SK139099A3

SK139099A3 - Immunotolerant prothrombin complex preparation

Info

Publication number: SK139099A3
Application number: SK1390-99A
Authority: SK
Inventors: Hans-Peter Schwarz; Peter Turecek
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2000-06-12
Also published as: AU6812198A; ES2160410T3; PT973544E; CA2285935C; NO994822L; WO1998044942A1; DK0973544T3; EP0973544B1; JP3976351B2; DE59800935D1; CA2285935A1; ATE202483T1; BR9807936A; JP2001524953A; AU737566B2; NO994822D0; US6358534B1; EP0973544A1

Description

IMUNOTOLERANTNÉ FARMACEUTICKÉ PRÍPRAVKY PROTROMBÍNOVÉHO KOMPLEXU, SPÔSOB ICH VÝROBY A ICH POUŽITIE

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutického prípravku na ošetrovanie porúch zrážanlivosti krvi, obzvlášť pacientov s inhibíciou faktora VIII. Vynález sa ďalej týka spôsobu výroby takýchto prípravkov a ich použitia.

Doterajší stav techniky

Zrážanie krvi je vyvolané radom po sebe nasledujúcich reakcii rôznych proteínov prípadne enzýmov. Nedostatkom faktorov zrážanlivosti krvi sa zabráni tvorbe fibrínu z fibrinogénu a tým uzatvoreniu rany; následkom je krvácanie. K takémuto prípadu dochádza pri hemofílii A. Tá je najrozšírenejším ochorením krvácavosti a je vyvolaná nedostatkom faktora VIII. Na substitučné ošetrenie hemofílie A sa používajú preparáty, ktoré obsahujú faktor VIII. Ošetrenie týmito preparátmi vedie vo väčšine prípadov k rýchlemu zastaveniu krvácania.

Existujú však tiež pacienti, u ktorých sa vyskytuje nielen nedostatok faktora VIII, ale sa vyvinula i tlmiaca látka (inhibítor), pôsobiaca proti faktoru VIII. Ďalšia skupina pacientov vykazuje inhibítory faktora VIII, bez toho aby trpela hemofíliou A. Podľa disponibilného množstva inhibítora faktora VIII sa inhibuje účinok privedeného faktora VIII jeho neutralizáciou.

Na ošetrenie pacientov s inhibíciou faktora VIII sa teraz ponúkajú prípravky na báze frakcií plazmy, ktoré obsahujú zmes faktorov zrážanlivosti. Tieto frakcie plazmy môžu napríklad obsahovať faktory protrombínového komplexu (faktor II, VII, IX a X). Prípravok podporujúci zrážanlivosť krvi s aktivitou faktor Vlll-Inhibítor-Bypass (FEIBA® TIM 4, firma IMUNO AG) sa získa

31309/H napríklad podľa AT-B 0 368 883 spracovaním kryozvyšku. Tento prípravok obsahuje rovnako faktory zrážania II, VII, IX a X.

Účinok preparátu FEIBA je na základe tohto komplexného zloženia mnohostranný. Mariani a spol. (Thrombosis Res. 31, 475-488 (1983)) uvádza ako princíp účinnosti faktor VII v jeho aktivovanej podobe. Bolo zistené, že po infúzii prípravku FEIBA sa objaví zvýšený obsah faktora Vila v plazme hemofylikov.

Úlohu faktora Vila v koncentrátoch protrombínových komplexov s „Faktor Vlll-Bypassing-Aktivity“ diskutuje rovnako Teitel (Thrombosis and Haemostasis 66 (5) 559-564 (1991)). Zároveň sa pojednáva tiež princíp účinku faktora Xa v preparátoch tohto druhu. Skúmané koncentráty protrombínového komplexu obsahovali faktor Vila, vyjadrené pomerom aktivity faktora VII k antigénu faktora VII 2,1 a 2,5.

Terapeutický prípravok obsahujúci protrombín vyrobený podľa EP 0 044 343-B1 je vhodný na ošetrenie inhibitorov faktorov zrážania a obsahuje jeden aktivovaný protrombínový komplex, u ktorého sú· faktory čiastočne aktivované. Podiel faktora Vila predstavuje 8-80 jednotiek/ml. Koncentrácia faktora IX je v oblasti 15 až 112 jednotiek/ml. Obdobne predstavuje obsah faktora Vila, vztiahnuté na faktor IX, 0,07 - 5,3 E faktor Vlla/E faktor IX. Vinazzer (Thromb. Res. 26, 21-29(1982)) ukazuje rozdiely prípravku UTOPLEX, ktorý sa vyrobí podľa EP 0 044 343 a FEIBA. Ako je uvedené, vyznačuje sa UTOPLEX vyšším obsahom trombínu (faktor Ha), merané v jednotkách NIH, v porovnaní s FEIBA (pozri tabuľka 1, str. 24).

Ále tiež vysoko čisté prípravky faktora Vila sá navrhujú na terapiu inhibovaných stavov faktorov zrážania (napríklad EP 0 082 182-B1 a Hedner a spol. (Haemostasis 19, 335-343 (1989)).

Výhodou prípravkov faktora Vila je neprítomnosť faktora VIII. Obsah faktora VIII v prípravkoch protrombínových komplexov alebo v aktivovaných prípravkoch protrombínových komplexov ako napríklad FEIBA spôsobuje totiž u pacientov s funkčnou inhibícou faktora VIII, že tieto inhibujúce protilátky sú

31309/H opätovným podávaním faktora VIII boostované , čím sa stav inhibovanej hemofílie prechodne dokonca zhorší.

Bolo ale zistené, že k efektívnemu zastaveniu krvácania pri hemofílii inhibíciou faktora VIII sa prípravky faktora Vila v ich účinku podriaďujú prípravkom faktorov protrombínového komplexu (Turecek P. a spol., Thrombosis & Haemostasis, 1997, str. 222).

Úlohou predloženého vynálezu preto je dať k dispozícii prípravok, ktorý má efektívnosť prípadne účinnosť prípravkov faktorov protrombínového komplexu, bez toho, že by vykazoval nežiaduce imunologické vedľajšie reakcie prípravkov takéhoto druhu.

