(A)在益生菌治疗后，总皮脂产生呈下降趋势。(B)在无痤疮组(n＝18)中，安慰剂治疗组和益生菌治疗组的皮脂产生没有变化。(C)在痤疮组(n＝7)中，益生菌组的皮脂排泄呈下降趋势(p＝0.125)。误差条表示平均值+SEM，*p＝<0.05。

图2描述皮肤水合作用。在用四周安慰剂，随后用4周益生菌治疗后，测量脸颊和前额的皮肤水合作用。(A)总体上，在对脸颊补充益生菌后，皮肤水合作用呈增加趋势(p＝0.18)。然而，未在前额上观察到差异(B)。对无痤疮组的脸颊进行的子分析(C)或无痤疮组的前额进行的子分析(D)没有显示出任何显著差异。对痤疮组进行的亚分析没有显示出脸颊(E)或前额(F)的任何差异。误差条表示平均值+SEM，*p＝<0.05。

图3描述皮肤经表皮水分损失(TEWL)。在用安慰剂和益生菌治疗两组四周后测量TEWL。在益生菌治疗后，脸颊的总体TEWL增加(A)，并且前额的总体TEWL呈上升趋势(B)。在无痤疮组中，脸颊的TEWL增加(C)而前额的TEWL没有增加(D)。在痤疮组中，在益生菌治疗后，脸颊(E)和前额(F)的TEWL均增加。误差条代表平均值+SEM，*p＝<0.05，**p＝<0.01。

图4描述血液中“肠漏”和炎症的基线标记。基于痤疮的存在与否将参与者分成两组，并在基线时使用ELISA测量他们的血浆酶浓度。(A)与无痤疮组相比，痤疮组的平均人FABP-2浓度呈上升趋势(p＝0.088)。各组中LPS(B)、连蛋白(C)和TNF-α(D)的平均总浓度均无差异。误差条表示平均值+SEM，*p＝<0.05。

图5描述FABP-2水平。在前四周给予两组的参与者安慰剂，随后给予四周益生菌。(A)在安慰剂治疗结束时痤疮组和无痤疮组中的相对FABP-2浓度均没有显著差异。(B)益生菌暴露后痤疮组中的FABP-2呈下降趋势。误差条表示平均值+SEM，*p＝<0.05。

图6描述连蛋白水平。在前四周给予两组的参与者安慰剂，随后给予四周益生菌。(A)在安慰剂治疗结束时痤疮组和无痤疮组中的相对连蛋白浓度均没有显著差异。(B)在益生菌治疗结束时痤疮组中的相对连蛋白浓度呈增加趋势。误差条表示平均值+SEM，*p＝<0.05。

图7描述TNF-α水平。在前四周给予两组的参与者安慰剂，随后给予四周益生菌。(A)在安慰剂治疗结束时痤疮组和无痤疮组中的相对TNF-α浓度均没有显著差异。(B)在益生菌治疗结束时痤疮组和无痤疮组中的相对TNF-α浓度均没有显著差异。误差条表示平均值+SEM，*p＝<0.05。

图8描述LPS水平。在前四周给予两组的参与者安慰剂，随后给予四周益生菌。(A)在安慰剂治疗结束时痤疮组中的相对LPS浓度显著增加，但无痤疮组中没有。(B)在益生菌治疗结束时痤疮组和无痤疮组中的相对LPS浓度均没有显著差异。误差条表示平均值+SEM，*p＝<0.05。

图9描述痤疮损伤计数。在对非囊性痤疮参与者(n＝7)进行每次访视时计数痤疮损伤。在暴露于安慰剂后痤疮损伤计数没有变化。然而，益生菌补充导致总损伤(TL)和非炎性损伤(NIL)计数的显著减少。炎性损伤(IL)呈下降趋势(p＝0.054)。误差条代表平均值+SEM，*p＝<0.05，**p＝<0.01。

图10描述血液短链脂肪酸的变化。A)在基线时比较总体群体(n＝25)、痤疮亚群(n＝7)和无痤疮亚群(n＝18)的短链脂肪酸。在痤疮患者中，乙酸盐水平呈下降趋势(p＝0.15)。B)在总体群体中，益生菌补充导致乙酸盐水平呈增加趋势(p＝0.13)且乙酸盐:丙酸盐的比率显著增加。C)在痤疮亚群中，益生菌补充没有统计学上的显著变化，尽管乙酸盐:丙酸盐的比率增加了2.6倍，但其不具有统计学显著性(p＝0.33)。D)无痤疮组中的益生菌补充导致乙酸盐水平(p＝0.11)和乙酸盐:丙酸盐的比率(p＝0.05)呈增加趋势。*p<＝0.05。

具体实施方式

如本文所用，本说明书和权利要求中所用的动词“包含”及其变化形式以其非限制性含义使用，意指包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，不定冠词“一个/种(a或an)”对元素的引用不排除存在多于一个/种元素的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个且仅一个元素。因此，不定冠词“一个/种(a或an)”通常意指“至少一个/种”。

如本文所用，“有效量”或“对…有效的量”定义为在必要的剂量下和时间段内有效实现所需生物结果(例如减少、预防或治疗疾病或病症和/或诱导特定的有益作用)的量。本披露的组合物的有效量可根据例如个体的年龄、性别和体重的因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳应答。可每日施用几个分开的剂量，或者可如个体情况的紧急程度所示按比例减少剂量。如将容易理解的，根据本披露的组合物可以以单份或全天间隔的多份施用。如本领域技术人员将理解的，份量不必限于每日施用，并且可以是在每两天或每三天或其他方便有效的基础上进行。根据情况的紧急程度，在给定日期的施用可以是以单份或全天间隔的多份施用。

如本文所用，术语“受试者”或“个体”是指任何脊椎动物，包括但不限于人和其他灵长类动物(例如黑猩猩以及其他猿类和猴物种)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、山羊和马)、家畜(例如狗和猫)、实验室动物(例如啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟类(例如家养鸟、野生鸟和猎鸟，如鸡、火鸡和其他鸡科鸟类、鸭、鹅等)。在一些实施方式中，受试者可以是哺乳动物。在其他实施方式中，受试者可以是人。

在各种实施例中，本披露提供了益生菌组合物，生产这些益生菌组合物的方法，以及通过向有需要的受试者施用有效量的益生菌组合物来有利地调节皮肤的真皮层和真皮下层的特性的方法。在本发明的其他实施例中，本披露的益生菌组合物增加皮肤水合作用、减少皱纹外观、减少皮脂含量、减少皮肤炎症、改变皮肤上的脂质组、改变皮肤微生物群、和/或减少痤疮损伤或酒渣鼻的出现和频率。在本发明的另其他实施例中，本披露的两种或更多种益生菌菌株的组合物产生了意想不到的协同作用，其有利地调节皮肤的真皮层和真皮下层的特性。在本发明的另其他实施例中，本披露的两种或更多种益生菌菌株的组合物产生了意想不到的协同作用，其增加皮肤水合作用、减少皱纹外观、减少皮脂含量、减少皮肤炎症、改变皮肤上的脂质组、改变皮肤微生物群、和/或减少痤疮损伤或酒渣鼻的出现和频率。这些作用已经基于用包含一种或多种定植益生菌材料菌株的组合物补充研究参与者进行了实验验证，这些菌株可以是基于孢子的益生细菌菌株。

在本发明的实施例中，益生菌组合物可含有益生菌微生物，该益生菌微生物在一些应用中可以是选自以下属的基于孢子的益生菌生物体：乳杆菌属、双歧杆菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、链球菌属、片球菌属和酵母属。在某些方面，益生菌微生物是以下中的至少一种：嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、双歧杆菌属物种、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸乳球菌、唾液链球菌、酿酒酵母和布拉酵母。益生菌微生物可以是呈孢子形式或处于营养状态。

