WO2010140140A1 - Composition de complexe prothrombique - Google Patents

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    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Definitions

  • the present invention relates to a process for preparing a prothrombin complex composition or concentrate comprising coagulation factors II,
  • the invention further provides a composition obtainable by this method.
  • vitamin K-dependent protein concentrates and, more particularly, prothrombin complex concentrates comprising the
  • Coagulation Factors II, VII, IX, and X are essential to prevent or treat hemorrhagic events in hemophiliac patients who suffer from a deficiency in one or more of the coagulation factors and / or who are suffering a deficit for some high molecular weight proteins.
  • PPSB concentrates such as Kaskadil® (from the French Fractionation and Biotechnology Laboratory) all include a significant proportion (approximately 80%) of contaminating proteins other than the component Factors II, VII, IX and X the PPSB.
  • the vitamin-K-dependent protein with the highest concentration is prothrombin or factor II (with a concentration of about 4.5 mg / ml for a total protein concentration in Kaskadil of about 35-45 mg / ml).
  • EP-A-0528701 (Association for the Development of Blood Transfusion) discloses a method for preparing human thrombin for therapeutic use and comprising successive steps of purifying a plasma cryoprecipitate supernatant on a DEAE resin Sephadex A50, for recalcification and viral inactivation of the eluate containing PPSB.
  • US-P-4411794 discloses a method for purifying coagulation factors II, VII, IX and X comprising a step of adsorbing a plasma precipitation supernatant with ammonium sulfate on a hydroxyapatite-type mineral support. in the presence of calcium ions, followed by a purification step on silica colloidal and dialysis.
  • the resulting PPSB concentrate contains many contaminating proteins and lacks the purity required to meet current safety criteria for blood products.
  • ammonium sulfate is not suitable for therapeutic use and has a relative toxicity.
  • US-P-4272523 discloses a method of plasma fractionation from a plasma cryoprecipitate supernatant.
  • this patent describes the preparation of a PPSB concentrate by combining the steps of adsorption of the cryoprecipitate supernatant on colloidal silica, dialysis / ultrafiltration, adsorption on tricalcium phosphate of the hydroxyapatite type, and adsorption on an exchange resin. anions of DEAE-Sephadex type.
  • colloidal silica purification step used to remove the high molecular weight proteins such as fibrinogen and the purification step on tricalcium phosphate proceed in the form of a batch adsorption (batch) , a form of implementation that, by its low reproducibility and difficulty of automation, is difficult to implement on an industrial scale.
  • tricalcium phosphate is difficult to control because it is in the form of powder sensitive to hygrometry and whose intrinsic characteristics may vary depending on the batch. The method of US-P-4272523 is therefore unsuitable for large scale preparation of PPSB concentrates for therapeutic use.
  • EP-A-0832200 discloses a method for purifying a recombinant FXI composition, comprising the successive stages of chromatography on anion exchange resin, on heparin resin and then on hydroxyapatite resin. This document does not relate to a prothrombin complex factor and the starting material is a composition of a recombinant factor and not of human origin.
  • WO2006 / 075664 discloses a method of purifying recombinant FVII comprising a step of chromatography on hydroxyapatite, without prior treatment of the composition containing the recombinant FVII.
  • the Applicant has surprisingly found that a method for purifying a protein concentrate dependent on vitamin K, in particular a prothrombin complex, combining the steps of preparing a plasma cryoprecipitate supernatant, a chromatography on an exchange resin and a anions and chromatography on hydroxyapatite makes it possible to prepare, industrially, a PPSB concentrate having a high degree of purity.
  • the PPSB prepared by the invention is substantially free of contaminating proteins and the factors II, VII, IX and X it contains have a high specific activity.
  • the process of the invention differs in particular from the purification methods known to date by the reduced number and the reproducibility of the purification steps carried out, and by the use of hydroxyapatite to chromatograph an eluate containing high proteins.
  • molecular weights such as fibrinogen, fibronectin, immunoglobulins, complement proteins.
  • the present invention provides a method for preparing a prothrombin complex composition comprising the steps of: a) providing a supernatant of a plasma cryoprecipitate, b) applying said supernatant to an anion exchange resin, and eluting into an eluate containing said complex and high molecular weight proteins, c) applying the eluate resulting from step b) on a hydroxyapatite column, d) eluting in an eluent containing said complex.
  • the method of the invention comprises an additional step of pre-elution c1), said pre-elution being preferably carried out at a pH of between 6.5 and 8.5, preferably about 8, with a phosphate buffer sodium or potassium phosphate, in particular at a concentration of 0.005 to 0.05M, advantageously from 0.01 to 0.05M, advantageously from 0.02 to 0.05M, and preferably 0.03M, said buffer also comprising 0.25 M NaCl
  • step d) is carried out with a potassium phosphate buffer preferably 0.5 M, 0.075 M NaCl, pH 8.
  • the method of the invention comprises at least one additional step of viral inactivation of the eluate resulting from step b) and / or from the eluate resulting from step d).
  • said at least one viral inactivation step is performed on the eluate resulting from step b) in the form of a solvent-detergent treatment, preferably in the presence of a Tween mixture ( polysorbate 80) -TnBP, preferably with a mixture polysorbate 80 1% (v / v) - TnBP 0.3% (v / v).
  • said at least one viral inactivation step is carried out in the form of a UV-C (Ultra Violet C) treatment, treatment with caprylate ions and / or by dry heating.
  • said at least one viral inactivation step is completed by a viral elimination step carried out on the eluate resulting from step d) in the form of a nanofiltration, for example one or more nanofiltration on one or more filter (s) with a porosity of, for example, between 15 nm and 100 nm.
  • a filter porosity for example 15nm, especially on a Planova 15N filter of Asahi.
  • the method of the invention comprises at least one additional diafiltration-ultrafiltration step after step b) and / or after step d).
  • step b) of the process of the invention comprises 2 substeps implemented on two different anion exchange resins.
  • the anion exchange resin of step b) has a positively charged group selected from diethylaminoethane (DEAE), polyethyleneimine (PEI) and quaternary aminoethane (QAE), said anions being preferably of the DEAE type.
  • DEAE diethylaminoethane
  • PEI polyethyleneimine
  • QAE quaternary aminoethane
  • the method of the invention comprises the addition of a thrombin inhibitor, preferably antithrombin III or a mixture of antithrombin III and heparin after step b) or after step d).
  • a thrombin inhibitor preferably antithrombin III or a mixture of antithrombin III and heparin after step b) or after step d).
  • composition prepared by the method of the invention further comprises other vitamin K-dependent proteins such as C, S and Z proteins.
  • the method according to the invention comprises a final additional formulation step, preferably by lyophilization and / or addition of pharmaceutically acceptable adjuvants or vehicles.
  • the present invention also relates to a prothrombin complex composition capable of being obtained by the method according to the invention, and whose concentration of immunoglobulins, and preferably IgM, is less than 0.1%, and / or whose fibrinogen concentration is less than 0.1%, and / or the fibronectin concentration is less than 0.1% and / or the concentration of complement factors is less than 0.1%.
  • the average specific activity of FIX in the prothrombin complex composition according to the invention is at least 4 IU per mg of protein.
  • the prothrombin complex composition according to the invention further comprises protein C, protein S and protein Z.
  • vitamin K-dependent proteins consisting of Factor II (FII), Factor VII (FVII), Factor IX
  • FIX Factor X
  • protein C protein S and protein Z of the prothrombin complex composition according to the invention represent at least 80%, preferably 85%, and more preferably 90%, total proteins of the composition.
  • the present invention also relates to the use of the prothrombin complex composition according to the invention as a medicament, preferably as a medicament for the treatment and prevention of hemorrhagic accidents related to vitamin K-dependent factor deficiency, or overdose of antivitamin K, or as a medicament for the treatment and prevention of hemorrhagic accidents related to a constitutional deficiency or acquired in factor II or factor X.
  • FIGURES Figure 1: elution yields in factors II, IX, VII and X as a function of the protein charge deposited on the hydroxyapatite column.
  • Figure 2 Quantity of factors II, IX, VII and X not retained on a column of hydroxyapatite as a function of the protein load introduced.
  • Figure 3 Variation of the percentage of unfixed FII and FIX as a function of the protein charge deposited on a column of hydroxyapatite.
  • FIG. 4 SDS-PAGE gel corresponding to the quantities of proteins eliminated during the pre-elution during chromatography on hydroxyapatite.
  • SDS gel PAGE 12% - Not reduced - deposits 10 ⁇ g of proteins, corresponding to the preeluates and eluates of the HA Biorad chromatography.
  • Wells 1 and 10 Molecular weight standards.
  • Well 2 PI-I.
  • Well 3 Trial 3 pre-eluted 0.25 M NaCl.
  • Well 4 Trial 3 eluate.
  • Well 5 Pre-eluting 0.25 M NaCl; 30 mM phosphate.
  • Well 6 Eluate test.
  • Well 7 PI-I.
  • Well 8 Pre-eluting trial 0.25 M NaCl; 30 mM phosphate.
  • Well 9 Eluate test 6.
  • Figure 5 Evolution of the filtration pressure as a function of time.
  • Figure 6 Evolution of the filtration rate according to the filtered weight.
  • Figure 7 SDS electrophoresis Page Novex 4 - 12% without reducer - colloidal blue colloid colomation.
  • Well 9 97 E 1601 - Final Retent 15 nm.
  • Well 10 Novex molecular weight indicator.
  • Figure 8 Characterization of factor IX by immunoblot.
  • Well 1 97 E 1106 - Eluat HA dialysis before nanofiltration.
  • Wells 2 and 3 97 E 1106 - PI-I.
  • Well 4 97 E 1504 - Filtrate 15 nm.
  • Well 5 HP IX Factor Indicator.
  • Factor IX HP is a "high purity" Factor IX, that is to say a Factor IX concentrate having a specific activity (expressed in units of FIX per mg of protein) greater than 100 U / mg.
  • the method of purifying proteins dependent on vitamin K and in particular prothrombin complex of the present invention comprises the following steps: a) providing a supernatant of a plasma cryoprecipitate.
  • the plasma cryprecipitate supernatant can be obtained by Cohn fractionation. In this particular case, it is necessary to avoid the denaturation of the proteins with ethanol and therefore to work at low temperature or to eliminate the alcohol before carrying out the adsorption of the proteins on hydroxyapatite.
  • the plasma cryprecipitate supernatant can be obtained by fractionation with ammonium sulfate salt. In this particular case, it is necessary to perform a dialysis in order to be in optimal conditions of adsorption on hydroxyapatite.
  • step b) applying said supernatant to an anion exchange resin, and eluting to an eluate containing said complex and high molecular weight proteins; c) applying the eluate resulting from step b) to a hydroxyapatite column; elute to an eluent containing said complex.
  • the high molecular weight proteins are those having a PM expressed in kDa greater than 300, preferably greater than 200, especially greater than 160, or even greater than 100.
  • the hydroxyapatite resin used in the invention may for example be ceramic-hydroxyapatite (ceramic HA), Biogel HT, etc.
  • the method of the invention comprises an additional step of pre-elution c1), said pre-elution preferably being carried out at ambient temperature with a 0.01 M potassium phosphate buffer, 0.25 M NaCl, pH 8. Or 0.03 M potassium phosphate buffer, 0.25 M NaCl, pH 8.0.
  • concentration of potassium phosphate of the pre-elution buffer preferably varies from 0.02 to 0.05M, and is preferably equal to 0.03M.
  • the pH of the pre-elution buffer preferably varies from pH 6.5 to pH 8.5, and is preferably equal to pH 8.
  • the elution of step d) is carried out with a 0.5 M potassium phosphate buffer, 0.075 M NaCl, pH 8.
  • the pH of the elution buffer preferably varies from pH 6.5 to pH 8.5, and is preferably equal to pH 8.
  • the concentration of potassium phosphate of the elution buffer preferably varies from 0.1 M to 0.5 M and is preferably equal to 0.25 M.
  • the high molecular weight contaminating proteins which are removed during the chromatography on hydroxyapatite comprise for example certain factors of complement (such as C4) which directly or indirectly reduce (eg after cleavage in the form of anaphylatoxins) the patient 's tolerance to commercially distributed prothrombin complex solutions to date.
  • C4 certain factors of complement
  • the Applicant has surprisingly found that the single hydroxyapat chromatography step allows you to remove most of the high molecular weight contaminating proteins contained in the plasma cryoprecipitate supernatant without the need for prior implementation such as purification. on colloidal silica, for example. It also eliminates proteins such as fibrinogen, fibronectin, Ig.
  • the chromatography on hydroxyapatite also makes it possible not to modify the respective proportion of the factors dependent on vitamin K during their purification, since the ratio between the factors II, VII, IX or X in the prothrombin complex concentrate obtained by the method of the invention is extremely comparable to that found in native plasma.