Podstata vynálezu

Vyššie uvedená úloha je vyriešená tak, že podľa predloženého vynálezu je daný k dispozícii imunotolerantný farmaceutický prípravok protrombínového komplexu, obsahujúci faktory II, IX, X a prípadne VII s minimálnym obsahom antigénu faktora VIII.

Obsah antigénu faktora VIII prípravku podľa vynálezu predstavuje výhodne menej ako 10 %, obzvlášť menej ako 5 %. Obsah faktora VIII je výhodne menší ako 0,1 faktor VIII : C antigén/E FEIBA. Pri zvlášť výhodnej forme uskutočnenia leží obsah antigénu faktora VIII dokonca pod 0,03/E FEIBA, ešte výhodnejšie pod 0,02/E FEIBA a najvýhodnejšie pod hranicou dokázateľnosti.

, » (

Zistenie, že obzvlášť pri ďalšom čistení faktorov protrombínového komplexu z plazmy alebo frakcie plazmy môže byť obsah faktora VIII a prípadne tiež obsah fosfolipidov redukovaný takým spôsobom, zatiaľ čo aktivita faktorov protrombínového komplexu zostáva ďalekosiahle zachovaná, je potrebné považovať za prekvapujúce.

Obzvlášť obsahuje farmaceutický prípravok podľa vynálezu najmenej faktory IXa, Xa a Vila a vykazuje aktivitu FEIB, skracuje teda čas zrážania

31309/H plazmy deficitnej faktorom VIII s funkčným inhibítorom (k tomu pozri napríklad AT-B 350 726). .

Prípravok podľa vynálezu sa môže vyrábať z plazmy alebo z frakcie plazmy. Frakcia plazmy sa môžu vyrobiť z plazmy, obzvlášť humánneho pôvodu, chromatografickým spracovaním, zrážaním alebo centrifugáciou, alebo sa použije zvyšok po kryoprecipitácii.

Frakcia plazmy obsahuje faktory závislé na vitamíne K ako faktory protrombínového komplexu, ale výhodne sú obsiahnuté tiež proteíny S, C a/alebo Z.

Pri jednej obzvlášť výhodnej forme uskutočnenia neobsahuje prípravok fosfolipidy. Výhodne predstavuje hornú hranicu obsiahnutých fosfolipidov 0,1 nmol/E FEIBA (ku stanoveniu pozri príklady).

Na základe neprítomnosti fosfolipidov sa môže zmierniť prípadne zamedziť tvorbe nežiaducich protilátok proti faktoru VIII.

Podľa predloženého vynálezu je daný k dispozícii tiež spôsob výroby tohto prípravku. Tento spôsob zahrňuje nasledujúce kroky :

a) poskytnutie plazmy alebo frakcie plazmy obsahujúcej faktory II, IX, X a prípadne VII,

b) uvedenie plazmy alebo frakcie plazmy do kontaktu s nosným materiálom, prípadne za prítomnosti detergentu, takže sa oddelí faktor VIII a prípadne fosfolipidy od faktorov II, IX, X a prípadne VII,

c) čistenie plazmy alebo frakcie plazmy, a

d) získanie frakcie obsahujúcej faktory II, IX, X a prípadne VII.

Pri výhodnom variante sa kroky b) a c), prípadne b), c) a d) vykonávajú ako jeden procesný krok.

V prípade použitej frakcie plazmy výhodne ide o plazmu s najmenej intermadiárnou čistotou.

31309/H

Ako prípravok s intermediárnou čistotou sa rozumie taká frakcia plazmy, ktorá je analogická definícií intermediárnej čistoty preparátov faktora VIII (k tomu pozri príklad Wood Clivé (ed.), Factor VIII: Purity and prophylaxis, Royal Society of Medicine).

Sprievodné proteíny, ktoré sa neodstránili chromatografickým čistením, môžu tak byť v preparáte intermediárnej čistoty ešte obsiahnuté.

Ako východiskové preparáty sa môžu použiť tiež obvyklé, na trh dodávané prípravky faktorov protrombínového komplexu, ako napríklad FEIBA S-TIM 4, IMUNO alebo aktivovaný protrombínový komplex.

Ako zodpovedajúce čistiace procesy sa použijú metódy známe podľa stavu techniky, výhodne sa vykonáva chromatografické spracovanie, zrážanie alebo centrifugácia. Ako frakcie plazmy sa môžu použiť tiež zvyšky po kryoprecipitácii.

Nosným materiálom je materiál vhodný na chromatografiu, filtráciu a/alebo nanofiltráciu. V prípade filtrácie ide obzvlášť o afinitnú alebo membránovú filtráciu.

Pokiaľ sa použije predčistený materiál, napríklad materiál predčistený pomocou iónomeniča, môže sa readsorpcia vykonať za zmenených podmienok na inom nosnom materiáli, výhodne na rovnakom nosnom materiáli, aký sa použil na predčistenie.

V jednej výhodnej forme uskutočnenia je nosný materiál špecifickým nosným materiálom pre faktor VIII, obzvlášť matrica vhodná na afinitnú chromatografiu. Obzvlášť výhodne sa použije matrica obsahujúca vWF.

Na nosný materiál takéhoto druhu sa výhodne adsorbuje faktor VIII a prípadne fosfolipid, zatiaľ čo faktory II, IX, X a prípadne VII sa neviažu.

Nosný materiál môže byť ale tiež nešpecifický nosný materiál pre faktor VIII, napríklad slabý aniónomenič, napríklad DEAE-, TMAE- alebo ďalšie aniónomeniče dostatočne známe podľa stavu techniky.

31309/H

Podľa zvolených podmienok sa na nosnom materiáli adsorbuje buď faktor VIII a prípadne fosfolipidy, zatiaľ čo faktory II, IX a X a prípadne VII sa nevážia alebo naopak.

Pri ďalšej výhodnej forme uskutočnenia vykazuje nosný materiál vyššiu afinitu pre protrombínový komplex ako pre faktor VIII. Tak sa napríklad adsorbujú faktory II, IX, X a prípadne VII, zatiaľ čo faktor VIII a prípadne fosfolipidy sa eluujú.