乳杆菌属的种类极其多样并且每年都在扩大。它拥有超过230个物种，已成长为细菌分类学中最大的属之一。由于该属已超出了可接受的“正常多样性”，因此重命名和重新分类是不可避免的，其中乳杆菌属最可能被分成十二个新属。许多具有经证实的工业重要性的传统“益生菌”物种和许多起子培养物最终不再被称为“乳杆菌属”。因此，一项重大的沟通挑战迫在眉睫，以减少有关“旧商业”命名法和“正确科学”命名法的不可避免的混淆。一旦国际原核生物系统学委员会在其官方期刊(国际系统学与进化微生物学杂志)上公布了新的命名法，这些变化即有效且正式。将提交用于公布的描述乳杆菌属新命名法的手稿可能准备在2018年底提交。同时，于2018年9月召开了分类学小组委员会会议，以讨论命名法变化，并且于2018年10月召开了(仅限邀请)LABIP研讨会，该研讨会将在考虑法规、法律/IP和行业影响的同时评价科学性。

益生菌通过菌落形成单位(“CFU”)来测量。很少有研究确定有效剂量，但有效剂量通常为数亿个CFU或更高。如果益生菌被用于帮助消化，则益生菌应随餐服用，否则如果在两餐之间服用，特别是如果与有助于稀释胃酸并使益生菌更快地进入消化道的液体一起服用，则益生菌可能会更好地存活。可以短期或长期服用益生菌。

在一些实施方式中，益生菌微生物在组合物中的浓度可以是至少约1·10⁹CFU/g、至少约2·10⁹CFU/g、至少约3·10⁹CFU/g、至少约4·10⁹CFU/g、至少约5·10⁹CFU/g、至少约6·10⁹CFU/g、至少约7·10⁹CFU/g、至少约8·10⁹CFU/g、至少约9·10⁹CFU/g、至少约1·10¹⁰CFU/g、至少约2·10¹⁰CFU/g、至少约3·10¹⁰CFU/g、至少约4·10¹⁰CFU/g、至少约5·10¹⁰CFU/g、至少约6·10¹⁰CFU/g、至少约7·10¹⁰CFU/g、至少约8·10¹⁰CFU/g、至少约9·10¹⁰CFU/g、或至少约1·10¹¹CFU/g。

基于孢子的益生菌补充剂可以包含在原位暴露于胃酸后存活率在以下任何范围内的孢子：约75％至约99％、约80％至约95％、约85％至约90％、以及大于约90％。

基于孢子的益生菌补充剂可以包含在以下任何范围内的许多孢子：约10亿至约100亿个孢子、约15亿个孢子至约95亿个孢子、约20亿个孢子至约90亿个孢子、约25亿个孢子至约80亿个孢子、约30亿个孢子至约70亿个孢子、约35亿个孢子至约65亿个孢子、约35亿个孢子至约60亿个孢子、约35亿个孢子至约50亿个孢子、和约35亿个孢子至约45亿个孢子。

基于孢子的益生菌补充剂可包括液体、糖果制品、粉末或丸剂形式，或者可以添加到食物产品中。在一个实施方式中，每克散装干燥原粉中存在约1·10¹⁰CFU的微生物，其中每克含有约60％或更少的细菌质量和约40％的载体系统。在其他实施方式中，每克含有约70％或更少的细菌质量和约30％的载体系统、约80％或更少的细菌质量和约20％的载体系统、约90％或更少的细菌质量和约10％的载体系统、约50％或更少的细菌质量和约50％的载体系统、约40％或更少的细菌质量和约60％的载体系统、约30％或更少的细菌质量和约70％的载体系统、约20％或更少的细菌质量和约80％的载体系统、或约10％或更少的细菌质量和约90％的载体系统。

本文披露的方法和组合物的实施方式可包含基于孢子的益生菌。基于孢子的益生菌由内体组成，这些内体对酸性pH高度耐受，在室温下是稳定的，并且与传统的益生菌补充剂相比向小肠递送更大量的高存活力细菌。传统的微囊化使用活微生物，然后将这些微生物微囊化以力求对其进行保护；然而，这是一个固有地导致微生物最终死亡从而降低微生物功效的过程。使用经天然微囊化以形成内体的基于孢子的微生物可能是优选的，因为这些微生物处于休眠状态并且不经历功效随时间的降解。这些基于孢子的微生物也特别具有热稳定性并且可以经受UV巴氏杀菌，因此它们也能够在热暴露或UV巴氏杀菌之前添加到食物产品或饮料中，而不经历功效随时间的降解。

益生菌补充可有益于皮肤病如特应性皮炎和痤疮。益生菌调节肠道微生物组，同时在肠道局部和远离肠道的全身具有抗炎作用。

本文描述的这项研究为科学界的不断发展(试图更好地了解肠道微生物组的范围)增加了支持使用益生菌治疗皮肤病症的证据。

本研究还增加了使用基于孢子的益生菌来改变肠道微生物群和血液短链脂肪酸以及其用于痤疮的潜力的证据。

抗生素疗法广泛用于治疗各种皮肤病症。然而，这种广泛使用可导致抗生素抗性，从而可影响肠道微生物组。益生菌补充可以是调节肠道微生物组并具有有益作用(例如治疗特应性皮炎和痤疮)的替代方法。

微囊化

在某些实施方式中，在添加至益生菌组合物之前将益生菌微生物进行微囊化。微囊化是通过包衣包围微小颗粒或液滴以得到具有许多有用特性的小胶囊的工艺。在相对简单的形式中，微胶囊是周围具有均匀的壁的小球体。微胶囊内部的材料称为核心、内相或填充物，而壁有时称为壳、包衣或膜。大多数微胶囊的直径在几微米到几毫米之间。

“微囊化”的定义已经扩大，并且包括大多数食品。每类食品成分均已被包封；香料是最常见的。微囊化技术取决于待包封材料的物理和化学特性。参见例如，L.S.Jackson和K.Lee,Microencapsulation and the food industry[微囊化和食品工业],Lebensmittel-Wissenschaft Technologie[食品科学技术](1991年1月1日)，将其通过引用以其整体并入本文。

然而，许多微胶囊与这些简单的球体几乎没有相似之处。核心可以是晶体、锯齿状吸收剂颗粒、乳液、皮克林乳液(Pickering emulsion)、固体悬浮液或较小微胶囊的悬浮液。微胶囊甚至可以具有多个壁。

可以使用各种技术来生产微胶囊，并且本领域普通技术人员将理解此类各种技术中的每一种。可用于生产微胶囊的这些技术包括但不限于如下所述的盘包衣、空气悬浮包衣、离心挤出、振动喷嘴、喷雾干燥、离子型凝胶化、界面缩聚、界面交联、原位聚合、和基质聚合。

盘包衣

广泛用于制药工业的盘包衣工艺是用于形成小的包衣颗粒或片剂的最古老的工业程序之一。使颗粒在盘或其他装置中翻滚，同时缓慢施加包衣材料。

空气悬浮包衣

空气悬浮包衣由威斯康星大学的Dale Eavin Wurster教授于1959年首次描述，与盘包衣相比，它提供了改善的控制和灵活性。在该工艺中，将固体颗粒状核心材料分散到支撑气流中，并用挥发性溶剂中的聚合物包衣这些悬浮颗粒，从而在其上留下非常薄的聚合物层。重复该过程几百次，直到获得所需的参数如包衣厚度等。支撑颗粒的气流也有助于对它们进行干燥，并且干燥速率与气流温度成正比，可改变气流温度以进一步影响包衣的特性。