  • the prothrombin complex composition (vitamin K dependent protein concentrate) resulting from the hydroxyapatite chromatography is significantly enriched.
  • the content, relative to the protein content, of this composition or protein concentrate of the prothrombin complex is about 60%, preferably about 70%, and more preferably about 80%, and the specific activity factors II, VII, IX, X is significantly increased compared to commercially distributed prothrombin concentrates (from 4 to 8 times higher, preferably 5 times higher), such as for example Kaskadil®.
  • the method of the invention comprises at least one additional step of viral inactivation of the eluate resulting from step b) and / or the eluate resulting from step d).
  • the viral inactivation step performed on the eluate resulting from step b) corresponds to a solvent-detergent treatment, preferably in the presence of a Tween (polysorbate 80) -TnBP mixture, preferably by a polysorbate mixture 80% (v / v) - 0.3% TnBP (v / v).
  • said at least one viral inactivation step is carried out in the form of a UV-C (Ultra Violet C) treatment, treatment with caprylate ions and / or by dry heating.
  • the method of the invention may comprise a second viral elimination step carried out on the eluate resulting from step d) and corresponding to at least one nanofiltration, preferably at least on a 15nm porosity filter, preferably on a Planova 15N filter (Asahi). It is thus possible to eliminate enveloped and non-enveloped viruses.
  • the method of the invention may therefore comprise at least one viral inactivation step for virologically securing the final product which is intended for therapeutic administration.
  • a first step of viral inactivation by treatment with a solvent-detergent mixture and allowing to inactivate the enveloped viruses can be carried out at any stage of the process and, preferably after purification on anion exchange resin.
  • the solvent-detergent mixture used may correspond to any suitable mixture known to those skilled in the art and is preferably composed as indicated above.
  • the viral inactivation treatment with solvent-detergent is generally carried out for a period of a few hours (for example 7 hours), at a substantially ambient temperature (for example of 25 ⁇ 1 ° C.).
  • the method of the invention may also comprise at least one viral elimination step by nanofiltration on at least one filter of low porosity, for example on at least one porosity filter between 15 nm and 100 nm.
  • a nanofiltration step more particularly makes it possible to secure the final product with respect to non-enveloped viruses (virus of the poliovirus or parvovirus type) and unconventional transmissible agents (prion type).
  • the nanofiltration is carried out on at least one filter having a porosity of 15 nm, and preferably on at least one Planova 15N filter (Asahi).
  • the nanofiltration is carried out on at least two filters having a different porosity, preferably a decreasing porosity.
  • This nanofiltration is preferably carried out after chromatography on hydroxyapatite insofar as the presence of high concentrations of high molecular weight proteins (for example fibrinogen, fibronectin, or IgM) in the protein extract to be filtered generally leads to clogging of the filter, especially when the process is implemented on an industrial scale.
  • high molecular weight proteins for example fibrinogen, fibronectin, or IgM
  • the PPSB concentrate resulting from the process comprising the above - mentioned two viral inactivation steps is consistent with the international recommendations of the EMEA or the FDA for plasma and biotechnology products, as long as it meets both the security requirements for non-enveloped viruses and naked viruses.
  • the method of the invention comprises at least one additional diafiltration-ultrafiltration step after step b) and / or after step d).
  • the process of the invention comprises two sub-stages of chromatography on resin anion exchangers. There is then an additional step b2) of applying the eluate from step b) to a second anion exchange resin and eluting the vitamin K-dependent protein concentrate comprising high molecular weight proteins.
  • the second anion exchange resin is a DEAE-Sepharose type resin, and preferably DEAE-Sepharose FF (Amersham).
  • a DEAE-Sepharose resin has the advantage of being resistant to the pressure and to the soda treatment usually used to sanitize and regenerate the gel.
  • the method of the invention comprises a final additional formulation step, preferably by lyophilization and / or addition of pharmaceutically acceptable adjuvants or carriers.
  • the product obtained after formulation comprises 0.13M NaCl, arginine 2g / l, lysine 2g / l, sodium citrate 3 g / l, and has a pH of 6.9 to 7.1.
  • the product obtained after formulation comprises arginine 10g / l, mannitol 35g / l, and has a pH of 6.9 to 7.1.
  • the product obtained after formulation comprises mannitol 45 g / l and has a pH of 6.9 to 7.1.
  • the product obtained after formulation comprises sodium citrate 1 g / l, mannitol 35 g / l, and has a pH of 6, 9 to 7, 1.
  • the method of the invention comprises a step of adding a thrombin inhibitor, preferably antithrombin III or a mixture of antithrombin III and heparin.
  • a thrombin inhibitor preferably antithrombin III or a mixture of antithrombin III and heparin.
  • Antithrombin can be of human plasma origin or of recombinant human origin, such as for example Atryn®, commercially distributed by GTC Biotherapeutics.
  • This addition can be carried out after step b) and / or after step d).
  • the addition of the thrombin inhibitor is carried out after the solvent-detergent treatment of the eluate resulting from step b), or before nanofiltration of the eluate resulting from step d).
  • Heparin cofactor II can also be used as a thrombin inhibitor, in the same concentrations as those proposed for antithrombin.
  • a thrombin inhibitor advantageously makes it possible to prevent or limit the activation of prothrombin (FII) in thrombin during the purification steps carried out during the process of the invention.
  • FII prothrombin
  • the absence of thrombic activity in the vitamin K-dependent protein concentrate obtained by the process of the invention makes it compatible with use as a therapeutic or prophylactic medicinal product in humans and allows a satisfactory preservation of this concentrate.
  • the anion exchange resin of step b) of the process of the invention has a positively charged group selected from diethylaminoethane.
  • step b) makes it possible to eliminate a part (which may be important) of proteins constituted by albumin, immunoglobulins (with the exception, to a certain extent, of certain Igs such as IgM), antithrombin III, and alpha antitrypsin.
  • Plasma protein adsorbed onto the anion exchange resin is recovered by gradually increasing the ionic strength.
  • the vitamin K dependent proteins obtained following step d) can then be purified independently by techniques well known to those skilled in the art, for example on an affinity gel.
  • the present invention also relates to the prothrombin factor concentrate (vitamin K-dependent proteins obtainable by the method described above.)
  • This protein concentrate preferably comprises the factors II, VII, IX and X, and has a IgM concentration less than 0.1%
  • the concentrate of the invention also comprises the C, S and Z proteins, and has a FIX average specific activity of at least 4 IU per mg of protein.
  • the present invention finally relates to the use of the prothrombin factor concentrate obtainable by the method of the invention as a medicament, and more particularly as a medicament for the treatment and the prevention of hemorrhagic accidents related to the deficit in dependent factors.
  • vitamin K such as constitutional deficiency of factor II or factor X, or overdose of vitamin K antagonist.
  • a plasma cryoprecipitate supernatant obtained by freeze-thawing and centrifugation at 0 ° -30 ° C. of fresh frozen plasma is used as starting material.
  • Cryoprecipitation is performed upstream of the plasma fractionation, at a temperature below 2 ° C, in order to separate the insoluble cryoprecipitate at a temperature below 4 °, mainly composed of Factor VIII, fibronectin and fibrinogen.
  • cryosurnagen The centrifugation supernatant is called cryosurnagen.
  • Cryosulders contain primarily albumin, immunoglobulins and other coagulation factors including vitamin D-dependent factors, Prothrombin (Factor II), Factor VII, Factor IX, Factor X, Protein C , Protein S and Protein Z.
  • the next step is to prepare a vitamin K-dependent factor-enriched fraction after adsorption on a weak anion exchange gel, DEAE Sephadex A-50 (diethylaminoethyl Sephadex).
  • the volume of purified cryosurnant is typically 2000 to 3000 liters. About 1.5 g of dry DEAE-Sephadex is used per liter of purified cryosurnant.
  • the DEAE-Sephadex powder Prior to purification, the DEAE-Sephadex powder is swollen (3 washes), with sieving of the gel on stainless steel cloth after each washing. Preparation, swelling and equilibration of the DEAE-Sephadex are carried out in a 0.075 M sodium chloride solution in a container equipped with a stirring blade and a bottom grid (sieve) which can leave escape the liquid but retaining the DEAE-Sephadex beads.
  • the swelling operation of DEAE-Sephadex is carried out at room temperature (15-25 ° C).
  • Final balancing of the gel is controlled by measuring the osmolarity of the effluent.
  • the cryosourcing at a preferred temperature of 17 +/- 1 ° C is sent continuously on the inflated and balanced DEAE-Sephadex, at a rate of 400 kg per hour after balancing the feed rates.
  • the entire cryosurnant is thus brought into contact with the DEAE-Sephadex with continuous stirring, allowing the continuous fixing of the vitamin K-dependent factors on the gel.
  • the gel is then washed three times with a buffer containing 0.2M NaCl, 10 mM citric acid, at pH 7, with 140 l of buffer per 2200 liters of purified cryosurnant.
  • the protein eluate resulting from purification on DEAE-Sephadex will be named "PPSB Intermediate Product 1" or "PPSB-PI-I” in the context of the present application.
  • PPSB-PI-I is then subjected to viral inactivation by treatment with a solvent-detergent mixture, and more specifically by treatment with polysorbate 80 (1% v / v) - Tri n-Butyl Phosphate (TnBP)
  • the viral inactivation treatment is carried out for a period of at least 6 hours at a temperature of 24 to 25 ° C.
  • detergents can be used as an alternative to polysorbate, such as cholate or octoxynol (Triton X100) at concentrations ranging from 0.5 to 2%, in the presence of TNBP, at a temperature of 15 to 30 0 C but preferably around 25 ° C.
  • the minimum incubation time for viral inactivation is 4 hours, but this incubation may be up to 12 hours.
  • the pH values generally applied range from 6 to 8 and the total protein concentration from 10 to 40 g / l.
  • the chromatography gel used is Macro prep ceramic hydroxyapatite (Biorad), having a particle size of 40 microns.
  • the dry gel is suspended in a 0.4 M phosphate buffer pH 6.8, then transferred to a Pharmacia K50 / 30 column.
  • the package is carried out at a flow rate of 100 cm / h.
  • the amount used is 30 g of dry gel, which provides a 50 ml column of packaged gel.
  • the column is rinsed with 5 column volumes of 2 M NaOH and stored in 2M NaOH. D.2 - Preparation of PPSB-PI-I to be injected on the column
  • PPSB-PI-I is, if necessary, thawed and virally inactivated for 3 hours in the presence of 1% polysorbate 80 and 0.3% TnBP.
  • the virally inactivated PPSB-PI-I is then half-diluted, optionally with a 20 mM benzamidine solution; and the pH of the solution is adjusted to 8 with 0.1M NaOH.
  • the column is connected to a U. V Pharmacia detector equipped with an industrial detection cell, and the optical density of the effluent is recorded at 280 nm.
  • the gel stored in 2M NaOH is washed with 5 volumes of pre-equilibration buffer (0.4 M potassium phosphate, pH 6.8).
  • the pre-elution is carried out at the same flow rate with a pre-elution buffer (0.01 M potassium phosphate, 0.25 M NaCl, 10 mM benzamidine, pH 8 or 0.03 M potassium phosphate, 0.25 M NaCl, benzamidine 10 mM (optional) pH 8) and 5 pre-eluate column volumes are collected.
  • the gel is then washed with 15 volumes of the same buffer.
  • Elution was performed at the same flow rate with an elution buffer (0.5 M potassium phosphate, 0.075 M NaCl, 10 mM benzamidine (optional), pH 8) and 5 eluate column volumes were collected.
  • the gel is regenerated with 5 column volumes of 2M NaOH and stored in 2M NaOH.
  • the eluate resulting from the chromatography on hydroxyapatite is subjected to ultrafiltration carried out on a Sartorius ultraart slice polysulfone cassette of 0.1 m 2 and 10 kD cutoff threshold.
  • the eluate is concentrated 3 times and dialyzed at constant volume against water ppi (purified for injection) until a resistivity of 70 ohms (the inlet pressure on the cassette is 0.5 bar and the flow ultrafiltration rate is 45 ml / min), followed by constant volume dialysis against 5 volumes of dialysis buffer (trisodium citrate 3 g / l, 0.13 M NaCl, lysine 2 g / l, arginine 2 g / l; 7).
  • the product is then reconcentrated twice and the cassette is rinsed with the dialysis buffer so as to obtain a final volume equal to 80% of the initial volume.
  • the product is finally frozen and stored at -40 ° C., and may optionally be subsequently filtered through a porosity filter of 15 nm.