Faktor VIII sa môže tiež cielene inaktivovať a napríklad sa potom neviazať v tejto inaktivovanej forme na nosný materiál. Takejto inaktivácie faktora VIII sa môže napríklad dosiahnuť disociáciou s použitím napríklad chelátotvorných látok, odbúraním, obzvlášť proteolytickým odbúraním, napríklad serínproteázami ako trombín alebo aktivovaný protein C, väzbou afinitných partnerov, ako protilátok alebo peptidov.

Všetky opísané varianty spôsobu sa môžu vykonávať tiež v prítomnosti detergentu, obzvlášť neiónového detergentu. Výhodne sa ako detergent použije polyéter alebo polysorbát, obzvlášť sa použije Tween alebo Triton.

Pokiaľ je prítomný detergent, pri výhodnej forme uskutočnenia sa opäť odstráni prípadne oddelí.

V ďalšej výhodnej forme uskutočnenia sa predpokladá krok k inaktivácii prípadne prítomných patogénov, obzvlášť krok vybraný zo skupiny ošetrení teplom, ošetrení parou, ošetrení rozpúšťadlom a/alebo ošetrení detergentom.

Prípravok podľa vynálezu je teda možné získať všeobecne vyššie

I opísanými spôsobmi. Vhodné sú obzvlášť na výrobu liečiv, ktoré sa hodia na ošetrenie pacientov s inhibíciou faktora VIII (hemofília A), obzvlášť pre pacientov s titrom inhibície väčším ako 1 Bethesda E/ml plazmy, výhodne väčším ako 5 Bethesda E/ml plazmy. Môže sa vyrobiť tiež kombinácia vysoko čistých jednotlivých faktorov II, IX a X a rovnako prípadne VII.

Pretože biologický materiál, teda materiál, ktorý pochádza z organizmov prípadne telesných kvapalín alebo mikroorganizmov môže byť kontaminovaný patogénmi, ako napríklad infekčnými molekulami alebo mikroorganizmami a

31309/H vírusmi, prípadne pyrogénmi, boli už skôr vyvinuté rôzne spôsoby na inaktiváciu prípadne zníženie·.kontaminácie patogénov prípadne pyrogénov.

Také spôsoby zahrňujú fyzikálne a/alebo chemické ošetrenie, ako napríklad rôzne filtračné metódy (napríklad nano-, dia- alebo ultrafiltrácia), ošetrenie teplom, spracovanie kyselinou alebo lúhom, ošetrenie detergentami a/alebo organickými rozpúšťadlami a rovnako ošetrenie UV-svetlom alebo laserovým svetlom. Opakovane boli podľa stavu techniky navrhované také kombinácie týchto spôsobov na inaktiváciu prípadne zníženie kontaminácie patogénov.

Z EP 0 197 554 je napríklad známy spôsob depyrogenácie a inaktivácie vírusov v biologickom alebo farmaceutickom produkte, ktorý zahrňuje ošetrenie prostriedkom na inaktiváciu vírusov a depyrogenáciu, ako napríklad amfifilná substancia a/alebo rozpúšťadlo na pevnej fáze, na ktorej je produkt adsorbovaný. Po tomto ošetrení sa prostriedok na inaktiváciu vírusov a depyrogenáciu oddelí od pevnej fáze, adsorbovaný produkt sa premyje a konečne sa eluuje z pevnej fázy.

Z EP 0 131 740 je známe ošetrenie prípravku obsahujúceho proteín v roztoku s organickým rozpúšťadlom ako di- alebo trialkylfosfáty, prípadne v prítomnosti detergenta (ošetrenie rozpúšťadlo/detergent), ktorým sa môžu proteínové prípravky získať bez toho, že by obsahovali lipidické vírusy.

Z AR-PS 402 151 je známe ošetrenie teplom, pri ktorom sa k prípravku vo vodnom roztoku pred zahriatím pridá tenzid v koncentrácii najmenej 1 % hmotnostné. ,

Ďalší spôsob na redukciu, prípadne supresiu nežiaducich aktivít v biologických alebo farmaceutických produktoch je známy z EP 0 083 999. Tento spôsob je založený na predĺženom kontakte s roztokom alebo suspenziou amfifilu, ktorý nepôsobí denaturačne. Depyrogenovaný produkt sa na odstránenie amfifilu spracuje na iónomeniči.

Nevýhodou mnohých týchto spôsobov známych podľa stavu techniky je častý výskyt straty aktivity nestabilných proteínov, obsiahnutých v

31309/H spracovávaných prípravkoch, napríklad krvných proteínov. Obzvlášť pri vykonávaní chromatografického čistenia dochádza k inaktivácii proteínov v relatívne vysokej miere. Odbúranie proteínov môže ale tiež viesť k aktivácii. Tak je napríklad známe, že sa faktor VII pri chromatografickom čistení na základe autokatalytických procesov veľmi ľahko aktivuje na nežiaduci, veľmi nestabilný faktor Vila.

Ďalšia nevýhoda spočíva vo vysokej časovej a aparátovej náročnosti mnohých spôsobov, čo silne znižuje ich využiteľnosť a ich použitie v produkčnom technickom meradle je často nevhodné.

V rámci predloženého vynálezu sa má preto využiť spôsob na účinnú inaktiváciu patogénov v biologickom materiáli, šetrný pre proteíny, obzvlášť pre nestabilné krvné proteíny, ktorý je možné ľahko previesť do prevádzkovo technického meradla a môže sa vykonávať ekonomicky. Obzvlášť sa má spôsobom inaktivácie patogénov významne zabrániť odbúraniu a možnej aktivácii proteínov na to citlivých.

U tohto spôsobu inaktivácie patogénov, obzvlášť vírusov v biologickom materiály sa tento materiál inkubuje s chemickým prostriedkom, pričom inkubácia sa vykonáva za prítomností eluotropnej soli zodpovedajúcej koncentrácii chloridu sodného najmenej 200 mmol/l, výhodne najmenej 300 mmol/l.

Inaktivácia patogénov v roztoku prináša oproti ošetreniu adsorbenta niektoré výhody. Tak je napríklad schodnosť takých spôsobov v homogénnom, jednofázovom systéme jednoduchšia a validácia inaktivácie je lepšie možná. Rovnako sa zdá, že lepšia prístupnosť patogénov v relatívne homogénnej fáze zvyšuje účinnosť tohto procesného kroku.