颗粒在包衣区部分中的再循环受腔室设计及其操作参数的影响。包衣腔室被布置成使得颗粒向上通过包衣区，然后分散到移动较慢的空气中并沉回到包衣腔室的底部，重复通过包衣区直到获得所需的包衣厚度。

离心挤出

使用含有同心喷嘴的旋转挤出头来包封液体。在该工艺中，核心液体射流被壁溶液或熔体(melt)的外壳(sheath)包围。当射流移动通过空气时，由于瑞利不稳定性(Rayleigh instability)，射流破裂成核心液滴，每个液滴包衣有壁溶液。当液滴在飞行中时，熔融壁可能变硬或溶剂可能从壁溶液中蒸发。由于大多数液滴在平均直径的+10％以内，它们落在喷雾喷嘴周围的窄环中。因此，如果需要，胶囊可以在形成后通过将它们捕获在环形硬化浴中而变硬。该工艺非常适合形成直径400-2,000μm的颗粒。由于液滴是通过液体射流的破裂形成的，该工艺仅适用于液体或浆液。可以实现高生产率，即每喷嘴每小时每头可以生产高达22.5kg(50lb)的微胶囊。含有16个喷嘴的头可供使用。

振动喷嘴

可以使用通过喷嘴的层流和喷嘴或液体的附加振动来进行核心-壳包封或微粒化(基质包封)。振动必须在瑞利不稳定性的共振中进行，并导致非常均匀的液滴。液体可由具有有限粘度(0-10,000mPa·s已被证明有效)的任何液体组成，例如溶液、乳液、悬浮液、熔体等。固化可以根据所使用的凝胶化系统使用内部凝胶化(例如，溶胶-凝胶处理、熔融)或外部凝胶化(另外的粘合剂系统，例如，在浆液中)进行。该工艺非常适用于产生20-10,000μm之间的液滴，更小和更大液滴的应用是已知的。这些装置在工业和研究中主要以1-20,000kg/小时(2-44,000lb/h)的容量，在20℃-1500℃(68°F-2732°F)(室温直至熔融硅)的工作温度下使用。具有一个直到几十万个喷嘴的喷嘴头可供使用。

喷雾干燥

当活性材料溶解或悬浮在熔体或聚合物溶液中并被捕获在干燥颗粒中时，喷雾干燥用作微囊化技术。主要优点是由于在干燥器中接触时间短而能够处理不稳定材料；此外，该操作是经济的。在现代喷雾干燥器中，待喷雾溶液的粘度可高达300mPa·s。通过将该技术与使用超临界二氧化碳相结合，可以包封敏感材料如蛋白质。

离子型凝胶化

凝聚-相分离工艺由在连续搅拌下进行的三个步骤组成：

(1)形成3个不混溶的化学相：液体制造媒介物相、核心材料相和包衣材料相。

(2)包衣的沉积：将核心材料分散在包衣聚合物溶液中。将包衣聚合物材料包被在核心周围。通过在核心材料和媒介物相之间形成的界面处吸附的聚合物而在核心周围沉积液体聚合物包衣。

(3)包衣的硬化：包衣材料在媒介物相中是不混溶的，并且其形式上变硬。硬化技术包括热、交联或溶解。

界面缩聚

在界面缩聚中，缩聚中的两种反应物在界面处相遇并迅速反应。该方法的基础是酰氯与含有活性氢原子的化合物(如胺或醇、聚酯、聚脲或聚氨酯)之间的经典Schotten-Baumann反应。在合适的条件下，柔性薄壁在界面处迅速形成。将农药和二酰氯的溶液在水中乳化，并添加含有胺和多官能异氰酸酯的水溶液。存在碱以中和反应过程中形成的酸。缩合的聚合物壁在乳液液滴的界面处瞬间形成。

界面交联

界面交联源自界面缩聚，并且开发界面交联是为了避免使用毒性二胺，用于药物或化妆品应用。在该方法中，含有活性氢原子的小双官能单体被生物来源的聚合物如蛋白质替代。当反应在乳液界面进行时，酰氯与蛋白质的各种官能团反应，导致膜的形成。该方法非常通用，并且微胶囊的特性(尺寸、孔隙率、可降解性、机械阻力)可以变化。设想了人工微胶囊在微氟通道中的流动。

原位聚合

在一些微囊化工艺中，在颗粒表面上进行单一单体的直接聚合。在一种工艺中，例如，将纤维素纤维包封在聚乙烯中，同时浸入无水甲苯中。通常的沉积速率为约0.5μm/min。包衣厚度范围为0.2-75μm(0.0079-3.0密耳)。包衣是均匀的，即使在尖锐的突起上也是如此。蛋白质微胶囊具有生物相容性和生物可降解性，并且蛋白质骨架的存在使得膜比通过界面缩聚获得的那些膜更具有抗性和弹性。

基质聚合

在许多工艺中，在颗粒形成过程中将核心材料包埋在聚合物基质中。这种类型的简单方法是喷雾干燥，在该方法中通过从基质材料中蒸发溶剂形成颗粒。然而，基质的固化也可由化学变化引起。

通过以下应解释为限制性的另外的实例进一步说明本发明。根据本披露，本领域技术人员应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对所披露的具体实施例进行许多改变，并且仍然获得同样或相似的结果。

实例

实例1：口服益生菌对微生物组和脂质组的影响

A.目的

本研究的目的是评估口服益生菌可如何改变肠道和皮肤的微生物组以及肠道、血液和皮肤的脂质组。主要目的是评估富含短链脂肪酸(“SCFA”)的益生菌是否可以使血液脂质组具有更高水平的SCFA。

B.背景

抗生素在皮肤病学中广泛用于治疗慢性皮肤病症，例如痤疮、酒渣鼻和特应性皮炎。先前的研究已经表明，口服益生菌对于皮肤病如特应性皮炎和痤疮可能是有益的，但是肠道与皮肤沟通的机制仍然难以捉摸。参见例如，M.K.Trivedi等人,Emerging Therapiesfor Acne Vulgaris[寻常痤疮的新疗法],19Am.J.Clinical Dermatology[美国临床皮肤病学杂志]505(2018)；M.Notay等人,Probiotics,Prebiotics,and Synbiotics for theTreatment and Prevention of Adult Dermatological Diseases[用于治疗和预防成人皮肤疾病的益生菌、益生元和合生素],18Am.J.Clinical Dermatology[美国临床皮肤病学杂志]721(2017)；将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。

SCFA和长链脂肪酸(“LCFA”)之间的平衡被认为是肠道中的细菌如何能够与身体的其余部位沟通的一个因素。研究表明，与年龄匹配的对照相比，痤疮患者的血液中SCFA水平降低。

本研究的目的是了解口服益生菌可如何改变肠道微生物组以及它们是否可以增加血液脂质组中的SCFA。最终，目标是找到在慢性皮肤病症的治疗中使用抗生素的合适替代物，使得可以减少抗生素的使用量。

