KR20120047216A - 프로트롬빈 복합 조성물 - Google Patents

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자크 샤바
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라보라토이레 프란카이스 듀 프락티온네멘트 에트 데스 바이오테크놀로지스 소시에테 애너님
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Abstract

본 발명은 응고인자 II, VII, IX 및 X을 포함하는 프로트롬빈 복합물의 조성물 또는 농축액을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 혈장 저온침전물의 상청액을 준비하는 단계, 상기 상청액을 음이온교환 수지 상에 도포하여 상기 복합물과 고분자량의 단백질을 함유하는 용출액을 제조하는 단계; 및 상기 용출액을 수산화인회석 컬럼 상에 도포하여 상기 복합물을 함유하는 제2 용출액을 제조하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 그 방법에 의하여 제조될 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

프로트롬빈 복합 조성물{PROTHROMBIC COMPLEX COMPOSITION}
본 발명은 응고인자 II, VII, IX 및 X을 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물 또는 농축액을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 방법에 의하여 얻어지는 조성물을 제공하는 것이다.
비타민 K 의존성 단백질의 농축액, 더욱 구체적으로는 응고인자 II, VII, IX 및 X("PPSB"라고도 함)을 포함하는 프로트롬빈 복합 농축액을 제조하는 것은 응고인자 하나 이상이 결핍 및/또는 고분자량의 어떤 단백질이 결핍되어 고생하는 혈우병 환자의 출혈 사고를 예방 또는 치료하기 위한 기본 사항이다.
그 환자들은, 출혈 상태인 동안, PPSB 치료가 필요하며, 그러므로, PPSB와 함께 정제된 상당량의 혈장 단백질을 투여받게 되는데, 그러면 과민성 쇼크(anaphylactic shock), 염증 반응 및 내성 문제와 같은 2차적 효과가 일어날 수 있다. 이것은 면역 글로불린 M과, 아나필라톡신(anaphylatoxin)이라고도 불리우며 인자 C3, C4, C5의 활성화에 의해 유래 되는 인자 C3a, C4a 또는 C5a와 함께하는 경우에 현저하다. 인자 C3a, C4a 및 C5a(특히 C3a)는 알러지 염증에 관여한다. 보체(complement)의 절편 C5a 및 C3a에 의하여 비만세포와 호염기 세포가 활성화되면, 혈관 투과성, 기관지 수축 및 혈관 확장을 증대시키는 류코트리엔과 히스타민이 방출된다.
비타민 K 의존성 인자를 정제하는 동안에 이들 절편의 형성을 억제하기 위해서는, 그들 각각의 전구체, 즉 보체 시스템의 인자 C3, C4 또는 C5을 제거하는 것이 바람직하다.
상기 PPSB 농축액은 현재 Kaskadil®("Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies" 사 제품)라는 상품명으로 상업적으로 구입가능한데, 이 제품은 PPSB를 구성하는 응고인자 II, VII, IX 및 X 이외에 단백질을 오염시키는 성분을 상당량(약 80%) 포함하고 있다. 농도가 가장 큰 비타민 K 의존성 단백질은 프로트롬빈 또는 인자 II이다(Kaskadil®내의 전체 단백질의 농도 약 35-45 Mg/mL에 대하여 4.5 Mg/mL 오더의 농도를 가짐).
그러므로, PPSB를 고정도로 정제하여, 그것을 구성하는 인자 II, VII, IX 및 X의 활성도와 각각의 비율을 유지시킬 수 있는 방법이 긴요하게 필요하다.
문헌 EP-A-0528701("Association pour l'essor de la transfusion sanguine")에는 혈장 저온침전물 상청액을 DEAE-Sephadex® A50 수지 상에서 정제하는 단계, PPSB를 함유하는 용출액을 재석회화(recalcifying) 단계 및 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 치료적 용도의 인간 트롬빈 제조방법이 기재되어 있다.
문헌 US-P-4411794에는 칼슘 이온 존재 하 수산화인회석 타입의 광물 지지체 상에서 혈장 침전물 상청액과 황산암모늄을 흡착시키는 단계, 이어서 콜로이드 실리카 상에서 정제하는 단계, 및 투석하는 단계를 포함하는 응고인자 II, VII, IX 및 X를 정제하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이로부터 생성되는 PPSB 농축액은 오염 단백질을 많이 포함하여, 현재의 혈액 유도 제품의 보건 안정성 기준을 충족할 정도로 순도를 갖지 못한다. 특히 황산암모늄은 상대적으로 독성이 있으므로 치료적 용도로 적합하지 못하다.
문헌 US-P-4272523에는 혈장 저온침전물 상청액으로부터 혈장을 분획하는 방법이 기재되어 있다. 이 특허에는 그 저온침전물 상청액을 콜로이드 실리카 상에 흡착시키는 단계, 투석/한외여과 단계, 수산화인회석 타입의 인산3칼슘 상에 흡착시키는 단계 및 DEAE-Sephadex 타입의 음이온교환 수지 상에 흡착시키는 단계를 거쳐서 PPSB 농축액을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 피브리노겐과 같은 고분자량 단백질을 제거하기 위하여 사용하는 콜로이드 실리카 상에서의 정제 단계와, 인산3칼슘 상에서의 정제 단계는 배치식 흡착 형태로 행하여지며, 따라서 그것의 낮은 생산성과 자동화 곤란성에 의하여, 공업적 규모로 적용하기가 어려움이 입증되었다. 또한, 인산3칼슘은 습기에 민감한 분말로써 배치마다 다양하게 변화하는 고유 특성을 가지므로 제어하기가 어렵다. 그러므로 상기 문헌 US-P-4272523은 치료적 용도로서 PPSB 농축액을 대량 생산하기에는 적합하지 않음이 입증되었다.
문헌 EP-A-0832200에는 음이온교환 수지 상, 헤파린 수지 상, 그 후 수산화인회석 수지 상에서 차례로 크로마토그래피 단계를 포함하는 재조합체 FXI의 조성물의 정제방법이 기재되어 있다. 이 문헌은 프로트롬빈 복합체의 인자와 관련이 없으며, 또한 출발물질이 인간 기원의 조성물이 아니라 재조합 인자의 조성물이다.
문헌 WO2006/075664에는 재조합체 FVII을 함유하는 조성물의 선행 처리 없이, 수산화인회석 상에서 크로마토그래피 단계를 포함하는 재조합체 FVII의 정제방법이 기재되어 있다.
본 출원인은 혈장 저온침전물의 상청액을 준비하는 단계, 음이온교환 수지 상에서 크로마토그래피 단계 및 수산화인회석 상에서 크로마토그래피 단계를 포함하는 비타민 K 의존성 단백질의 농축액 특히 프로트롬빈 복합물의 정제 방법이 고순도의 PPSB 농축액을 공업적으로 제조할 수 있음을 알아냈다. 본 발명에 의하여 제조된 PPSB는 실질적으로 오염 단백질이 없으며, 이것이 함유하는 인자 II, VII, IX 및 X는 높은 비활성도(specific activity)을 갖는다. 본 발명의 방법은 지금까지 알려진 정제방법과 가장 구별되는 것으로서, 피브리노겐, 피브로넥틴, 면역 글로불린, 보체 단백질과 같은 고분자량의 단백질을 함유하는 용출액을 수산화인회석을 사용하는 크로마토그래피에 의하여, 수행하는 정제 단계의 수를 감소시킬 수 있고 또 재현성이 좋다.
본 발명의 목적은
a) 혈장 저온침전물의 상청액을 준비하는 단계,
b) 상기 상청액을 음이온교환 수지 상에 도포하여, 프로트롬빈 복합물과 고분자량의 단백질을 함유하는 용출액으로 용출하는 단계,
c) 상기 단계 b)에서 생성된 용출액을 수산화인회석 컬럼 상에 도포하는 단계, 및
d) 상기 프로트롬빈 복합물을 함유하는 용출액으로 용출하는 단계,
를 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법이다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 예비 용출 단계 cl)을 더 포함하며,상기 예비 용출은 pH 6.5~8.5, 바람직하게는 약 pH 8에서, 0.005~0.05M, 적합하게는 0.01~0.05M, 더욱 적합하게는 0.02~0.05M, 바람직하게는 0.03M 농도의 인산나트륨 또는 인산칼륨 버퍼로 수행되며, 또 상기 버퍼는 0.25M NaCl을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 용출 단계 d)는 0.075M NaCl, 0.5M 인산칼륨 버퍼, pH 8에서 수행한다.
적합하게는, 본 발명의 방법은 단계 b) 및/또는 단계 d)에서 생성되는 용출액의 바이러스 불활성(inactivation) 단계를 적어도 하나 더 포함한다. 바람직한 구체예로, 상기 적어도 하나의 바이러스 불활성 단계는 단계 b)에서 생성되는 용출액을 용매-세제 처리의 형태로, 바람직하게는 Tween(폴리소르베이트 80)-TnBP 혼합물 존재하, 더욱 바람직하게는 1%(v/v) 폴리소르베이트 80 - 0.3%(v/v) TnBP 혼합물의 존재하에서 수행한다. 구체적 실시예로, 상기 적어도 하나의 바이러스 불활성 단계는 UV-C(Ultra Vilot C) 처리, 카프릴레이트 이온 및/또는 건조 가열 처리로서 행한다. 적합하게는, 상기 적어도 하나의 바이러스 불활성 단계는 단계 d)에서 생성되는 용출액을 예를 들어 15~100nm의 기공을 갖는 하나 또는 다수개의 필터 상에서, 바람직하게는 15nm의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터 상에서, 구체적으로는 Asahi사로부터 구입 가능한 Planova 15N 필터 상에서 한번 또는 여러 번 나노여과를 행하는 바이러스 제거 단계를 수행하여 완료된다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 단계 b) 및/또는 단계 d) 후에 정용여과(diafiltration)-한외여과 단계를 적어도 하나 더 포함한다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법의 단계 b)는 2개의 다른 음이온교환 수지 상에서 수행되는 2개의 서브 단계들을 포함한다.