Biologický materiál obsahuje výhodne humánny proteín a je to obzvlášť plazma alebo frakcia plazmy alebo pochádza z bunkovej kultúry. Výhodne obsahuje biologický materiál krvný faktor, ako faktor XII, XI, VIII, V, proteín závislý na Willebradovom faktore alebo fibrinogéne, obzvlášť na vitamíne K,

31309/H ako faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, proteín C, proteín S, prípadne proteín Z.

Proteíny sa môžu vyskytovať ako jednotlivé faktory, výhodne vo vyčistenej forme, alebo ako komplexné zmesi. Pri jednej obzvlášť výhodnej forme uskutočnenia obsahuje biologický materiál najmenej jeden faktor protrombínového komplexu a je obzvlášť materiál obsahujúci frakciu obsahujúcu protrombínový komplex alebo faktor VII, napríklad sa vychádza zo zodpovedajúceho zvyšku (kryozvyšok) po kryoprecipitácii plazmy.

Prípravok podľa vynálezu je výhodne prípravok s aktivitou FEIB (factor Eight Inhibitor Bypassing-Activity), teda prípravok, ktorý je vhodný na ošetrenie pacientov s inhibíciou faktora Vili.

Materiál pochádzajúci z bunkovej kultúry je výhodne materiál obsahujúci rekombinantné vyrobené krvné faktory, medzi nimi faktory vnútorného alebo vonkajšieho zrážania, fibrinolýzy, trombolýzy alebo ich inhibítorov, obzvlášť krvných faktorov závislých na vitamíne K. Ako bunky prichádzajú do úvahy bežné bunky pre expresiu rekombinantných proteínov, výhodne bunky cicavcov, ako napríklad Vero-, CHO- alebo BHK-bunky. Zodpovedajúce proteíny sa môžu priamo zo surového bunkového extraktu podrobiť spôsobu podľa vynálezu k inaktivácii prípadne sa vyskytujúcich patogénov, môže ale tiež ísť o predčistenú bunkovú frakciu.

Chemický prostriedok je napríklad detergent (amfifil, tenzid), ktorý je výhodne obsiahnutý v množstve najmenej 1 %, výhodnejšie viac ako 5 %, najvýhodnejšie viac ako 10 %; podľa vynálezu sa ale tiež môžu použiť iné chemické prostriedky, obzvlášť také, u ktorých je už napríklad známy virucidny, baktericídny alebo depyrogenačný účinok, prípadne zmesi najrôznejších chemických prostriedkov.

Výber je však limitovaný tým, aby nebola podstatne ovplyvnená nativita biologického materiálu. Pre ekonomický spôsob sa volí chemikália, ktorá zachová biologickú aktivitu materiálu viac ako 50 %, vztiahnuté na aktivitu pred inkubáciou, výhodne najmenej 70 %, obzvlášť viac ako 85 %. Zachovanie

31309/H biologickej aktivity znamená, že proteíny obsiahnuté v biologickom materiáli môžu vykonávať jm prirodzene pripísané funkcie, prípadne rôzne funkcie. Táto biologická aktivita sa potom môže podľa druhu proteínu zisťovať a udávať, napríklad pomocou štandardizovaného chromogénneho testu alebo stanovenia antigénov. Prípadne sa chemický prostriedok na inkubáciu oddelí.

Ako detergent sa všeobecne rozumie syntetická, organická substancia aktívna na hraničných plochách.

Výhodne sa pre spôsob podľa vynálezu použije neiónový detergent. Neiónové tenzidy ako polyéter, obzvlášť alkylfenolpolyglykoléter sú medzi iným produkty etoxylácie mastných kyselín, amidov mastných kyselín, mastných amínov, mastných alkoholov, amínoxidov, esterov mastných kyselín, polyalkoholov a esterov cukrov.

Taký tenzid nepôsobí na proteíny denaturačne a výhodne sa vyberie zo skupiny polysorbátov a tritonu. Ako polysorbát sa napríklad používa Tween®.

Pokiaľ sa detergenty použitú ako chemické prostriedky, potom sa tieto detergenty podľa výhodnej formy uskutočnenia vynálezu použijú bez prídavku ďalších prostriedkov, obzvlášť bez prídavku toxických organických látok alebo rozpúšťadiel, ako napríklad TNBP. Tým sa minimalizuje riziko kontaminácie.

Biologický materiál sa spôsobom podľa vynálezu inkubuje chemickým prostriedkom. Inkubácia znamená uviesť do kontaktu biologický materiál s roztokom, suspenziou alebo emulziou chemického prostriedku po dostatočne dlhý čas potrebný na inaktiváciu prípadne prítomných patogénov, prípadne pyrogénov pri určitej teplote. Uvedenie do kontaktu sa môže napríklad vykonať jednoduchým ponechaním zmesi po definovaný čas.

Inkubácia sa podľa predloženého vynálezu vykonáva v prítomnosti eluotropnej soli. Ako „eluotropná soľ sa ďalej rozumie soľ v zmesi s chemickým prostriedkom alebo soľ v komplexnom prípravku, s vlastnosťou vylúhovať adsorbované látky z pevných adsorbentov alebo adsorbentov napojených kvapalinou alebo gélových adsorbentov a/alebo vytlačiť. Výhodne v prípade eluotropných solí ide o desorpčný prostriedok, aký sa používa pre

31309/H chromatografické procesy. Adsorbovaná látka je podľa toho dostatočne rozpustná v prítomnosti eluotropnej soli, to znamená, že sa výhodne volia podmienky, pri ktorých nedochádza ku zrážaniu biologického materiálu.

Druh a koncentrácia soli prípadne prípravku sa všeobecne volí podľa použitého adsorbenta. Elučný účinok soli závisí napríklad na polarite rozpúšťadla, stúpa teda napríklad v poradí etanol - acetón - metanol - voda. Adsorbent môže byť pevnou fázou, obzvlášť matrica vhodná na iónomeničovú chromatografiu. V prípravku obsahujúcom eluotropnú soľ môžu byť obsiahnuté ešte ďalšie prísady, napríklad ďalšie soli. Výhodne v prípade prípravku ide o vodné prípravky s pH hodnotou v rozpätí medzi 6,0 až 8,0, výhodnejšie okolo 7,0.