C.纳入和排除标准

纳入标准：

18岁或以上。

排除标准：

研究开始的一个月内服用口服抗生素的那些；

受试者必须没有糖尿病、已知心血管疾病、恶性肿瘤、肾病或长期使用类固醇史；

BMI高于30kg/m²的那些；

在研究前两周和研究参与期间不愿意或在医学上无法(根据研究者的判断)停止使用面部外用药物(如类视黄醇或抗生素)的那些；

在过去两个月内经历了基于激素的疗法的改变的那些，这些基于激素的疗法包括但不限于口服避孕药或基于孕酮的药丸(释放孕酮的IUD被认为是释放激素的疗法)；

使用改变血脂的药物(如他汀类药物和抗高血脂药物)的那些；

当前吸烟者，或过去一年吸烟或有5年吸烟史的那些；

孕妇；

囚犯；以及

不同意的成人。

D.研究时间线

每个研究参与者将参与为期两个月的研究，并且整个研究将在一年内进行。

E.研究终点

一个或多个主要终点：

(1)血液脂质组变化-具体是SCFA的存在。

一个或多个次要终点：

(1)肠道微生物组变化-具体是产生SCFA的细菌的存在；

(2)通过皮脂仪测量的皮脂产生；

(3)经表皮水分损失(“TEWL”)；

(4)水合作用；

(5)皮肤微生物组变化；

(6)肠道脂质组变化；以及

(7)皮肤脂质组变化。

F.涉及的程序

本研究将纳入符合纳入标准但没有任何排除标准的二十五(25)名受试者。本研究将是一项评估益生菌的影响的开放标签、单盲、安慰剂对照的研究。我们选择了25名受试者作为试点研究的合适样品，由于先前没有研究评估血液脂质组的变化，不可能进行功效分析。

前4周-每日服用安慰剂片剂：

看起来类似于益生菌配制品的补充剂；

每个安慰剂片将只含有米粉；并且

剂量-每天2片。

第二个4周-每日服用益生菌片剂：

益生菌配制品(含5种菌株)：40亿(4·10⁹)个CFU，包括HU36(印度芽孢杆菌菌株)；HU58(枯草芽孢杆菌菌株)；SC109(克劳氏芽孢杆菌菌株)；SC208(凝结芽孢杆菌菌株)；和地衣芽孢杆菌。

HU36(“Colorspore^TM”)是印度芽孢杆菌菌株，其制剂由印度孟买的维里迪斯生物制药私人有限公司(Viridis BioPharma Pvt.Ltd.)制造。英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collection of Industrial,Food and Marine Bacteria，“NCIMB”)有限公司为印度芽孢杆菌HU36指定的菌株编号为41361。

HU58(“ProBiotene^TM”)是枯草芽孢杆菌菌株，其制剂由印度孟买的维里迪斯生物制药私人有限公司制造。枯草芽孢杆菌HU58已保藏在国家生物技术研究中心(NationalCenter for Biotechnology Research)，登录号为EF101709。芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center，“BGSC”)为芽孢杆菌属HU58指定的编号为3A34，而NCIMB有限公司指定的菌株编号为30283。

SC109是克劳氏芽孢杆菌菌株，其制剂由印度孟买的协同生命科学私人有限公司(Synergia Life Sciences Pvt.Ltd.)于2018年3月制造。克劳氏芽孢杆菌SC109已保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)，登录号为DSM 32639。

SC208是凝结芽孢杆菌菌株，其制剂由印度孟买的协同生命科学私人有限公司于2018年3月制造。凝结芽孢杆菌SC208已保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心，登录号为DSM 32640。

剂量：每天2片，每日总剂量为40亿(4·10⁹)个CFU。

安慰剂和益生菌片剂将由微生物组实验室(Microbiome Labs)提供。

G.与研究相关的程序

尿妊娠试验(针对未进行子宫切除术的女性受试者)(时间线见表1)：

对孕妇没有已知的风险，但该研究将不会纳入孕妇。将建议妇女需要避免怀孕并使用可接受的避孕措施，包括以下：

1.禁欲；或

2.以下可接受的避孕形式中的两种形式：

男性乳胶避孕套；

女性避孕套；

口服避孕药；

长效型(Depot-based)孕激素避孕药；或

宫内节育器。

粪便收集

将从受试者收集粪便样品。将给予受试者说明书以完成收集。将这些样品进行去识别。时间线见表1。

静脉穿刺

将使用标准静脉穿刺技术收集多达5毫升的血液，并在分析前储存在-80℃。血液将用于建立基线值以与终点值进行比较。我们将收集血液以评估SCFA、LCFA、脂质介质谱(lipid mediator profile)、抗氧化剂状态和炎性细胞因子的基线值和终点值，从而将它们与微生物组评估相关联。在研究访视之前，将要求受试者在抽血前禁食六小时。时间线见表1。

皮肤微生物组

将在面部使用棉拭子。时间线见表1。

皮肤微粉刺(Microcomedome)

然后将粘性毛孔清洁条(如碧柔(Bioré)条)施加到面部，并轻轻除去。时间线见表1。

皮脂胶带(Sebutape)收集

皮脂胶带(CuDerm，德克萨斯州达拉斯市)是一种无痛且无创的粘性贴片，其被置于皮肤上以允许吸收分泌的皮脂。然后可以随后除去粘性贴片以允许对收集的皮脂进行分析。在皮脂胶带施加之前，将申请人的面部用70％异丙醇湿巾清洁。将皮脂胶带放置在受试者的面部。将使用一次性手套和镊子施加皮脂胶带长达一小时。除去后，在分析前，将皮脂胶带贴片储存在-80℃的皮脂胶带Clear View PRO储存卡上。冷冻室位于上锁且安全的房间内。时间线见表1。

皮脂仪

将进行皮脂仪测量(时间线见表1)。皮脂仪装置的风险最小，因为它是一种仅需接触皮肤30秒的无创且无痛的装置。皮脂仪装置允许对皮脂分泌进行无创且无痛测量，并且已用于多项IRB批准的研究。

经表皮水分损失(“TEWL”)和收集

将进行TEWL测量(时间线见表1)。这是一种允许测量角质层的屏障功能的无创且无痛装置。这种无创装置已广泛用于皮肤屏障功能的研究。每个装置具有在测量期间与皮肤表面接触的平顶电极(flat-top electrode)。每次收集将花费不到1分钟。受试者在测量期间和测量后不会感到不适。

水合作用收集

将进行水合作用测量(时间线见表1)。这是一种允许测量角质层的屏障功能的无创且无痛装置。这种无创且无痛装置已广泛用于皮肤屏障功能的研究。每个装置具有在测量期间与皮肤表面接触的平顶电极。每次收集将花费不到1分钟。受试者在测量期间和测量后不会感到不适。