  • FII Coagulation Factor II
  • FVII Factor VII
  • FIX Factor IX
  • FX Factor X
  • the capacity of the hydroxyapatite column was tested with doses of 3, 5, 7 and 9 ml of virally inactivated PPSB-PI-I per ml of gel, under the same experimental conditions as those described above. There was no pre-release.
  • the calculated yield for each factor is the ratio of the total amount of coagulant units in the resulting hydroxyapatite eluate to the total amount of coagulant units in the PPSB-PI-I.
  • the yields obtained as a function of the load are detailed in the following Table I:
  • the percentage of non-fixed factor calculated for each factor corresponds to the ratio of the total amount of coagulating units in the fraction not fixed at the total amount of coagulant units in the starting PPSB-PI-I.
  • the percentages of unfixed factor are summarized in Table II.
  • Table II Quantity of factors II, IX, VII and X not retained on the gel as a function of the load.
  • Figure 3 also shows that for these two factors (FII and FX), the percentage of unfixed factor varies linearly with the load.
  • the charge of 5 ml of PPSB-PI-I per ml of gel for which the fixing of FII and FX is still acceptable has been retained.
  • a pre-elution with a 30 mM phosphate buffer was tested.
  • Such a pre-elution is preferably carried out with a phosphate buffer.
  • the operating conditions are identical to those described above and the protein load used is 5 ml of PPSB-PI-I per ml of gel.
  • Table III Quantity of factors II, IX, VII and X in the eluate as a function of the type of pre-elution carried out.
  • Pre-elution performed with a 30 mM phosphate buffer also makes it possible to eliminate a large number of accompanying proteins and in particular high molecular weight proteins (100 to 200 kD) as shown by the SDS PAGE gel (see FIG. 4).
  • the purified antithrombin is added to the hydroxyapatite chromatography eluate before ultrafiltration at a concentration of 0.5 U / ml (preferably at a concentration of 0.1 to 0.04 units of antithrombin per unit of FIX) and heparin at 2 U / ml.
  • the experimental conditions are the same as those described above, with a pre-elution in 3OmM phosphate buffer.
  • the column charge was 5 ml of PPSB per ml of gel.
  • the tests carried out are reproducible between them and the thrombic activities measured at 6 and 24 h are practically nil, and are therefore compatible for a subsequent therapeutic use of vitamin K-dependent protein concentrate (a thrombic activity of 6 hours). More corresponds to very small amounts of thrombin, well below 0.001 NIH unit).
  • the yields are of the order of 70 5 for factors II and IX and of the order of 60 and 64 on average for factors VII and X.
  • Table VII Yields in factors II, IX, VII and X after ultrafiltration of the eluate resulting from the hydroxyapatite
  • the binding of vitamin K-dependent coagulation factors appears more specific on calcium phosphate-based surfaces (of the hydroxyapatite type) compared to the ion-exchange gel, which explains the purity of the product obtained.
  • Analysis of the proteins recovered after elution on a hydroxyapatite gel shows that the proteins included in the protein concentrate of interest have a molecular weight of between 75 and 50 kDa, which corresponds to the molecular weight of the proteins dependent on vitamin K, and in particular the molecular weight of the various coagulation factors making up the prothrombin complex.
  • Table IX below lists the proteins present in a protein concentrate obtained by purification on an anion exchange resin after viral inactivation (and instead of the purification on hydroxyapatite of the invention). It should be noted that in such a concentrate, the sum of the vitamin K-dependent proteins (FII, FVII, FIX, FX, protein C, protein S, protein Z) represents 17% of the total proteins.
  • Table IX List and relative proportions of proteins present in a concentrate resulting from a single purification on an anion exchange resin or purification comprising a first anion exchange resin and a second anion exchange resin replacing the anion exchange resin.
  • the protein concentrate resulting from the process of the invention and obtained in particular after the chromatography step on hydroxyapatite contains a proportion of proteins dependent on vitamin K (FII, FVII, FIX, FX, protein C, protein S, protein Z) of the order of 90 to 95% of the total proteins.
  • the concentrate resulting from this chromatography on hydroxyapatite has a specific activity increased by 5 to 7 times relative to the intermediate product 1 resulting from the chromatography on anion exchange resin. Additional measurements also show that chromatography on hydroxyapatite also makes it possible to effectively eliminate polysorbate 80 and TnBP used during the viral inactivation step.
  • the filters used are Planova 15 N (Asahi) reference filters.
  • the filters used are composed of hollow fibers of hydrophilic cupro ammonium cellulose, the nominal pore size of which is 15 ⁇ 2 nm.
  • the equilibration buffer of the filters consists of 0.13M sodium chloride, Tri Sodium Citrate 2H 2 O 3g / l, Lysine HCl 2g / l, Arginine HCl 2g / l and water ppi (purified for injection).
  • the buffer is adjusted to pH 7.0 ⁇ 0.05, at a resistivity of 75 ⁇ .cm, and to an osmolality of 314 mosmol / Kg H 2 O, at a temperature of 20 to 25 ° C.
  • the filters are prepared individually, rinsed in ppi water under a pressure of the order of 500 mbar. The integrity of the filter is checked before use after rinsing with water ppi. The performance of the air leak test or "Leakage test”, checks the absence of air passage through the fibers in the outer jacket under an air pressure of 1000 ⁇ 50 mBar. (SOP of Integrity Test for Asahi Planova Filters). Before filtration of the solution, the filter is equilibrated using the formulation buffer.
  • the formulation buffer consists of 0.13M NaCl, arginine 2g / l, lysine 2g / l, sodium citrate 3g / l, and has a pH of 6.9 to 7.1.
  • the formulation buffer consists of 10 g / l arginine, 35 g / l mannitol and a pH of 6.9 to 7.1. In another embodiment, the formulation buffer consists of 45 g / l mannitol and has a pH of 6.9 to 7.1. In another embodiment, the formulation buffer is composed of 1 g / l sodium citrate, 35 g / l mannitol and has a pH of 6.8 to 7.1. The pH and resistivity of the 15 nm filtrate are controlled (pH 7.0 ⁇ 0.1 - Osmolality 314 ⁇ 10 mOsmol / Kg H 2 O).
  • An eluate bottle resulting from the purification on ceramic hydroxyapatite described above and optionally dialyzed is thawed in a water bath at 37 ° C.
  • Prefiltration is optionally carried out on a 0.2 ⁇ m tri-acetate cellulose filter (Sartolab P - Sartorius) before filtration on the 15 nm Planova 15N filter.
  • the filtration of the eluate is carried out under a constant compressed air pressure of 500 ⁇ 50 mbar.
  • the pressure measurement is performed at the input of the filter of
  • an air leakage test (“leakage test”) is performed after filling the outer jacket of the filter to control the integrity of the membrane and to validate the filtration step.
  • Filtration pressure was maintained at an average of 500 ⁇ 100 mBar during the filtration tests (see Figure 5).
  • the final filtration rate must be greater than 10% of the initial flow rate.
  • the filter is considered to be clogged, especially for smaller diameter pores.
  • a continuation of filtration could indeed favor the passage of potential viruses through the larger pores of the membrane.
  • the average duration of filtration is of the order of 2 hours.
  • the average volumetric capacity is of the order of 10 1 / m 2 of membrane, which corresponds to a capacity of approximately 47.9 ⁇ 4.7 g of proteins per m 2 .
  • the tests are made from raw materials from different batches which prove to be perfectly reproducible.
  • the ceramic hydroxyapatite chromatography step provides good recovery for all of the vitamin K dependent factors. It is noted that the concentrations before and after nanofiltration over 15 nm are very close, thus demonstrating a high nanofiltration efficiency of the four factors. coagulation. Table XV: Evolution of specific activity during nanofiltration 15 nm
  • the specific activities determined for all coagulation factors are of the same order for all tests carried out before and after nanofiltration.
  • the specific activity determined with respect to factor IX is greater than 5 for all the tests carried out.
  • the determination of the thrombic activity is performed on an automatic apparatus detecting the appearance of a clot by means of the sample.
  • protease activities was carried out spectrophotometrically using specific chromogenic substrates.
  • the hydrolysis of a specific chromogenic substrate by a protease is accompanied by the release of a yellow molecule detected at 405 nm, whose rate of appearance is proportional to the concentration of the enzyme of the solution. tested.
  • Table XVII Determination of thrombic activity with chromogenic substrate S 2238
  • Substrate S2238 is a specific substrate for thrombin. It is noted that in the absence of inhibitor, residual thrombin-like activity is observed in all the samples tested. This activity is substantially inhibited by the addition of the thrombin inhibitor 2581 and equivalently in the presence of a mixture of Antithrombin III (AT-III) and heparin. Thrombin can therefore be effectively neutralized by its physiological inhibitor AT-III in the presence of heparin.
  • AT-III Antithrombin III
  • the residual thrombic activity measured by the thrombic activity test with the chromogenic substrate corresponds to an activity of less than 0.01 IU / ml in the 15 nm filtrates.
  • the major band at 66 kDa corresponds essentially to prothrombin which alone accounts for about 60% of the total proteins of the protein concentrate.
  • An immunoblot is carried out after electrophoresis on homogeneous SDS gel without reducing agent. After transfer to nitrocellulose and saturation with albumin, contact with a monoclonal anti-factor IX primary antibody (Sigma Ref F1020) is carried out. Labeling with a secondary anti - mouse antibody labeled with peroxidase (BioRad) is carried out before revelation by ECL technique on autoradiography film (Pierce). The results are shown in FIG. 8. The presence of non-specific bands in the wells corresponding to PI-I is observed.
  • the dialyzed eluate from the ceramic hydroxyapatite column has only one homogeneous band. There is also no visible difference after nanofiltration 15 nm, nor with the factor IX HP used as a control.
  • the average volumetric capacity of the filter is of the order of 10 1 / m 2 of membrane, which corresponds to an average capacity of
  • the specific activity for the different factors is of the same order before and after nanofiltration.
  • Formulation a 0.13 M NaCl - 0.010 M Sodium Citrate, 2.0 g / L Lysine HCl, 2.0 g / L Arginine HCl, pH 7.0 ⁇ 0.1
  • Formulation b 0.13 M NaCl , 0.010 M Sodium citrate, pH 7.0 ⁇ 0.1
  • test 97E1806 50 mM benzamidine was added to the buffers and heparin 2UI / ml was added before the 15 nm nanofiltration step.
  • the protein concentrate resulting from the nanofiltration on 0 15 nm porosity filter does not exhibit any thrombic activity.
  • test 97E1007 heparin 5 IU / ml and AT-III 2 U / ml were added at the time of treatment Detergent Solvent and before the chromatography step on hydroxyapatite, a good filterability of 12.5 l / m 2 and no coagulation (and therefore thrombic activity) are observed.
  • tests 97E2312 and 97E3012 heparin 2 IU / ml and AT-III 0.5 IU / ml are added directly to the eluate resulting from the chromatography on hydroxyapatite before the ultrafiltration step. The protein concentrate resulting from nanofiltration on filter of porosity 15 nm does not exhibit thrombic activity.
  • Antithrombin III is therefore a good inhibitor of the thrombic activity of the protein concentrate containing the prothrombin complex of the invention. Heparin also appears to act as a cofactor of AT-III and potentiate the inhibitory activity of AT-III. The best efficiency of antithrombin is thus obtained when it is added to the hydroxyapatite chromatography eluate. It appears that antithrombin binds only very little to hydroxyapatite.
  • Table XIX show that the chromatography on ceramic hydroxyapatite carried out in the context of the process of the present invention makes it possible to obtain a purification rate of the vitamin K-dependent proteins which is very much greater than that which would be obtained with the use of a second anion exchange resin to replace the hydroxyapatite of the invention.
  • the set of factors dependent on vitamin K represent 70 to 80% of the total protein for the nanofiltered concentrate obtained by the pork of the present invention, against only 15 to 17% for a concentrate that would be produced using a second anion exchange resin to replace the hydroxyapatite.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition ou concentré de complexe prothrombique comprenant les facteurs de coagulation II, VII, IX et X, ledit procédé comprenant les étapes consistant à fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma, à appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d' anions pour obtenir un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire et à appliquer ledit éluat sur une colonne d' hydroxyapatite pour obtenir un second éluat contenant ledit complexe. L' invention fournit encore une composition susceptible d'être obtenue par ce procédé.

Description

COMPOSITION DE COMPLEXE PROTHROMBIQUE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition ou concentré de complexe prothrombique comprenant les facteurs de coagulation II,
VII, IX et X. L'invention fournit encore une composition susceptible d'être obtenue par ce procédé.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La mise à disposition de concentrés de protéines dépendantes de la vitamine K et, plus particulièrement, de concentrés de complexe prothrombique comprenant les
Facteurs de coagulation II, VII, IX et X (également appelé PPSB) est primordiale pour prévenir ou traiter les accidents hémorragiques chez les patients hémophiles qui souffrent d'un déficit en l'un ou plusieurs des facteurs de la coagulation et/ou qui souffrent d'un déficit pour certaines protéines de haut poids moléculaires.