바람직한 구체예로, 단계 b)의 음이온교환 수지는 디에틸아미노에탄(DEAE), 폴리에틸렌이민(PEI) 및 4급 아미노에탄(QAE)으로부터 선택되는 양전하 기, 바람직하게는 DEAE 타입을 갖는다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 단계 b) 또는 단계 d) 후에 트롬빈의 억제제, 바람직하게는 안티트롬빈 III 또는 안티트롬빈 III과 헤파린의 혼합물을 첨가하는 공정을 더 포함한다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 조성물은 단백질 C, S 및 Z과 같은 비타민 K 의존성 다른 단백질을 더 포함한다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 냉동-건조 및/또는 약학적으로 허용가능한 보조약 또는 캐리어 첨가와 같은 최종 추가적 배합 공정을 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명에 의한 방법에 의하여 얻어지는 프로트롬빈 복합 조성물로서, 면역 글로불린, 바람직하게는 IgM의 농도는 0.1% 미만, 및/또는 피브리노겐 농도는 0.1% 미만, 및/또는 피브로넥틴 농도는 0.1% 미만 및/또는 보체(complement) 인자의 농도는 0.1% 미만이다.
바람직한 구체예로, 본 발명에 의한 프로트롬빈 복합 조성물 내에서의 FIX의 평균 비활성도(specific activity)는 단백질 mg 당 적어도 4 IU이다.
바람직한 구체예로, 본 발명에 의한 프로트롬빈 복합 조성물은 단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z을 더 포함한다.
바람직한 구체예로, 본 발명에 의한 프로트롬빈 복합 조성물의 인자 II(FII), 인자 VII(FVII), 인자 IX(FIX), 인자 X(FX), 단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z로 구성된 비타민 K 의존성 단백질은 그 조성물 전체 단백질의 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%이다.
또한 본 발명은 본 발명에 의한 프로트롬빈 복합 조성물의 의약 용도, 바람직하게는 비타민 K 의존성 인자 결핍, 또는 항비타민 K 과량 투여와 관련된 출혈 사고를 치료 또는 예방하기 위한 의약 용도, 또는 인자 II 또는 인자 X의 선천적 또는 후천적 결핍과 관련된 출혈 사고를 치료 또는 예방하기 위한 의약 용도에 관한 것이다.
도 1은 수산화인회석 컬럼 상에 침적된 단백질 로딩양에 대한 인자 II, IX, VII 및 X의 용출 수율을 나타내는 도면.
도 2는 도입된 단백질 로딩양에 대한 수산화인회석 상에 유지되지 않는 인자 II, IX, VII 및 X의 양을 나타내는 도면.
도 3은 수산화인회석 컬럼 상에 침적된 단백질 로딩양에 대한 비결합 FII 및 FIX의 백분율 변동을 나타내는 도면.
도 4는 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 동안 예비용출에 의해 제거된 단백질의 양에 대응하는 SDS-PAGE 겔을 나타내는 도면. 12% SDS-PAGE 겔-비감소-침적: 단백질 10㎍, HA Biorad 상에서의 크로마토그래피로부터 예비용출액 및 용출액에 대응. 웰 1 및 10: 분자량 표준. 웰 2: PI-1. 웰 3; 시험 3 예비용출액 (0.25M NaCl). 웰4: 시험 3 용출액. 웰 5: 시험 5 예비용출액(0.25M NaCl; 30mM 인산염). 웰 6: 시험 5 용출액. 웰 7: PI-1. 웰 8: 시험 6 예비용출액(0.25M NaCl; 30mM 인산염). 웰 9: 시험 6 용출액.
도 5는 시간에 따른 여과 압력의 변화를 나타내는 도면.
도 6은 여과 중량에 따른 여과 유속의 변화를 나타내는 도면.
도 7은 환원제 없이 4~12% SDS PAGE Novex 상에서의 전기영동을 나타내는 도면-콜로이드 쿠마시 블루 스테이닝. 웰 1: 97E 0801-PI-1. 웰 2: 97E 0801-비흡착된 HA 세라믹. 웰 3: 97E 0801-예비용출. 웰 4: 97E 0801-용출. 웰 5: 97E 0801-투석 용출 10kDa. 웰 6: 97E 0901-15nm 여과 후. 웰 7: 97E 1401-15nm 여과 후. 웰 8: 97E 1601-15nm 여과 후. 웰 9: 97E 1601-최종 보존물 15nm. 웰 10: Novex 분자량 조절.
도 8은 면역블롯에 의한 인자 IX의 특성을 나타내는 도면. 웰 1: 97E 1106-나노여과 전 투석된 HA 용출액. 웰 2 및 웰 3: 97E 1106-PI-1. 웰 4: 97E 1504-15nm 여과액. 웰 5: 인자 IX HP 대조구. 인자 IX HP는 고순도의 인자 IX, 즉 인자 IX 농축액은 100U/mg 이상의 비활성도(단백질 mg 당 FIX 단위로 표현)를 갖는다.
본 발명의 비타민 K 의존성 단백질 정제 방법, 구체적으로는 프로트롬빈 복합체 정제 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 혈장 저온침전물의 상청액을 준비하는 단계. 바람직한 구체예로, 상기 혈장 저온침전물 상청액은 Cohn 분획에 의하여 얻어질 수 있다. 이 경우, 에탄올에 의한 단백질의 변성을 피하기 위하여, 저온에서 운전하거나 또는 수산화인회석 상에 단백질을 흡착시키기에 앞서 그 알코올의 제거가 필요함이 판명되었다. 다른 구체예로, 상기 혈장 저온침전물 상청액은 황산암알루미늄 염으로 분획하여 얻어질 수 있다. 그 경우, 수산화인회석 상에서의 최적인 흡착 조건을 만들기 위하여 투석을 행함이 필요함이 판명되었다.
b) 상기 상청액을 음이온교환 수지 상에 도포하여, 프로트롬빈 복합물과 고분자량의 단백질을 함유하는 용출액으로 용출하는 단계.
c) 상기 단계 b)에서 생성된 용출액을 수산화인회석 컬럼 상에 도포하는 단계.
d) 상기 프로트롬빈 복합물을 함유하는 용출액으로 용출하는 단계.
상기 고분자량의 단백질은 kDa로 환산한 분자량(MW)이 300 이상, 더욱 바람직하게는 200 이상, 더더욱 바람직하게는 160 이상, 가장 바람직하게는 100 이상을 갖는 것들이다.
본 발명에 사용되는 수산화인회석 수지는 예를 들어 세라믹 수산화인회석(세락믹 HA), 바이오겔 HT 등을 들 수 있다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 예비 용출 단계 cl)을 더 포함하며, 상기 예비 용출은 0.25M NaCl, 0.01M 인산칼륨 버퍼, pH 8.0, 또는 0.25M NaCl, 0.03M 인산칼륨 버퍼, pH 8.0 하 실온에서 행하는 것이 바람직하다. 상기 예비 용출 버퍼의 인산칼륨 농도는 0.02~0.05M가 바람직하며, 0.03M 근방이 좋다. 상기 예비 용출 버퍼의 pH는 pH 6.5~pH 8.5가 바람직하며, pH 8 근방이 좋다.
단계 d)의 용출은 0.075M NaCl, 0.5M 인산칼륨 버퍼, pH 8에서 행하는 것이 바람직하다. 상기 용출 버퍼의 pH는 pH 6.5~pH 8.5가 바람직하며, pH 8 근방이 좋다. 상기 용출 버퍼의 인산칼륨 농도는 0.1M~0.5M이 바람직하며, 0.25M 근방이 좋다.
수산화인회석 컬럼 상에서, 바람직하게는 세라믹 수산화인회석 컬럼(HA-Biorad) 상에서 크로마토그래피를 행하면, 상기 음이온교환 수지 상에서의 크로마토그래피 단계 b)에서 비타민 K 의존성 단백질(구체적으로 프로트롬빈 복합물)과 함께 용출된 고분자량의 단백질을 제거할 수 있다. 이들 고분자량의 단백질을 제거하면, 프로트롬빈 복합액을 의료 용도로 사용할 때에 통상적으로 발생할 수 있는 2차적 효과를 감소 또는 제거할 수 있다. 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 동안에 제거되는 고분자량의 오염 단백질은 오늘날 상업적으로 판매되는 프로트롬빈 복합물 용액에 대한 환자의 내성을 직접 또는 간접적(예를 들어 아나필라톡신의 형태로 분열한 후)으로 감소시키는 보체의 특정 인자(예: C4)를 포함한다. 본 출원인은 수산화인회석 상에서의 한 번의 크로마토그래피 단계로, 혈장 저온침전물 상청액에 함유되어 있는 고분자량의 오염 단백질의 대부분을 콜로이드 실리카 상에서의 정제와 같은 예비 실행을 하지 않고서도 제거할 수 있음을 알아냈다. 이때 피브리노겐, 피브로넥틴, Ig 와 같은 단백질들도 제거된다.
수산화인회석 상에서 크로마토그래피를 행하면, 추가적으로 정제 동안에 비타민 K 의존성 인자들의 각각의 비율이 변하지 않으므로, 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 프로트롬빈 복합 농축액 내에서의 인자 II, VII, IX 또는 X 간의 비율은 원래 혈장 내에서의 이들 비율과 아주 흡사하다.