Pri výhodnej forme uskutočnenia sa ako eluotropná soľ použije chlorid sodný, ale i iné soli alkalických kovov alebo kovo alkalických zemín, medzi nimi chlorid vápenatý. Ako eluotropné soli sa môžu použiť i tzv. chaotropy, ako napríklad močovina, rodanidy alebo guanidín. Koncentrácia soli je najmenej > 200 mmol/l, výhodne > 300 mmol/l. Horná hranica použitej koncentrácie závisí obzvlášť na rozpustnosti danej soli a pre chlorid sodný predstavuje napríklad okolo 2 mol/l. Chaotropné látky, ako napríklad močovina, sa môžu dokonca napríklad použiť v koncentrácii až do 8 mol/l.

Inkubácia biologického materiálu chemickými prostriedkami sa vykonáva dostatočne dlhý čas na inaktiváciu prípadne prítomných patogénov, výhodne medzi 10 minútami a 10 hodinami, najvýhodnejšie medzi 1 hodinou a 5 hodinami. Čas potrebný k spôsobu podľa vynálezu sa môže zistiť pomocou modelových vírusov ako HIV, Sindbis-, FSME- alebo vírusov hepatitídy predbežným pokusom.

Tiež voľba teploty ovplyvňuje použitý čas. Pri spôsobe podľa vynálezu sa výhodne inkubuje pri teplote miestnosti, napríklad v rozpätí teplôt medzi 15 až 45 °C, obzvlášť medzi 20 až 30 °C.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa biologický materiál výhodne adsorbuje na pevný nosič, vyčistí sa a inkubácia sa vykoná bezprostredne po elúcii

31309/H vyčisteného materiálu, pričom eluát sa ešte ďalej spracováva, napríklad centrifugáciou, filtráciou alebo inými fyzikálnymi metódami.

Pevný nosič je výhodne materiál vhodný pre chromatografiu, obzvlášť nosič vhodný na iónomeničovú chromatografiu, hydrofóbnu chromatografiu alebo afinitnú chromatografiu. Napríklad sa používajú materiály ako Sepharose®, Superdex®, Sephadex®, Spherodex®, Toyopearl®, alebo anorganické materiály ako hydroxylapatit.

Ako iónomeniče sa môžu používať iónomeničové materiály, ako napríklad DEAE-Sephacel®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose® CL6B, DEAE-Sepharose® Fast Flow, QAE-Sephadex®, Q-Sepharose® Fast Flow, QSepharose® High Performance, DEAE-Tris-Acryl, DEAE-Spherodex®, Q-HyperD (dodávaný firmou Sepracor), DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Fractogel® EMD-TMAE alebo iné Fractogelové materiály.

Ako príklady hydrofóbnych chromatografických materiálov je možné napríklad uviesť Butyl-Sepharose®, Octyl-Sepharose®, Phenyl-Sepharose®, Fractogel® TSK-butyl, t-Butyl-HlC Suppor alebo TSK-Gel Butyl Toyopearl®.

Biologický materiál sa môže priamo z komplexnej zmesi adsorbovať na nosič a čistiť, inaktivačnému kroku môžu ale predchádzať alebo mu nasledovať tiež ďalšie kroky na čistenie materiálu, pričom v rámci predloženého vynálezu je výhodné ďalšie chromatografické čistenie.

Spôsobom podľa vynálezu sa patogény inaktivujú. Ako patogény sa rozumejú tiež produkty degradácie napríklad vírusov, obzvlášť tiež izolovaný génom alebo jeho fragmentmi.

Spôsoby inaktivácie vírusov sa dnes označujú za účinné, ak po použití spôsobu na vzorke biologického materiálu, ktorý bol zmiešaný s vysokou dávkou testovaného vírusu, napríklad HlV-vírusu alebo Sindbis-vírusu ako modelového vírusu pre vírusy Hepatitis nemožno vo vzorke dokázať žiadne vírusy a titer vírusu bol tak redukovaný pod hranicu dokázateľnosti. Dôkaz a kvantifikácia nukleových kyselín sa môže napríklad vykonávať pomocou metódy PCR, ako sa opisuje v AT-PS 401 062 alebo priamou titráciou.

31309/H

Ako miera inaktivácie je známy tzv. redukčný faktor, ktorý sa po jedinom pridaní testovaného vírusu vypočíta z dekadického logaritmu kvocientov začiatočného a konečného titra vírusu. Podľa európskej smernice EC 111/8115/89-EN Komisie európskeho spoločenstva je ďalej známy tzv. celkový redukčný faktor. Vypočíta sa zo súčtu redukčných faktorov jednotlivých subsekvenčných inaktivačných opatrení.

Výhodne sa vykonáva tiež ďalší nezávislý krok na inaktiváciu prípadne redukciu kontaminácie patogénmi. Tu prichádzajú do úvahy všetky podľa stavu techniky známe spôsoby na minimalizáciu infekčného rizika.

Obzvlášť sa ako ďalší krok na inaktiváciu prípadne redukciu kontaminácie vykonáva filtrácia a/alebo ošetrenie teplom.

Ako filtrácia sa výhodne vykonáva nanofiltrácia. Výhodné ošetrenie teplom sa vykonáva na pevnom biologickom materiáli, napríklad na lyofilizáte s riadeným obsahom vody, napríklad obsahom vody medzi 5 a 8 % a teplote medzi 50 a 80 °C, ako sa opisuje v EP 0 159 311.

Pri jednej výhodnej forme uskutočnenia sa vykonáva dvojstupňové ošetrenie s detergentom ako chemickým prostriedkom. Pritom sa v prvom kroku použije detergent v množstve najmenej 1 %, výhodne najmenej 5 %, najvýhodnejšie najmenej 10 %. V druhom stupni sa použije ďalší detergent v množstve najmenej 10 %, výhodne najmenej 12 %, najvýhodnejšie najmenej 14 %. Použitý detergent môže byť pre obidva stupne rovnaký, môžu sa ale tiež použiť rozdielne detergenty. Celkom všeobecne je možné kombináciu krokov na inaktiváciu vírusov silne redukovať prípadne vylúčiť riziko vírusovej infekcie po podaní príslušného preparátu.