Lors d'un épisode hémorragique, les patients sont soumis à un traitement par le PPSB et reçoivent par conséquent des doses importantes de protéines plasmatiques usuellement co-purifiées avec le PPSB, qui peuvent entraîner l'apparition d'effets secondaires tels que des chocs anaphylactiques, des réactions de type inflammatoire et des problèmes de tolérance. C'est notamment le cas avec les Immunoglobulines M et les facteurs C3a, C4a ou C5a, également appelés anaphylatoxines, qui résultent de l'activation des facteurs C3, C4, C5. Les facteurs C3a, C4a et C5a (particulièrement le C3a) sont impliqués dans l'inflammation allergique. L'activation des mastocytes et des basophiles par les fragments C5a et C3a du complément entraîne en effet la libération de leucotriènes et d'histamine, à l'origine d'une augmentation de la perméabilité capillaire, d'une bronchoconstriction et d'une vasodilatation.
Afin d'éviter la formation de ces fragments au cours du procédé de purification des facteurs vitamine-K dépendant, il est donc préférable d'éliminer leur précurseurs respectifs à savoir les facteurs C3, C4 ou C5 du système du complément.
Les concentrés de PPSB disponibles commercialement à ce jour, tels que le Kaskadil® (du Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies) comprennent tous une proportion importante (environ 80%) de protéines contaminantes autres que les Facteurs II, VII, IX et X composant le PPSB. La protéine vitamine-K-dépendant dont la concentration est la plus importante est la prothrombine ou facteur II (avec une concentration de l'ordre de 4,5 mg/ml pour une concentration de protéines totales dans le Kaskadil d'environ 35-45 mg/ml).
II existe par conséquent un besoin important pour un procédé autorisant un plus haut degré de purification du PPSB, et susceptible de préserver l'activité et la proportion respective des Facteurs II, VII, IX et X qui le composent.
Le document EP-A-0528701 (Association pour l'essor de la transfusion sanguine) décrit un procédé de préparation de thrombine humaine destiné à un usage thérapeutique et comprenant des étapes successives de purification d'un surnageant de cryoprécipité de plasma sur une résine DEAE-Sephadex® A50, de recalcification et d' inactivation virale de l'éluat contenant le PPSB.
Le document US-P-4411794 décrit un procédé de purification des facteurs de coagulation II, VII, IX et X comprenant une étape d'adsorption d'un surnageant de précipitation du plasma avec du sulfate d'ammonium sur un support minéral de type hydroxyapatite en présence d' ions calcium, suivie d'une étape de purification sur silice colloïdale et d'une dialyse. Il apparaît toutefois que le concentré de PPSB qui en résulte comprend de nombreuses protéines contaminantes et ne possède pas le degré de pureté requis pour répondre aux critères actuels en matière de sécurité sanitaire des produits dérivés du sang. Le sulfate d' amonium n'est en particulier pas adapté à une utilisation thérapeutique et présente une toxicité relative.
Le document US-P-4272523 décrit un procédé de fractionnement du plasma à partir d'un surnageant de cryoprécipité de plasma. Ce brevet décrit notamment la préparation d'un concentré de PPSB en cumulant les étapes d' adsorption du surnageant de cryoprécipité sur silice colloïdale, de dialyse/ultrafiltration, d' adsorption sur phosphate tricalcique de type hydroxyapatite, et d' adsorption sur résine échangeuse d' anions de type DEAE- Sephadex. Il apparaît toutefois que l'étape de purification sur silice colloïdale utilisée pour éliminer les protéines de haut poids moléculaire telles que le fibrinogène et que l'étape de purification sur phosphate tricalcique se déroulent sous la forme d'une adsorption par lot (en batch) , une forme de mise en œuvre qui, par sa faible reproductibilité et sa difficulté d'automatisation, se révèle difficile à mettre en œuvre à une échelle industrielle. En effet le phosphate tricalcique est difficilement maîtrisable car il se présente sous forme de poudre sensible à l'hygrométrie et dont les caractéristiques intrinsèques peuvent varier en fonction des lots. Le procédé du document US-P-4272523 s'avère donc inadapté pour la préparation à grande échelle de concentrés de PPSB destinés à un usage thérapeutique .
Le document EP-A-0832200 décrit un procédé de purification d'une composition de FXI recombinant, comprenant les étapes successives de chromatographie sur résine échangeuse d' anions, sur résine héparine puis sur résine hydroxyapatite. Ce document n'a pas trait à un facteur du complexe prothrombique et le produit de départ est une composition d'un facteur recombinant et non d'origine humaine.
Le document WO2006/075664 décrit un procédé de purification de FVII recombinant comprenant une étape de chromatographie sur hydroxyapatite, sans traitement préalable de la composition contenant le FVII recombinant .
RESUME DE L'INVENTION
Le demandeur a trouvé de manière surprenante qu'un procédé de purification d'un concentré de protéines dépendantes de la vitamine K, notamment complexe prothrombique, combinant les étapes de préparation d'un surnageant de cryoprécipité de plasma, de chromatographie sur résine échangeuse d' anions et de chromatographie sur hydroxyapatite permet de préparer, de manière industrielle, un concentré de PPSB présentant un haut degré de pureté. Le PPSB préparé par l'invention est sensiblement dépourvu de protéines contaminantes et les facteurs II, VII, IX et X qu'il contient présentent une activité spécifique élevée. Le procédé de l'invention se distingue tout particulièrement des procédés de purification connus à ce jour par le nombre réduit et la reproductibilité des étapes de purification mises en œuvre, et par l'utilisation d' hydroxyapatite pour chromatographier un éluat contenant des protéines de haut poids moléculaire telles que fibrinogène, fibronectine, immunoglobulines, protéines du complément.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition de complexe prothrombique comprenant les étapes suivantes : a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma, b) appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d' anions, et éluer en un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire, c) appliquer l'éluat résultant de l'étape b) sur une colonne d' hydroxyapatite, d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape additionnelle de préélution cl), ladite préélution étant de préférence effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de préférence environ 8, avec un tampon phosphate de sodium ou phosphate de potassium, notamment en une concentration de 0,005 à 0,05M, avantageusement de 0,01 à 0,05M, avantageusement de 0,02 à 0,05M, et de manière préférée 0,03M, ledit tampon comprenant également du NaCl 0,25 M.
Plus préférablement, l'élution de l'étape d) est réalisée avec un tampon phosphate de potassium de préférence 0,5 M, NaCl 0,075 M, pH 8.
Avantageusement, le procédé de l'invention comprend au moins une étape additionnelle d' inactivation virale de l'éluat résultant de l'étape b) et/ou de l'éluat résultant de l'étape d) . Dans un mode de réalisation préféré, ladite au moins une étape d' inactivation virale est effectuée sur l'éluat résultant de l'étape b) sous la forme d'un traitement solvant-détergent, de préférence en présence d'un mélange Tween (polysorbate 8O)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1% (v/v) - TnBP 0,3% (v/v). Dans un mode de réalisation particulier, ladite au moins une étape d' inactivation virale est effectuée sous la forme d'un traitement UV-C (Ultra Violet C) , traitement avec des ions caprylate et/ou par chauffage à sec. Avantageusement, ladite au moins une étape d' inactivation virale est complétée par une étape d'élimination virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape d) sous la forme d'une nanofiltration, par exemple une ou plusieurs nanofiltrations sur un ou plusieurs filtre (s) de porosité comprise par exemple entre 15nm et lOOnm. De préférence sur au moins un filtre de porosité par exemple de 15nm, notamment sur un filtre Planova 15N de Asahi .
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend au moins une étape additionnelle de diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou après l'étape d) .
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) du procédé de l'invention comprend 2 sous-étapes mises en œuvre sur deux résines échangeuses d' anions distinctes.
Dans un mode de réalisation particulier, la résine échangeuse d' anions de l'étape b) possède un groupe chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane (DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l' aminoéthane quaternaire (QAE), ladite résine échangeuse d' anions étant de préférence du type DEAE.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend l'addition d'un inhibiteur de la thrombine, de préférence l' antithrombine III ou d'un mélange d' antithrombine III et d'héparine après l'étape b) ou après l'étape d) .
Dans un mode de réalisation, la composition préparée par le procédé de l'invention comprend en outre d'autres protéines dépendantes de la vitamine K tel que les protéines C, S et Z .
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend une étape additionnelle finale de formulation, de préférence par lyophilisation et/ou addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention concerne également une composition de complexe prothrombique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, et dont la concentration en Immunoglobulines, et de préférence en IgM, est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibrinogène est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibronectine est inférieure à 0,1 % et/ou dont la concentration en facteurs du complément est inférieure à 0,1 %.
Dans un mode de réalisation particulier, l'activité spécifique moyenne du FIX dans la composition de complexe prothrombique selon l'invention est d'au moins 4 UI par mg de protéines.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition de complexe prothrombique selon l'invention comprend en outre la protéine C, la protéine S et la protéine Z.
Dans un mode de réalisation particulier, les protéines dépendantes de la vitamine K, constituées par le Facteur II (FII), le Facteur VII (FVII), le Facteur IX
(FIX) , le Facteur X (FX) , la protéine C, la protéine S et la protéine Z de la composition de complexe prothrombique selon l'invention représentent au minimum 80 %, de préférence 85%, et plus préférablement 90%, des protéines totales de la composition.
La présente invention concerne également l'utilisation de la composition de complexe prothrombique selon l'invention comme médicament, préférablement comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs dépendants de la vitamine K, ou au surdosage en antivitamine K, ou comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés à un déficit constitutionnel ou acquis en facteur II ou en facteur X.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Rendements d'élution en facteurs II, IX, VII et X en fonction de la charge protéique déposée sur la colonne d' hydroxyapatite . Figure 2 : Quantité de facteurs II, IX, VII et X non retenus sur colonne d' hydroxyapatite en fonction de la charge protéique introduite.
Figure 3 : Variation du pourcentage de FII et de FIX non fixé en fonction de la charge protéique déposée sur colonne d' hydroxyapatite .
Figure 4 : Gel SDS-PAGE correspondant aux quantités de protéines éliminées au cours de la préélution lors de la chromatographie sur hydroxyapatite. gel SDS PAGE 12 % - Non réduit - dépôts : 10 μg de protéines, correspondant aux Prééluats et éluats de la chromatographie sur HA Biorad. Puits 1 et 10 : Standards de poids moléculaires. Puits 2 : PI-I. Puits 3 : Essai 3 prééluat 0,25 M NaCl. Puits 4 : Essai 3 éluat. Puits 5 : Essai 5 prééluat 0,25 M NaCl ; 30 mM phosphate. Puits 6 : Essai 5 éluat. Puits 7 : PI-I. Puits 8 : Essai 6 prééluat 0,25 M NaCl ; 30 mM phosphate. Puits 9 : Essai 6 éluat.
Figure 5: Evolution de la pression de filtration en fonction du temps.
Figure 6 : Evolution du débit de filtration en fonction du poids filtré.
Figure 7 : Electrophorèse SDS Page Novex 4 - 12 % sans réducteur - coloration bleu coomassie colloïdal.
Puits 1 : 97 E 0801 - PI-I. Puits 2 : 97 E 0801 - Non
Adsorbé HA Céramique. Puits 3 : 97 E 0801 - Pré élution. Puits 4 : 97 E 0801 - élution. Puits 5 : 97 E 0801 - élution dialysée 10 kDa . Puits 6 : 97 E 0901 - Après filtration 15 nm. Puits 7 : 97 E 1401 - Après filtration
15 nm. Puits 8 : 97 E 1601 - Après filtration 15 nm.
Puits 9 : 97 E 1601 - Retentât final 15 nm. Puits 10 : Témoin de poids moléculaires Novex.
Figure 8 : Caractérisation du facteur IX par immunoblot. Puits 1 : 97 E 1106 - Eluat HA dialyse avant nanofiltration. Puits 2 et 3 : 97 E 1106 - PI-I. Puits 4 : 97 E 1504 - Filtrat 15 nm. Puits 5 : Témoin Facteur IX HP. Le Facteur IX HP est un Facteur IX de « haute pureté », c'est-à-dire un concentré de Facteur IX ayant une activité spécifique (exprimée en unité de FIX par mg de protéines) supérieure à 100 U/mg.
DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION
Le procédé de purification de protéines dépendantes de la vitamine K et notamment de complexe prothrombique de la présente invention comprend les étapes suivantes : a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma. Dans un mode de réalisation particulier, le surnageant de cryprécipité de plasma peut être obtenu par fractionnement de Cohn. Dans ce cas particulier, il s'avère nécessaire d'éviter la dénaturation des protéines par l'éthanol et donc de travailler à basse température ou d'éliminer l'alcool avant de procéder à l'adsorption des protéines sur hydroxyapatite . Dans un autre mode de réalisation, le surnageant de cryprécipité de plasma peut être obtenu par fractionnement avec un sel ammonium sulfate. Dans ce cas particulier, il s'avère nécessaire d' opérer une dialyse afin de se trouver dans des conditions optimales d'adsorption sur hydroxyapatite. b) appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d'anions, et éluer en un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire, c) appliquer l' éluat résultant de l'étape b) sur une colonne d' hydroxyapatite, d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.
Les protéines de haut poids moléculaires sont celles ayant un PM exprimé en kDa supérieur à 300, de préférence supérieur à 200, notamment supérieur à 160, voire supérieure à 100. La résine hydroxyapatite utilisée dans l'invention peut être par exemple ceramic-Hydroxyapatite (ceramic HA) , Biogel HT, etc.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape additionnelle de préélution cl), ladite préélution étant de préférence effectuée à température ambiante avec un tampon phosphate de potassium 0,01 M, NaCl 0,25 M, pH 8,0 ou un tampon phosphate de potassium 0,03 M, NaCl 0,25 M, pH 8,0. La concentration en phosphate de potassium du tampon de préélution varie de préférence de 0.02 à 0.05M, et est préférentiellement égale à 0.03M. Le pH du tampon de préélution varie de préférence de pH 6,5 à pH 8,5, et est préférentiellement égal à pH 8.
De manière préférentielle, l'élution de l'étape d) est réalisée avec un tampon phosphate de potassium 0,5 M, NaCl 0,075 M, pH 8. Le pH du tampon d'élution varie de préférence de pH 6,5 à pH 8,5, et est préférentiellement égal à pH 8. La concentration en phosphate de potassium du tampon d'élution varie de préférence de 0,1 M à 0,5 M et est préférentiellement égale à 0,25 M.
La chromatographie sur colonne d' hydroxyapatite et, de préférence sur hydroxyapatite céramique (HA-Biorad) , permet d'éliminer les protéines de haut poids moléculaire qui sont éluées avec les protéines dépendantes de la vitamine K (notamment le complexe prothrombique) lors de l'étape b) de chromatographie sur résine échangeuse d'anions. L'élimination de ces protéines de haut poids moléculaire permet de réduire, ou de préférence d'éliminer les effets secondaires qui résultent généralement de l'utilisation thérapeutique d'une solution de complexe prothrombique. En effet, les protéines contaminantes de haut poids moléculaire qui sont éliminées lors de la chromatographie sur hydroxyapatite comprennent par exemple certains facteurs du complément (tel le C4) qui réduisent, de manière directe ou indirecte (par exemple après clivage sous la forme d' anaphylatoxines) , la tolérance du patient aux solutions de complexe prothrombique distribuées commercialement à ce jour. Le demandeur a trouvé de manière surprenante que la seule étape de chromatographie sur hydroxyapat i te permet d'éliminer la plupart des protéines contaminantes de haut poids moléculaire contenues dans le surnageant de cryoprécipité de plasma sans nécessiter la mise en œuvre préalable telle qu'une purification sur silice colloïdale, par exemple. On élimine aussi les protéines telles que fibrinogène, fibronectine, Ig.
La chromatographie sur hydroxyapatite permet en outre de ne pas modifier la proportion respective des facteurs dépendants de la vitamine K lors de leur purification, puisque le rapport entre les facteurs II, VII, IX ou X dans le concentré de complexe prothrombique obtenu par le procédé de l'invention est extrêmement comparable à celui rencontré dans le plasma natif.
Il en résulte que la composition de complexe prothrombique (concentré de protéines dépendantes de la vitamine K) résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite est significativement enrichi. La teneur, par rapport à la teneur en protéines, de cette composition ou concentré en protéines du complexe prothrombique est d'environ 60%, de préférence d'environ 70%, et plus préférablement d'environ 80%, et l'activité spécifique des facteurs II, VII, IX , X est significativement accrue par rapport aux concentrés prothrombiques distribués commercialement (de 4 à 8 fois supérieure, de préférence 5 fois supérieure) , comme par exemple le Kaskadil®.
Par ailleurs, l'élimination des protéines de haut poids moléculaire lors de la chomatographie sur hydroxyapatite constitue un avantage industriel en ce qu'elle permet désormais d' inactiver viralement le concentré de protéines dépendantes de la vitamine K par nanofiltration sur des filtres de porosité de l'ordre de 15 nm. Les filtres seraient sinon rapidement colmatés par la présence de telles protéines de haut poids moléculaire dans la solution à filtrer. Enfin, lorsqu'une inactivation virale par traitement solvant-détergent est réalisée entre la chromatographie sur la résine échangeuse d' anions de l'étape b) et la chromatographie sur hydroxyapatite de l'étape d) , la purification sur hydroxyapatite permet d'éliminer sensiblement l'intégralité du solvant et du détergent présents dans le concentré protéique chargé sur l' hydroxyapatite .
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend au moins une étape additionnelle d' inactivation virale de l'éluat résultant de l'étape b) et/ou de l'éluat résultant de l'étape d) . De manière préférentielle, l'étape d' inactivation virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape b) correspond à un traitement solvant-détergent, de préférence en présence d'un mélange Tween (polysorbate 8O)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1% (v/v) - TnBP 0,3% (v/v) . Dans un mode de réalisation particulier, ladite au moins une étape d' inactivation virale est effectuée sous la forme d'un traitement UV-C (Ultra Violet C), traitement avec des ions caprylate et/ou par chauffage à sec. De manière préférentielle, le procédé de l'invention peut comprendre une seconde étape d'élimination virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape d) et correspondant à au moins une nanofiltration, de préférence au moins sur un filtre de porosité 15nm, de préférence sur un filtre Planova 15N (Asahi) . On peut ainsi éliminer les virus à enveloppe et ceux sans enveloppe. Le procédé de l'invention peut donc comprendre au moins une étape d' inactivation virale visant à sécuriser d'un point de vue virologique le produit final qui est destiné à une administration thérapeutique. Une première étape d' inactivation virale par traitement avec un mélange solvant-détergent et permettant d' inactiver les virus enveloppés peut être mise en œuvre à tout stade du procédé et, de préférence après la purification sur résine échangeuse d'anions. Le mélange solvant-détergent utilisé peut correspondre à tout mélange approprié connu de l'homme du métier et se compose de manière préférentielle comme indiqué supra. Le traitement d' inactivation virale par solvant-détergent est généralement mis en œuvre pendant une durée de quelques heures (par exemple 7 heures) , à une température sensiblement ambiante (par exemple de 25 ± 1°C) .
Par ailleurs, le procédé de l'invention peut également comprendre au moins une étape d'élimination virale par nanofiltration sur au moins un filtre de faible porosité, par exemple sur au moins un filtre de porosité comprise entre 15nm et lOOnm. Une telle étape de nanofiltration permet plus particulièrement de sécuriser le produit final vis-à-vis des virus non-enveloppés (virus de type poliovirus ou parvovirus) et des agents transmissibles non conventionnels (type prion) . Dans le cadre du procédé de l'invention, la nanofiltration est réalisée sur au moins un filtre ayant une porosité de 15nm, et de préférence sur au moins un filtre Planova 15N (Asahi) . Dans un mode de réalisation particulier, la nanofiltration est réalisée sur au moins deux filtres ayant une porosité différente, de préférence une porosité décroissante. Cette nanofiltration est de préférence effectuée après la chromatographie sur hydroxyapatite dans la mesure où la présence de concentrations importantes de protéines de haut poids moléculaires (par exemple le fibrinogène, la fibronectine, ou les IgM) dans l'extrait protéique à filtrer conduit généralement au colmatage du filtre, a fortiori lorsque le procédé est mis en œuvre à une échelle industrielle.
Le concentré de PPSB résultant du procédé comprenant les 2 étapes d' inactivation virale susmentionnées se révèle conforme aux recommandations internationales émises par l'EMEA ou la FDA en ce qui concerne les produits plasmatiques et biotechnologiques, dans la mesure où il satisfait à la fois aux conditions de sécurité requises pour les virus non enveloppés et pour les virus nus .
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend au moins une étape additionnelle de diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou après l'étape d) .
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend deux sous-étapes de chromatographie sur résine échangeurs d'anions. Il y a alors une étape additionnelle b2) consistant à appliquer l'éluat de l'étape b) sur une seconde résine échangeuse d'anions et à éluer le concentré de protéines dépendantes de la vitamine K comprenant des protéines de haut poids moléculaire. De manière préférentielle, la seconde résine échangeuse d'anions est une résine de type DEAE- Sepharose, et de préférence la DEAE-Sepharose FF (Amersham) . Une résine DEAE-Sépharose présente l'avantage de résister à la pression ainsi qu'au traitement à la soude usuellement utilisé pour sanitiser et régénérer le gel .
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape additionnelle finale de formulation, de préférence par lyophilisation et/ou addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement acceptables. Dans un mode de réalisation, le produit obtenu après formulation comprend du NaCl 0,13 M, de l'arginine 2g/l, de la lysine 2g/l, du citrate de sodium 3 g/1, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le produit obtenu après formulation comprend de l'arginine 10g/l, du mannitol 35g/l, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le produit obtenu après formulation comprend du mannitol 45g/l et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le produit obtenu après formulation comprend du citrate de sodium 1 g/1, du mannitol 35g/l, et a un pH de 6, 9 à 7, 1.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprenant une étape d'addition d'un inhibiteur de la thrombine, de préférence l' antithrombine III ou un mélange d' antithrombine III et d'héparine. L' antithrombine peut être d'origine plasmatique humaine ou d'origine humaine recombinante, comme par exemple l'Atryn®, distribuée commercialement par GTC Biotherapeutics . Cette addition peut être effectuée après l'étape b) et/ou après l'étape d) . De manière préférée, l'addition de l'inhibiteur de la thrombine est effectuée après le traitement solvant-détergent de l'éluat résultant de l'étape b) , ou avant nanofiltration de l'éluat résultant de l'étape d) . Le cofacteur II de l'héparine peut également être utilisé en tant qu'inhibiteur de la thrombine, dans les mêmes concentrations que celles proposées pour 1 ' antithrombine .
L'addition d'un inhibiteur de la thrombine permet avantageusement d'empêcher ou de limiter l'activation de la prothrombine (FII) en thrombine lors des étapes de purification mises en œuvre lors du procédé de l'invention. L'absence d'activité thrombique dans le concentré de protéines dépendantes de la vitamine K obtenu par le procédé de l'invention le rend compatible avec une utilisation en tant que médicament thérapeutique ou prophylactique chez l'homme et permet une conservation satisfaisante de ce concentré. De manière préférée, la résine échangeuse d' anions de l'étape b) du procédé de l'invention possède un groupe chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane
(DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l' aminoéthane quaternaire (QAE). Cette résine échangeuse d' anions est plus préférablement la DEAE-Sephadex A-50® distribuée par
GE Healthcare. La chromatographie de l'étape b) permet d'éliminer une partie (qui peut être importante) des protéines constituées par l'albumine, les immunoglobulines (à l'exception, dans une certaine mesure, de certaines Ig comme l'IgM), de l' antithrombine III, et de l' alpha-antitrypsine . La récupération des protéines plasmatiques adsorbées sur la résine échangeuse d' anions s'opère par augmentation graduelle de la force ionique.
Dans un mode de réalisation particulier, les protéines vitamine K dépendants obtenus suite à l'étape d) peuvent ensuite être purifiés indépendamment par des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple sur un gel d'affinité.
La présente invention porte également sur le concentré de facteur prothrombique (protéines dépendantes de la vitamine K susceptible d'être obtenu par le procédé décrit ci-dessus. Ce concentré de protéines comprend préférentiellement les facteur II, VII, IX et X, et possède une concentration en IgM inférieure à 0,1%
(pourcentage rapporté au taux protéines total du concentré) , une concentration en fibrinogène inférieure à 0,1% (pourcentage rapporté au taux protéines total du concentré) , une concentration en fibronectine inférieure à 0,1% et une concentration en facteurs du complément inférieure à 0,1%. De préférence, le concentré de l'invention comprend également les protéines C, S et Z, et possède une activité spécifique moyenne du FIX d'au moins 4 UI par mg de protéines. La présente invention concerne enfin sur l'utilisation du concentré de facteur prothrombique susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention comme médicament, et plus particulièrement comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs dépendants de la vitamine K, tel qu' un déficit constitutionnel en facteur II ou en facteur X, ou au surdosage en antivitamine K.