面部照片

将获取所有受试者的使用数码相机拍摄的面部照片。没有紫外线暴露。时间线见表1。

食物记录

将提供食物日记/日志以跟踪指定天数的饮食。

消化问卷

将提供消化问卷以更好地了解和跟踪受试者的消化健康。

H.所有受试者

筛选/同意(访视1)：

(1)同意过程；

(2)将记录病史和手术史；

(3)研究团队将审查受试者正在服用的任何药物和补充剂；

(4)将提供如何完成食物日记/日志的说明；

(5)将提供粪便套件；

(6)如果患者使用了外用药物、抗生素和益生菌，则在基线前和筛选后可能会被冲洗。

基线访视(访视2)(筛选访视后至少3天)：

(1)尿妊娠试验(适用于女性受试者)；

(2)面部拭子；

(3)面部皮脂胶带收集；

(4)待收集的粪便样品；

(5)将提供第二粪便样品套件；

(6)粘性毛孔条；

(7)静脉穿刺采血；

(8)面部摄影；

(9)皮脂仪测量；

(10)TEWL测量；

(11)水合作用测量；

(12)将收集先前的食物日记/日志；

(13)将提供新的食物日记/日志；

(14)将提供和收集消化问卷；

(15)将提供干预/药丸日志；

(16)将支付干预性补充剂的费用。

第4周访视(+/-1周)(访视3)：

(1)尿妊娠试验(适用于女性受试者)；

(2)面部拭子；

(3)面部皮脂胶带收集；

(4)待收集的粪便样品；

(5)将提供粪便样品套件；

(6)粘性毛孔条；

(7)静脉穿刺采血；

(8)面部摄影；

(9)皮脂仪测量；

(10)TEWL测量；

(11)水合作用测量；

(12)将收集先前的食物日记/日志；

(13)将提供新的食物日记/日志；

(14)将提供和收集消化问卷；

(15)将收集先前的研究药剂日志；

(16)将提供干预/药丸日志；

(17)将支付干预性补充剂的费用；

(18)从上个月的供应中收集并计数的药丸。

第8周访视(+/-周)(访视4)：

(1)尿妊娠试验(适用于女性受试者)；

(2)面部拭子；

(3)面部皮脂胶带收集；

(4)待收集的粪便样品；

(5)粘性毛孔条；

(6)静脉穿刺采血；

(7)面部照片；

(8)皮脂仪测量；

(9)TEWL测量；

(10)水合作用测量；

(11)注意到的不良反应；

(12)将收集食物日记/日志；

(13)将提供和收集消化问卷；

(14)将收集干预/药丸日志；

(15)从上个月的供应中收集并计数的药丸。

将对所有收集的样品(血液、粘性条、粪便和皮脂胶带)进行去识别和编码。只有研究团队才能访问将样品与受试者匹配的密钥。密钥将受密码保护并位于上锁的房间内。

程序表如下：

表1：程序表

I.临床试验早期发现(如表2所示)：

(1)与安慰剂相比，益生菌在统计学上显著降低皮脂排泄率；

(2)与安慰剂相比，益生菌在统计学上显著增加皮肤水合作用。

临床试验早期发现如下：

表2：临床试验早期发现

实例2：益生菌补充对皮脂产生、皮肤屏障功能和痤疮的安慰剂对照的、评价者双盲的评估。

目的是前瞻性地评估口服益生菌如何改变皮肤的生物物理特性和皮脂产生。此外，该研究还试图评估肠道微生物组和血液脂质组的变化，以便将其与肠道中的变化相关联。

方法和结果总结

这是一项为期8周的双盲研究，其中25名参与者被分配在前四周服用安慰剂药丸，并在另四周服用益生菌。在基线、4周和8周时进行血液和肠道收集，面部摄影，皮脂产生、经表皮水分损失(TEWL)和水合作用测量。一位对研究干预盲的经委员会认证的皮肤科医生对痤疮受试者的炎性和非炎性损伤进行分级。

如下所述，在益生菌补充后，皮肤的生物物理特性发生改变，倾向于减少皮脂排泄并增加总体TEWL。对痤疮患者的亚组分析显示，总损伤计数、非炎性损伤计数和炎性损伤计数有所改善。LPS和FABP-2(肠道通透性的标记)在痤疮亚组中补充益生菌后均具有改善的趋势。非痤疮群体的肠道微生物群发生改变，其中阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度增加，而痤疮群体的毛螺菌科(Lachnospiraceae)和活泼[瘤胃球菌]([Ruminococcus]gnavus)的相对丰度增加。总体上，循环短链脂肪酸的乙酸盐:丙酸盐的比率增加。

本研究的目的是前瞻性地评估口服益生菌可如何改变皮肤生物力学特性和皮脂产生。包括招募非囊性痤疮参与者，以进一步对群体进行分层。最后，评估肠道微生物组和血液脂质组的变化，以将皮肤中的可测量变化与这些因素相关联。

研究设计

本研究于2018年6月至2018年10月作为单盲、安慰剂对照的8周研究进行。本研究由加州大学戴维斯分校的机构审查委员会(Institutional Review Board)批准，并在ClinicalTrials.gov(NCT03605108)上注册。所有参与者在参与之前都提供了书面知情同意书并获得了经济补偿。在加州大学戴维斯分校皮肤病学诊所招募了二十五名健康参与者(平均年龄30.8岁；范围：19-62岁)并就合格性进行了筛选。参与者入组并由临床研究协调员分配干预措施。排除标准包括过去一个月的任何外用抗生素使用、可能干扰或增加研究参与风险的急性或慢性疾病史、BMI高于30kg/m²的个体、在前两个月内开始新的激素避孕药或改用不同的激素避孕药的受试者、在过去14天内正在使用或曾经使用类视黄醇的个体、使用改变血脂的药物(如他汀类药物和抗高血脂药物)的受试者。排除患有囊性痤疮的参与者，但允许患有非囊性痤疮的受试者，因为非囊性痤疮不被认为是一种疾病。最后，如果受试者是当前吸烟者、或过去一年曾吸烟、或有5年吸烟史，则排除在外。

该研究进行8周，并且由五次访视(同意、基线、第4周和第8周随访)组成。二十五名受试者在前四周接受安慰剂药丸，并且相同的二十五名受试者在另四周接受如实例1中的益生菌配制品(Megasporebiotic，微生物组实验室，佛罗里达州圣奥古斯丁)，该益生菌配制品是基于孢子的益生菌，其包含来自革兰氏阳性孢子形成菌株[印度芽孢杆菌(HU36)、枯草芽孢杆菌(HU58)、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌]的40亿个孢子。指示受试者每天服用两片。指示受试者在其研究访视当天不要清洁其面部或身体或将任何产品施加于其面部。

采血

在基线、4周和8周时收集禁食血液样品，以评估短链脂肪酸、长链脂肪酸、脂质介质谱、抗氧化剂状态和炎性细胞因子的基线值和终点值，从而将它们与微生物组评估相关联。

肠道微生物组收集

收集粪便样品以确定肠道微生物组和脂质组在基线、4周和8周时如何变化。受试者被指示在其访视前收集粪便后立即将粪便收集物置于冷冻室中，并且将所有样品立即置于-80℃冷冻室中直至用于分析。

面部摄影

通过使用BTBP 3D Clarity

面部建模和分析系统(Brigh-Tex生物光子公司(Brigh-Tex BioPhotonics)，加利福尼亚州圣何塞)在基线、第4周和第8周时获得所有参与者的高分辨率照片。摄影仪器在零外部环境照明(zero extraneously ambient lighting)下自动拍摄照片，具有可再现的脸部位置和相同的摄影曝光。与多个面部特征的临床分级相比，该系统已得到验证(Petukhova T.A.,Foolad N.,Prakash N.等人,“Objectivevolumetric grading of postacne scarring[痤疮后瘢痕的客观体积分级],”J.Am.Acad.Dermatol.[美国皮肤病学会杂志](2016)75:229-31；Foolad N.,Prakash N.,Shi V.Y.等人,“The use of facial modeling and analysis to objectively quantifyfacial redness[使用面部建模和分析来客观地量化面部发红],”J.Cosmet.Dermatol.[化妆品皮肤病学杂志](2016)15:43-8；Ornelas J.,Rosamilia L.,Larsen L.等人,“Objective assessment of isotretinoin-associated cheilitis:IsotretinoinCheilitis Grading Scale[异维甲酸相关唇炎的客观评估：异维甲酸唇炎分级量表],”J.Dermatolog.Treat.[皮肤病学治疗杂志](2016)27:153-5；Foolad N.,Shi V.Y.,Prakash N.等人,“The association of the sebum excretion rate with melasma,erythematotelangiectatic rosacea,and rhytides[皮脂排泄率与黄褐斑、红斑血管扩张玫瑰斑和面部皱痕的关联],”Dermatol.Online J.[皮肤病学在线期刊](2015)21(6):2；将这些文献中的每一个通过引用并入本文)。