수산화인회석 상에서의 크로마토그래피에 의해 생성되는 프로트롬빈 복합 조성물(비타민 K 의존성 단백질의 농축액)은 그 양이 현저하게 많음이 밝혀졌다. 단백질 함량에 대한 프로트롬빈 복합 단백질의 조성물 또는 농축액의 함량은 약 60%, 바람직하게는 약 70%, 더욱 바람직하게는 약 80%이며, 인자 II, VII, IX, X의 비활성도(specific activity)는 상업적으로 판매되는 프로트롬빈 농축액(예: Kaskadil®)에 비하여 현저하다(4~8배 이상, 바람직하게는 5배 이상).
또한, 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 동안에 고분자량의 단백질을 제거하면, 그 후 15nm 오더의 기공을 갖는 필터 상에서 나노여과에 의하여 비타민 K 의존성 단백질의 농축액을 바이러스 불활성화 할 수 있는 공업적 장점이 있다. 그렇지 않으면 필터링 되는 용액 내의 고분자량 단백질에 의하여 필터가 신속하게 막힌다. 마지막으로, 단계 b)의 음이온교환 수지 상에서의 크로마토그래피와 단계 d)의 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 사이에서 용매-세제 처리에 의한 바이러스 불활성을 행하고, 수산화인회석 상에서 정제하면, 수산화인회석 상에 로딩된 단백질 농축액 내에 존재하는 용매와 세제의 전량을 실질적으로 제거할 수 있다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 단계 b) 및/또는 단계 d)에서 생성되는 용출액에 대하여 추가적으로 바이러스 불활성 단계를 적어도 하나 포함한다. 단계 b)에서 생성되는 용출액에 대하여 행하여지는 바이러스 불활성 단계는 용매-세제 처리 형태, 바람직하게는 Tween(폴리소르베이트 80)-TnBP 혼합물 존재 하, 더욱 바람직하게는 1%(v/v) 폴리소르베이트 80 - 0.3%(v/v) TnBP 혼합물 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예로, 상기 적어도 하나의 바이러스 불활성 단계는 UV-C(Ultra Violet C) 처리, 카프릴레이트 이온 처리 및/또는 건조 가열에 의하여 행한다. 본 발명의 방법은 단계 d)에서 생성되는 용출액을 적어도 하나의 나노여과, 바람직하게는 기공 15nm의 필터 상에서, 더욱 바람직하게는 Planova 15N 필터(Asahi) 상에서 여과를 행하는 바이러스 제거 제2 단계를 포함할 수 있다.
이렇게 하여 외피보유 바이러스(enveloped virus)와 외피 없는 바이러스를 제거할 수 있다.
그러므로 본 발명의 방법은 의약적 투여용인 최종 제품의 바이러스 안정성을 얻기 위하여 적어도 하나의 바이러스 불활성 단계를 포함할 수 있다.
용매-세제 혼합물로 처리하여 외피보유 바이러스를 불활성화하는 제1 바이러스 불활성 단계는 본 방법의 임의 단계, 바람직하게는 음이온교환 수지 상에서의 정제 단계 후에 행할 수 있다. 상기용매-세제 혼합물은 종래 공지의 임의 혼합물을 사용할 수 있고, 바람직하게는 표시 슈프라(supra)로 구성된다. 이 용매-세제에 의한 바이러스 불활성 처리는 통상 수시간 (예를 들어 7시간) 동안, 실제적으로 실온(예를 들어 25±1℃)에서 실행된다.
또한, 본 발명의 방법은 작은 기공을 갖는 적어도 하나의 필터, 예를 들어 15nm 내지 100nm 사이의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터 상에서 나노여과하여 바이러스를 제거하는 적어도 하나의 바이러스 제거 단계를 포함할 수도 있다. 상기의 나노여과 단계를 수행함으로써, 최종 제품의 외피 없는 바이러스(예: 폴리오바이러스 또는 파르보바이러스 타입) 및 비통상 전파성 제(예: 프라이온 타입)에 대한 안정성을 더욱 확보할 수 있게 된다. 본 발명의 방법에서는, 나노여과는 기공 15nm을 갖는 적어도 하나의 필터, 바람직하게는 적어도 하나의 Planova 15N 필터(Asahi) 상에서 행한다. 바람직한 구체예로, 나노여과는 다른 기공, 바람직하게는 감소하는 기공을 갖는 적어도 2개의 필터 상에서 행한다. 이 나노여과는 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 후에 행하는 것이 바람직한데, 그 이유는 필터링 되는 단백질 추출물 내에서 고분자량의 단백질 농축액(예를 들어 피브리노겐, 비브로넥틴, 또는 IgM)이 많이 존재하면 필터를 봉쇄하기 때문이며, 이 방법이 공업적 규모로 실행되는 경우에 더더욱 그렇다.
상기 2개의 바이러스 불활성 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 PPSB 농축액은 외피 없는 바이러스와 네이키드 바이러스 모두에 대하여 요구되는 안정성 조건을 만족하므로, 주시 혈장(regard plasma)과 생화학 기술 제품에 대해 EMEA 또는 FDA가 공표한 국제적 권장사항에 따름이 입증되었다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 단계 b) 및/또는 단계 d) 후에 추가적으로 정용여과(diafiltration)-한외여과 단계를 적어도 하나 더 포함한다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 음이온교환 수지상에서 2개의 크로마토그래피 서브 단계를 포함한다. 즉 단계 b)의 용출액을 제2 음이온교환 수지 상에 도포하여 고분자량의 단백질을 포함하는 비타민 K 의존성 단백질 농축액을 용출하는 추가적 단계 b2)를 포함한다. 제2 음이온교환 수지는 DEAE-Sepharose 타입의 수지가 바람직하며, 구체적으로는 DEAE-Sepharose FF(Amersham)이다. DEAE-Sepharose 수지는 압력뿐만 아니라, 겔을 위생적으로 처리하고 재생하기 위하여 통상 사용되는 수산화나트륨 처리에도 견디는 장점이 있다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 냉동-건조 및/또는 약학적으로 허용가능한 보조약 또는 캐리어 첨가와 같은 최종 추가적 배합 공정을 포함한다. 구체예로, 배합 후 얻어진 제품은 013M NaCl, 아르기닌 2g/L, 라이신 2g/L, 구연산 나트륨 3g/L을 포함하며, 6.9~7.1의 pH를 갖는다. 다른 구체예로, 배합 후에 얻어진 제품은 아르기닌 10g/L, 만니톨 35g/L를 포함하며, 6.9~7.1의 pH를 갖는다. 또 다른 구체예로, 배합 후 얻어진 제품은 만니톨 45g/L를 포함하며, 6.9~7.1의 pH를 갖는다. 또 다른 구체예로, 배합 후 얻어진 제품은 구연산 나트륨 1g/L, 만니톨 35g/L를 포함하며, 6.9~7.1의 pH를 갖는다.
바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 트롬빈 억제제, 바람직하게는 안티트롬빈 III 또는 안티트롬빈 III과 헤파린의 혼합물을 첨가하는 단계를 포함한다. 상기 안티트롬빈은 인간 혈장으로부터 기원 되며 또는 GTC Biotherapeutics로부터 상업적으로 구입 가능한 Atryn®과 같은 재조합 인간 기원을 갖는다. 이것의 첨가는 단계 b) 및/또는 단계 d) 후에 행할 수 있다. 바람직하게, 트롬빈 억제제의 첨가는 단계 b)에서 생성되는 용출액의 용매-세제 처리 후, 또는 단계 d)에서 생성되는 용출액의 나노여과 전에 행한다. 또한 헤파린의 공인자(cofactor) II도 안티트롬빈에서 제안하였던 동일 농도로 트롬빈 억제제로서 사용할 수 있다.
트롬빈 억제제를 첨가하게 되면, 본 발명의 방법 동안에 수행되는 정제 단계 동안에 프로트롬빈(FII)이 트롬빈으로의 활성화를 방지 또는 제한할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 비타민 K 의존성 단백질 농축액 내에서 트롬빈 활성도가 없으면, 그 단백질 농축액은 인간의 치료약 또는 예방약으로 사용하기에 적합하게 되며 또한 보존성이 높아진다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 b)의 음이온교환 수지는 디에틸아미노에탄(DEAE), 폴리에틸렌이민(PEI) 및 4급 아미노에탄(QAE)으로부터 선택되는 양전하 기를 갖는다. 이 음이온교환 수지는 GE Healthcare로부터 구입가능한 DEAE-Sephadex A-50®이 더욱 바람직하다. 단계 b)의 크로마토그래피로, 알부민, 면역 글로불린(IgM과 같은 특정의 Ig(s) 제외), 안티트롬빈 III 및 알파-안티트립신으로 구성된 단백질의 부분(그 부분이 중요할 수 있음)을 제거할 수 있다. 음이온교환 수지 상에 흡착된 혈장 단백질의 회수는 이온력을 서서히 증가시킴으로써 행한다.
특별한 구체예로, 단계 d)에서 얻어진 비타민 K 의존성 단백질은 그 후 종래 공지의 기술, 예를 들어 친화성 겔 상에서 독립적으로 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 프로트롬빈 인자(상기한 방법에 의하여 얻어질 수 있는 비타민 K 의존성 단백질)의 농축액에 관한 것이다. 이 단백질 농축액은 인자 II, VII, IX 및 X를 바람직하게 포함하며, IgM의 농도 0.1% 미만(농축액의 전체 단백질 양에 대한 백분율), 피브리노겐 농도 0.1% 미만(농축액의 전체 단백질 양에 대한 백분율), 피브로넥틴 농도 0.1% 미만 및 보체(complement) 인자의 농도 0.1% 미만을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 농축액은 단백질 C, S 및 Z을 더 포함하며, 단백질 mg당 적어도 4IU의 FIX 평균 비활성도를 갖는다.