Le procédé de la présente invention est illustré de manière plus détaillée par les exemples qui suivent. Ces exemples décrivent des modes de réalisation spécifiques de la présente invention et ne sauraient être considérés comme restreignant la portée de cette dernière.
EXEMPLES
Exemple 1 : Conditions expérimentales mises en œuvre pour la purification du concentré de protéines dépendantes de la vitamine K
A - Préparation du Surnageant de cryoprécipité de plasma .
On utilise comme matière de départ un surnageant de cryoprécipité de plasma que l'on obtient par congélation- décongélation et centrifugation à 0-30C de plasma frais congelé . La cryoprécipitation est réalisée en amont du fractionnement plasmatique, à une température inférieure à 2°C, afin de séparer le cryoprécipité insoluble à une température inférieure à 4°, principalement composé de Facteur VIII, de fibronectine et de fibrinogène.
Le cryoprécipité est séparé du surnageant par centrifugation en continu à une température voisine de +4 0C. Le surnageant de centrifugation est appelé cryosurnageant .
Le cryosurnageant contient essentiellement l'albumine, les immunoglobulines ainsi que les autres facteurs de coagulation dont les facteurs Vitamine-K Dépendant, composés de la Prothrombine (Facteur II), du Facteur VII, du Facteur IX, du Facteur X, de la Protéine C, de la Protéine S et de la Protéine Z.
B - Chromatographie sur résine échangeuse d' anions
L'étape suivante consiste à préparer une fraction enrichie en facteur vitamine K-dépendant après adsorption sur un gel d'échange d' anions faibles, le DEAE Sephadex A- 50 (diéthylamino-éthyl Sephadex) .
Le cryosurnageant est réchauffé à une température minimale de +100C (optimalement de +16 à 18°C) . Ce cryosurnageant peut, le cas échéant subir des filtrations clarifiante sur filtres de 1 μm puis de 0,5 μm avant sa purification sur le gel de DEAE-Sephadex .
Le volume de cryosurnageant purifié est classiquement de 2000 à 3000 litres. Environ 1,5 g de DEAE-Sephadex sec sont utilisés par litre de cryosurnageant purifié.
Préalablement à la purification, la poudre de DEAE- Sephadex est gonflée (3 lavages) , avec tamisages du gel sur toile inox après chaque lavage. La préparation, le gonflement et l'équilibrage de la DEAE-Sephadex sont réalisés dans une solution de chlorure de sodium 0,075 M dans un container doté d'une pale d'agitation et d'une grille de fond de cuve (tamis) pouvant laisser échapper le liquide mais retenant les billes de DEAE-Sephadex.
L'opération de gonflement du DEAE-Sephadex est réalisée à température ambiante (15 - 25°C). L'équilibrage final du gel est contrôlé par la mesure de 1 ' osmolarité de l'effluent.
Le cryosurnageant à une température préférentielle de 17+/-1 °C, est envoyé en continu sur la DEAE-Sephadex gonflée et équilibrée, à un débit de 400 kg par heure après équilibrage des débits d'alimentation.
La totalité du cryosurnageant est ainsi mise en contact avec la DEAE-Sephadex sous agitation continuelle, permettant la fixation en continu des facteurs dépendants de la vitamine-K sur le gel.
Le gel est ensuite lavé trois fois avec un tampon contenant 0,2M de NaCl, 10 mM d'acide citrique, à pH 7, à raison de 140 1 de tampon pour 2200 litres de cryosurnageant purifié.
L'élution des protéines dépendantes de la vitamine-K
(et des protéines de haut poids moléculaire qui sont co- purifiées avec elles) est réalisée à l'aide d'un tampon
NaCl 2M, acide citrique 10 mM, à pH 7, à raison de 75 litres de tampon pour 2200 litres de cryosurnageant purifié.
La fraction protéique obtenue lors de l'élution est ensuite dessalée par des moyens classiques, c'est-à-dire par ultrafiltration à l'aide de cassettes ayant un seuil de coupure de 10 kilodaltons et éventuellement 30 kilodaltons et dialyse contre un tampon NaCl 0,15M, acide citrique 10 mM, à pH7.
L'éluat protéique résultant de la purification sur DEAE-Sephadex sera nommé « PPSB Produit Intermédiaire 1 » ou « PPSB-PI-I » dans le cadre de la présente demande.
A ce stade du procédé de purification, il s'avère possible de congeler le PPSB-PI-I dans l'attente de la mise en œuvre des autres étapes de purification l'éluat résultant de la DEAE-Sephadex à ce stade.
C - Inactivation virale par traitement Solvant/Détergent
Le PPSB-PI-I est ensuite soumis à une inactivation virale par traitement avec un mélange solvant-détergent, et plus spécifiquement par un traitement avec du polysorbate 80 (1% v/v) - Tri n-Butyl Phosphate (TnBP)
(0,3% v/v). Le traitement d' inactivation virale est effectué pendant une durée d' au moins 6 heures à une température de 24 à 25°C.
D'autres détergents peuvent être utilisés en tant qu'alternative au polysorbate, tels que le cholate ou l'octoxynol (Triton XlOO) à des concentrations allant de 0,5 à 2 %, en présence de TNBP, à une température de 15 à 300C mais préférentiellement autour de 25°C. La durée minimale d'incubation pour l' inactivation virale est de 4 heures mais cette incubation peut s'étendre jusqu'à 12 heures. Les pH généralement appliqués vont de 6 à 8 et la concentration en protéines totales de 10 à 40 g/1.
D - Chromatographie sur Hydroxyapatite HA
D.l - Package du gel
Le gel de chromatographie utilisé est le Macro prep céramic hydroxyapatite (Biorad) , possédant une granulométrie de 40 microns. Le gel sec est mis en suspension dans un tampon phosphate 0,4 M pH 6,8, puis transféré dans une colonne Pharmacia K50/30.Le package est effectué à un débit de 100 cm/h. La quantité utilisée est de 30 g de gel sec, ce qui fourni une colonne de 50 ml de gel packé. La colonne est rincée par 5 volumes de colonne de NaOH 2 M et stockée dans NaOH 2 M. D.2 - Préparation du PPSB-PI-I à injecter sur la colonne
Le PPSB-PI-I est, le cas échéant, décongelé et viralement inactivé pendant 3 heures en présence de polysorbate 80 1% et de TnBP 0,3%. Le PPSB-PI-I viralement inactivé est ensuite dilué au demi, de manière optionnelle avec une solution de benzamidine 20 mM; et le pH de la solution est ajusté à 8 avec du NaOH O,1M.
D.3 - Chromatographie :
La colonne est reliée à un détecteur U. V Pharmacia muni d'une cellule de détection industrielle, et la densité optique de l'effluent est enregistrée à 280 nm. Le gel stocké en NaOH 2M est lavé par 5 volumes de tampon de prééquilibrage (phosphate de potassium 0,4 M; pH 6,8).
La colonne est ensuite équilibrée par 15 volumes de tampon d'équilibrage (phosphate de potassium 0,0 IM; NaCl
0,075 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) . Puis la solution de PPSB est injectée à un débit de 100 cm/h et la colonne est lavée par le tampon d'équilibrage jusqu'au retour à la ligne de base.
La préélution s'effectue au même débit avec un tampon de préélution (phosphate de potassium 0,01 M; NaCl 0,25 M; benzamidine 10 mM; pH 8 ou phosphate de potassium 0,03 M; NaCl 0,25 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) et 5 volumes de colonne de prééluat sont recueillis. Le gel est ensuite lavé avec 15 volumes du même tampon.
L'élution est effectuée au même débit avec un tampon d'élution (phosphate de potassium 0,5 M; NaCl 0,075 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) et 5 volumes de colonne d'éluat sont collectés. Le gel est régénéré par 5 volumes de colonne de NaOH 2M et stocké dans du NaOH 2M.
E - Ultrafiltration et dialyse
L'éluat résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite est soumis à une ultrafiltration réalisée sur une cassette Sartorius ultrasart slice polysulfone de 0,1 m2 et de 10 kD de seuil de coupure.
L'éluat est concentré 3 fois et dialyse à volume constant contre de l'eau p.p.i (purifiée pour injection) jusqu'à obtenir une résistivité de 70 ohms (la pression d'entrée sur la cassette est de 0,5 bars et le débit d' ultrafiltration est de 45 ml/mn) , puis dialyse à volume constant contre 5 volumes de tampon de dialyse (citrate trisodique 3 g/1; NaCl 0,13 M; lysine 2 g/1; arginine 2 g/1; pH 7) . Le produit est ensuite reconcentré 2 fois et la cassette est rincée avec le tampon de dialyse de manière à obtenir un volume final égal à 80% du volume initial. Le produit est enfin congelé et stocké à -400C, et pourra, le cas échéant être ultérieurement filtré sur filtre de porosité de 15 nm.
F - Dosage
Les quantités et/ou les concentrations des Facteur de la coagulation II (FII), Facteur VII (FVII), Facteur IX (FIX) et Facteur X (FX) qui composent le complexe prothrombique (ou PPSB) sont dosées (par la mesure de la capacité à induire la coagulation) et l'activité thrombique est mesurée.
De même, la quantité et/ou la concentration des protéines C, S est dosée à l'aide des kits « Asserachrom® Total Protein S » et « Asserachrom® Protein C », distribués par Stago. Les dosages antigéniques des facteurs VII, IX, X et de la protéine Z sont réalisés par ELISA à l'aide des kits
« Asserachrom®VII : Ag »,« Asserachrom®IX: Ag »,« Asserachro m® X:Ag », et « Asserachrom® Protein Z » distribués par Stago.
Les quantités et/ou les concentrations de polysorbate 80 et de TnBP sont mesurées. Exemple 2 : Résultats expérimentaux
A - Etude de la capacité de la colonne
La capacité de la colonne d' hydroxyapatite a été testée avec des doses de 3, 5, 7 et 9 ml de PPSB-PI-I viralement inactivé par ml de gel, dans les mêmes conditions expérimentales que celles décrites ci-dessus. Il n'a pas été effectué de préélution.
Le rendement calculé pour chaque facteur correspond au rapport de la quantité totale d'unités coagulantes dans l'éluat résultant de l' hydroxyapatite sur la quantité totale d'unités coagulantes dans le PPSB-PI-I. Les rendements obtenus en fonction de la charge sont détaillés dans le tableau I suivant :
Tableau I - Rendements d'élution en facteurs II, IX, VII et X en fonction de la charge sur le gel
Figure imgf000024_0001
Ces données sont représentées graphiquement dans la figure 1. On observe une nette décroissance de la fixation du FX en fonction de la charge.
Le pourcentage de facteur non fixé calculé pour chaque facteur correspond au rapport de la quantité totale d'unités coagulantes dans la fraction non fixée à la quantité totale d'unités coagulantes dans le PPSB-PI-I de départ. Les pourcentages de facteur non fixé sont résumés dans le tableau II.
Tableau II : Quantité de facteurs II, IX, VII et X non retenus sur le gel en fonction de la charge.
Figure imgf000025_0001
Ces données sont représentées graphiquement dans la figure 2. Sur cette dernière figure, il apparaît de manière plus nette que le FII et le FX sont les facteurs qui se fixent le moins sur la colonne d' hydroxyapatite .
La figure 3 montre par ailleurs que pour ces deux facteurs (FII et FX) , le pourcentage de facteur non fixé varie de manière linéaire avec la charge. La charge de 5 ml de PPSB-PI-I par ml de gel pour laquelle la fixation des FII et FX est encore acceptable à été retenue.
B - Influence de la préélution
Dans le but d'éliminer le plus grand nombre de protéines contaminantes, une préélution avec un tampon phosphate 30 mM a été testée. Une telle préélution est de préférence réalisée avec un tampon phosphate .^ à ! Λ mM, et plus préférentiellement 30 mM, dans la mesure où l'élution des facteurs II et VII a été constaté à partir d'une concentration en phosphate de 50 mM. Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites plus haut et la charge protéique utilisée est de 5 ml de PPSB-PI-I par ml de gel.
Aucun facteur de coagulation n'a pu être détecté dans les prééluats. Les rendements ne sont donc pas affectés par cette préélution, ainsi que le montre les résultats suivants:
Tableau III : Quantité de facteurs II, IX, VII et X dans l'éluat en fonction du type de préélution réalisée.
Figure imgf000026_0001
Tableau IV : Quantité de protéines copurifiées éliminées au cours de la préélution phosphate
Figure imgf000027_0001
La préélution réalisée avec un Tampon phosphate 30 mM permet en outre d'éliminer un grand nombre de protéines accompagnantes et notamment des protéines de hauts poids moléculaire (100 à 200 kD) ainsi que le montre le gel SDS PAGE (voir figure 4) .