Podľa predloženého vynálezu sa dáva k dispozícii tiež chromatograficky čistený prípravok, obsahujúci autodynamicky aktivovateľný krvný faktor s podielom aktivovaného krvného faktora menej ako 50 %, vztiahnuté na obsah aktivovaného a neaktivovaného krvného faktora, výhodne menej ako 40 %, výhodnejšie menej ako 30 %, ešte výhodnejšie menej ako 20 %, ešte viac

31309/H výhodnejšie menej ako 10 %, najvýhodnejšie menej ako 1 %, a s obsahom detergentu.

Obzvlášť ide o prípravok obsahujúci protrombinový komplex s aktivitou faktora Vila menej ako 50 %, vztiahnuté na obsah aktivovaného a neaktivovaného faktora VII, výhodne menej ako 10 % a najvýhodnejšie menej ako 1 %. Obsah detergentu v prípravku podľa vynálezu pritom zodpovedá farmaceutický prijateľnému množstvu, výhodne medzi 1 % a hranicou dokázateľnosti detergentu.

Ako autodynamicky aktivovateľný krvný faktor sa podľa predloženého vynálezu rozumie krvný faktor, ktorý je aktivovateľný autokatalyticky, kontaktom na povrchu alebo pomocou procesu, ako napríklad chromatografického procesu. Obzvlášť je takýto krvný faktor vybraný zo skupiny faktor Vil, faktor XII, faktor XI a prekalikreín.

V ďalšej výhodnej forme uskutočnenia neobsahuje prípravok inhibítory serínproteázy, ako napríklad inhibítory trombínu, prípadne kofaktory, ako napríklad heparín. V špeciálnej forme uskutočnenia je neprítomnosť substancií tohto druhu daná už počas chromatografického procesu.

Preto sa predložený vynález týka tiež zodpovedajúcich prípravkov, ktoré sa môžu získať spôsobom podľa vynálezu.

V prípravkoch podľa vynálezu môžu byť obsiahnuté tiež ďalšie prísady, napríklad stabilizačné pôsobiace substancie ako aminokyseliny.

Nasledujúcimi príkladmi má byť predložený vynález ešte bližšie vysvetlený, bez toho, že aby sa týmito príkladmi obmedzoval.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Stanovenie faktora VIII

31309/H

Stanovenie antigénu faktora VIII vo FEIBA sa uskutočňuje metódou podľa Moritz B. a spol. (Thromb. Haemost. 1997, Suppl: 31). Pri tomto stanovení sa monoklonálnou protilátkou proti ľahkému reťazcu molekuly faktora VIII ako Captureprotilátky a pomocou monoklonálnej protilátky ako detekčnej látky, rovnako proti ľahkému reťazcu molekuly faktora VIII, avšak smerované proti inému epitopu, dokáže selektívne faktor Vili vedľa ďalších proteínov plazmy vo FEIBA.

Príklad 2

Stanovenie fosfolipidu

Organicky viazaný fosfát sa extrahuje z lyofilizovaného prášku frakcie FEIBA metódou podľa Folch J. a spol. (J. Biol. Chem. 1957, 226:497-509) pomocou zmesi rozpúšťadiel pozostávajúcich z chloroformu a metanolu v pomere 2 objemové diely chloroformu k jednému objemovému dielu metanolu. Extrakt obsahujúci celý podiel fosfolipidu sa následne prevedie do teflónovej nádobky a organické rozpúšťadlá sa odparia v prúde dusíka. Po prídavku pufra (20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,4) a Oxisolvreagenz (firma Merck) sa teflónová nádoba tesne uzatvorí a digeruje počas 5 hodín pri teplote 160 °C. Digeráciou uvoľnený fosfát sa kvantitatívne stanoví fotometrický ako molybdénový komplex metódou podľa Ames B.N. (Methods in Enzymology 1966, 8:115-118).

Príklad 3 ’ i

Výroba afinitného nosiča viažuceho faktor VIII

Spôsobom opísaným vo FEBS. Lett. 1994, 351:345-348 sa vyrobí bunkový kloň CHO-, ktorý produkuje rekombinanty Willebrandovho faktora. Transfekciou s vektorom kódujúcim pre humánny cDNA furín (van den Ouweland a spol., Nucleic Acid Res. 1990, 18:664) sa bunková línia uvedie k Co-expresii humánneho furínu. Stabilné bunkové klony tohto druhu boli v prevádzkovom meradle fementované v perfúznych reaktoroch na

31309/H mikronosičoch (Bluml a spol. v : Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds Animal celí technology, Oxford, London : Butterworth-Heinemann, 1994:267-269).

Čistenie sa vykonáva dvojstupňovým chromatografickým procesom podľa Thromb. Haemost. 1995, 73:1160. Získa sa frakcia desorbovaná elúciou kuchynskou soľou a prepufruje sa gélovou filtráciou cez Sephadex G25 (firma Pharmacia) v pufri obsahujúcom 20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH

7,5. Následne sa prípravok skoncentruje pomocou ultrakoncentrácie cez membránu Amicon YM30 (cut-off : 30.000 D) na koncentráciu proteínu 3 mg/ml. Koncentrácia Wiilebrandovho faktora v tomto prípravku predstavuje 60 E vWF-antigénu/mg proteínu.