마지막으로 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 얻어지는 프로트롬빈 인자 농축액을 의약으로 사용, 보다 구체적으로는 비타민 K 의존성 인자 결핍(예를 들어 인자 II 또는 인자 X의 선천적 결핍), 또는 항비타민 K 과량 투여와 관련된 출혈 사고를 치료 또는 예방하기 위한 의약으로 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 하기 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 특정 실시예를 기술할 뿐이고 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 비타민 K 의존성 단백질 농축액을 정제하기 위하여 수행한 실험조건.
A-혈장 저온침전물 상청액의 준비.
출발물질로는, 냉동된 신선한 혈장을 0-3℃에서 냉동-해동 및 원심분리에 의하여 얻은 혈장 저온침전물 상청액을 사용하였다.
인자 VIII, 피브로넥틴 및 피브리노겐으로 주로 구성된 4℃ 미만의 온도에서의 불용 저온침전물을 분리하기 위하여, 2℃ 미만의 온도에서 혈장 분획물의 상청액을 취하였다.
4℃ 근방의 온도에서 연속적으로 원심분리하여 상청액에서 저온침전물을 분리하였다. 저온침전물을 분리한 후의 원심분리 상청액을 저온 상청액이라고 한다.
그 저온 상청액은 프로트롬빈(인자 II), 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단배질 C, 단백질 S 및 단백질 Z으로 구성된 비타민 K 의존성 인자를 포함한 다른 응고인자뿐만 아니라 알부민, 면역 글로불린을 필수적으로 함유한다.
B-음이온교환 수지 상에서의 크로마토그래피.
다음 단계는 약 음이온교환 겔, 즉 DEAE Sephadex A-50(디에틸아미노-에틸 Sephadex) 상에서의 흡착 후 비타민 K 의존성 인자가 풍부한 분획물을 제조하는 것으로 구성된다.
상기 저온 상청액을 최하 10℃의 온도(바람직하게는 16~18℃)까지 가열시킨다. 필요에 따라 이 저온 상청액을 DEAE-Sephadex 겔 상에서 정제하기 전에 1㎛ 그 후 0.5㎛의 필터 상에서 정화 여과를 수행해도 좋다.
상기 정제된 저온 상청액의 부피는 통상적으로 2000~3000리터이다. 정제된 저온 상청액 1리터당 약 1.5g의 건조 DEAE-Sephadex가 사용된다.
정제에 앞서, 상기 DEAE-Sephadex 분말을 3번의 세척을 통해 팽윤시켰는데, 이때 각각의 세척 후에 스테인레스스틸 망 위에서 겔을 체질하였다. 상기 DEAE -Sephadex의 팽윤과 평형은 교반 블레이드 및 액체는 빠져나가고 DEAE-Sephadex 비드는 남아있도록 하는 탱크 바텀 그리드(시브)가 구비된 컨테이너 내에서 0.075M 염화나트륨 용액으로 행하였다. 상기 DEAE-Sephadex의 팽윤 운전은 실온(15~25℃)에서 행하였다.
그 겔의 최종 평형은 유출액의 오스몰 농도(osmolarity)를 측정하여 컨트롤하였다.
상기 저온 상청액을 바람직하게는 17±1℃의 온도에서 연속적으로 상기 팽윤 및 평형 DEAE-Sephadex 상에 시간당 400kg의 유속(공급 유속의 평형 후의 유속임)으로 공급하였다.
상기 저온 상청액 전부를 연속적으로 교반하면서 DEAE-Sephadex와 접촉시켜서, 그 겔 상에 비타민 K 의존성 인자를 연속적으로 결합시켰다.
그 후 그 겔을 0.2M NaCl, 구연산 10mM을 함유하는 버퍼로 pH 7에서 3번 세척하였는데, 사용한 버퍼의 양은 정제된 저온 상청액 2200리터에 대하여 140리터이다.
비타민 K 의존성 단백질(및 이들과 함께 정제되는 고분자량의 단백질)의 용출은 2M NaCl, 구연산 10mM을 함유하는 버퍼에 의하여 pH 7에서 달성되는데, 사용한 버퍼의 양은 정제된 저온 상청액 2200리터에 대하여 75리터이다.
용출에 의해 얻어진 단백질 분획을 그 후에 통상의 수단(10kDa 및 필요에 따라 30kDa의 차단 문턱값(cut-off threshhold)을 갖는 카세트에 의한 한외여과와 pH 7에서 0.15M NaCl, 10mM 구연산 버퍼에 의한 투석)에 의하여 탈염 처리한다.
DEAE-Sephadex 상에서의 정제에 의하여 생성된 단백질 용출액을 본 발명에서는 <<PPSB 중간체 1>> 또는 <<PPSB-PI-1>>라고 한다.
상기 정제 방법 단계에서는, DEAE-Sephadex 단계에서 생생된 용출액을 다른 정제 단계를 수행하기 위하여 대기하는 동안에 PPSB-PI-1을 냉동할 수 있음이 판명되었다.
C-용매-세제 처리에 의한 바이러스 비활성화.
그 후 PPSB-PI-1를 용매-세제 혼합물 처리, 더욱 구체적으로는 (1% v/v) 폴리소르베이트 80-(0.3% v/v)트리-n-부틸포스페이트(TnBP) 처리에 의하여 바이러스 불활성화 처리한다. 이 바이러스 불활성화 처리는 24~25℃의 온도에서 적어도 6시간 수행한다.
폴리소르베이트 대용으로 다른 세제, 예를 들어 콜레이트(cholate) 또는 옥토시놀(Triton X100)을 TnBP 존재하에서 0.5~2%의 농도로, 15~30℃ 온도, 바람직하게는 25℃ 온도 근방에서 사용할 수 있다. 이 바이러스 불활성화를 위한 최소 인큐베이션 시간은 4시간이며, 12시간까지 연장할 수 있다. 통상적으로 pH는 6~8이고, 전체 단백질 농도는 10~40 g/L이다.
D-수산화인회석(HA) 상에서의 크로마토그래피.
D.1-겔 패키지
입자 크기 40미크론의 Macro prep ceramic hydroxyapatite(Biorad)을 크로마토그래피 겔로 사용하였다. 이 건조 겔을 pH 6.8에서 0.4M 인산염 버퍼 속에 현탁시킨 후, Pharmacia K50/30 컬럼 속으로 이송하였다. 이 패키지는 유속 100cm/h에서 달성되었다. 사용한 건조 겔의 양은 30g이며, 그 양은 패키지 겔의 50mL 컬럼을 제공한다. 이 컬럼을 5컬럼 부피비의 2M NaOH로 린스하고, 2M NaOH 속에 저장하였다.
D.2-컬럼 상에 주입할 PPSB-PI-1의 준비
상기 PPSB-PI-1를 필요에 따라 해동하고, 1% 폴리소르베이트 80과 0.3% TnBP 존재하에서 3시간 동안 바이러스 불활성화하였다. 그 후 이 바이러스 불활성화된 PPSB-PI-1를 필요에 따라 20mM 벤자미딘 용액으로 반으로 희석하고; 그 용액의 pH를 0.1M NaOH로 8로 조정하였다.
D.3-크로마토그래피:
상기 컬럼을 공업적 검출 셀이 부착된 Pharmacia UV 검출기에 연결하고, 유출액의 광학 밀도를 280nm에서 기록하였다. 상기 2M NaOH에 저장된 겔을 예비 평형 버퍼(0.4M 인산칼륨; pH 6.8) 5배 부피로 세척하였다.
그 후 그 컬럼을 평형 버퍼(0.01M 인산칼륨; 0.075M NaCl; 10mM 벤자미딘(필요시); pH 8) 15배 부피로 평형화하였다. 그 다음에 PPSB 용액을 100cm/h 유속으로 주입하고, 컬럼을 기준선에 복귀할 때까지 상기 평형 버퍼로 세척하였다.
예비 용출 버퍼(0.01몰 인산칼륨; 0.25M NaCl; 10mM 벤자미딘; pH 8 또는 0.03M 인산칼륨; 0.25M NaCl; 벤자미딘 10mM(필요시); pH 8)로 동일 유속으로 예비 용출을 행하여 예비 용출액을 5배 컬럼 부피 포집하였다. 그 후 그 겔을 동일 버퍼 15배 부피로 세척하였다.
용출 버퍼(0.5몰 인산칼륨; 0.075M NaCl; 10mM 벤자미딘(필요시); pH 8)로 동일 유속으로 용출을 행하여 용출액을 5배 컬럼 부피 포집하였다. 그 겔을 2M NaOH의 5배 컬럼 부피로 재생하여 2M NaOH 속에 저장하였다.
E-한외여과 및 투석
수산화인회석 상에서의 크로마토그래피에 의해 생성된 용출액을 10kDa의 차단 문턱값을 갖는 0.1㎡ 사토리우스 울트라사트 슬라이스 폴리설폰(Sartorius Ultrasart slice polysulfone) 카세트 상에서 한외여과 하였다.
그 용출액을 3배 농축하고 70오옴의 저항값이 얻어질 때까지(그 카세트 상에서의 주입 압력은 0.5bar이고 한외여과 유속은 45mL/분임) 주입용 정제수(pwi)에 대하여 일정한 부피로 투석하고, 그 후 투석 버퍼(구연산 3나트륨 3g/L; 0.13M NaCl; 라이신 2g/L; 아르기닌 2g/L; pH 7)의 5배 부피에 대하여 일정한 부피로 투석하였다. 그 후 제품을 2번 재농축하고, 카세트를 투석 버퍼로 린스하여 최종 부피를 초기 부피의 80%로 얻었다. 그 제품을 필요하다면, 15nm의 기공을 갖는 필터 상에서 연속적으로 여과하고, 최종적으로 -40℃에서 냉동 저장하였다.
F-분석
프로트롬빈 복합물(또는 PPSB)을 구성하는 응고인자 II(FII), 인자 VII(FVII), 인자 IX(FIX) 및 인자 X(FX)의 양 및/또는 농도를 분석하고, 응고를 유도하는 능력을 측정함으로써 트롬빈 활성을 측정하였다.
또한, C, S 단백질의 양 및/또는 농도를 Stago로부터 구입가능한 kits(<<Asserachrom® Total Protein S>> 및 <<Asserachrom® Protein C>>)에 의해 분석하였다.
인자 VII, IX, X 및 단백질 Z의 항원 분석은 Stago로부터 구입가능한 kits(<<Asserachrom® VII:Ag>>, <<Asserachrom® IX:Ag>>, <<Asserachrom® X:Ag>>, <<Asserachrom® Protein Z>> )에 의해 ELISA에 의해 수행하였다.
폴리소르베이트 80과 TnBP의 양 및/농도를 측정하였다.
실시예 2: 실험 결과
A: 컬럼 용량의 연구
인회석 컬럼의 용량을 상기한 동일 실험 조건 하에서, 겔 1mL 당 바이러스 불활성화된 PPSB-PI-1의 3, 5, 7 및 9mL의 투여량으로 시험하였다. 예비 용출은 행하지 않았다.
각각의 인자에 대하여 계산한 수율은 PPSB-PI-1 내의 응고 단위의 전체 양에 대한 수산화인회석 상에서 생성된 용출액 내의 응고 단위의 전체 양의 비율에 대응한다.
다음 표 1에 로딩양에 따라 얻은 수율을 기재하였다.
컬럼의 로딩양