面部分级与分析

由委员会认证的皮肤科医生以盲法方式评价面部照片，使得评价者和参与者对干预是双盲的。通过量化炎性和非炎性损伤来评估痤疮受试者的痤疮变化。将炎性和非炎性损伤的总和量化为总损伤计数。

皮肤屏障功能

研究者通过测量基线、4周和8周时的皮脂产生(

SM 815；Courageand Khazaka公司(Courage and Khazaka)，德国科隆)、经表皮水分损失(“TEWL”，使用Vapometer；德尔芬技术公司(Delfin Technologies)，康涅狄格州斯坦福德市)、和水合作用(MoistureMeterSC；德尔芬技术公司，康涅狄格州斯坦福德市)来评估皮肤屏障功能。

统计学分析

将研究参与者作为整体组进行分析，然后细分为两组，痤疮组和无痤疮组。在基线、4周和8周时分析数据。将α设置为0.05并使用重复测量威尔科克森检验(repeatedmeasure Wilcoxon test)进行统计学分析。P值如果小于0.05，则被认为是显著的，而如果在0.05与0.2之间，则被报告为接近显著性。

测量结果

主要结果测量是评估益生菌是否可在益生菌补充4周后减少皮脂产生。次要结果测量包括肠道微生物组的变化、皮肤屏障生物物理特性的变化、皮肤微生物组的变化、以及血液脂质组变化的变化。

微生物组收集

在无菌条件下用无菌拭子擦拭鼻唇和眉间皮肤以在基线、第4周和第8周时收集样本用于微生物组分析。Copan-e拭子(480C)用于收集微生物组样品。将拭子收集到无菌无DNA酶的微量离心管中的300μL Copan-e缓冲液中，以使样品体积最小化。将拭子储存在-80℃下直至提取DNA。在每次访视时，均施加无创粘性毛孔清洁条(碧柔公司(Biore)，俄亥俄州辛辛那提市)和皮脂胶带(Cuderm，德克萨斯州达拉斯市)。

粪便取样

向受试者提供家用粪便收集套件。套件预期在第0周、第4周和第8周访视的24小时内完成。指示受试者将粪便保存在其家用冷冻室中，直到他们来访。粪便收集套件包括冰袋，以在运输时保持样品冷却。研究团队收集粪便样品后，将其保存在80℃冷冻室中直至进行处理。

微生物组分析

将粪便样品在冰上解冻，然后使用无菌刮刀将0.25±0.05g粪便材料转移到Qiagen PowerSoil(12888-100)珠管中。珠磨(bead beating)后，将样品在80℃加热杀灭3分钟，冷冻，然后解冻并用10mg/mL溶菌酶在42℃处理2h(此后添加C1)。在60μL而非100μL中洗脱DNA。除了在珠磨之前进行加热杀灭和溶菌酶步骤之外，皮肤拭子的处理方式相同。

扩增16S rRNA基因的V3V4区用于测序。粪便和皮肤样品的V3 F引物是相同的：

5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG。

对于粪便样品，使用先前公开的V4 R引物(Walters W.,Hyde E.R.,Berg-LyonsD.等人,“Improved Bacterial 16S rRNA Gene(V4 and V4-5)and Fungal InternalTranscribed Spacer Marker Gene Primers for Microbial Community Surveys[用于微生物群落调查的改进的细菌16S rRNA基因(V4和V4-5)和真菌内转录间隔标记基因引物],”mSystems[mSystems期刊](2016)1(1)1-10；将其通过引用并入本文)。V4 F皮肤微生物组特异性引物为：

5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。

使用Phusion高保真DNA聚合酶(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)F530L)制备文库：1U聚合酶、2mM MgCl2、5％DMSO、0.5μM各引物、0.2mM dNTP，最终反应体积为25μL。每次反应使用3μL粪便DNA或5μL拭子DNA。对于未产生条带的反应，用更多的DNA(对于粪便为5μL，而对于拭子为10μL)重试PCR。

PCR程序包括2min热启动(98℃)，随后是30个循环，98℃持续30s，62℃持续30s和72℃持续15s，最后在72℃延伸30s，然后在4℃下暂停。所有样品在凝胶上运行以确保PCR成功并使用Qubit荧光计系统量化。将样品送到加州大学伯克利分校进行条形编码和测序。在Illumina MiSeq平台上进行300个循环的配对末端测序。

在Qiime2中处理测序数据(Caporaso J.G.,Kuczynski J.,Stombaugh J.等人,“QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[QIIME允许分析高通量群落测序数据],”Nat.Methods[自然方法](2010)7:335-6，将其通过引用并入本文)。构建多种PCoA图，计算香农多样性(Shannon diversity)并按组别和处理方式进行比较，并且计算每个分类单元的t检验、倍数变化和Δ相对丰度并在组别/处理方式之间进行比较。可视化趋势，此外根据分类单元计算方差。对于使用Qiime2分类器未能良好分辨的大量OTU，构建系统发育以更好地放置它们并进一步解析或聚集OTU。从核糖体数据库项目(RDP)网站提取类型序列；MEGA7用于比对序列和构建系统发育(Cole J.R.,Wang Q.,Cardenas E等人,“The Ribosomal Database Project:improved alignments and newtools for rRNA analysis[核糖体数据库项目：用于rRNA分析的改进的比对和新工具],”Nucleic Acids Res.[核酸研究](2009)37:D141-5；Kumar S.,Stecher G.,Tamura K.,“MEGA7:Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0for BiggerDatasets[MEGA7：用于更大数据集的分子进化遗传学分析7.0版],”Mol.Biol.Evol.[分子生物学与进化](2016)33:1870-4；将这些文献中的每一个通过引用并入本文)。

短链脂肪酸(SCFA)量化

分离血浆SCFA并通过GC-MS量化为二甲基-叔丁基硅烷(DiMTBS)衍生物。具体地，将从含有EDTA的取样管和校准水溶液中分离的血浆样品(250μL)以及程序LC-MS水空白用5μL 5.24mM d3-乙酸盐和0.259mM d5-丙酸盐(CDN)富集，用15μL 6N盐酸酸化，并用1mLMTBE萃取。将样品以10,000rcf离心5min，并将0.5mL上清液用约100mg硫酸钠干燥10min。将100μL亚等分试样与15μL MTBSTFA+1％TBDMS(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)在50℃下孵育90min并允许在室温下静置过夜。然后用10μL 272μM 15:1n5甲酯内标富集样品。在配备有30m×0.25mm、0.25μm DB-5ms和5973N MSD的6890GC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉)上，使用1:10分流的2μL进样液、电子轰击电离和选择离子监测/全扫描质谱生成来分离残余物。GC参数：进样口-280℃；烘箱程序-100℃(保持2min)，35℃/min至280℃；载气-1.5mL/min氦气；总流量-19mL/min。获取数据并用MassHunter v B.08处理。针对d3-乙酸盐回收率进行乙酸盐校正，而针对d5-丙酸盐回收率进行丙酸盐和丁酸盐校正。

根据图10测试并评估短链脂肪酸(SCFA)水平。

研究结果：

皮肤生物物理特性

跟踪皮肤生物物理特性的变化以更好地评估皮肤屏障和皮脂生产率的变化。总体上，皮脂排泄率在安慰剂干预期间保持不变，但在益生菌干预后有接近显著性的降低(图1，p＝0.18)。当研究参与者按照痤疮患者和无痤疮患者进行分层时，在无痤疮组中，使用安慰剂或益生菌暴露的皮脂排泄率保持不变。然而，痤疮组的皮脂排泄率有更明显的下降，但在益生菌干预期间仍然仅接近显著性(图1，p＝0.125)，尽管在安慰剂干预期间没有变化。