E - Influence de l'addition d' antithrombine et d'héparine
Afin de maintenir une faible activité thrombique dans l'extrait protéique en cours de purification, on ajoute dans l' éluat de chromatographie hydroxyapatite avant ultrafiltration de 1 ' antithrombine purifiée à une concentration de 0,5 U/ml (de préférence à une concentration de 0,1 à 0,04 unité d' antithrombine par unité de FIX) et de l'héparine à 2 U/ml. Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites plus haut, avec une préélution en tampon phosphate 3OmM. La charge de la colonne était de 5 ml de PPSB par ml de gel. El - Activités en FII, FX, FVII et X dans les éluats dialyses après purification sur hydroxyapatite
Tableau V : Activités en facteurs II, IX, VII et X et activité thrombique dans l'éluat après hydroxyapatite
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
Les essais réalisés sont reproductibles entre eux et les activités thrombiques mesurées à 6h et à 24 h sont quasiment nulles, et sont de ce fait conformes pour un usage thérapeutique ultérieur du concentré de protéines dépendant de la vitamine K (une activité thrombique de 6 heures et plus correspond à de très faibles quantités de thrombine, très inférieures à 0,001 unité NIH) .
E2 - Rendements en FII, FX, FVII et X dans l'éluat dialyse après purification sur hydroxyapatite Tableau VI : Rendements en facteurs II, IX, VII et X et activité thrombique dans l'éluat dialyse ou ultrafiltré après hydroxyapatite
Figure imgf000029_0001
Les rendements sont de l'ordre de 70 5 pour les facteurs II et IX et de l'ordre de 60 et 64 en moyenne pour les facteurs VII et X.
Tableau VII : Rendements en facteurs II, IX, VII et X après ultrafiltration de l'éluat résultant de 1' hydroxyapatite
Figure imgf000029_0002
moyenne 8 3 71 73 7 9 écart type 15 ,6 9,8 3,6 9, 2
C.V. 18 ,9 13,9 4,9 11 ,6
Les rendements pour l'ensemble des facteurs après ultrafiltration sont de l'ordre de 70 à 80%. Tableau VIII : Activités spécifiques en facteurs II, X, VII et IX dans l'éluat dialyse après hydroxyapatite
Figure imgf000030_0001
moyenne 6, 1 2, 7 5, 8 6,6 3,1 écart type 0, 5 0, 1 1, 3 0,3 0,3
C.V. 8, 7 1, 8 23, 1 4,4 8,4
PPSB-PI-I 1, 2 0, 6 1 1,2 35
Les activités spécifiques calculées pour chaque facteur sont augmentées d'environ cinq fois par rapport à un concentré de FII, FVII, FIX et FX obtenu par la mise en œuvre d'une chromatographie sur résine échangeuse d' anion à la place de l' hydroxyapatite de l'invention.
F -Conclusion sur l'étape de purification sur hydroxyapatite
La fixation des facteurs de coagulation dépendants de la vitamine K apparaît plus spécifique sur des surfaces à base de phosphate de calcium (de type hydroxyapatite) comparé au gel d'échange d'ions ce qui explique la pureté du produit obtenu. L'analyse des protéines récupérées après élution sur gel d' hydroxyapatite montre que les protéines comprises dans le concentré protéique d'intérêt ont un poids moléculaire compris entre 75 et 50 kDa, ce qui correspond au poids moléculaire des protéines dépendantes de la vitamine K, et en particulier au poids moléculaire des différents facteurs de coagulation composant le complexe prothrombique . Le tableau IX ci-dessous établit la liste des protéines présentes dans un concentré protéique obtenu par purification sur une résine échangeuse d' anions après inactivation virale (et en remplacement de la purification sur hydroxyapatite de l'invention). Il convient de remarquer que dans un tel concentré, la somme des protéines dépendantes de la vitamine K (FII, FVII, FIX, FX, protéine C, protéine S, protéine Z) représente 17% des protéines totales.
Tableau IX Liste et proportions relatives des protéines présentes dans un concentré résultant d'une purification unique sur une résine échangeuse d' anions ou d'une purification comprenant une première résine échangeuse d' anions et une seconde résine échangeuse d' anions en remplacement de la chromatographie sur hydroxyapatite de l'invention
Figure imgf000031_0001
Au contraire, le concentré protéique résultant du procédé de l'invention et notamment obtenu après l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite contient une proportion en protéines dépendantes de la vitamine K (FII, FVII, FIX, FX, protéine C, protéine S, protéine Z) de l'ordre de 90 à 95 % des protéines totales.
Le concentré qui résulte de cette chromatographie sur hydroxyapatite présente une activité spécifique augmentée de 5 à 7 fois par rapport au produit intermédiaire 1 résultant de la chromatographie sur résine échangeuse d'anions. Des mesures complémentaires montrent par ailleurs que la chromatographie sur hydroxyapatite permet en outre d'éliminer efficacement le polysorbate 80 et le TnBP utilisés lors de l'étape d' inactivation virale.
Enfin, l'addition d' antithrombine III et d'héparine dans l'éluat de chromatographie d' hydroxyapatite permet d'obtenir de façon systématique un produit dépourvu d'activité thrombique à 24 h.
Enfin, l'élimination de la plupart des protéines contaminantes et notamment des protéines contaminantes de hauts poids moléculaires permet de filtrer le produit sur membranes de porosité 15 nm en utilisant des surfaces de filtration acceptables (environ 10 litres de produit par mètre carré de membrane) .
G - Nanofiltration du concentré obtenu après chromatographie sur hydroxyapatite
G.l - Mise en œuvre expérimentale de la nanofiltration
Les filtres utilisés sont des filtres de référence Planova 15 N (Asahi) . Les filtres utilisés sont composés de fibres creuses en cellulose cupro ammonium hydrophile, dont la taille nominale des pores est de 15 ± 2 nm. Le tampon d'équilibration des filtres se compose de chlorure de sodium 0,13M, de Tri Sodium Citrate 2 H2O 3g/l, de Lysine HCl 2g/l, d'Arginine HCl 2g/l et d'eau p.p.i. (purifiée pour injection). Le tampon est ajusté à pH 7,0 ± 0,05, à une resistivité de 75 Ω.cm, et à une osmolalité de 314 mosmol / Kg H2O, à une température de 20 à 25°C.
Les filtres sont préparés individuellement, rincés en eau ppi sous une pression de l'ordre de 500 mBar . L' intégrité du filtre est contrôlée avant utilisation après rinçage à l'eau ppi. La réalisation du test de fuite à l'air ou « Leakage test », contrôle l'absence de passage d'air à travers les fibres dans la jaquette externe sous une pression d'air de 1000 ± 50 mBar. (SOP of integrity Test for Asahi Planova Filters) . Avant filtration de la solution, le filtre est équilibré à l'aide du tampon de formulation. Dans un mode de réalisation particulier, le tampon de formulation se compose de NaCl 0,13M, arginine 2g/l, lysine 2g/l, citrate de sodium 3 g/1, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le tampon de formulation se compose d' arginine 10 g/1, de mannitol 35g/l et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le tampon de formulation se compose de mannitol 45g/l et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le tampon de formulation se compose de citrate de sodium lg/1, de mannitol 35 g/1 et a un pH de 6, 9 à 7, 1. Le pH et la resistivité du filtrat 15 nm sont contrôlés (pH 7,0 ± 0,1 - Osmolalité 314 ± 10 mOsmol / Kg H2O) .
Un flacon d'éluat résultant de la purification sur hydroxyapatite céramique décrite plus haut et éventuellement dialyse est décongelé en bain marie à 37°C
± 2°C. Une préfiltration est éventuellement réalisée sur un filtre en tri-acétate de cellulose 0,2 μm (Sartolab P - Sartorius) avant filtration sur le filtre de 15 nm Planova 15N.
La filtration de l'éluat est réalisée sous une pression d'air comprimé constante de 500 ± 50 mBar. La mesure de pression est effectuée en entrée du filtre de
15 nm à l'aide d'un manomètre numérique. L'éluat résultant de la filtration sur filtre 15 nm est collecté en sortie basse de filtre dans un flacon positionné sur une balance. Des relevés du poids filtré sont effectués à intervalles de temps réguliers afin de déterminer le débit de filtration. La filtration réalisée est frontale sans recirculation.
En fin de filtration un test de fuite à l'air (« leakage test ») est réalisé après remplissage de la jaquette externe du filtre afin de contrôler l'intégrité de la membrane et de valider l'étape de filtration.
Afin de tester la reproductibilité de l'étape de nanofiltration, les essais sont réalisés en appliquant des conditions opératoires standardisées détaillées dans le tableau X.
Tableau X : Conditions et paramètres opératoires appliqués lors de la nanofiltration sur 15 nm
Figure imgf000034_0001
Après nanofiltration, la quantité et/ou la concentration des facteurs de coagulation FII, FVII, FIX et FX est mesurée par des techniques classiques connues de l'homme du métier. Il en va de même pour la détermination des taux de protéines totales.
G.2 - Résultats obtenus après nanofiltration de l'éluat résultant de l' hydroxyapatite
G.2.1 - Suivi des paramètres de nanofiltration
La pression de filtration a été maintenue dans une moyenne de 500 ± 100 mBar pendant les essais de filtration (voir figure 5) .
L'évolution du débit de filtration est mesurée pendant la nanofiltration (voir la figure 6) . On observe une diminution régulière du débit de filtration en fonction du poids filtré. Un profil similaire est obtenu pour tous les essais réalisés.
Tableau XI: Suivi des débits de nanofiltrations
Figure imgf000035_0001
Suivant les préconisations du fournisseur de filtre Asahi, le débit de filtration final doit être supérieur à 10 % du débit initial. Pour un ratio de débit inférieur à 10 % le filtre est considéré comme étant colmaté, en particulier pour les pores de plus faible diamètre. Une poursuite de la filtration pourrait en effet favoriser le passage des virus potentiels par les pores les plus larges de la membrane.
Le ratio des débits de nanofiltration final / 5 initial est conforme pour tous les essais réalisés.
Tableau XII: suivi des paramètres de filtration
Figure imgf000036_0001
La durée moyenne de filtration est de l'ordre de 2 10 heures. La capacité volumétrique moyenne est de l'ordre de 10 1/m2 de membrane, ce qui correspond à une capacité d'environ 47,9 ± 4,7 g de protéines par m2.
G.2.2 - Bilan en protéines totales et en facteurs de 15 coagulation après nanofiltration
Figure imgf000036_0002
On note de bons rendements de nanofiltration en protéines totales avec des valeurs supérieures à 90 %.
Les essais sont réalisés à partir de matières premières provenant de lots différents se révèlent 5 parfaitement reproductibles .
Tableau XIV : Bilan en facteurs de coagulation au
Figure imgf000037_0001
10 On note une bonne reproductibilité des différents essais pour tous les facteurs de coagulation
L'étape de chromatographie sur hydroxyapatite céramique permet une bonne récupération pour l'ensemble 15 des facteurs dépendants de la vitamine K. On note que les concentrations avant et après nanofiltration sur 15 nm sont très proches démontrant ainsi un rendement élevé de nanofiltration des quatre facteurs de coagulation. Tableau XV : Evolution de l'activité spécifique au cours de la nanofiltration 15 nm
Figure imgf000038_0001
Les activités spécifiques déterminées pour tous les facteurs de coagulation sont de même ordre pour tous les essais réalisés avant et après nanofiltration . L'activité spécifique déterminée par rapport au facteur IX est supérieure à 5 pour tous les essais réalisés.
10
Tableau XVI : Rendement en facteurs de coagulation après nanofiltration 15 nm
N° essai FII: C FVII: C FIX :C FX: C nanof iltration % %
97 E 2703 120, 0 100,0 104 ,5 95,7
97 E 0204 93, 2 101,0 98, 7 95, 9
97 E 0804 104, 2 90,3 114 ,0 96,2
97 E 0904 126, 6 93, 8 92, 6 100, 0
97 E 1504 84, 8 107,5 98, 4 95,2
Moyenne 105, 8 98,5 101 ,6 96, 6 / Ecart Type ± 17 ,6 ± 6,7 ± 8 ,1 ± 1,9
15 On observe pour chaque essai réalisé un rendement de même ordre (et supérieur à 90%) pour tous les facteurs de coagulation . G.2.3 - Détermination de l'activité thrombique
La détermination de l'activité thrombique est réalisée sur un appareil automatique détectant l'apparition d'un caillot par op a c i f i c a t i o n de 1 ' échantillon .