PPSB-PI-1(mL)/겔(mL)		 FII 수율
(%)		 FVII 수율
(%)		 FIX 수율
(%)		 FX 수율
(%)
3
5
7
9		 88
91
108
93		 103
111
88
85		 112
111
106
96		 92
79
69
57
표 1: 겔 상에 로딩양에 따른 인자 II, IX, VII 및 X의 용출 수율.
이들 데이터를 도 1에 그래프로 나타내었다. 로딩양의 증가에 따라 FX 결합은 현저히 감소함을 알았다.
각각의 인자에 대하여 계산한 비결합 인자의 백분율은 초기 PPSB-PI-1 내의 응고 단위의 전체 양에 대한 비결합 분획물 내의 응고 단위의 전체 양의 비율에 대응한다. 비결합 인자의 백분율을 표 2에 나타낸다.
컬럼의 로딩양

PPSB-PI-1(mL)/겔(mL)		 비결합
FII
(%)		 비결합
FVII
(%)		 비결합
FIX
(%)		 비결합
FX
(%)
3
5
7
9		 <1
3
11
18		 <1
<1
5
8		 <1
<1
<1
<1		 5
14
26
35
표 2: 로딩양에 따른 겔 상에 유지되지 않은 인자 II, IX, VII 및 X의 양.
이들 데이터를 도 2에 그래프로 나타내었다. 도 2의 마지막 형태로부터, 인자 FII 및 FX가 수산화인회석 컬럼 상에 적게 결합하는 인자임을 명확히 알 수 있다.
또한 도 3은 이들 인자(FII 와 FX)의 비결합 인자 백분율은 모두 로딩양에 대하여 리니어하게 변동한다. FII 및 FX의 결합이 여전히 받아들일 수 있는 겔 1mL 당 PPSB-PI-1 5mL 로딩양이 유지되었다.
B: 예비용출의 영향
가능한 한 많은 오염 단백질을 제거할 목적으로, 30mM 인산염 버퍼에 의한 예비용출을 시행하였다. 상기 예비용출은 인자 II와 VII가 50mM의 인산염 농도로부터 관측되는 범위 내에서, 바람직하게는 20~40mM 인산염 버퍼, 더욱 바람직하게는 30mM 인산염 버퍼로 행한다. 운전 조건은 상술한 조건과 같으며, 사용된 단백질 로딩양은 겔 1mL 당 PPSB-PI-1 5mL이다.
상기 예비용출에서는 응고인자가 검출될 수 없었다. 그러므로 수율은 하기 결과에 의해 알 수 있는 바와 같이, 이 예비용출에 의하여 영향을 받지 않는다
시험
번호		 예비용출 FII:C
(%)		 FVII:C
(%)		 FIX:C
(%)		 FX:C
(%)
3
4
5
6		 0.25M NaCl
0.25M NaCl
0.25M NaCl, 30mM 인산염
0.25M NaCl, 30mM 인산염		 83
88
95
80		 86
103
80
81		 86
112
93
79		 68
92
69
72
표 3: 수행한 예비용출 형태에 대한 용출액 내에서의 인자 II, XII, VII 및 X의 양.
시험번호 30mM 인산염 예비용출액 내의 전체 단백질(mg) 용출액 내의 전체 단백질(mg)
3(인산염 예비용출 없음)
4(인산염 예비용출 없음)
5
6
7
8
9
10
11
12		 5
0
44
68
52
58
57
62
62
68		 1218
916
964
897
1078
1013
1061
1061
1125
1166
표 4: 인산염에 의한 예비용출 동안에 제거된 공정제된 단백질의 양.
SDS PAGE 겔에 의해 나타낸 바와 같이, 30mM 인산염 버퍼로 행한 예비용출에 의해서 더욱 단백질, 특히 고분자량(100~200 kD)의 단백질이 제거되었다.(도 4 참조)
E: 안티트롬빈과 헤파린의 첨가 영향.
정제 동안에 단백질 추출물 내에서 트롬빈의 활성도를 낮게 유지하기 위하여, 한외여과에 앞서서 정제 안티트롬빈 0.5U/mL(바람직하게는 FIX 단위당 안티트롬빈 0.1~0.04 단위) 및 헤파린 2U/mL을 수산화인회석 크로마토그래피 용출액 내에 첨가하였다. 실험 조건은 상술한 30mM 인산염 버퍼 내에서의 예비용출과 동일한 조건이다. 컬럼의 로딩양은 겔 mL 당 PPSB 5mL 였다.
E1: 수산화인회석 상에서 정제 후 투석된 용출액 내의 FII, FIX, FVII 및 FX 활성도.
Figure pct00001
표 5: 수산화인회석 상에서 정제 후 용출액 내의 인자 II, IX, VII 및 X 활성도와 트롬빈 활성도.
행한 시험은 그들 사이에 재현성이 있으며, 6h와 24h에서 측정한 트롬빈 활성도는 준 제로여서, 결과적으로 비타민 K 의존성 단백질 농축액이 의료 용도로 적합하였다(6시간 이상의 트롬빈 활성도는 트롬빈의 매우 적은 양(0.001 NIH 단위보다 훨씬 적음)에 해당한다).
E2: 수산화인회석 상에서 정제 후 투석된 용출액 내의 FII, FIX, FVII 및 FX 수율.
시험
번호		 FII:C