当测量皮肤水合作用时，观察到益生菌组中脸颊上的总体水合作用增加接近显著性(图2，p＝0.18)，而在前额水合作用中或任何分层群体中均没有发现差异。在总体益生菌暴露后以及在对痤疮患者和无痤疮患者进行分层后，脸颊上的经表皮水分损失(TEWL)增加(图3)。总体群体的前额TEWL类似地增加，并且痤疮组中的增加接近显著性(p＝0.08)。

肠源性蛋白和TNF-α

为了理解安慰剂和益生菌干预可能如何影响炎症以及“肠漏”的概念，我们评估了基线时和干预治疗后几种蛋白质的血液水平。虽然肠源性标记在基线时没有升高，但在任何干预之前，痤疮组中的FABP-2水平相对于无痤疮组的升高接近显著性(图4，p＝0.088)。TNF-α的水平在痤疮患者和无痤疮患者中没有显著差异。

用安慰剂干预导致FABP-2(图5)、连蛋白(图6)或TNF-α(图8)没有变化。在安慰剂暴露期间痤疮患者中的LPS水平显著增加，但在无痤疮组中没有增加(图8，p<0.05)。暴露于益生菌导致LPS的归一化(图8)，而连蛋白和TNF-α的水平保持不变。益生菌暴露后FABP-2水平降低(p＝0.14)，而连蛋白水平呈增加趋势(p＝0.099)。

痤疮对益生菌干预的应答

在研究结束时，为了进一步研究皮脂相关的变化，评价痤疮患者的照片以评价其痤疮严重程度的变化。在安慰剂干预后损伤计数没有变化。然而，在服用益生菌4周后，总损伤计数和非炎性损伤计数显著减少(图9)。在益生菌暴露后炎性损伤计数的减少接近显著性(p＝0.054)。总体上，结果表明，使用益生菌4周后痤疮的客观量度得到改善。

肠道和皮肤微生物组的变化

我们首先评估肠道和皮肤微生物组的整体多样性的整体变化。在安慰剂或益生菌干预后，肠道和皮肤微生物组的香农多样性均未发生改变。

当评价肠道微生物组并按照痤疮受试者和无痤疮受试者进行分层时，虽然总体多样性没有改变，但出现了几种模式。

在对照(非痤疮)组中，在服用益生菌4周后，具有最大细菌变化的粪便细菌属包括拟普雷沃菌属(Alloprevotella)(增加42倍)、乳球菌属(增加17.8倍)、红螺菌目(Rhodospirillales)(增加11.1倍)和普雷沃菌属(Prevotella)(增加9.7倍)。最大相对丰度变化为阿克曼氏菌属(增加2.8倍)、普雷沃菌科NK3B31组(增加2.9倍)、乳杆菌属(减少13倍)、扭链[瘤胃球菌]([Ruminococcus]torques)组(减少3.5倍)和链球菌属(减少11.6倍)。

对痤疮组进行的亚分析显示，在服用益生菌4周后，具有最大细菌变化的粪便细菌属包括Selenomonadales属(增加16倍)、活泼[瘤胃球菌]组(增加14.9倍)、Erysipelatodostridium属(增加12.5倍)、Ruminidostridium属(减少7倍)、韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)(减少9倍)、丁酸球菌属(Butyricoccus)属(减少8.6倍)、瘤胃球菌属(减少10倍)和狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)(减少33.8倍)。最大相对丰度变化为链球菌属(增加6.2倍)、活泼[瘤胃球菌]组(增加14.8倍)、韦荣氏球菌属(Veilonella)(减少5.3倍)。

血液短链脂肪酸的变化

在基线时，发现痤疮患者具有较低的乙酸盐水平的趋势(p＝0.15)，而当比较血液丁酸盐和丙酸盐水平时没有发现变化(图10)。在益生菌补充后，总体上乙酸盐水平呈增加趋势(图10B，p＝0.13)且乙酸盐:丙酸盐的比率显著增加。对非痤疮组进行的亚分析显示，乙酸盐水平的增加接近显著性(图10D，p＝0.11)且乙酸盐:丙酸盐的比率增加(p＝0.05)。对痤疮组进行的亚分析显示，乙酸盐:丙酸盐的比率增加2.6倍，但该差异不具有统计学显著性(p＝0.33)。

讨论

研究表明，口服补充益生菌可能影响皮肤的皮脂水平及其生物物理特性。虽然长期以来一直在许多不同的传统(如印度医学(Ayurvedic medicine)和传统中医)中探索肠道-皮肤轴，但这项工作扩展了越来越多的文献，这些文献表明这种联系的临床证据。

一个意外的发现是，在所有招募的参与者中注意到的皮脂趋势更可能是由于患有非囊性痤疮的参与者内部的变化。痤疮改善的研究通常进行8-12周。然而，即使经过四周，在总损伤计数中也观察到37％的减少，这与另一项公开的针对痤疮的益生菌研究一致，其中作者显示四周后痤疮减少38％(Jung G.W.等人,2013)。因此，这里关于总损伤计数、非炎性损伤计数和炎性损伤计数的改善以及皮脂产生呈减少趋势的发现表明通过调节皮脂产生可调节痤疮。虽然皮脂变化的机制尚不清楚，但有必要进行未来的研究。虽然招募群体仅限于非囊性痤疮，但未来的研究应考虑招募和评估患有更严重的痤疮的那些。本研究的一个优点是我们使用安慰剂组，每个人都作为他们自己的对照以更好地分离益生菌的作用并减少个体间差异。

此处有几条“肠漏”的证据。当评估LPS时，在益生菌补充之前和之后没有总体变化。然而，痤疮亚群中的LPS在暴露于安慰剂时增加，并且在暴露于益生菌时归一化。FABP-2标记在痤疮患者中在基线时升高，在安慰剂暴露期间归一化，并且在痤疮亚群中随着益生菌暴露而呈下降趋势。虽然FABP-2已被报道为肠道通透性的标记，但它也参与脂肪酸转运和脂质吸收，并且高脂肪饮食可增加FABP-2的水平。因此，痤疮患者基线时FABP-2水平升高的趋势可代表在肠道水平上更高的脂肪摄入或对脂肪更高的敏感性。无论如何，在益生菌补充后FABP-2水平有降低的趋势，这表明益生菌可能在痤疮患者中具有FABP-2的归一化趋势，并且这与皮脂产生的减少和临床痤疮的改善相关联。总之，结果表明，在痤疮患者中LPS和FABP-2的变化可能存在“肠漏”的证据，并有早期证据表明可用益生菌暴露进行校正。然而，有必要进一步评估LPS和FABP-2的作用，并有必要在更大的研究中进行进一步评估。

注意到微生物组中的几个有趣的变化。首先，皮肤微生物组和肠道微生物组的多样性没有发生变化，尽管个别细菌仍有一些值得注意的变化。本研究中使用的益生菌(芽孢杆菌属物种)由通常在小肠中含量丰富的形成孢子的细菌组成。取样方法侧重于在结肠和直肠生物体中更丰富并且可能不反映小肠水平的多样性变化的粪便收集。

当评估个别细菌时，有几个显著的发现。在非痤疮群体中，益生菌补充导致阿克曼氏菌属的存在增加，并且这与先前用基于芽孢杆菌属的益生菌的补充研究一致。我们还注意到，乳球菌属和普雷沃菌属物种的丰度在非痤疮组中增加。据报道乳球菌属具有抗炎作用，而普雷沃菌属被认为是一种与复合纤维含量较高的非西方饮食有关的细菌。已知阿克曼氏菌属和普雷沃菌属都产生短链脂肪酸33，这反映出在补充益生菌后，血液乙酸盐水平和乙酸盐:丙酸盐的比率呈增加趋势。