L'analyse réalisée correspond à un test de coagulation dont la sensibilité permet la détection d'une faible quantité de thrombine résiduelle dans un échantillon. Le résultat est conforme si l'on obtient une absence de coagulation après 6 heures à 37°C et après 24 heures à 24°C.
Aucune génération de thrombine n'est observée au cours de la nanofiltration de l'éluat résultant de 1' hydroxyapatite . La détermination de l'activité thrombique indique une absence de coagulation après 6 Heures à 37°C. Toutefois, les tests réalisés montrent qu'un début de formation de caillot peut être observé au temps 24 Heures, ce résultat étant confirmé par un test réalisé de façon traditionnelle en bain-Marie.
Des expériences ont été réalisées pour déterminer si l'ajout d'un inhibiteur de protéases, tel que par exemple 1' antithrombine III permet de faire disparaître l'activité thrombique résiduelle observée à 24 heures.
La détermination des activités protéasiques a été réalisée par spectrophotomètrie, en utilisant des substrats chromogénes spécifiques. L'hydrolyse d'un substrat chromogène spécifique par une protéase s'accompagne en effet de la libération d'une molécule de couleur jaune détectée à 405 nm, dont la vitesse d'apparition est proportionnelle à la concentration de l'enzyme de la solution testée. Tableau XVII : Détermination de l' activité thrombique avec le substrat chromogène S 2238
S 2238 + i S 2238
S 2238 Activité lia
Etapes 2581 + AT-III U DO Δ U DO U DO + Héparine
PPSB-PI-I 97 E 1106 0,0172 0,0142 0,0030 0,0149
Eluat HA dialyse 97 E 1106 0,0314 0,0200 0,0114 0,0339
Filtrat 15 nm 97 E 2506 0,0065 0,0020 0,0045 0,0014
97 E 1007 0,0075 0,0015 0,0060 0,0021
97 E 1607 0,0090 0,0021 0,0069 0,0017
97 E 1707 0,0103 0,0018 0,0085 0,0018
Le substrat S2238 est un substrat spécifique de la thrombine. On note qu'en absence d'inhibiteur, une activité résiduelle de type thrombine est observée dans tous les échantillons testés. Cette activité est sensiblement inhibée par l'addition de l'inhibiteur de la thrombine i 2581 et de façon équivalente en présence d'un mélange d' Antithrombine III (AT-III) et d'héparine. La thrombine peut donc être neutralisée efficacement par son inhibiteur physiologique l'AT-III en présence d'héparine.
L'activité thrombique résiduelle mesurée par le test de l'activité thrombique avec le substrat chromogène correspond à une activité inférieure à 0,01 Ul/ml dans les filtrats 15 nm.
L'aprotinine montre également une bonne efficacité pour l'inhibition des protéases résiduelles. Toutefois, l'origine bovine de cet inhibiteur ne permet pas de l'utiliser dans le cadre de la purification de produits destinés à un usage thérapeutique chez l'homme. G.2.4 - Caractérisation du concentré protéique par électrophorèse SDS Page
Ainsi qu'on peut le voir sur la Figure 7, la majorité des protéines de haut poids moléculaire ont été éliminées dans la fraction non adsorbée de la chromatographie sur hydroxyapatite HA Céramique. On ne note pas de différence notable de composition à l'étape de nanofiltration 15 nm, le filtrat 15 nm se révélant en tous points similaire au concentré protéique avant nanofiltration.
La bande majeure à 66 kDa correspond essentiellement à la prothrombine qui représente à elle seule environ 60 % des protéines totales du concentré protéique.
G.2.5 - Caractérisation du facteur IX par immunoblot
Un immunoblot est réalisé après électrophorèse sur gel SDS Page 10 % homogène sans réducteur. Après transfert sur nitrocellulose et saturation avec de l'albumine, un contact avec un anticorps primaire monoclonal anti-facteur IX (Sigma Réf. F1020) est réalisé. Le marquage par un anticorps secondaire antisouris marqué à la péroxydase (BioRad) est réalisé avant révélation par technique ECL sur film d' autoradiographie (Pierce) . Les résultats sont montrés dans la figure 8. On observe, la présence de bandes non spécifiques dans les puits correspondant au PI-I.
Au contraire, l'éluat dialyse provenant de la colonne hydroxy-apatite céramique ne présente d'une seule bande homogène. On ne note par ailleurs pas de différence visible après nanofiltration 15 nm, ni avec le facteur IX HP utilisé comme témoin.
G.2.6 - Conclusion La nanofiltration sur filtre Planova Asahi 15 nm de l'éluat dialyse résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite céramique a été réalisée de façon reproductible en respectant des conditions opératoires standardisées.
On note de façon reproductible, une diminution du débit proportionnel au poids filtré. La capacité volumétrique moyenne du filtre est de l'ordre de 10 1/m2 de membrane, ce qui correspond à une capacité moyenne de
47,9 ± 4,7 g de protéines pour les essais réalisés.
Le bilan en protéines totales donne un rendement moyen de 91,1 ± 14,0 %, comparable au rendement en facteurs de coagulation 99,4 ± 22,2 pour le FII :C, 91,5
± 18,2 pour le facteur VII :C, 95,8 ± 16,1 pour le facteur IX :C et 90,5 ± 15,1 pour le facteur X :C.
L'activité spécifique pour les différents facteurs est de même ordre avant et après nanofiltration .
On ne note pas de différence notable avant et après filtration 15 nm par caractérisation par électrophorèse SDS Page.
H - Essais d'optimisation de la stabilité de la solution au cours de la fabrication
Des essais complémentaires ont été réalisés en faisant varier différents paramètres avec pour objectif d'obtenir un éluat résultant de l' hydroxyapatite qui puisse être filtré sur 15 nm et présenter une teneur très faible ou inexistante en activité thrombique. Tableau XVIII: Liste des essais réalisés pour la stabilisation de l'éluat hydroxy-apatite céramique
Figure imgf000043_0001
* AT-III additionné au moment du traitement Solvant 5 Détergent avant chromatographie
** AT-III additionné avant ultrafiltration
Formulation a : NaCl 0,13 M - Citrate de Sodium 0,010 M, Lysine HCl 2,0 g/1, Arginine HCl 2,0 g/1, pH 7,0 ± 0,1 0 Formulation b : NaCl 0,13 M, Citrate de Sodium 0,010 M, pH 7,0 ± 0,1
Afin de pouvoir comparer les résultats des essais entre eux, les paramètres de conduite de l'étape de nanofiltration n'ont pas été modifiés. 5
Dans l'essai 97E1806, de la benzamidine 50 mM a été ajoutée dans les tampons et de l'héparine 2UI /ml a été ajoutée avant l'étape de nanofiltration sur 15 nm. Le concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur 0 filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité thrombique .
Lors de l'essai 97E1007, de l'héparine 5 Ul/ml et de l'AT-III 2 U/ml ont été ajoutées au moment du traitement 5 Solvant Détergent et avant l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite, une bonne filtrabilité de 12,5 1/m2 et une absence de coagulation (et donc d'activité thrombique) sont observées. Dans les essais 97E2312 et 97E3012, de l'héparine 2 Ul/ml et de l'AT-III 0,5 Ul/ml sont ajoutées directement dans l'éluat résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite avant étape d' ultrafiltration . Le concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité thrombique .
Dans les essais 98E0801 et 98E1301, de l'AT-III 0,5 UI/ ml est ajoutée en absence d'héparine dans léluat résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite avant l' ultrafiltration . Dans ces deux cas, le concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité thrombique.
L' antithrombine III constitue par conséquent un bon inhibiteur de l'activité thrombique du concentré protéique contenant le complexe prothrombique de l'invention. L'héparine semble en outre agir comme un cofacteur de l'AT-III et potentialiser l'activité inhibitrice de cette dernière. La meilleure efficacité de l' antithrombine est ainsi obtenue lorsque celle-ci est ajoutée dans l'éluat de chromatographie hydroxyapatite. Il apparaît en effet que l' antithrombine ne se fixe que très peu sur l' hydroxyapatite .
I - Comparaison entre le concentré de protéines obtenu par le procédé de l'invention et un concentré obtenu par un procédé comprenant une chromatographie sur résine échangeuse d'ions en remplacement de la chromatographie sur hydroxyapatite Tableau XIX : Comparaison de la composition d'un PPSB purifié avec une chromatographie d'échange d'ions en remplacement de la chromatographie sur hydroxyapatite et du concentré selon l'invention nanofiltré 15 N
Figure imgf000045_0001
Les résultats du tableau XIX montrent que la chromatographie sur hydroxy-apatite céramique effectuée dans le cadre du procédé de la présente invention permet d'obtenir un taux de purification des protéines dépendantes de la vitamine K très largement supérieur à celui qui serait obtenu avec l'utilisation d'une seconde résine échangeuse d'anions en remplacement de l' hydroxyapatite de l'invention. Par ailleurs, L'ensemble des facteurs dépendants de la vitamine K représentent 70 à 80 % des protéines totales pour le concentré nanofiltré obtenu par le porcédé de la présente invention, contre 15 à 17 % seulement pour un concentré qui serait produit en utilisant une seconde résine échangeuse d' anions en remplacement de l' hydroxyapatite .
On note également que les ratios respectifs des facteurs de coagulation composant le complexe prothrombique sont comparables dans les concentrés obtenus par les deux procédés susmentionnés.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une composition de complexe prothrombique comprenant les étapes suivantes : a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma b) appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d'anions, et éluer en un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire, c) appliquer l' éluat résultant de l'étape b) sur une colonne d' hydroxyapatite, d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.
2. Le procédé selon la revendication 1 comprenant une étape additionnelle de préélution cl), ladite préélution étant de préférence effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de préférence environ 8, avec un tampon phosphate de sodium ou phosphate de potassium, notamment en une concentration de 0,005 à 0,05M, avantageusement de 0,01 à 0,05M, avantageusement de 0,02 à 0,05M, et de manière préférée 0,03M, ledit tampon comprenant également de préférence du NaCl, avantageusement en une concentration de 0,25 M.
3. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'élution de l'étape d) est réalisée avec un tampon phosphate de potassium de préférence 0,5 M, NaCl 0,075 M, pH 8.
4. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins une étape additionnelle d' inactivation virale de l' éluat résultant de l'étape b) et/ou de l' éluat résultant de l'étape d) .
5. Le procédé selon la revendication 4 dans lequel ladite au moins une étape d' inactivation virale est effectuée sur l' éluat résultant de l'étape b) sous la forme d'un traitement solvant-détergent, de préférence en présence d'un mélange Tween (polysorbate 8O)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1% (v/v) - TnBP 0,3% (v/v) .
6. Le procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, comprenant au moins une étape additionnelle d'élimination virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape d) sous la forme d'une nanofiltration, de préférence sur un filtre ayant une porosité de 15 à lOOnm, de préférence sur un filtre ayant une porosité de 15nm.
7. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins une étape additionnelle de diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou après l'étape d) .
8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle l'étape b) comprend 2 sous-étapes mises en œuvre sur deux résines échangeuses d' anions distinctes.
9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la résine échangeuse d' anions de l'étape b) possède un groupe chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane (DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l' aminoéthane quaternaire (QAE), ladite résine échangeuse d' anions étant de préférence du type DEAE.
10. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant l'addition d'un inhibiteur de la thrombine, de préférence l' antithrombine III ou d'un mélange d' antithrombine III et d'héparine après l'étape b) ou après l'étape d) .
11. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la composition comprend en outre d'autres protéines dépendantes de la vitamine K tel que C, S et Z .
12. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant une étape additionnelle finale de formulation, de préférence par lyophilisation et/ou addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement acceptables.
13. Composition de complexe prothrombique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, et dont la concentration en Immunoglobulines, et de préférence en IgM, est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibrinogène est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibronectine est inférieure à 0,1 % et/ou dont la concentration en facteurs du complément est inférieure à 0,1 %.
14. Composition de complexe prothrombique selon la revendication 13, dont l'activité spécifique moyenne du FIX est d'au moins 4 UI par mg de protéines.
15. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 comprenant en outre la protéine C, la protéine S et la protéine Z.
16. Composition de complexe prothrombique selon la revendication 15, dans laquel les protéines dépendantes de la vitamine K, constituées par le Facteur II (FII), le
Facteur VII (FVII), le Facteur IX (FIX), le Facteur X
(FX), la protéine C, la protéine S et la protéine Z, représentent au minimum 80 %, de préférence 85%, et plus pr é f é r ab 1 eme n t 90%, des protéines totales de la composition.
17. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 comme médicament .
18. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs dépendants de la vitamine K, ou au surdosage en antivitamine K.
19. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés à un déficit constitutionnel ou acquis en facteur II ou en facteur X.
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