%		 FVII:C

%		 FIX:C

%		 FX:C

%
25
26
27
28		 57
64
76
85		 59
63
57
60		 72
63
77
70		 59
60
65
71
평균
표준편차
C.V.		 71
12.4
17.7		 60
2.5
4.2		 71
5.8
8.2		 64
5.5
8.6
표 6: 수산화인회석 상에서 정제 후 투석 또는 한외여과된 용출액 내의 인자 II, IX, VII 및 X의 수율.
인자 II와 IX의 수율은 평균이 70% 오더였고, 인자 VII와 X의 수율은 평균이 각각 60%와 64% 오더였다.
시험
번호		 FII:C

%		 FVII:C

%		 FIX:C

%		 FX:C

%
25
26
27
28		 66
-
97
85		 74
-
79
60		 77
-
72
70		 77
-
89
71
평균
표준편차
C.V.		 83
15.6
18.9		 71
9.8
13.9		 73
3.6
4.9		 79
9.2
11.6
표 7: 수산화인회석 상에서 정제로 생성된 용출액의 한외여과 후 인자 II, IX, VII 및 X의 수율.
한외여과 후 모든 인자들의 수율은 70~80% 오더였다.
시험
번호		 FII:C

U/mg		 FVII:C

U/mg		 FIX:C

U/mg		 FX:C

U/mg		 전체
단백질
mg/mL
25
26
27
28		 6.3
5.7
6.8
5.7		 2.8
2.7
2.7
2.7		 7.7
4.9
5.5
4.9		 6.8
6.3
6.8
6.3		 3
2.9
3.1
3.5
평균
표준편차
C.V.		 6.1
0.5
8.7		 2.7
0.1
1.8		 5.8
1.3
23.1		 6.6
0.3
4.4		 3.1
0.3
8.4
PPSB-PI-1 1.2 0.6 1 1.2 35
표 8: 수산화인회석 상에서 정제 후 투석된 용출액 내의 인자 II, X, VII 및 IX 비활성도.
본 발명의 수산화인회석 상에서의 정제 후 각각의 인자에 대하여 계산한 비활성도는 음이온교환 수지 상에서 크로마토그래피하여 얻어진 FII, FVII, FIX 및 FX의 농축액에 비하여 약 5배 증가하였다.
F: 수산화인회석 상에서의 정제 단계에 대한 결론
비타민 K 의존성 응고인자는 이온교환 겔에 비하여 인산칼슘(수산화인회석 타입)에 기초한 표면 상에 더욱 특이하게 결합하는데, 이것은 얻어진 제품의 순도를 설명하는 것이다. 수산화인회석 겔 상에서 용출 후 회수한 단백질을 분석한 결과, 관심의 단백질 농축액에 포함되어 있는 단백질은 75 내지 50kDa 사이의 분자량을 가지며, 이 분자량은 비타민 K 의존성 단백질의 분자량, 특히 프로트롬빈 복합물을 구성하는 다른 응고인자의 분자량에 대응된다.
하기 표 9는 바이러스 불활성화 후에 음이온교환 수지상에서의 정제(본 발명의 수산화인회석 상에서의 정제 대용)에 의하여 얻어진 단백질 농축액에 존재하는 단백질의 목록을 나타낸다. 상기 농축액에서, 비타민 K 의존성 단백질(FII, FVII, FIX, FX, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z)의 합계는 전체 단백질의 17%임을 알 수 있다.
단백질 % MW
IgM 0.30~0.40 900
C4bp 1.60~2 590
피브로넥틴 0.45~0.65 440
피브리노겐 0.65~1 330
C4 9~13 206
C3 0.55~0.75 180
C3c 0.45~0.65 180
C5 0.05~0.1 180
단백질 S 0.90~1.15 75
프로트롬빈(FII) 12~15 68.7
알부민 2.10~2.5 68
안티트롬빈 III 0.05~1.5 65
인자 X 1.25~1.75 59
단백질 C 0.20~0.50 57
인자 IX 0.15~0.45 55.4
단백질 Z 0.05~0.20 55
인자 VII 0.01~0.05 50
표 9: 본 발명의 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 대신에, 음이온교환 수지 상에서의 한 번의 정제 또는 제1 음이온교환 수지 및 제2 음이온교환 수지을 포함하는 정제에 의해 생성된 농축액 내에 존재하는 단백질의 목록 및 상대적 비율.
이와 대조적으로, 본 발명의 방법(수산화인회석 상에서의 크로마토그래피)으로부터 생성된 단백질 농축액은 비타민 K 의존성 단백질(FII, FVII, FIX, FX, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z)의 비율이 전체 단백질의 90~95% 오더를 함유한다.
이 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피로부터 생성된 농축액은 음이온교환 수지 상에서의 크로마토그래피로부터 생성된 중간체에 비하여 비활성도가 5~7배 증가한다. 게다가 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피에 의해서, 바이러스 불활성화 단계 동안에 사용한 폴리소르베이트 80 및 TnBP가 효율적으로 제거됨을 알았다.
마지막으로, 수산화인회석 크로마토그래피 용출액 내에 안티트롬빈 III과 헤파린을 첨가하면, 24h에서 트롬빈 활성이 없는 제품을 시스템적으로 얻을 수 있는 가능성이 있다.
마지막으로, 오염 단백질, 특히 고분자량의 오염 단백질이 대부분 제거되면, 적합한 여과 표면을 사용함으로써 15nm 기공을 갖는 막 상에서 제품을 여과할 수 있다(막 1㎡ 당 제품 약 10리터).
G: 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 후에 얻어진 농축액의 나노여과.
G.1- 나노여과의 실험적 수행
Planova 15N(Asahi)을 필터로 사용하였다. 그 필터는 친수성 구리-암모늄 셀룰로오스 내에 중공사로 구성되며, 기공은 15±2nm 이다.
그 필터의 평형 버퍼는 0.13M 염화나트륨, 구연산 3나트륨2H2O 3g/L, 라이신HCl 2g/L, 아르기닌HCl 2g/L 및 주입용 정제수(pwi)로 구성된다. 이 버퍼는 20~25℃의 온도에서 pH 7.0±0.05, 저항값 75Ω.cm, 오스몰 농도 314mosmol/kg H2O로 조정되었다.
그 필터들은 별개로 준비하고, 500mbar 오더의 압력 하에서 주입용 정제수(pwi)로 린스하였다. 그 필터의 완전성은 주입용 정제수로 린스한 후에 그리고 사용 전에 조절하였다. 공기압력 1000±50mbar 하에서 외부 재킷 내에서 공기 누기 시험 또는 <<누출 시험>>을 행하여, 섬유를 통한 공기 유통이 없음을 체크하였다. (Asahi Planova Filter용 완전성 시험의 SOP). 용액을 여과하기 전에, 그 필터를 배합 버퍼에 의해 평형화하였다. 구체예로, 그 배합 버퍼는 0.13M NaCl, 아르기닌 2g/L, 라이신 2g/L, 구연산나트륨 3g/L로 구성되며, pH는 6.9~7.1이다. 또 다른 구체예로, 그 배합 버퍼는 아르기닌 10g/L, 만니톨 35g/L로 구성되며, pH는 6.9~7.1이다. 또 다른 구체예로, 그 배합 버퍼는 구연산나트륨 1g/L, 만니톨 35g/L로 구성되며, pH는 6.9~7.1이다.
그 15nm 여액의 pH와 저항값을 체크하였다(pH 7.0±0.1, 오스몰 농도 314±10mosmol/kg H2O).
상기한 세라믹 수산화인회석 상에서의 정제(필요에 따라 투석)로 생성된 용출액을 담은 플라스크를 37℃±2℃ 욕조에서 해동하였다. Planova 15N 15nm 필터 상에서의 여과 전에 필요에 따라 0.2 ㎛ 셀룰로오스 트리아세테이트 필터(Sartolab P-Sartorius) 상에서 예비 여과를 행하였다.
상기 용출액의 여과는 일정한 압축 공기압 500±50mbar 하에서 행하였다. 그 압력 측정은 디지털 압력계에 의해 15nm 필터의 주입구에서 행하였다. 15nm 필터 상에서의 여과로부터 생성된 용출액을 저울 위에 놓은 플라스크 내의 필터의 하부 배출구에서 포집하였다. 여과 유속을 결정하기 위하여 정해진 시간 간격으로 여과 중량을 측정하였다. 여과는 임의 재순환 없이 전면 수행하였다.
여과 종료 시점에서, 막의 완전성을 체크하고 또한 여과단계의 실효성을 입증하기 위하여 피터의 외부 쟈켓을 채운 후에 공기 누출 시험(<<누출 시험>>)을 행하였다.
나노여과 단계의 재현성을 시험하기 위하여, 상기 시험들은 하기 표 X에 기술한 표준 운전 조건을 채용하여 행하였다.
운전 파라미터 값
온도 ℃ 20±2
가한 압력 mbar 500±50
전체 단백질 g/L 5.0±1.0
인자 IX:C 전체 IU 약 3200
평균 단백질 로딩양 g/㎡ 50±10
부피 로딩양 l/㎡ 10.0±1
표 10: 15nm 나노여과 동안 행하여진 운전 조건 및 운전 파라미터.
나노여과 후, 응고인자 FII, FVII, FIX 및 FX의 양 및/또는 농도를 종래 공지의 기술에 의하여 측정하였다. 전체 단백질 양을 구하기 위하여 동일한 조작을 행하였다.
G.2: 수산화인회석 상에서의 정제로부터 생성된 용출액의 나노여과 후에 얻어진 결과.
G.2.1-나노여과 파라미터 추적
여과 압력은 여과 시험 동안 평균 500±100mbar를 유지시켰다(도 5 참조).
여과 유속의 변화를 나노여과 동안 측정하였다(도 6 참조). 여과 유속은 여과 중량에 따라 일정하게 감소함이 관찰되었다. 행하여진 모든 시험에서도 같은 프로파일이 얻어졌다.
나노여과 시험 번호 초기 유속 g/분 최종 유속 g/분 비율 %
97E 2703 2.3 0.4 17.4
97E 0204 3.0 0.9 30.0
97E 0804 2.0 0.6 30.0
97E 0904 1.8 0.6 33.3
97E 1504 1.8 0.3 16.7
표 11: 나노여과 유속 추적.
Asahi 필터 공급자의 추천에 따라, 최종 유속은 초기 유속의 10%보다 커야 한다. 10%보다 작을 경우, 작은 입경의 필터 기공이 막힐 것으로 생각된다.
연속적으로 여과를 행하면, 막의 기공이 넓어져서 바이러스의 통과가 실제적으로 또한 잠재적으로 증진될 수 있다.
최종/초기 나노여과 유속의 비율은 행하여진 모든 시험에 적용하였다.
나노여과
시험 번호		 여과시간
분		 용량
L/㎡		 평균 유속
L/hour/㎡		 용량
g/㎡
97E 2703 138 11.4 4.9 50.2
97E 0204 70 9.7 8.0 42.7
97E 0804 89 10.0 6.8 49.0
97E 0904 99 10.5 6.4 52.5
97E 1504 148 10.7 4.3 51.4
표 XII: 여과 파라미터 추적
평균 여과 시간은 2시간 오더이었다. 평균 부피 용량은 10L/㎡ 막 오더이고, 이것은 ㎡당 단백질 약 47.9±4.7g의 용량에 상당한다.
G.2.2-나노여과 후 전체 단백질과 응고인자의 밸런스
나노여과
시험번호		 부피 Vo
mL		 전체 단백질 15N 투과
mL		 전체 단백질 수율
%
g/L mg g/L mg
97E 2703 120.0 4.6 552 114.6 4.4 504 95.7
97E 0204 102.0 4.8 490 108.7 4.4 478 97.7
97E 0804 112.0 6.4 717 116.7 5.9 689 96.0
97E 0904 110.0 5.5 605 121.4 5.0 607 100.3
97E 1504 112.0 4.8 538 112.0 4.8 538 94.0
평균/표준편차 111.2 ±
6.4		 5.2 ±
0.7		 580 ±
86		 114.7 ±
4.8		 4.9 ±
0.6		 563 ±
85		 96.7 ±
2.4
표 13: 전체 단백질 밸런스
전체 단백질 나노여과 수율은 90% 이상으로 우수하다. 다른 배치로부터의 원재료로 이 시험을 행하였고, 그 결과 완전히 재현성이 있음이 판명되었다.
나노여과
시험번호
 FII:C
IU/mL		 FVII:C
IU/mL		 FIX:C
IU/mL		 FX:C
IU/mL
15N 전 15N 후 15N 전 15N 후 15N 전 15N 후 15N 전 15N 후
97E 2703 30 36 16.0 15.0 25 23 24 22
97E 0204 32 28 19.0 18.0 27 25 30 27
97E 0804 39 39 30.0 26.0 32 35 39 36
97E 0904 34 39 20.0 17.0 31 26 32 29
97E 1504 30 30 19.0 19.0 29 29 29 29
평균/
표준편차		 33 ±
3.7		 34.4 ±
5.1		 20.8 ±
5.4		 19.0 ±
4.2		 28.8 ±
2.9		 27.6 ±
4.7		 30.8 ±
5.4		 28.6 ±
5.0
표 14: 15nm 나노여과 단계 동안 응고인자 밸런스
모든 응고인자에 대하여 다른 시험에서도 재현성이 우수하였다.