Prípravok rekombinantného Wiilebrandovho faktora sa zriedi pufrom, obsahujúcim 20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5, na 1,5 mg/ml. Vopred aktivovaný gél, vhodný na afinitnú chromatografiu (Actigel, ALDSuperfiow, firma Sterogone) sa excesívne premyje pufrom obsahujúcim 20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5. Jeden objemový diel premytého gélu sa zmieša s 1,1 objemového dielu proteínového roztoku, ktorý sa má imobilizovať a následne sa pridá 0,15 objemového dielu roztoku 0,1 M kyanobórhydridu (NaCNBHa) v 0,1 M fosfátovom pufri, pH 7,0. V tomto pufri sa gél trepaním suspenduje a za pokračujúceho trepania sa inkubuje počas 16 hodín pri teplote miestnosti. Následne sa gél premyje na sintrovom nuči desaťnásobným objemom pufra obsahujúcim 20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5 a päťnásobným objemom pufra, obsahujúcim 20 ml Tris HCl, 2 M chloridu sodného, pH 7,5. Potom sa ešte ekvilibruje piatimi objemovými dielmi pufra 20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5 a gél sa prevedie na chromatografický stĺpec s rozmermi priemer k výške gélového lôžka 1 : 4. Stanovením koncentrácie proteínu v roztokoch inkubačného zvyšku roztoku Wiilebrandovho faktora a afinitného gélu, oddelených na sintrovom nuči a rovnako premývacích roztokov bolo možné zistiť pomer naviazaní viac ako 90 % použitého proteínu.

31309/H

Príklad 4

Výroba protrombínového komplexu neobsahujúceho faktor VIII kontaktom s afinitným gélom (toho času podľa názoru prihlasovateľky najlepšia cesta na uskutočnenie vynálezu)

Farmaceutický preparát FEIBA S-TIM4 IMMUNO (1000 jednotiek) sa rekonštituuje v 20 ml destilovanej vody. Po úplnom rozpustení lyofilizovaného prášku obsahuje roztok koncentráciu účinnej látky 50 jednotiek v ml. 10 ml tohto roztoku sa uvedie do kontaktu so 100 mg vyššie opísaného imobilizovaného Willebrandovho faktoru a inkubuje sa počas 1 hodiny pri teplote miestnosti za ľahkého trepania. Následne ša imobilizát odstráni filtráciou cez sintrový nuč. Roztok FEIBA obsiahnutý vo filtráte vykazuje aktivitu 49 jednotiek FElBA/ml. Väzbou faktora VIII obsiahnutého v preparáte na imobilizovaný Willebrandov faktor bol antigén faktora VIII v tomto prípravku pod hranicou dokázateľnosti.

Príklad 5

Výroba aktivovaného protrombínového komplexu neobsahujúceho faktor VIII readsorpciou na nešpecifickom nosiči mg DEAE-Sephadex® A-50 firmy Pharmacia sa počas 15 minút pri teplote miestnosti inkubuje k napučaniu s 1 ml roztokom 30 g/l chloridu sodného vo vode. Potom sa gél oddelí centrifugáciou od napúčaného zvyšku. Následne sa päťkrát vykoná premytie gélu vždy 1 ml pufra (9 g/l Na2HPO₄.2H2O, 7 g/l NaCI, pH 7,0) a ďalšie dve premytia pufrom (7 g/l citrátu trisodného . 2H₂O, 7 g/l NaCI) a rovnako resuspendácia a centrifugácia.

ml čerstvo zamrazenej ľudskej citrátovej plazmy sa roztaví pri 0 až + 4 °C a vzniknutý kryoprecipitát sa oddelí centrifugáciou pri teplote +2 °C. Vzniknutý „kryozvyšok“ sa inkubuje premytým DEAE-Sephadex®, pričom sa generuje FEIBA a spolu s faktormi protrombínového komplexu a inertným proteínom sa adsorbuje na gél. Potom sa koadsorbovaný inertný proteín odstráni z DEAE-gélu premytím pufrom (9 g/l Na2HPO₄.2^0, 7 g/l NaCI).

31309/H

Gélový proteínový komplex vlhký pufrom sa teraz suspenduje s 1,5 ml roztoku 150 mg/rpl TWEEN®-80 a 30 mg/ml chloridu sodného počas 1 hodiny pri teplote 26 °C. Ošetrením roztokom vyššieho iónového škrobu sa proteín spoločne s faktorom protrombínového komplexu a prípadne prítomnými patogénmi desorbuje. Následne sa suspenzia zriedi prídavkom 6,5 ml vody a jednu hodinu sa readsorbuje pri teplote miestnosti, pričom sa frakcia protrombínového komplexu novo readsorbuje. Teraz sa zároveň readsorbuje na gél nepatrná časť faktora VIII obsiahnutá v proteínovej frakcii. Gél/proteínový komplex sa potom päťkrát premyje vždy 1 ml roztoku 7 g/l chloridu sodného vo vode do odstránenia detergentu.

K elúcii sa gél spracuje miešaním s 0,7 ml roztoku 30 g/l chloridu sodného vo vode. Eluát sa potom dialyzuje proti destilovanej vode, zamrazí sa a lyofílizuje. Po rekonštitúcii lyofilizátu sa stanoví aktivita FEIB podľa AT-B 350 726.

Ďalej sa stanoví obsah antigénu faktora VIII. Ako kontrola slúži konvenčné vyrobený preparát FEIBA, aký sa opisuje v AT 350 726. Prípravok získaný opísaným spôsobom vykazuje v porovnaní s kontrolou obsah faktora VIII znížený o faktor 10.

Kontaktom s detergentom sa inaktivujú tiež prípadne prítomné patogény, obzvlášť vírusy obklopené lipidmi.

Príklad 6

Výroba aktivovaného protrombínového komplexu neobsahujúceho faktor VIII a neobsahujúci fosfolipidy readsorpciou na nešpecifickom nosiči.

mg DEAE-Sephadex® A-50 firmy Pharmacia sa počas 15 minút pri teplote miestnosti inkubuje k napúčaniu s 1 ml roztoku 30 g/l chloridu sodného vo vode. Potom sa gél oddelí centrifugáciou od napučaného zvyšku. Následne sa päťkrát prevedie premytie gélu vždy 1 ml pufra (9 g/l Na₂HPO4.2H2O, 7 g/l NaCI, pH 7,0) a ďalšie dve premytia pufrom (7 g/l citrátu trisodného . 2H2O, 7 g/l NaCI) a rovnako resuspendácia a centrifugácia.