在对痤疮参与进行的亚分析中，益生菌补充导致毛螺菌科和活泼[瘤胃球菌]组的存在增加以及丁酸球菌属物种的减少。活泼[瘤胃球菌]是毛螺菌科细菌和短链脂肪酸产生细菌的一部分，尤其是丙酸盐，其可具有抗炎作用。在痤疮患者中，注意到乙酸盐短链脂肪酸的血液水平呈相对降低的趋势。尽管不具有统计学显著性，但值得注意的是，在补充益生菌后，总体和非痤疮组中的乙酸盐:丙酸盐水平有所增加。痤疮组具有大的效应量，增加2.6倍，但没有达到统计学显著性。由于痤疮亚分析的效力不足，研究发现需要使用更大队列进行进一步研究。未来的研究应涉及扩大的群体，该群体侧重于痤疮参与者，以评估他们的脂质组和微生物组如何随着益生菌补充而变化。还不清楚在痤疮患者中肠道如何与皮肤沟通，但是短链脂肪酸仍然是值得进一步审查的候选物。

当考虑皮肤生物物理变化时，值得注意的是，在补充益生菌后，皮肤水合作用没有改变，但TEWL增加。这与皮脂产生呈减少的趋势相关联，并且可以反映出皮脂是减少TEWL的一个因素。参与者中没有任何被视为抱怨或客观记录的皮肤干燥或过敏的情况。

本研究存在一些局限性。本研究侧重于数量相对较少的痤疮受试者，而未来的研究将需要扩大痤疮队列。然而，本研究确实依赖于客观量度如总损伤计数，并且证实了先前对益生菌治疗痤疮的观察结果(Jung G.W.等人,2013)。此外，损伤计数与皮脂产生呈减少趋势相关，并进一步支持观察结果。第二个限制是粪便收集更能代表远端结肠微生物组，而非整个肠道的真正代表。这是大多数肠道微生物组分析的常见限制，但是本研究包括对肠源性标记和短链脂肪酸的血液水平的评价，这允许评估肠道的整体影响，而不仅仅是评估肠道微生物组。第三个限制是干预仅进行4周。然而，参与者在转向益生菌补充之前首先用安慰剂进行冲洗，并且每个人都作为他们自己的对照，这提高了研究的整体统计功效。未来的研究，尤其是对于痤疮，应该延长8或12周。最后，该研究没有为参与者制定任何饮食冲洗法(washout)或饮食指南，并且研究结果可能受到饮食的影响，因为这也可能影响肠道微生物组和短链脂肪酸的产生。然而，该研究利用每个人作为他们自己的对照，这控制了饮食的影响并加强了目前的研究发现。

总体上，发现益生菌补充改变了皮肤的生物物理特性，具有减少皮脂产生的趋势，尤其是在痤疮患者中。对痤疮患者的亚组分析显示，总损伤计数、非炎性损伤计数和炎性损伤计数得到改善。非痤疮群体的阿克曼氏菌属有所增加，而痤疮群体的毛螺菌科和活泼[瘤胃球菌]有所增加。尽管本研究保证了对益生菌的更多研究兴趣，但未来的研究将需要更好地描述益生菌在皮脂产生和调节痤疮中的作用。

除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中被单独描述一样。术语“约”的使用旨在描述在大约±10％范围内高于或低于所述值的值；在其他实施例中，这些值的范围可以在大约±5％的范围内高于或低于所述值；在其他实施例中，这些值的范围可以在大约±2％的范围内高于或低于所述值；在其他实施例中，这些值的范围可以在大约±1％的范围内高于或低于所述值。前述范围旨在通过上下文变得清楚，并未暗示进一步的限制。

除非另外定义，否则本文中的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但本文描述了优选的方法和材料。所引用的所有出版物、专利和专利公开出于所有目的均通过引用以其整体并入本文。

虽然在前述说明书中已经就本发明的某些实施例描述了本发明，并且出于说明的目的已经陈述了许多细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，本发明容许另外的实施例，并且可以在不偏离本发明的基本原理的情况下对本文描述的某些细节进行相当大的改变。

在不偏离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他具体形式体现，因此，应参考所附权利要求而非前述说明书来指示本发明的范围。

Claims (18)

1.一种调节有需要的人受试者的真皮和真皮下特性的方法，该方法包括以下步骤：

a.鉴定需要真皮或真皮下调节的人受试者；

b.向该人受试者施用有效量的基于孢子的益生菌组合物，该益生菌组合物包含菌株印度芽孢杆菌(HU36)、枯草芽孢杆菌(HU58)、凝结芽孢杆菌(SC-208)、克劳氏芽孢杆菌(SC-109)和地衣芽孢杆菌，每种菌株包含芽孢杆菌属孢子。

2.如权利要求1所述的方法，其中在人胃肠道中乙酸盐、丙酸盐或丁酸盐中的一种或多种有所增加。

3.如权利要求2所述的方法，其中在人胃肠道中乙酸盐与丙酸盐或丁酸盐的比率大幅增加。

4.如权利要求1所述的方法，其中该基于孢子的益生菌组合物以约1×10⁸至约1×10¹²个芽孢杆菌属孢子(CFU)的日剂量施用。

5.如权利要求4所述的方法，其中该基于孢子的益生菌组合物以约4×10⁹个芽孢杆菌属孢子(CFU)的日剂量施用。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述经调节的特性是增加皮肤水合作用、减少皱纹外观、减少皮脂含量、减少皮肤炎症、改变皮肤上的脂质组、改变皮肤微生物群以及减少痤疮损伤或酒渣鼻的出现和/或频率中的一种或多种。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述施用步骤是通过口服施用。

8.一种减少有需要的人受试者的痤疮损伤的出现和/或频率的方法，该方法包括以下步骤：

a.鉴定需要真皮或真皮下调节的人受试者；

b.向该人受试者施用有效量的基于孢子的益生菌组合物，该益生菌组合物包含菌株印度芽孢杆菌(HU36)、枯草芽孢杆菌(HU58)、凝结芽孢杆菌(SC-208)、克劳氏芽孢杆菌(SC-109)和地衣芽孢杆菌，每种菌株包含芽孢杆菌属孢子。

9.如权利要求8所述的方法，其中在人胃肠道中乙酸盐、丙酸盐或丁酸盐中的一种或多种有所增加。

10.如权利要求9所述的方法，其中在人胃肠道中乙酸盐与丙酸盐或丁酸盐的比率大幅增加。

11.如权利要求8所述的方法，其中该基于孢子的益生菌组合物以约1×10⁸至约1×10¹²个芽孢杆菌属孢子(CFU)的日剂量施用。

12.如权利要求11所述的方法，其中该基于孢子的益生菌组合物以约4×10⁹个芽孢杆菌属孢子(CFU)的日剂量施用。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述痤疮损伤的出现和/或频率是增加皮肤水合作用、减少皱纹外观、减少皮脂含量、减少皮肤炎症、改变皮肤上的脂质组、和改变皮肤微生物群中的一种或多种。

14.如权利要求8所述的方法，其中所述施用步骤是通过口服施用。

15.一种基于孢子的益生菌组合物，其包含菌株印度芽孢杆菌(HU36)、枯草芽孢杆菌(HU58)、凝结芽孢杆菌(SC-208)、克劳氏芽孢杆菌(SC-109)和地衣芽孢杆菌，每种菌株包含芽孢杆菌属孢子。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物是膳食补充剂。

17.如权利要求15所述的组合物，其中所述孢子是微囊化孢子。

18.如权利要求15所述的组合物，其进一步包含内体。

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