세라믹 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 단계에 의하여, 비타민 K 의존성 인자 모두가 양호하게 회수되었다. 15nm 나노여과 전 후의 농도가 매우 근접하므로, 4개의 응고인자에 대하여 높은 여과 수율을 나타내고 있음을 알았다.
나노여과
시험번호
 S.A.FII
IU/mg		 S.A.FVII
IU/mg		 S.A.FIX
IU/mg		 S.A.FX
IU/mg
15N 전 15N 후 15N 전 15N 후 15N 전 15N 후 15N 전 15N 후
97E 2703 6.5 8.2 3.5 3.4 5.4 5.2 5.2 5.0
97E 0204 6.7 6.4 4.0 4.1 5.6 5.7 6.3 6.1
97E 0804 6.1 6.6 4.7 4.4 5.0 5.9 6.1 6.1
97E 0904 6.2 7.8 3.6 3.4 5.6 5.2 5.8 5.8
97E 1504 6.3 6.3 4.0 4.0 6.0 6.0 6.0 6.0
평균/
표준편차		 6.4 ±
0.24		 7.1 ±
0.88		 4.0 ±
0.47		 3.9 ±
0.44		 5.5 ±
0.36		 5.6 ±
0.38		 5.9 ±
0.42		 5.8 ±
0.46
표 15: 15nm 나노여과 동안 시간에 따른 비활성도의 변화.
모든 응고인자에 대한 비활성도는 나노여과 전 후 동일한 오더이었다. 인자 IX에 대한 비활성도는 모든 시험에서 5 이상이었다.
나노여과
시험번호		 FII:C
%		 FVII:C
%		 FIX:C
%		 FX:C
%
97E 2703 120.0 100.0 104.5 95.7
97E 0204 93.2 101.0 98.7 95.9
97E 0804 104.2 90.3 114.0 96.2
97E 0904 126.6 93.8 92.6 100.0
97E 1504 84.8 107.5 98.4 95.2
평균/
표준편차		 105.8 ±
17.6		 98.5 ±
6.7		 101.6 ±
8.1		 96.6 ±
1.9
표 16: 15nm 나노여과 후 응고인자 수율.
모든 응고인자에 같은 오더(90% 이상)의 수율이 관찰되었다.
G.2.3-트롬빈 활성도 측정
트롬빈 활성도는 시료의 혼탁화에 의하여 혈전의 발생을 검출하는 자동 장치로 측정하였다.
이 분석은 응고 시험, 시료 내에 소량의 잔류 트롬빈을 검출하는 민감도에 대응한다. 37℃에서 6시간 후 및 24℃에서 24시간 후에 응고가 없으면, 그 결과는 순응한다.
수산화인회석 상에서의 정제로부터 생성된 용출액의 나노여과 동안에 트롬빈이 생성되지 않음이 관찰되었다. 그 트롬빈 활성도 측정 결과는 37℃에서 6시간 후에 응고가 없음을 나타낸다. 그러나, 행한 시험에서, 24시간에서 혈전이 형성되기 시작하며, 이 결과는 욕조에서 행하는 전통적인 시험에 의해 확인된다.
안티트롬빈 III과 같은 단백질분해효소(protease) 억제제의 첨가가 24시간에 관찰된 잔류 트롬빈 활성을 소멸시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 시험을 행하였다.
상기 단백질분해효소 활성도는 특정 색소기판(chromogenic substrate)을 사용하여, 분광광도계에 의해 측정하였다. 단백질분해효소에 의한 특정 색소기판의 가수분해는 405nm에서 검출된 황색 분자의 이탈을 수반하며, 발생 속도는 시험한 용액의 효소 농도에 비례한다.
단계 S 2238
U OD		 S 2238 + i 2581
U OD		 활성도 IIa
△U OD		 S 2238 + AT-III
+ 헤파린
PPSB-PI-1 97E 1106 0.0172 00.0142 0.0030 0.0149
투석된 HA 용출액 97E 1106 0.0314 0.0200 0.0114 0.0339
15nm 여과액
97E 2506
97E 1007
97E 1607
97E 1707		 0.0065 0.0020 0.0045 0.0014
0.0075 0.0015 0.0045 0.0021
0.0090 0.0021 0.0069 0.0017
0.0103 0.0018 0.0085 0.0018
표 17: 색소 기판 S 2238으로 트롬빈 활성도 측정
상기 기판 S2238은 특정의 트롬빈 기판이다. 억제제가 없으면, 시험한 모든 시료에서 트롬빈 타입의 잔류 활성이 관찰되었다. 이 활성은 트롬빈 i 2581 억제제의 첨가에 의해 실질적으로 억제되었으며, 안티트롬빈 III(AT-III)과 헤파린의 혼합물의 존재하에서도 동일하게 억제되었다. 그러므로 이 트롬빈은 헤파린의 존재 하에서 트롬빈의 생리학적 억제제 AT-III에 의하여 효율적으로 중화된다.
색소기판으로 트롬빈의 활성도를 측정한 잔류 트롬빈 활성도는 15nm 여과액에서 0.1 IU/mL 미만의 활성도에 대응한다.
아프로티닌(aprotinin)도 잔류 단백질분해효소 억제제로서 좋은 효율을 갖는다. 그러나, 이 억제제의 소(bovine) 기원에 의해, 인간의 치료적 용도로 기획된 제품의 정제로는 사용되지 않는다.
G.2.4-SDS Page 전기영동에 의한 단백질 농축액의 특성.
도 7에 나타낸 바와 같이, 고분자량의 단백질 대부분은 HA 세라믹 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피로부터 비흡착된 분획물 내에서 제거되었다. 15nm 나노여과 단계에서 조성물 차이는 없어, 이 15nm 여과액은 모든 포인트에서 나노여과 전의 단백질 농축액과 거의 같음이 판명되었다.
주요 66kDa 밴드는 실질적으로 단백질 농축액의 전체 단백질의 약 60%을 차지하는 프로트롬빈에 대응한다.
G.2.5-면역블롯에 의한 인자 IX의 특성.
환원제 없이 균질한 10% SDS Page 겔 상에서의 전기영동 후에 면역블롯(immunoblot)을 제조하였다. 나이트로셀룰로오스 상에 옮겨 알부민으로 포화시킨 후, 항인자 IX 단클론 1차항체(Sigma Ref.F1020)와 접촉시켰다. 과산화효소(BioRad)로 표지된 항마우스2차항체에 의한 표지는 자기방사도법 필름(Pierce) 상에서의 ECL 기법에 의한 현상 전에 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다. 비특정 밴드의 존재가 PI-1에 대응하는 웰 내에서 관찰되었다.
반대로, 세라믹 수산화인회석 컬럼으로부터 투석 용출액은 하나의 균질한 밴드만을 나타낸다. 또한, 15nm 나노여과 후에 현저한 차이는 없었고, 대조구로서 사용한 인자 IX HP와도 차이가 없었다.
G.2.6-결론
세라믹 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피로 생성된 투석 용출액의 Planova Asahi 15nm 필터 상에서의 나노여과는 표준화된 운전 조건에 의한 재현성 있는 방법으로 행하였다.
여과 중량에 비례한 유속의 감소가 재현성 있게 나타났다. 필터의 평균 부피 용량은 10L/㎡ 막 오더이고, 이것은 평균 용량 47.9±4.7g 단백질에 대응한다.
전체 단백질 밸런스는 평균 수율 91.1±14.0%이며, 이것은 응고인자 FII:C 99.4±22.2, FVII:C 91.5±18.2, FIX:C 95.8±16.1 및 FX:C 90.5±15.1 수율과 유사하다.
다양한 인자에 대한 비활성도는 나노여과 전과 후에 같은 오더이다.
SDS Page 전기영동에 의한 특성은 15nm 여과 전후에 현저한 차이가 없다.
H-제조 동안 용액의 안정성을 최적화하기 위한 시험.
15nm 상에서 여과되고 그리고 매우 낮은 트롬빈 활성을 갖는 수산화인회석으로부터 생성된 용출액을 얻을 목적으로, 다른 파라미터를 변경하면서 보충 시험을 행하였다.
시험 번호 배합 번호 원재료 벤자미딘
mmol/L		 AT III
U/mL		 헤파린
IU/mL		 트롬빈
활성
97E 1806 a 냉동 50 - 2.0 유순
97E 1007 a 신선 - 2.0* 5.0 유순
97E 2312
97E 3012		 b 신선 - 0.5** 2.0 유순
98E 0801
98E 1301		 b 신선 - 0.5** - 유순
표 18: 세라믹 수산화인회석 용출액을 안정화하기 위하여 행한 시험 목록.
* AT-III을 크로마토그래피 전에 용매-세제 처리의 단계에서 첨가.
** AT-III을 한외여과 전에 첨가.
배합 a: 0.13M NaCl-0.010M 구연산나트륨, 라이신HCl 2.0g/L, 아르기닌HCl 2.0g/L, pH 7.0±0.1
배합 b: 0.13M NaCl, 0.010M 구연산나트륨, pH 7.0±0.1
시험 결과를 서로 비교하기 위하여, 나노여과 단계를 행하기 위한 파라미터를 변경하지 않았다.
97E 1806 시험에서, 50mL 벤자미딘이 버퍼에 첨가되고, 2IU/mL 헤파린이 15nm 나노여과 단계 전에 첨가되었다. 기공 15nm의 필터 상에서 나노여과로부터 생성된 단백질 농축액은 트롬빈 활성이 없었다.
97E 1007 시험에서, 5IU/mL 헤파린과 2U/mL AT-III이 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 단계 전에 용매-세제 처리의 단계에 첨가되어, 12.5L/㎡의 양호한 필터링이 얻어졌고 또한 응고(트롬빈 활성)가 없음이 관찰되었다.
97E 2312와 97E 3012 시험에서, 2IU/mL 헤파린과 0.5IU/mL AT-III이 나노여과 전에 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피로 생성된 용출액 내에 직접 첨가되었다. 기공 15nm의 필터 상에서 나노여과로부터 생성된 단백질 농축액은 트롬빈 활성이 없었다.
98E 0801와 98E 1301 시험에서, 헤파린 부존재 하에, 0.5IU/mL AT-III이 나노여과 전에 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피로 생성된 용출액 내에 첨가되었다. 이 모두, 기공 15nm의 필터 상에서 나노여과로부터 생성된 단백질 농축액은 트롬빈 활성이 없었다.
그러므로 안티트롬빈 III은 본 발명의 트롬빈 복합물을 함유하는 단백질 농축액의 양호한 트롬빈 활성 억제제를 형성한다. 또한 헤파린은 AT-III의 공인자로 작용하여, AT-III의 억제활성을 잠재적으로 조력한다. 따라서 안티트롬빈의 최고의 효율은 헤파린이 그 수산화인회석 크로마토그래피 용출액에 첨가되었을 때 얻어진다. 안티트롬빈만이 수산화인회석 상에 거의 결합하지 않는 것 같다.
I- 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 단백질 농축액과 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 대신에 이온교환 수지 상에서의 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 단백질 농축액의 비교.
특성 수산화인회석 대신에 음이온교환 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 농축액 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 나노여과된 농축액
전체 단백질(mg/mL) 32.0±7.5 5.0±0.6
SA IU FIX/mg 0.8±0.2 5.9±0.4
FII IU/mL 40.0±8 35.0±4.8
FVII IU/mL 26.5±8.5 19.0±3.8
FIX IU/mL 25.5±5.5 27.8±4.2
FX IU/mL 40±8 29.2±4.7
37℃ 6시간에서의 트롬빈 활성 없음 없음
25℃ 24시간에서의 트롬빈 활성 없음 없음
헤파린 IU/mL FIX 0.1~0.25 0.1~0.25
안티트롬빈 IU/mL 없음 0.5~1
표 19: 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피 대신에 이온교환 크로마토그래피로 정제한 PPSB의 조성물과 본 발명에 의한 15N 나노여과 농축액 조성물의 비교.
표 19 결과로부터, 본 발명의 범위에서 행한 세라믹 수산화인회석 상에서의 크로마토그래피에 의하여 얻어진 비타민 K 의존성 단백질이 본 발명의 수산화인회석 대신에 제2 양이온교환 수지를 사용하여 얻어진 비타민 K 의존성 단백질보다 정제 레벨이 상당히 우수함을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 나노여과 농축액 내의 전체 단백질 중 70~80%가 비타민 K 의존성 인자인 반면, 수산화인회석 대신에 제2 양이온교환 수지를 사용하여 얻은 농축액에는 전체 단백질 중 15~17%만이 비타민 K 의존성 인자였다.
또한 프로트롬빈 복합물을 구성하는 응고인자의 각각의 비율은 상술한 양쪽의 방법에 의하여 얻어진 농축액 내에서 유사하다.