31309/H ml čerstvo zmrazenej ľudskej citrátovej plazmy sa roztaví pri 0 až +4 °C a vzniknutý _tkryoprecipitát sa oddelí centrifugáciou pri teplote +2 °C. Vzniknutý „kryozvyšok sa inkubuje premytým DEAE-Sephadex®, pričom sa generuje FEIBA a spolu s faktormi protrombínového komplexu, faktorom VIII, fosfolipidmi a inertným proteínom sa adsorbuje na gél. Potom sa koadsorbovaný inertný proteín odstráni z DEAE-gélu premytím pufrom (9 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 7 g/l NaCl).

Gélový proteínový komplex vlhký pufrom sa teraz suspenduje s 1,5 ml roztokom 1 mg/ml TWEEN®-80 a 30 mg/ml chloridu sodného počas 1 hodiny pri teplote miestnosti, pričom sa deadsorbuje proteínová frakcia a nešpecifický adsorbované nečistoty. Následne sa gél oddelí filtráciou. Proteínový roztok sa teraz ďalším prídavkom TWEEN®-80 doplní na koncentráciu detergentu 150 mg/ml a následne sa inkubuje 1 hodinu za miešania. Následne sa zriedi prídavkom 6,5 ml vody a gél sa readsorbuje na pripravený čerstvo premytý DEAE-Sephadex® A-50, pričom sa frakcia protrombínového komplexu novo readsorbuje. Teraz sa zároveň readsorbuje na gél nepatrná časť faktora VIII obsiahnutá v proteínovej frakcii. Následne sa päťkrát premyje vždy 1 ml roztoku 7 g/l chloridu sodného vo vode do odstránenia detergentu. Pritom sa odstráni tiež viazaný fosfolipid, ktorý bol po kontakte s amfifilom solubilizovaný.

Na elúciu sa gél spracuje miešaním s 0,7 ml roztokom 30 g/l chloridu sodného vo vode. Eluát sa potom dialyzuje proti destilovanej vode, zamrazí sa a lyofilizuje. Po rekonštitúcii lyofilizátu sa stanoví aktivita FEIB podľa AT-B 350 726.

Ďalej sa stanoví obsah antigénu faktora VIII a fosfolipidu ako je opísané. Ako kontrola slúži konvenčné vyrobený preparát FEIBA, ktorý bol získaný podľa AT 350 726. Prípravok získaný opísaným spôsobom vykazuje v porovnaní s kontrolou znížený obsah faktora VIII a neobsahuje fosfolipidy. Výsledky analýzy sú zhrnuté v Tabuľke 1.

31309/H

Tabuľka 1 - Obsah faktora Vlll/fosfolipidu

	FEIBA	FVIII C: Ag	FVIII C : Aq FEIBA	Fosfolipid
	U/ml	U/ml	U/U	nM Fosfát/U FEIBA
FEIBA štandard)	51	7,0	0,14	0,14
FEIBA (produkt podľa vynálezu)	70	1,0	0,01	<0,02

31309/H

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Imunotolerantný farmaceutický prípravok protrombínového komplexu, obsahujúci faktory II, IX, X a prípadne VII, vyznačujúci sa tým, že vykazuje obsah antigénu faktora VIII menej ako 0,1.
2. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že je vyrobený z plazmy alebo z frakcie plazmy.
3. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že prípravok obsahuje najmenej jeden z faktorov IXa, Xa a Vila a vykazuje aktivitu FEIB.
4. Farmaceutický prípravok podľa niektorého z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že neobsahuje fosfolipidy.
5. Spôsob výroby prípravku podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje nasledujúce kroky:

a) poskytnutie plazmy alebo frakcie plazmy obsahujúce faktory II, IX, X a prípadne VII,

b) uvedenie plazmy alebo frakcie plazmy do' kontaktu s nosným materiálom, prípadne za prítomnosti detergenta, tak že sa oddelí faktor VIII a prípadne fosfolipidy od faktorov II, IX, X a prípadne VII,

c) čistenie plazmy alebo frakcie plazmy a

d) získanie frakcie obsahujúcej faktory II, IX, X a prípadne VII.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že sa kroky b) a c) vykonávajú ako jeden procesný krok.
7. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že nosný materiál je materiál vhodný na chromatografiu, filtráciu a/alebo nanofiltráciu
8. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 7, vyznačujúci sa tým, že nosný materiál je špecifickým nosným materiálom pre faktor VIII, obzvlášť matrica vhodná na afinitnú chromatografiu.

31309/H
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že matrica je matrica obsahujúca vWF..
10. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa faktor VIII a prípadne fosfolipid adsorbujú na nosnom materiáli.
11. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 7, vyznačujúci sa tým, že *’ nosný materiál vykazuje vyššiu afinitu pre protrombínový komplex ako pre ₉ faktor VIII a obzvlášť je slabým aniónomeničom.
12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa faktory II, IX, X a prípadne VII adsorbujú, zatiaľ čo faktor VIII a prípadne fosfolipidy sa eluujú.
13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa faktory II, IX, X a prípadne VII neviažu na nosný materiál.
14. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 13, vyznačujúci sa tým, že detergent je neiónový detergent, obzvlášť polyéter.
15. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 14, vyznačujúci sa tým, že sa detergent po kontakte s plazmou alebo frakciou plazmy odstráni.
16. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 15, vyznačujúci sa tým, že sa frakcia plazmy získa chromatografiou, zrážaním alebo centrifugáciou, prípadne je zvyškom z kryoprecipitácie.

*
17. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 15, vyznačujúci sa tým, že frakcia plazmy vykazuje najmenej intermediárnu čistotu.
18. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 17, vyznačujúci sa tým, že sa vykoná najmenej jeden krok na inaktiváciu alebo obmedzenie kontaminácie vírusmi alebo časťami vírusov, obzvlášť vybraných zo skupiny ošetrení teplom, ošetrení parou, ošetrení rozpúšťadlom a/alebo ošetrení detergentom a nanofiltrácia.
19. Prípravok podľa nároku 1, získaný spôsobom podľa nároku 5.
20. Použitie prípravku podľa nároku 1 na výrobu liečiva na ošetrenie pacientov s inhibíciou faktora VIII, teda s hemofíliou A, obzvlášť pacientov s

31309/H titrom inhibítora väčším ako 1 Bethesda E/ml plazmy, výhodne väčším ako 5 Bethesda E/ml plazmy.