Claims (19)

  1. a) 혈장 저온침전물의 상청액을 준비하는 단계,
    b) 상기 상청액을 음이온교환 수지 상에 도포하여, 프로트롬빈 복합물과 고분자량의 단백질을 함유하는 용출액으로 용출하는 단계,
    c) 상기 단계 b)에서 생성된 용출액을 수산화인회석 컬럼 상에 도포하는 단계, 및
    d) 상기 프로트롬빈 복합물을 함유하는 용출액으로 용출하는 단계,
    를 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    예비 용출 단계 cl)을 더 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법으로서,
    상기 예비 용출은 pH 6.5~8.5, 바람직하게는 약 pH 8에서, 0.005~0.05M, 적합하게는 0.01~0.05M, 더욱 적합하게는 0.02~0.05M, 바람직하게는 0.03M 농도의 인산나트륨 또는 인산칼륨 버퍼로 수행하며, 또 상기 버퍼는 NaCl을 적합하게는 0.25M 농도로 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 용출 단계 d)는 0.075M NaCl, 0.5M 인산칼륨 버퍼, pH 8에서 수행하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b) 및/또는 단계 d)에서 생성되는 용출액의 바이러스 불활성 단계를 적어도 하나 더 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 바이러스 불활성 단계는 단계 b)에서 생성되는 용출액을 용매-세제 처리의 형태로, 바람직하게는 Tween(폴리소르베이트 80)-TnBP 혼합물 존재하, 더욱 바람직하게는 1%(v/v) 폴리소르베이트 80 - 0.3%(v/v) TnBP 혼합물 존재하에서 수행하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    단계 d)에서 생성되는 용출액을 나노여과의 형태로, 바람직하게는 15~100nm의 기공을 갖는 필터 상에서, 더욱 바람직하게는 15nm의 기공을 갖는 필터 상에서 수행하여 적어도 하나의 바이러스 제거 단계를 더 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b) 및/또는 단계 d) 후에 정용여과(diafiltration)-한외여과 단계를 적어도 하나 더 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)는 2개의 다른 음이온교환 수지 상에서 수행되는 2개의 서브 단계들을 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)의 음이온교환 수지는 디에틸아미노에탄(DEAE), 폴리에틸렌이민(PEI) 및 4급 아미노에탄(QAE)으로부터 선택되는 양전하 기, 바람직하게는 DEAE 타입을 갖는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b) 또는 단계 d) 후에 트롬빈의 억제제, 바람직하게는 안티트롬빈 III 또는 안티트롬빈 III과 헤파린의 혼합물을 첨가하는 공정을 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 단백질 C, S 및 Z과 같은 비타민 K 의존성 다른 단백질을 더 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    냉동-건조 및/또는 약학적으로 허용가능한 보조약 또는 캐리어 첨가와 같은 최종 추가적 배합 공정을 포함하는 프로트롬빈 복합 조성물의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 얻어지는 프로트롬빈 복합 조성물로서,
    면역 글로불린 바람직하게는 IgM의 농도는 0.1% 미만, 및/또는 피브리노겐 농도는 0.1% 미만, 및/또는 피브로넥틴 농도는 0.1% 미만 및/또는 보체(complement) 인자의 농도는 0.1% 미만인 프로트롬빈 복합 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    FIX의 평균 비활성도(specific activity)는 단백질 mg 당 적어도 4 IU인 프로트롬빈 복합 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z을 더 포함하는 프로트로빈 복합 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    인자 II(FII), 인자 VII(FVII), 인자 IX(FIX), 인자 X(FX), 단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z로 구성된 비타민 K 의존성 단백질은 조성물 전체 단백질의 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%인 프로트롬빈 복합 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약으로서의 프로트롬빈 복합 조성물.
  18. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    비타민 K 의존성 인자 결핍, 또는 항비타민 K 과량 투여와 관련된 출혈 사고를 치료 또는 예방하기 위한 의약으로서의 프로트롬빈 복합 조성물.
  19. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    인자 II 또는 인자 X의 선천적 또는 후천적 결핍과 관련된 출혈 사고를 치료 또는 예방하기 위한 의약으로서의 프로트롬빈 복합 조성물.
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